Bu protokolün genel amacı, akış sitometrisi yoluyla çift floresan hücreleri ölçerek BK-poliomavirüs kodlama dışı kontrol bölgesi nin transkripsiyonel aktivitesini ölçmektir. BK-poliomavirüs, özellikle böbrek nakli alıcılarında, bağışıklık sistemi zayıf hastalarda ciddi patolojilere neden olabilir. Ancak, son derece etkili antivirüs şu anda mevcut olmadığından, diğer bileşiklerin potansiyel anti-viral etkisini ölçen yöntemler gereklidir.
Bu yöntem virologların kodlama yanlı kontrol bölgesi tarafından yönlendirilen BK-poliomavirüs transkripsiyonel aktivitesini etkileyen potansiyel anti-viral ajanların etkisini analiz etmelerini sağlar. Bu test daha arketipik kodlama dışı kontrol bölgeleri ile karşılaştırıldığında organizatör etkinliği üzerinde yeniden düzenlemelerin etkisini incelemek için izin verir. Çift floresan raporu ile viral organizatör aktivitesini incelemenin avantajı, erken ve geç gen ekspresyonunun karşılıklı bağımsız bir şekilde analiz edilebilmektedir.
Ayrıca, sadece transfected ve floresan hücreler analiz edildiğinden, virüs stoklarının ve uzun süreli enfeksiyöz hücre kültürü deneylerinin zor perforasyonu gerekli değildir, ayrıca hücre canlılığını ve perforasyonunu azaltan ilaçlar incelenebilir. Bu protokol, Duisburg-Essen Üniversitesi tıp fakültesi etik komitesi tarafından onaylanan insan araştırma yönergelerini izler. İlk adım poliomavirüs DNA izolasyonu için kan örnekleri toplamaktır.
EDTA satın alma tüpleri kan en az üç mililitre toplamak. Numuneyi 2, 500 G'de 15 dakika santrifüj edin ve plazmayı yeni bir tüpe pipetleyin. 1,5 mililitrelik mikro-santrifüj tüpüne 40 mikrolitre protein SK hazırlayın ve pipetleme ile 400 mikrolitre plazma ekleyin.
Üreticinin talimatlarında açıklandığı gibi DNA leke çıkarma kiti kullanarak DNA'yı izole edin. Toplam 50 mikrolitre hacimde A astar çiftini kullanarak pcr öncesi ana karışımı hazırlayın ve önceden izole edilmiş DNA'yı kullanın. PCR tüpleri içine ana karışımı 45 mikrolitre dağıtın.
PCR tüpleri içine izole DNA beş mikrolitre ekleyin ve tablo üç gösterildiği gibi reaksiyon koşulları ile PCR çalıştırın. Denatürasyon annealing ve uzatma 35 döngüler halinde tekrarlayın. İç içe uygulama için, klonlama için kısıtlama sitelerini barındıran Astar çifti B'yi kullanın.
10 mikrolitre PCR ürününün altı kat jel yükleme boyasının iki mikrolitresini karıştırın. % 1.5 agarose jel karışımı 10 mikrolitre yük ve 60 miliamper de 30 dakika boyunca jel çalıştırın. Uygun bir UV dokümantasyon sistemi kullanarak jel görselleştirin.
PCR amplicon'ları, üreticinin talimatlarına uygun bir PCR arıtma kiti kullanarak arındırın. 37 santigrat derecede iki saat boyunca gösterge kısıtlama enzimleri ile saflaştırılmış amplikonss sindirin. Sindirilmiş amplicons arındırmak için arıtma adımlarını tekrarlayın.
Buna paralel olarak, aynı zamanda plazmid omurgasını sindirmek. Sindirilmiş plazmid omurgasını %0,8 düşük monte agarose jel üzerinde analiz edin. Jeli 40 miliamperden daha yüksek bir akımda çalıştırmayın.
Uzun dalga UV ışığı kullanarak DNA parçalarını görselleştirin ve temiz bir neşter kullanarak bükülmüş omurgayı kesin. DNA hasarlarını önlemek için uzun UV ışınlarına maruz kalma sürelerinden kaçının. Yeni bir 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüp içine flomel jel parçası parçası için Çit.
Jel parçayı eritmek ve her iki dakikada bir nazik girdap ile karıştırmak için düşük modda agarose parçasını 10 dakika boyunca 65 santigrat derecede ısıtın. Erimiş jel doğrudan ligasyon için kullanılabilir. Ligate omurga ve sindirilmiş amplicon t4 DNA ligaz kullanarak gecede 16 santigrat derece.
Standart klonlama işleminden sonra plazma DNA'sını izole edin. Pozitif klonları kontrol etmek ve % 1 agarose jel üzerinde sindirilmiş parçaları görselleştirmek için restriksiyon enzim sindirim gerçekleştirin. Tohum 100, 000 HEK293T hücreleri 12 kuyu plaka sıc24 saat önce transfeksiyon ve kuluçka gece leme 37 santigrat derece, transfeksiyon sırasında aktif çoğalma korumak.
Hücreler transfeksiyonda yaklaşık %80 birleşme de olmalıdır. Steril tüpe 250 mikrolitre azaltılmış serum media yerleştirin ve bildirilen her plazma DNA'sının bir mikrogramını ekleyin ve pipetleme ile hafifçe karıştırın. DNA karışımına transfeksiyon reaktifinin üç mikrolitresini ekleyin ve pipetleme yaparak hafifçe karıştırın ve 22 santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın.
Karışımı ekleyin, damla-bilge kuyuya ve yavaşça kuyuya dağıtmak. Dört saat sonra, test maddeleri ve çözücü kontrolü içeren taze orta ile supernatant değiştirin. Bu örnekte, mTOR inhibitörleri INK-128 ve rapamisin kullanılmıştır.
Analiz ene kadar 37 derecede kuluçkaya yat. Floresan mikroskobu altında kırmızı ve yeşil floresan için hücreleri kontrol edin. Kırmızı ve yeşil floresan sisi erken ve geç BK-poliomavirüs gen ekspresyonuna tekabül eder.
Transfeksiyondan 72 saat sonra, supernatant'ı dikkatlice arzula. Bir mililitre soğuk PBS ile hücreleri iki kez yıkayın. Yavaşça 500 mikrolitre trypsin ekleyin ve hücrelerin erken ayrılmasını önlemek için biraz plaka açın.
Bu adım hücre doublets önlemek için önemlidir. Ekolarak, tripsin doğrudan aynı pipet ucu ile kaldırılır. Hücreleri en az beş dakika 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Tripsin S hücrelerini %3 FCS içeren bir mililitre PBS içeren yeniden askıya alın ve önceden etiketlenmiş FACS tüplerde süspansiyonu aktarın. FACS analizinden önce mililitre başına bir mikrogram konsantrasyonunda DAPI ekleyin. Akış sitometrekullanarak hücreleri analiz edin.
Her örnek için en az 10.000 canlı hücreyi ölçün. Doğru sonuçlar elde etmek için kırmızı ve yeşil sinyalleri ayırt etmek için ilk tazminat esastır. Kodlama olmayan kontrol naibi, klonlama için kısıtlama alanlarını barındıran iç astar çifti kullanılarak iç içe açılan bir PCR protokolü kullanılarak güçlendirilmiştir.
Amplikon doğrulama agarose jel elektroforezi ile gerçekleştirilirken, arketipik NCCR dizilerinden elde edilen amplikonslar jeldeki homojen boyut dağılımında, yeniden düzenlenmiş NCCR'lardan elde edilenler ise boyutları farklıydı. NCCR içeren pozitif klonların seçimi kısıtlama analizi ile doğrulandı. Küçük spacer bölge pozitif klonlar gösteren büyük NCCR parçaları ile değiştirildi.
Doğrulanmış klonlardan izole edilen plazmid DNA'sı pyrosequencing için gönderildi. Bu örnekte, P bloğundaki silme ve O bloğundaki ikame algılandı. HEK293T hücreleri rapor edilebilir yapıya saygı ile geçici olarak transekse edildi ve NCCR aktivitesi floresan mikroskopisi ile izlendi.
Kırmızı ve yeşil floresanlar sırasıyla erken ve geç BK-poliomavirüs gen ekspresyonuna karşılık gelmektedir. İkinci örnek nispeten güçlü bir erken ama orta geç gen ekspresyonu varken ilk NCCR güçlü bir geç gen ekspresyonu gösterdi. DAPI negatif hücreleri geçitli ve tdTomato karşı eGFP gösteren bir nokta arsa oluşturuldu.
Analize negatif olduğu kadar tdTomato veya eGFP pozitif olan numuneler de analize dahil edildi. Ortalama floresan yoğunlukları her test klon elde edildi. Bu örnekte, çift mTOR inhibitörü INK128 ile yapılan tedavi tdTomato MFI'yi önemli ölçüde azaltmıştır, bu da erken ekspresyonun inhibe edildiği anlamına gelir.
Bu yöntem transkripsiyonel aktivite yoluyla BK-poliomavirüs tespit etmek için şu anda kullanılan ve diğer bileşiklerin belirlenmesine olanak sağlar. Erken gen ekspresyonunda, bu kesinlikle viral ima belirler. İnhibitör damlaları BK-poliomavirüs reaktivasyonu durumunda immünazasyonlu hastalar için ajan olarak kullanılabilir.
