Bu eser Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve teknoloji, Japonya (KAKENHI) K.H. (#15 K 01691) için Y.F. (#15 K 08625), K.Y. (#26461532) ve bir hibe Bakanlığı inatçı hastalığı projeden incelenmesi için bir araştırma hibe tarafından desteklenmiştir Sağlık, iş gücü ve refahı (K.Y. #201510032A). Edanz grubu (www.edanzediting.com/ac) bu yazının taslağını düzenleme için teşekkür ediyoruz.

Kullanmadan önce ilgili tüm malzeme güvenlik bilgi formları (MSDS) başvurun. Örnek bulaşma deri kaynaklı SM tarafından en aza indirmek için eldiven giymek. HeLa hücreleri % 10 fetal sığır serum ile (FBS), 2 mM Ltamamlanan kartal'ın en az gerekli ortamda yetiştirilen mevcut iletişim kuralı uygulandığı-glutamin, 1000 U/L penisilin ve 100 mg/L streptomisin.
1. hazırlanması Lipid örnekleri
Not: Test tüpleri Teflon kaplı vidalı kapakları dahil olmak üzere tüm cam ürünleri deterjan-Alerjik olması önemlidir.
<ol><li>Toplam lipid kesir çekme--dan Bligh & Dyer yöntem7 kullanarak hücre homogenate<ol>
<li>Kültür kaldırma (veya şartına) medya 10 cm doku kültürü çanak ve durulama buz gibi PBS 6 mL ile iki kez.</li>
		<li>Buz gibi PBS 1 mL P1000 pipet tarafından 10 cm doku kültürü çanak içine ekleyin. Hücreleri hücre Kazıma aletleri ile hasat ve 2.0 mL silikonlu plastik tüpler içine toplamak.</li>
		<li>(1000 × g, 5 dk, 4 ° C) aralıklarla sonra süpernatant P1000 pipet tarafından kaldırın.</li>
		<li>1 mL metanol ekleyin. Kısaca tüpler ve 200 W 5 dakika içinde banyo tipi sonicator için solüsyon içeren temizleyicide. Not: hücre Pelet verimli bir şekilde homojen bir banyo tipi sonicator su seviyesi ayarlayın.</li>
		<li>Metanol içinde hücre homogenate pipet tarafından test tüpleri (13 mm x 100 mm) Teflon kaplı vidalı kapağı içine aktarın.</li>
		<li>1 mL metanol, kloroform, Çift Kişilik distile su 0.8 mL ve 50 µL 10 µmol/L iç standart d18:1 /(D31)-16, 1 mL ekleyin: 0 SM her tüp içine.</li>
		<li>Girdap test tüpleri şiddetle oda sıcaklığında 5 min için. Not: Bu noktada, bir tek fazlı (kloroform/metanol/su 1/2/0.8 (v/v/v) =) oluşur.</li>
		<li>1 mL kloroform ve 1.0 mL Çift Kişilik distile su ekleyin.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 5 min için 2500 devirde şiddetle girdap tüpler. Not: Bu noktada, sulu (üst) faz ve organik (alt) faz ayrılır.</li>
		<li>(Dan 2,150 × g, 5 dk, 25 ° C) aralıklarla sonra toplamak ve daha düşük faz tek kullanımlık cam tüpler (ilk alt aşaması) içine aktarın. Not: Pasteur pipet ve bir emanet pipet filtresi kullanarak alt aşaması toplamak. Pipet ucu alt aşama Ekle, üst aşaması ve pipet ucu içinde interfacial kabartmak sunmak için 'E' Vana yanındaki küçük ampul sıkmak ve pipet daha düşük faz sifon.</li>
		<li>Kloroform test tüpleri ve girdap içine 2 mL tüpler yeterince üst aşaması ve interfacial kabartmak ile karışımı oda sıcaklığında 5 min için 2500 devirde şiddetle ekleyin.</li>
		<li>(Dan 2,150 × g, 5 dk, 25 ° C) aralıklarla sonra toplamak ve değiştirilen düşük faz adım 1.1.10 açıklandığı gibi ilk alt aşaması ile tek kullanımlık cam tüplerin içine aktarın.</li>
		<li>Cam tüpler bir azot akış altında yerleştirin ve organik çözücüler toplanan alt aşamasında tamamen kaldırmak.</li>
		<li>Örnekleri sulandırmak 500 µL etanol ve metanol ile filtrate ile 0,02-µm filtre ve mağaza-20 ° C'de cam şişe içinde</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kalibrasyon eğrisi oluşturma ve doğrulama yöntemi için numune hazırlama<ol>
<li>0.1, 0.5, 1, 5, 10 veya standart bileşik 50 µmol/L, 50 µL ekleyin (d18:1 /(D9)-18:1 SM) test tüpleri Teflon kaplı vidalı kapağı içine.</li>
		<li>Hücre homogenate her test tüpüne ekleyin ve 1 mL metanol ekleyin. Not: Cep homogenate bir matris olarak her deney göre değişebilir. 10 cm kültür tabağına hücrelerden türetilmiş örneklerinde SM tür düzenli olarak analiz edilir, hücre homogenate her test tüpü içinde miktarı bu hücre 10 cm kültür tabağına yakın olması gerekir.</li>
		<li>Toplam lipid kesir adımları 1.1.6-1.1.14 içinde açıklandığı gibi ayıklayın.</li>
		<li>Kalite kontrol (QC) örnekleri gibi adımları 1.2.1-1.2.3 descried yöntemi doğrulamak için hazır olun. Üç QC örnek standart bileşik farklı konsantrasyonları ile hazırlamak (d18:1 /(D9)-18:1 SM): bir 3 x (QC düşük, QC-L), Merkezi yakın bir standart eğri alt sınır içinde (QC-orta, QC-M) ve üst sınırına yakın bir Standart eğri (QC-yüksek, QC-H).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. SM analiz LC-ESI-MS/MS tarafından
<ol><li>Mobil faz hazırlanması<ol>
<li>Solvent karışımı (Asetonitril/metanol/GKD2O sulu faz ve isopropanol için organik faz için = 1/2/2 (v/v/v)) içinde cam şişe Teflon kaplı vidalı kapakları ve 5 dakika içinde banyo tipi sonicator için solüsyon içeren temizleyicide.</li>
		<li>Formik asit (son konsantrasyonu 26,4 mmol/L) ve NH4OH ekleyin (14,9 mmol/L) her mobil faz içine.</li>
	</ol></li>
	<li>LC-ESI-MS3 SM kalitatif analiz<ol>
<li>Yüksek performanslı sıvı Kromatografi (HPLC) sistemi etkinleştirmek, giriş tüpler mobil aşamalarını içeren cam şişe koymak ve HPLC satırları temizle. HPLC sistemi bir C18 HPLC sütun (1.5 mm kimlik × 100 mm Uzunluk, parçacık boyutu 3.0 µm) bağlantı, sıcaklığı 50 ° C sütun fırında tutmak ve sütun ile 100 µL/dak örnekleri autosampl bir örnek rafa koymak, sulu mobil faz durumu er.</li>
		<li>Triple quadrupole ve birinci ve ikinci habercisi yanı sıra Tablo 1 ve Tablo 2 iyonları ilgi SM türlerin listelendiği gibi MS3 analizi için quadrupole doğrusal iyon kapanı kütle spektrometresi sistemi parametrelerini ayarlamak.<ol>
<li>Veri toplama yazılımı simgesini çift tıklatın, çift tıklayın 'Donanım yapılandırma', 'LC + QTRAP4500 + Vana' seçin ve 'Profil' etkinleştir'i tıklatın.</li>
			<li>'Yeni alt projesi' ve 'Tamam' ı tıklatarak yeni bir alt klasör oluşturun.</li>
			<li>'Dosya' sekmesini tıklatın, seçme 'Yeni' ve 'Edinme yöntem' ve 'Tamam' seçin. 'Kitle Spec' simgesi ve 'MS' sekmesini seçin tarama türü 'MS/MS/MS (MS3)' tıklatın, oranı 10.000 Da/s, 'Negatif' olarak polarite ve sürekli olarak ' süre' analiz (dk) olmak inceden inceye gözden geçirmek. M/z 'Start (Da)' ve 'Dur (Da)' taranacak aralığı ayarlayın. SM tür ilgi hedefinin 1 ve 2 habercisi iyonların m/z ayarlayın. Not: birden fazla SM tür analiz için vurgulamak '-MS3' simgesi, sağ tıklatın, 'Bu deney Kopyala' seçin ve daha sonra diğer SM türlerin 1. ve 2 habercisi iyonların m/z koyun.</li>
			<li>'Gelişmiş MS' sekmesini seçin ve her parametre aşağıdaki gibi ayarlayın: tarama modu 'Profil', adım boyu 0,12 (Da), çözünürlük Q1 ve Q3 olarak olarak sırasıyla seçme yoğunluğu eşik 0, ayar süresi 50 (ms), 1,5 ms olarak kitle aralıkları arasında duraklama olarak 'Birimi' ve 'Edebiyat', ' dinamik doldurmak saat ', Q3 giriş engel olarak 8 V ve uyarma zamanı 25 ms olarak.</li>
			<li>'Bayan' sekmesinde 'Parametreleri Düzenle' düğmesini tıklayın ve select 'kaynak/gaz' sekmesini perde gaz, çarpışma gaz, ionspray gerilim, sıcaklık, İyon kaynağı gas1 ve Tablo 1' de listelenen gibi gas2 parametrelerini ayarlamak. Sonra select 'Bileşik' sekmesini declustering potansiyeli, giriş potansiyeli, çarpışma enerji, uyarma enerji ve Tablo 2' de listelenen yayılmış çarpışma enerji parametrelerini ayarlamak.</li>
			<li>'Entegre Valco Vana' vurgulayın ve 'Pozisyon adı için adım 0' A olarak seçin ve 'B' olarak pozisyon için toplam 5.0 dk zaman. Ayrıca pozisyon için toplam olarak 'A' ayarla 70.0 dk zaman.</li>
			<li>'Shimadzu LC sistemi' vurgulayın. 'Pompa' sekmesini seçin ve pompalama modunu ayarlayın ikili akış, 0,28 mL/dk ve en fazla baskı limitler 20,0 MPa olarak olarak toplam akış olarak. 'Otomatik Örnekleyici' sekmesini seçin ve durulama 200 µL ayarlamak, 35 µL/s hızda durulama, örnekleme hızı 5.0 µL/s olarak kontur olarak 52 mm, iğne, 25,0 min zamanda tasfiye, 'Önce ve sonra aspirasyon' olarak 5 s ve durulama modu olarak dip zamanı durulayın.<ol>
<li>Ayrıca, soğutucu birimi etkinleştirmek, soğutucu sıcaklık 4 ° C ayarlayın ve denetim şişe iğne kontur 52 mm. seçtiğinizde 'Fırın' sekmesinde, fırın etkinleştirmek ve fırın sıcaklık ve en yüksek sıcaklığı 50 ° C ile 85 ° C anılan sıraya göre ayarla.</li>
				<li>'Denetleyicisi' sekmesini seçin ve 'Güç' kutuyu işaretleyin. 'Zaman programı' sekmesini seçin ve solvent degradeleri aşağıdaki gibi ayarlayın: çözücüler A / B 100/0 oranında 5 min için 80/20 için doğrusal değişiklik program üzerinde 4 dk 35/65 üzerinde 50 dk ve 25/75 için 1 dk. sonra , 25/75 10 dk sonra doğrusal olarak 100/0 tutunuz 4 dak. Sonra yöntem kaydedin.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Toplu iş dosyası oluşturun<ol>
<li>'Satın alma toplu yapı' simgesini çift tıklatın, 'Set Ekle','ı tıklatın 'Örnekleri' eklemek, yeni örnekleri ayarlamak ve 'Tamam' ı tıklatın.</li>
			<li>' Yöntemi Düzenleyicisi ' düğmesini tıklatın ve kullanılacak yöntemi seçin. Bir toplu iş dosyasında birden çok yöntemi kullanılırsa, 'Birden fazla yöntemleri kullan' kutuyu işaretleyin ve her örnek için edinme yöntemini seçin. ' Örnek yeniden adlandırın ', 'Şişe konumunu' uygun bir sayı belirleyin ve enjeksiyon Birim miktar koymak. Ardından toplu iş dosyasını kaydedin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>MS3 ürün iyon spectra ilgi SM türlerin LC-ESI-MS3 analizi tarafından elde.<ol>
<li>Toplu iş dosyasında 'Gönder' sekmesini seçin, örnekleri analiz satırı vurgulayın ve 'Gönder' düğmesini tıklatın.</li>
			<li>Tıklatın "View Quene' simgesini, 'Equilibrate' simgesi, kullanılması, saat 1 dk. ayarla ve 'Tamam' ı tıklatın için satın alma yöntemi seçin.</li>
			<li>'İnce ayarlar için rezerv araç' karşılık gelen simgeyi tıklatarak devre dışı bırakın. Sonra toplu sırayı "Basit Başlat" simgesini tıklatarak yürütmek.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Her MS3 ürün iyon spectra SM oranı (m/z) çarpımı iyon spectra şarj etmek için kitle ve sphingoid tam kitle karşılaştırarak atamak LCB ve N-asil yan ilgi. Karbonlar ve çift sayı Tahvil sphingoid LCB ve Nbelirlemek-ilgili ürün iyonları göre asil yan.<ol>
<li>Uygun alt proje klasörün işaretlendiğinden emin olun, 'Açık veri dosyası' simgesini çift tıklatın ve analiz edilecek örnekleri seçin. Zirve Kromatografik her hedef SM türler için sürükleyin ve sonra çift tıklatın. Elde edilen MS3 ürün iyon spectra sürüklenen alanı içinde sunulacak.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Kantitatif analiz LC-ESI-MS/MS tarafından SM<ol>
<li>Mobil aşamaları ve HPLC sütun 2.1 ve 2.2.1. adımda açıklandığı gibi ayarlayın.</li>
		<li>Triple quadrupole ve quadrupole doğrusal iyon kapanı kütle spektrometresi sistem izleme (MRM) çözümlemesi Tablo 1 ve Tablo 2içinde listelendiği gibi birden çok tepki için parametrelerini ayarlamak.<ol>
<li>2.2.2.1 ve 2.2.2.2. adımda açıklandığı gibi ve prosedürlerini yürütecektir.</li>
			<li>'Dosya' sekmesini tıklatın, seçme 'Yeni' ve 'Edinme yöntem' ve 'Tamam' seçin. 'Kitle Spec' simgesi ve 'MS' sekmesini seçin tarama türü 'MRM', 'Pozitif' olarak polarite'yi seçin. 'Süre' çözümlenmesi için tüm zaman olarak ayarlayın. [M + H]+ m/z ve 184 'Q1 kitle (Da)' ve 'Q3 kitle (Da)' hedef SM tür ilgi anılan sıraya göre ayarlayın. 'Zaman' 10 ms ve hedef SM tür adı olarak ' ID' olarak ayarlayın.</li>
			<li>'Gelişmiş MS' sekmesini seçin ve her parametre aşağıdaki gibi ayarlayın: çözünürlük Q1 her ikisini ve Q3 'Birimi', yoğunluk eşik 0, olarak olarak saat (ms) 0 ayarlanması ve duraklatma 5 ms olarak kitle aralıkları arasında.</li>
			<li>'Bayan' sekmesinde 'Parametreleri Düzenle' düğmesini tıklatın ve parametre perde gaz, çarpışma gaz, ionspray gerilim, sıcaklık, İyon kaynağı gas1 ve Tablo 1' de listelenen gibi gas2 koymak ' Kaynak/gaz' sekmesini seçin. Sonra potansiyeli, giriş potansiyeli, çarpışma enerji ve Tablo 2' de listelenen çarpışma hücre çıkış potansiyel declustering parametreleri koymak 'Bileşik' sekmesini seçin.</li>
			<li>Vana 2.2.2.6 adımda açıklandığı gibi ayarlayın.</li>
			<li>LC koşulu 2.2.2.7. adımda açıklandığı gibi ayarlayın. Sonra yöntem kaydedin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>2.2.3. adımda açıklandığı gibi toplu iş dosyası oluşturun.</li>
		<li>2.2.4. adımda açıklandığı gibi LC-ESI-MS/MS analizi tarafından her SM türlerin MRM verileri alır.</li>
		<li>Veri tümleştirmesi için yazılım kullanarak MRM verileri işlemek ve ayıklanan iyon Kromatografik her SM türler için en yüksek alan verileri elde etmek.<ol>
<li>Veri tümleştirmesi kantitatif analiz yazılımı simgesini çift tıklatın, 'Düzenle' sekmesini tıklatın ve Tümleştirme Kullanıcı Varsayılanlarını seçin. Gauss pürüzsüz genişlik 1,0 punto ayarlayın ve 'Tamam' ı tıklatın. 'Düzenle' sekmesini tıklatın ve 'Yeni sonuçları tablo' seçin. Entegre edilebilir, bir ok düğmesini tıklatın ve 'İleri' düğmesini tıklatın örnek seçin. 'Yeni yöntem Oluştur' seçin, yöntemin adını ayarla ve 'İleri' yi tıklatın. 'İleri' düğmesini tıklatın ve d18:1 /(D31)-16 kutuyu işaretleyin: 0 SM olduğu gibi 'İleri' düğmesini tıklatın ve '' Son'u tıklatın.</li>
			<li>'Tepe inceleme görüntüler' tıklatın ve Kromatografik doruklarına uygun şekilde tanındığını onaylayın. Bu unutulmamalıdır bu d18:1 /(D31)-16 tutma zamanı: SM tarafından genellikle daha küçük 0 ~ 34-1 SM biri ile karşılaştırıldığında 0.3 min (genellikle oluşur d18:1 / 16:0 SM).</li>
		</ol>
</li>
		<li>D18:1 /(D31)-16 her SM türlere zirvesine her SM tür oranı göre ölçmek: 0 SM iç standart.<ol>
<li>'Dosya' sekmesini tıklatın, 'Ver' seçin, 'Sonuçları tablo' seçin, Biçim 'MultiQuant', 'tüm sütunları vermek gibi' sütun onaylamak, satır olarak 'Bu açıkça gizli dışında tüm satırları Aktar' ve 'Tamam' tıklatın.</li>
			<li>Dışa aktarılan dosyayı Excel yazılımında açın. SM tür hedef alan IS alanına göre normalize (d18:1 /(D31)-16:0 SM). Sonra hedef eklenen örnek SM türler miktarını hesaplamak için IS enjekte örnek teorik miktarıyla çarpın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Standart eğri oluşturmak yoluyla<ol>
<li>D18:1 /(D9)-18 MRM veri elde edilir: 1 SM ve d18:1 /(D31)-16:0 SM örneklerde standart eğri LC-ESI-MS/MS analizi tarafından adım 2.3.1-2.3.4 içinde açıklandığı gibi oluşturmak için.</li>
		<li>D18:1 /(D9)-18 pik alanının veri elde edilir: 1 SM ve d18:1 /(D31)-16:0 2.3.5. adımda açıklandığı gibi SM.</li>
		<li>D18:1 /(D9)-18, miktarı: 1 SM açıklandığı adım 2.3.6 olarak eklenen örnek.</li>
		<li>/(D9)-18 x ekseni ve y ekseni nominal tutar ve d18:1 hesaplanan miktarı ayarlayarak eğilim çizgisini oluşturmak: 1 SM ve eğilim çizgisi formül elde edilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Nicel yöntemi Excel yazılımı kullanarak doğrulama<ol>
<li>Yöntem doğrulamak için d18:1 /(D9)-18 miktarını ölçmek: 1 SM ve d18:1 /(D31)-16:0 QC SM örnekleri her QC analiz ederek örnek en az üç kez 1 günde ve adım 2.3.1-2.3.4 içinde açıklandığı gibi en az 3 gün tekrarlayın.</li>
		<li>En yüksek alan verileri elde etmek ve d18:1 /(D9)-18, miktarı: 1 SM açıklandığı adım 2.3.5 ve 2.3.6 olarak eklenen örnek.</li>
		<li>Kalibrasyon eğrisi elde göre d18:1 /(D9)-18 miktarını hesaplamak: 1 SM enjekte örnek.</li>
		<li>Hassas değerlendirilmesi<ol>
<li>Ortalama ve standart sapma d18:1 /(D9)-18 miktarını hesaplamak: 1 SM içi günün veri kümesinde 2.5.3. adımda elde edilen ve arası gün Excel yazılımı kullanarak.</li>
			<li>2.5.4.1 adımda elde ortalama standart sapma tarafından bölünmüş ve % ifade.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Doğruluk değerlendirilmesi<ol>
<li>Her veri doğruluğunu aşağıdaki gibi hesaplar: [(2.5.3. adımda elde hesaplanan tutar.) / (Nominal tutar) - 1] × 100(%)</li>
			<li>Veri kümesi içi günlük ve arası gün üzerinde doğruluk mutlak değerini ortalamasını hesaplamak.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Huitema, K., van den Dikkenberg, J., Brouwers, J. F., Holthuis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+family+of+animal+sphingomyelin+synthases.">Identification of a family of animal sphingomyelin synthases.</a> EMBO J. 23 (1), 33-44 (2004).</li><li>Kihara, Y., Mizuno, H., Chun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophospholipid+receptors+in+drug+discovery.">Lysophospholipid receptors in drug discovery.</a> Exp Cell Res. 333 (2), 171-177 (2015).</li><li>Kihara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+degradation+pathways,+functions,+and+pathology+of+ceramides+and+epidermal+acylceramides.">Synthesis and degradation pathways, functions, and pathology of ceramides and epidermal acylceramides.</a> Prog Lipid Res. 63, 50-69 (2016).</li><li>Merrill, A. H., Sullards, M. C., Allegood, J. C., Kelly, S., Wang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipidomics:+high-throughput,+structure-specific,+and+quantitative+analysis+of+sphingolipids+by+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry.">Sphingolipidomics: high-throughput, structure-specific, and quantitative analysis of sphingolipids by liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Methods. 36 (2), 207-224 (2005).</li><li>Houjou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+selective+identification+of+molecular+species+in+phosphatidylcholine+and+sphingomyelin+by+conditional+neutral+loss+scanning+and+MS3.">Rapid and selective identification of molecular species in phosphatidylcholine and sphingomyelin by conditional neutral loss scanning and MS3.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 18 (24), 3123-3130 (2004).</li><li>Hama, K., Fujiwara, Y., Tabata, H., Takahashi, H., Yokoyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Quantitation+Using+Two+Stable+Isotopically+Labeled+Species+and+Direct+Detection+of+N-Acyl+Moiety+of+Sphingomyelin.">Comprehensive Quantitation Using Two Stable Isotopically Labeled Species and Direct Detection of N-Acyl Moiety of Sphingomyelin.</a> Lipids. , (2017).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification.">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).</li><li>Gu, H., Liu, G., Wang, J., Aubry, A. F., Arnold, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+the+correct+weighting+factors+for+linear+and+quadratic+calibration+curves+with+least-squares+regression+algorithm+in+bioanalytical+LC-MS/MS+assays+and+impacts+of+using+incorrect+weighting+factors+on+curve+stability,+data+quality,+and+assay+performance.">Selecting the correct weighting factors for linear and quadratic calibration curves with least-squares regression algorithm in bioanalytical LC-MS/MS assays and impacts of using incorrect weighting factors on curve stability, data quality, and assay performance.</a> Anal Chem. 86 (18), 8959-8966 (2014).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> J Biol Chem. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Thomas, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ozone-induced+dissociation:+elucidation+of+double+bond+position+within+mass-selected+lipid+ions.">Ozone-induced dissociation: elucidation of double bond position within mass-selected lipid ions.</a> Anal Chem. 80 (1), 303-311 (2008).</li><li>Baba, T., Campbell, J. L., Le Blanc, J. C., Baker, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+sphingomyelin+characterization+using+electron+impact+excitation+of+ions+from+organics+and+mass+spectrometry.">In-depth sphingomyelin characterization using electron impact excitation of ions from organics and mass spectrometry.</a> J Lipid Res. 57 (5), 858-867 (2016).</li><li>Ryan, E., Nguyen, C. Q. N., Shiea, C., Reid, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+Structural+Characterization+of+Sphingolipids+via+193+nm+Ultraviolet+Photodissociation+and+Ultra+High+Resolution+Tandem+Mass+Spectrometry.">Detailed Structural Characterization of Sphingolipids via 193 nm Ultraviolet Photodissociation and Ultra High Resolution Tandem Mass Spectrometry.</a> J Am Soc Mass Spectrom. , (2017).</li><li>Pham, H. T., Ly, T., Trevitt, A. J., Mitchell, T. W., Blanksby, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+complex+lipid+isomers+by+radical-directed+dissociation+mass+spectrometry.">Differentiation of complex lipid isomers by radical-directed dissociation mass spectrometry.</a> Anal Chem. 84 (17), 7525-7532 (2012).</li></ol>

Yazarlar onlar hiçbir çıkar çatışması var bildirin.

Mevcut nitel yöntemde, biz MS3 ürün iyonları bir SPC ve bir Nelde edilen-asil yan. Düzgün bir SPC ve bir Natamak için önemlidir-asil yan. Bu amaçla, bu diğer phosphorylcholine içeren moleküller de MS3 ürün iyonları tespit edilebilir olması gerekmektedir. Diacyl-phosphatidylcholine (PC) ve plasmalogen-PC bol memeli hücrelerinde varsa ve onların hydrophobicity SM benzemektedir. Bu nedenle, diacyl-PC ve plasmalogen-PC ile bir izotop (genellikle 13C) teorik...

Sphingomyelin (SM) memeli hücrelerinde ortak bir sphingolipid var. Sphingosine-1-fosfat ve bir ceramide bağışıklık içinde çok önemli rolleri olan kaçakçılığı hücre ve bariyer Homeostazı, sırasıyla2deri gibi SM sentezlenmiş intracellularly1 ve diğer organizmalardandır için bir habercisi olarak hediye. 3. Böylece, SM metabolizma kesin analizini organizmalardandır fizyolojik ve patolojik rolleri elucidating için önemlidir.
SM bir ceramide ve daha da bir sphingosine ve bir Noluşan ceramide 1-hidroksi grubuna bağlı bir phosphorylcholine oluşur-asil yan. Sphingosine ve Nkarbon ve çift bağ sayıları içinde a değişiklik-asil yan sonuç sütun sayısı ve ceramide (SM) tür. Son gelişmeler LC-ESI-MS/MS / SM4,5nicel ve nitel analiz sağladı. Kalitatif analiz, karbon sayısı ve çift bağı bir sphingoid SM LCB ürün iyon spectra LCB in atayarak tespit edilmiştir. Ancak, yapısal bilgi N-asil yan doğrudan elde değil onun karşılık gelen ürün iyonları rapor değil çünkü ve bu nedenle N-asil moieties habercisi iyonlar arasındaki fark analizi tarafından sonuca vardım ve Ürün iyonları LCB için her iki pozitif ve negatif iyon modları4,5' te karşılık gelen. Bu raporda, biz ürün iyonları LCB ve Nalgılamak için bir yöntem mevcut-asil yan triple quadrupole ve hassas yapısal kolaylaştırır quadrupole doğrusal iyon kapanı kütle spektrometresi kullanılarak modunda aynı anda MS3 spekülasyon her SM türler6.
Biyolojik örnekler matrisinde neden iyon bastırma (veya geliştirme) etkileri LC-ESI-Bayan analizi doğru miktar engel ve bu nedenle, aynı matris ilgi bütün analitler için kalibrasyon eğriler oluşturmak için arzu edilir biyolojik örneği. Ancak, hemen hemen bütün SM türlerin biyolojik örneklerde, özellikle de kapsamlı bir analiz hazırlamak mümkün olduğundan bu strateji mümkün değil. Böylece, bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak ve biyolojik örneklerde çivili bir temsilcisi SM türler kullanarak sayısal Aralık belirlemek pratiktir. İki isotopically etiketli SM türler bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için kullanılan; bir dahili bir standart diğeri bir standart bileşik kullanıldı. Küçük bir miktar isotopically etiketli SM türlerin biyolojik örnekleri çivili ve başarıyla bir kalibrasyon eğrisi ve nicel aralığı6elde edilen standart bir bileşik tespit ettik.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:737px;" width="738">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">PBS</td>
			<td style="width:131px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">10010023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">100 mm tissue culture dish</td>
			<td style="width:131px;">IWAKI</td>
			<td style="width:119px;">3020-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:131px;">IWAKI</td>
			<td style="width:119px;">9000-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Siliconized 2.0 mL tube</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-681-321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Test tube</td>
			<td style="width:131px;">IWAKI</td>
			<td style="width:119px;">TST SCR 16-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Teflon-lined screw cap</td>
			<td style="width:131px;">IWAKI</td>
			<td style="width:119px;">9998CAP415-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Disposable glass tube</td>
			<td style="width:131px;">IWAKI</td>
			<td style="width:119px;">9832-1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:321px;">CAPCELL PAK C18 ACR 3 &#181;m 1.5 mm I.D. x 100 mm</td>
			<td style="width:131px;">Shiseido</td>
			<td style="width:119px;">92223</td>
			<td>Guard cartridge is inserted into cartridge holder, and linked to C18 column</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:321px;">CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm GUARD CARTRIDGE</td>
			<td style="width:131px;">Shiseido</td>
			<td style="width:119px;">12197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Cartridge holder</td>
			<td style="width:131px;">Shiseido</td>
			<td style="width:119px;">12415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:131px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">018-19853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">2-Propanol (Isopropyl Alcohol)</td>
			<td style="width:131px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">161-09163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Methanol</td>
			<td style="width:131px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">134-14523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Formic acid</td>
			<td style="width:131px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">066-00466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">28% Ammonia water</td>
			<td style="width:131px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">016-03146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Sonicator (bath type)</td>
			<td style="width:131px;">SHARP</td>
			<td style="width:119px;">UT-206H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Vortex mixer for glass test tube</td>
			<td style="width:131px;">TAITEC</td>
			<td style="width:119px;">Mix-EVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">1.4 mL glass vial</td>
			<td style="width:131px;">Tomsic</td>
			<td style="width:119px;">500-1982</td>
			<td>Samples are stored in 1.4 mL glass vial sealed with screw cap and 8 mm septum at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">8 mm septum</td>
			<td style="width:131px;">Tomsic</td>
			<td style="width:119px;">200-3322</td>
			<td>When samples are analyzed, screw caps are replaced with screw caps with slit septum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Screw cap for 1.4 mm glass vial</td>
			<td style="width:131px;">Tomsic</td>
			<td style="width:119px;">500-2762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Screw cap with slit septum</td>
			<td style="width:131px;">Shimadzu GLC</td>
			<td style="width:119px;">GLCTV-803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">PVDF 0.22 &#181;m filter</td>
			<td style="width:131px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLGVR04NL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:321px;">Triple quadrupole and quadrupole linear ion trap mass spectrometry</td>
			<td style="width:131px;">SCIEX</td>
			<td style="width:119px;">QTRAP4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:321px;">The software for data acquisition and analysis of product ion spectra</td>
			<td style="width:131px;">SCIEX</td>
			<td style="width:119px;">Analyst</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:321px;">The software for data integration in quantitative analysis</td>
			<td style="width:131px;">SCIEX</td>
			<td style="width:119px;">MultiQuant</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">HPLC system</td>
			<td style="width:131px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:119px;">Nexera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Glass bottle</td>
			<td style="width:131px;">Sansyo</td>
			<td style="width:119px;">85-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">d18:1/24:0 sphingomyelin</td>
			<td style="width:131px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">860592P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Sphingosylphosphorylcholine</td>
			<td style="width:131px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">567735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:131px;">ThermoFisher&#160;</td>
			<td style="width:119px;">26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:131px;">ThermoFisher&#160;</td>
			<td style="width:119px;">25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Penicillin and streptomycin</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eagle&#8217;s minimum essential medium</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M4655</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative and qualitative method for sphingomyelin by lc-ms using two stable isotopically labeled sphingomyelin species

Biz sphingomyelin (SM) niteliksel çözümleme ve kantitatif sıvı Kromatografi-electrospray iyonlaşma-tandem kütle spektrometresi (LC-ESI-MS/MS) tarafından bir yöntem mevcut. SM bir phosphorylcholine ve bir ceramide hidrofilik ve hidrofobik bileşeni olarak sırasıyla oluşan bir ortak sphingolipid var. SM türlerinin sayısı sphingoid uzun zincirli temel (LCB) içinde a değişiklik nedeniyle memeli hücreleri mevcut ve bir N-asil yan ceramide içinde. Bu raporda, biz karbon ve çift bağı bir LCB ve bir Nsayısı tahmin etme yöntemi gösterir-asil yan onların karşılık gelen ürün iyonları MS/MS/MS (MS3) deneylerde dayalı. Buna ek olarak, biz bir kantitatif analiz yöntemi SM için SM Nefelometri içinde kullanılan aralığını belirleme kolaylaştıran iki kararlı isotopically etiketli SM türler, kullanarak mevcut. Mevcut yöntemi SM tür biyolojik örnekler ve kozmetik gibi endüstriyel ürünlerin çeşitli karakterize faydalı olacaktır.

Kimyasal sentez d18:1 / 24:0 SM (şekil 1A) ve d18:1 / 24:0 SM lipid örneklerinde HeLa hücreleri (şekil 1B) elde analiz LC-ESI-MS3 [M + HCOO]- istihdam ve [M-CH3] tarafından- birinci ve ikinci habercisi iyonları, olarak anılan sıraya göre. Demethylated-sphingosylphosphorylcholine (SPC) (m/z 449) spektrum yoğunluğunu SM Ndaha ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species at JoVE.com

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

Sphingomyelin türler Sphingomyelin LC-MS iki kararlı Isotopically kullanarak tarafından için nicel ve nitel yöntemi etiketli

Burada, bir protokol ölçmek ve birden çok tepki izleme kullanarak her sphingomyelin tür hak ve MS/MS/MS modu, sırasıyla mevcut.

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

quantitative-qualitative-method-for-sphingomyelin-lc-ms-using-two

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.7K Görüntüleme.  Teikyo University. Burada, bir protokol ölçmek ve birden çok tepki izleme kullanarak her sphingomyelin tür hak ve MS/MS/MS modu, sırasıyla mevcut.

Video: Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as industrial materials. Gene expression profiles are powerful tools for investigating metabolic regulation in plant cells. Therefore, detailed, accurate gene expression profiles during seed development are required for crop breeding. Acquiring highly purified RNA is essential for producing these profiles. Efficient methods are needed to isolate highly purified RNA from seeds. Here, we describe a method for isolating RNA from seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method enables highly purified RNA to be obtained from seeds without the use of phenol, chloroform, or additional processes for RNA purification. This method is applicable to Arabidopsis, rapeseed, and soybean seeds. Our method will be useful for monitoring the expression patterns of low level transcripts in developing and mature seeds.

We have succeeded in establishing a method for RNA isolation from plant seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method is suitable for monitoring the expression of genes with low level transcripts in seeds.

Kantitatif Transkriptom analizinde kullanım için tohumlar yüksek oranda saf RNA&#39;nın izolasyonu için etkili bir yöntem

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Biyokimya

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. Moreover, even cultures of a single cell type may contain cells in distinct metabolic states, such as resting or cycling cells. Methods for measuring metabolic activities of such subpopulations are valuable tools for understanding cellular metabolism. Complex cell populations are most commonly separated using a cell sorter, and subpopulations isolated by this method can be analyzed by metabolomics methods. However, a problem with this approach is that the cell sorting procedure subjects cells to stresses that may distort their metabolism.
To overcome these issues, we reasoned that the mass isotopomer distributions (MIDs) of metabolites from cells cultured with stable isotope-labeled nutrients are likely to be more stable than absolute metabolite concentrations, because MIDs are formed over longer time scales and should be less affected by short-term exposure to cell sorting conditions. Here, we describe a method based on this principle, combining cell sorting with liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS). The procedure involves analyzing three types of samples: (1) metabolite extracts obtained directly from the complex population; (2) extracts of "mock sorted" cells passed through the cell sorter instrument without gating any specific population; and (3) extracts of the actual sorted populations. The mock sorted cells are compared against direct extraction to verify that MIDs are indeed not altered by the cell sorting procedure itself, prior to analyzing the actual sorted populations. We show example results from HeLa cells sorted according to cell cycle phase, revealing changes in nucleotide metabolism.

This article describes a method for studying cellular metabolism in complex communities of multiple cell types, using a combination of stable isotope tracing, cell sorting to isolate specific cell types, and mass spectrometry.

Kararlı İzotop izlemeyi kullanma Kompleks Hücre Toplulukları Sıralama alt popülasyonlar Metabolizma Ölçme Bir Yöntem

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in regulating transcription. These include the direct interaction with transcription factors, the covalent modification of histones and other proteins, and the occasional chromatin conformation alteration. Accordingly, establishing relatively quick methods for identifying proteins that interact within this network is crucial to enhancing our understanding of the underlying regulatory mechanisms. LC-MS/MS-mediated protein binding partner identification is a validated technique used to analyze protein-protein interactions. By immunoprecipitating a previously-identified member of a protein complex with an antibody (occasionally with an antibody for a tagged protein), it is possible to identify its unknown protein interactions via mass spectrometry analysis. Here, we present a method of protein preparation for the LC-MS/MS-mediated high-throughput identification of protein interactions involving nuclear cofactors and their binding partners. This method allows for a better understanding of the transcriptional regulatory mechanisms of the targeted nuclear factors.

We have established a method for the purification of coregulatory interaction proteins using the LC-MS/MS system.

LC-MS / MS Analizi Nükleer kofaktör ile etkileşimde proteinlerin yüksek verimli belirlenmesi için bir protein Hazırlama Yöntemi

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis can be characterized using an in vitro DNA synthesis assay followed by polyacrylamide gel electrophoresis. The goal of this assay is to quantify synthesis of both natural DNA and modified DNA (M-DNA). These approaches are particularly useful for resolving oligonucleotides with single nucleotide resolution, enabling observation of individual steps during enzymatic oligonucleotide synthesis. These methods have been applied to the evaluation of an array of biochemical and biophysical properties such as the measurement of steady-state rate constants of individual steps of DNA synthesis, the error rate of DNA synthesis, and DNA binding affinity. By using modified components including, but not limited to, modified nucleoside triphosphates (NTP), M-DNA, and/or mutant DNA polymerases, the relative utility of substrate-DNA polymerase pairs can be effectively evaluated. Here, we detail the assay itself, including the changes that must be made to accommodate nontraditional primer DNA labeling strategies such as near-infrared fluorescently labeled DNA. Additionally, we have detailed crucial technical steps for acrylamide gel pouring and running, which can often be technically challenging.

This protocol describes the characterization of DNA polymerase synthesis of modified DNA through observation of changes to near-infrared fluorescently labeled DNA using gel electrophoresis and gel imaging. Acrylamide gels are used for high resolution imaging of the separation of short nucleic acids, which migrate at different rates depending on size.

DNA polimeraz etkinliği tahlil Akrilamid Jel Elektroforez tarafından görüntülenmiştir yakın kızılötesi floresan etiketli DNA'yı kullanarak

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides an alternative strategy, capillary isoelectric focusing (cIEF), with many advantages compared to conventional immunoblotting. This is an antibody-based, automated, rapid, and quantitative method in which a complete western blotting procedure takes place inside an ultrathin capillary. This technique does not require a gel to transfer to a membrane, stripping of blots, or x-ray films, which are typically required for conventional immunoblotting. Here, proteins are separated according to their charge (isoelectric point; pI), using less than a microliter (400 nL) of total protein lysate. After electrophoresis, proteins are immobilized onto the capillary walls by ultraviolet light treatment, followed by primary and secondary (horseradish peroxidase (HRP) conjugated) antibody incubation, whose binding is detected through enhanced chemiluminescence (ECL), generating a light signal that can be captured and recorded by a charge-coupled device (CCD) camera. The digital image can be analyzed and quantified (peak area) using software. This high throughput procedure can handle 96 samples at a time; is highly sensitive, with protein detection in the picogram range; and produces highly reproducible results because of automation. All of these aspects are extremely valuable when the quantity of samples (e.g., tissue samples and biopsies) is a limiting factor. The technique has wider applications as well, including screening of drugs or antibodies, biomarker discovery, and diagnostic purposes.

Capillary isoelectric focusing is an antibody-based, ultrasensitive, high throughput technique, enabling detailed characterization of proteins and their isoforms from extremely small biological samples. The following describes a protocol for detection and quantification of specific proteins and their isoforms in an automated and robotized manner.

Proteinler ve onların izoformlarının kapiller Isoelectric odaklanarak yöntemi tarafından son derece hassas ve nicel tespiti

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a key pathological feature of HD is the aberrant accumulation of mutant HTT (mHTT) protein into high molecular weight complexes and intracellular inclusion bodies composed of fragments and other proteins. Conventional methods to measure and understand the contributions of various forms of mHTT-containing aggregates include fluorescence microscopy, western blot analysis, and filter trap assays. 
However, most of these methods are conformation specific, and therefore may not resolve the full state of mHTT protein flux due to the complex nature of aggregate solubility and resolution.
For the identification of aggregated mHTT and various modified forms and complexes, separation and solubilization of the cellular aggregates and fragments is mandatory. Here we describe a method to isolate and visualize soluble mHTT, monomers, oligomers, fragments, and an insoluble high molecular weight (HMW) accumulated mHTT species. HMW mHTT tracks with disease progression, corresponds with mouse behavior readouts, and has been beneficially modulated by certain therapeutic interventions1. This approach can be used with mouse brain, peripheral tissues, and cell culture but may be adapted to other model systems or disease contexts.

A method is described for fractionation of insoluble and soluble mutant huntingtin species from mouse brain and cell culture. The method described is useful for characterization and quantification of huntingtin protein flux and aids in analyzing protein homeostasis in disease pathogenesis and in the presence of perturbations

Çözünür ve çözünmez Huntingtin türler çözümlenmesi için ayırma

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these epigenetic marks is accomplished by sequential oxidation by ten-eleven translocation dioxygenases (TET1-3), followed by the thymine-DNA glycosylase-dependent base excision repair. Inactivation of the TET2 gene due to genetic mutations or by other epigenetic mechanisms is associated with a poor prognosis in patients with diverse cancers, especially hematopoietic malignancies. Here, we describe an efficient single step purification of enzymatically active untagged human TET2 dioxygenase using cation exchange chromatography. We further provide a liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) approach that can separate and quantify the four normal DNA bases (A, T, G, and C), as well as the four modified cytosine bases (5-methyl, 5-hydroxymethyl, 5-formyl, and 5-carboxyl). This assay can be used to evaluate the activity of wild type and mutant TET2 dioxygenases.

Here, we present a protocol for an efficient single step purification of the active untagged human ten-eleven translocation-2 (TET2) 5-methylcytosine dioxygenase using ion-exchange chromatography and its assay using a liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)-based approach.

Etkili arınma ve on-Eleven Translocation-2 5-metilsitozin Dioxygenase için tahlil LC-MS/MS tabanlı geliştirme

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances in both basic and clinical research. However, as with many similar experimental techniques, the outcome of Western blot analyses is easily influenced by choices made in the design and execution of the experiment. Specific housekeeping proteins have traditionally been used to normalize protein levels for quantification, however, these have a number of limitations and have therefore been increasingly criticized over the past few years. Here, we describe a detailed protocol that we have developed to allow us to undertake complex comparisons of protein expression variation across different tissues, mouse models (including disease models), and developmental timepoints. By using a fluorescent total protein stain and introducing the use of an internal loading standard, it is possible to overcome existing limitations in the number of samples that can be compared within experiments and systematically compare protein levels across a range of experimental conditions. This approach expands the use of traditional western blot techniques, thereby allowing researchers to better explore protein expression across different tissues and samples.

This method describes a robust and reproducible approach for the comparison of protein levels in different tissues and at different developmental timepoints using a standardized quantitative western blotting approach.

Sağlam dokulara ve standart nicel Western Blot kullanarak geliştirme boyunca Protein düzeylerinin karşılaştırılması

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The protocol outlined here takes advantage of the di-glycine (-GG) modification left after the tryptic digestion of ubiquitin incorporated in a chain. By quantifying these topology-characteristic peptides the relative abundance of each ubiquitin chain topology can be determined. The steps required to quantify these peptides by a parallel reaction monitoring experiment are reported taking into consideration the stabilization of ubiquitin chains. Preparation of heavy controls, cell lysis, and digestion are described along with the appropriate mass spectrometer setup and data analysis workflow. An example data set with perturbations in ubiquitin topology is presented, accompanied by examples of how optimization of the protocol can affect results. By following the steps outlined, a user will be able to perform a global assessment of the ubiquitin topology landscape within their biological context.

This method describes the assessment of global changes in ubiquitin chain topology. The assessment is performed by the application of a mass spectrometry-based targeted proteomics approach.

Paralel Reaksiyon İzleme ile Ubiquitin Zincir Analizi

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 (FET) family of fusion oncoproteins, is one of the most frequently involved fusion genes in Ewing sarcoma. These FET family fusion proteins typically harbor a low-complexity domain (LCD) of FET protein at their N-terminus and a DNA-binding domain (DBD) at their C-terminus. EWS-FLI1 has been confirmed to form biomolecular condensates at its target binding loci due to LCD-LCD and LCD-DBD interactions, and these condensates can recruit RNA polymerase II to enhance gene transcription. However, how these condensates are assembled at their binding sites remains unclear. Recently, a single-molecule biophysics method-DNA Curtains-was applied to visualize these assembling processes of EWS-FLI1 condensates. Here, the detailed experimental protocol and data analysis approaches are discussed for the application of DNA Curtains in studying the biomolecular condensates assembling on target DNA.

Here, we describe the use of the single-molecule imaging method, DNA Curtains, to study the biophysical mechanism of EWS-FLI1 condensates assembling on DNA.

DNA Üzerine Birleştirilen EWS-FLI1 Kondensatlarının Tek Moleküllü Görüntülenmesi

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...