Diese Arbeit wurde unterstützt durch ein Forschungsstipendium für das Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie von Japan (KAKENHI), K.H (#15 K 01691), Y.F. (#15 K 08625), K.Y (#26461532) und ein Stipendium für das Studium der hartnäckigen Krankheit-Projekt vom Ministerium für Gesundheit, Arbeit und Wohlfahrt (K.Y #201510032A). Wir danken der Edanz Gruppe (www.edanzediting.com/ac) für die Bearbeitung eines Entwurfs des Manuskripts.

Finden Sie alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (SDB) vor dem Gebrauch. Tragen Sie Handschuhe um Probe Verunreinigungen von der Haut abgeleitet SM zu minimieren. Dieses Protokolls galt, HeLa-Zellen gewachsen in Adlers minimale wesentliche Medium ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 1.000 U/L Penicillin und Streptomycin 100 mg/L.
1. Vorbereitung der Lipid-Proben
Hinweis: Es ist wichtig, dass alle Glaswaren, einschließlich Reagenzgläser mit Teflon ausgekleidet Schraubverschlüsse Waschmittel-frei sein.
<ol><li>Gewinnung von insgesamt Lipid-Anteil aus Zelle Homogenat mit Bligh & Dyer Methode7<ol>
<li>Entfernen Sie die Kultur (oder konditioniert) Medien von 10 cm Gewebe Kulturschale und zweimal mit 6 mL eiskaltem PBS abspülen.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL eiskaltem PBS in 10 cm Gewebe Kulturschale P1000 Pipette. Ernte der Zellen mit Zelle Schaber und sammeln Sie in 2,0 mL silikonisierte Kunststoffrohre.</li>
		<li>Entfernen Sie nach Zentrifugation (1.000 × g, 5 min, 4 ° C) den Überstand durch ein P1000 Pipette.</li>
		<li>1 mL Methanol hinzugeben. Vortex Rohre kurz und bei 200 W für 5 min in ein Bad-Typ sonikator beschallen. Hinweis: Einstellen Sie das Wasser-Niveau in einem Bad-Typ sonikator so, dass die Zelle Pellet effizient homogenisiert wird.</li>
		<li>Übertragen Sie die Zelle Homogenat in Methanol Pipette in Reagenzgläser (13 mm x 100 mm) mit Schraubverschlüssen Teflon ausgekleidet.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL Methanol, 1 mL Chloroform, 0,8 mL doppelt destilliertem Wasser und 50 µL 10 µmol/L des internen standard D18:1 /(D31)-16:0 SM in jedes Reagenzglas.</li>
		<li>Vortex Reagenzgläser energisch für 5 min bei Raumtemperatur. Hinweis: an dieser Stelle eine einzelne Phase (Chloroform/Methanol/Wasser = 1/2/0,8 (V/V/V)) wird gebildet.</li>
		<li>1 mL Chloroform und 1,0 mL doppelt destilliertes Wasser zugeben.</li>
		<li>Vortex-Rohre kräftig bei 2.500 u/min für 5 min bei Raumtemperatur. Hinweis: an dieser Stelle werden die wässrigen (oben) und organischen (unteren) Phase getrennt.</li>
		<li>Nach Zentrifugation (2.150 × g, 5 min, 25 ° C), zu sammeln und die untere Phase in Einweg-Glasröhren (untere Anfangsphase) übertragen. Hinweis: Sammeln Sie die untere Phase mit einer Pasteurpipette und eine Pipette Sicherheitsfilter. Setzen Sie die PIPETTENSPITZE in die untere Phase, die kleine Handpumpe neben der 'E'-Ventil, die obere Phase und Grenzflächen Flusen in der Pipettenspitze liefern und dann die untere Phase in die Pipette siphon.</li>
		<li>Fügen Sie 2 mL Chloroform in den Reagenzgläsern und Wirbel Rohre kräftig bei 2500 u/min für 5 min bei Raumtemperatur ausreichend mit der oberen Phase und Grenzflächen Flusen zu mischen.</li>
		<li>Nach Zentrifugation (2.150 × g, 5 min, 25 ° C), sammeln Sie und übertragen Sie die modifizierte untere Phase in Einweg-Glasröhren mit der unteren Anfangsphase wie in Schritt 1.1.10 beschrieben.</li>
		<li>Stellen der Glasröhren unter einer Stickstoff-Stream und die organischen Lösungsmitteln in den gesammelten untere Phase vollständig zu entfernen.</li>
		<li>Rekonstruieren Sie die Proben mit 500 µL von Methanol oder Ethanol, mit 0,02 µm Filter Filtern und speichern in Glasfläschchen bei-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Probenvorbereitung für die Eichkurve Konstruktion und Validierung der Methode<ol>
<li>Fügen Sie 50 µL 0.1, 0.5, 1, 5, 10 oder 50 µmol/L standard Verbindung (D18:1 /(D9)-18:1 SM) in Reagenzgläsern mit Schraubverschlüssen Teflon ausgekleidet.</li>
		<li>Fügen Sie Zelle Homogenat in jedes Reagenzglas und 1 mL fügen Sie Methanol hinzu. Hinweis: Die Höhe der Zelle Homogenat als Matrix variiert je nach jedem Experiment. Wenn die SM-Arten in Proben von Zellen in der Kulturschale 10 cm abgeleitet routinemäßig analysiert werden, sollte die Höhe der Zelle Homogenat in jedes Reagenzglas in der Nähe der Zellen in der Kulturschale 10 cm sein.</li>
		<li>Extrahieren Sie die gesamten Lipid-Anteil beschriebenen Schritte 1.1.6-1.1.14.</li>
		<li>Bereiten Sie Qualitätskontrolle vor (QC) Proben für die Validierung der Methode, wie in 1.2.1-1.2.3 Schritten umherspaziert. Drei QC Proben mit verschiedenen Konzentrationen der standard Verbindung vorbereiten (D18:1 /(D9)-18:1 SM): innert 3 x die untere Grenze der Standardkurve (QC-Low, QC-L), eines in der Nähe der Mitte (QC-Mitte, QC-M), und eines in der Nähe der oberen Grenze der Standardkurve (QC-hoch, QC-H).</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) SM-Analyse von LC-ESI-MS/MS
<ol><li>Vorbereitung der mobilen phase<ol>
<li>Mischen Sie das Lösungsmittel (Acetonitril/Methanol/DdH2O = 2/2/1 (V/V/V) für die wässrige Phase und Isopropanol für die organische Phase) in Glas-Flaschen mit Schraubverschlüssen Teflon ausgekleidet und für 5 min in ein Bad-Typ sonikator beschallen.</li>
		<li>Hinzufügen von Ameisensäure (Endkonzentration 26,4 Mmol/L) und NH4OH (14,9 Mmol/L) in jedem mobilen Phase.</li>
	</ol></li>
	<li>Qualitative Analyse der SM von LC-ESI-MS3<ol>
<li>Die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)-System zu aktivieren, die Glasflaschen, die mobile Phasen enthalten Einlass Röhrchen gesteckt und bereinigen die HPLC-Linien. Eine C-18 -HPLC-Säule (1,5 mm i.d. × 100 mm Länge, Partikel Größe 3,0 µm) mit der HPLC-Anlage verknüpfen, halten die Temperatur in der Spalte Ofen bei 50 ° C und Zustand der Spalte mit der wässrigen mobile Phase 100 µL/min. setzen die Proben in einem probenrack in der autosampl äh.</li>
		<li>Legen Sie die Parameter der triple Quadrupol und Quadrupol lineare Ionenfalle Massenspektrometrie System für MS3 -Analyse, wie in Tabelle 1 und Tabelle 2 sowie der ersten und zweiten Vorläufer Ionen der SM-Arten von Interesse aufgeführt.<ol>
<li>Doppelklick auf das Icon für die Datenerfassung, Doppelklick die Hardware-Konfiguration, wählen Sie "LC + QTRAP4500 + Valve" und klicken Sie auf "Profil aktivieren".</li>
			<li>Erstellen Sie einen neuen Unterordner, indem Sie auf "Neues Unterprojekt" und "OK".</li>
			<li>Klicken Sie auf die Registerkarte "Datei", wählen Sie "Neu" und "Übernahme-Methode" und "OK". Klicken Sie auf das Symbol 'Mass Spec' und 'MS' tab. Wählen Sie Scan-Typ als "MS/MS/MS (MS3)", Abtastrate als 10.000 Da/s, Polarität als "Negativ" und "Dauer" als ganze Zeit analysiert (min) sein. M/Z 'Start (Da)' und 'Stop (Da)' als zu scannenden Bereichs festgelegt. Stellen Sie die m/Z der 1. und 2. Vorläufer Ionen des Ziels SM Arten von Interesse. Hinweis: Um mehrere SM-Arten zu analysieren, markieren die "-MS3" Symbol, klicken Sie rechts, wählen Sie "Copy dieses Experiment" und setzen Sie dann die m/Z der 1. und 2. Vorläufer Ionen anderer SM-Arten.</li>
			<li>Wählen Sie die Registerkarte "Advanced MS", und legen Sie jeden Parameter wie folgt: Scan-Modus als "Profil", Schrittweite als 0,12 (Da), Auflösung Q1 und Q3 'Einheit' und 'Beleuchtet', bzw. Intensität Schwelle als 0, Abbindezeit 50 (ms), Pause zwischen Masse reicht als 1,5 ms, wählen Sie "dynamische Zeit zu füllen ", Q3 Eintrittsbarriere als 8V und Erregung Zeit als 25 ms.</li>
			<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche "Parameter bearbeiten" im Reiter "MS" und wählen Sie die "Quelle/Gas" tab. Legen Sie die Parameter der Vorhang Gas, Kollision Gas, Ionspray Spannung, Temperatur, Ionen-Quelle gas1 und gas2 wie in Tabelle 1aufgeführt. Dann wählen Sie "Compound" tab. legen die Parameter der declustering Potenzial, Eingang Potenzial, Aufprallenergie, Anregungsenergie und Aufprallenergie verteilt wie in Tabelle 2aufgeführt.</li>
			<li>Markieren Sie "Integrierte Valco Valve" und wählen Sie 'Position Name für Schritt 0' a und "B" als Position für insgesamt 5,0 min Zeit. Legen Sie auch 'A' als Position für insgesamt 70,0 min..</li>
			<li>Markieren Sie "Shimadzu LC-System". Wählen Sie die Registerkarte "Pump" und legen Sie Pumpen Modus als binäre Flow, Gesamtfluss als 0,28 mL/min und maximal druckgrenzen als 20,0 MPa. Wählen Sie die Registerkarte "Autosampler" und stellen Sie die Spülung Lautstärke als 200 µL, Nadel Hub 52 mm, Spülung 35 µL/s Geschwindigkeit, Geschwindigkeit als 5.0 µL/s Probenahme, Spülzeit 25,0 min, spülen Sie Dip-Mal als 5 s und spülen Modus als "Vor und nach dem Absaugen".<ol>
<li>Darüber hinaus ermöglichen die Kühlereinheit, als 4 ° C kühlere Temperatur einstellen und das Fläschchen Nadel Regelhub 52 mm. Wählen Sie die Registerkarte "Ofen" ermöglichen den Ofen und die Ofentemperatur und die maximale Temperatur 50 ° C und 85 ° C "bzw." festgelegt.</li>
				<li>Wählen Sie die Registerkarte "Controller" und aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Einschalten". Wählen Sie die Registerkarte "Zeitprogramm" und legen Sie die Lösungsmittel Steigungen wie folgt: Lösungsmittel A / B im Verhältnis 100/0 für 5 min Programm lineare Änderungen an 80/20 über 4 min, 35/65 über 50 min und 25/75 über 1 min. danach , halten Sie sie an 25/75 für 10 min, dann linear auf 100/0 über 4 min. Speichern Sie anschließend die Methode.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Batch-Datei erstellen<ol>
<li>Doppelklick das "Bauen Erwerb Batch"-Symbol, klicken Sie auf ' hinzufügen ', "Hinzufügen Proben", legen Sie die Anzahl der neuen Proben, und klicken Sie auf "OK".</li>
			<li>Klicken Sie auf "Methode Editor" und wählen Sie die Methode verwendet werden. Wenn mehrere Methoden in einer Batch-Datei verwendet werden, aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Verwendung mehrerer Methoden" und wählen Sie die Erwerbsmethode für jede Probe. Benennen Sie "Probe", legen Sie die entsprechende Anzahl für "Fläschchen Position", und geben Sie die Menge der Einspritzmenge. Speichern Sie die Batch-Datei.</li>
		</ol>
</li>
		<li>MS3 Produkt Ion Spektren der SM-Arten von Interesse durch LC-ESI-MS3 -Analyse zu erhalten<ol>
<li>Wählen Sie die Registerkarte 'Senden' in Batch-Datei, markieren Sie die Zeile der zu analysierenden Proben, und klicken Sie auf die Schaltfläche "Senden".</li>
			<li>Klicken Sie auf die '' Ansicht Quene "Symbol"Äquilibriert"-Symbol, wählen Sie die Erwerbsmethode verwendet werden, die Uhrzeit als 1 min und klicken Sie auf"OK".</li>
			<li>Deaktivieren Sie "Reserve Instrument für Tuning" durch Anklicken des entsprechenden Symbols. Führen Sie dann Stapelsequenz durch Anklicken des Symbols "Sample starten".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Weisen Sie jeder MS3 Produkt Ion Spektren des SM durch den Vergleich der Masse Verhältnis (m/Z) des Produktes berechnen Ionen-Spektren und die genaue Masse der Sphingoid LCB und N-Acyl Glyko-von Interesse. Ermitteln die Anzahl von Kohlenstoffatomen und doppelte Anleihen in der Sphingoid LCB und N-Acyl Glyko-gemäß der entsprechenden Produkt-Ionen.<ol>
<li>Bestätigen Sie, dass der entsprechende Sub-Projekt-Ordner ausgewählt ist, dann doppelklicken Sie das Symbol "Open Data File", und wählen Sie die Proben analysiert werden. Ziehen Sie die Peak im Chromatogramm für jedes Ziel SM Arten und klicken Sie dann doppelt. Die erhaltenen MS3 Produkt Ion Spektren im Bereich gezogen werden vorgestellt.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Quantitative Analyse des SM durch LC-ESI-MS/MS<ol>
<li>Legen Sie die mobilen Phasen und HPLC-Säule, wie unter Punkt 2.1 und 2.2.1 beschrieben.</li>
		<li>Legen Sie die Parameter der triple Quadrupol und Quadrupol lineare Ionenfalle Massenspektrometrie System für mehrere Reaktion monitoring (MRM) Analyse, wie in Tabelle 1 und Tabelle 2aufgeführt.<ol>
<li>Führen Sie die Verfahren, wie in Schritt 2.2.2.1 und 2.2.2.2 beschrieben.</li>
			<li>Klicken Sie auf die Registerkarte "Datei", wählen Sie "Neu" und "Übernahme-Methode" und "OK". Klicken Sie auf das Symbol 'Mass Spec' und 'MS' tab. Wählen Sie Scan-Typ als "MRM" Polarität "Positiv". Legen Sie "Dauer", als die ganze Zeit analysiert werden. Legen Sie den m/Z [M + H]+ und 184 als "Q1 (Da)' und 'Q3 Masse (Da)" des Ziels SM Arten von Interesse, jeweils. Festlegen Sie 'Zeit' als 10 ms und "ID" als Namen für das Ziel SM Arten.</li>
			<li>Wählen Sie die Registerkarte "Advanced MS", und legen Sie jeden Parameter wie folgt: sowohl die Auflösung Q1 und Q3 als "Einheit", Intensität Schwelle als 0, Zeiteinstellung 0 (ms) und Pause zwischen Masse reicht als 5 ms.</li>
			<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche "Parameter bearbeiten" im Reiter "MS" und wählen Sie die "Quelle/Gas" Registerkarte legen Sie die Parameter der Vorhang Gas und Kollision Gas, Ionspray Spannung, Temperatur, Ionen-Quelle gas1 gas2 wie in Tabelle 1aufgeführt. Wählen Sie dann die "Compound" Registerkarte "setzen Sie die Parameter des declustering Potenzial, Eingang Potenzial, Aufprallenergie und Kollision Zelle Ausfahrt Potenzial wie in Tabelle 2aufgeführt.</li>
			<li>Stellen Sie das Ventil, wie in Schritt 2.2.2.6 beschrieben.</li>
			<li>Legen Sie die LC-Bedingung, wie in Schritt 2.2.2.7 beschrieben. Speichern Sie anschließend die Methode.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Die Batch-Datei zu erstellen, wie unter Punkt 2.2.3 beschrieben.</li>
		<li>Erhalten Sie die MRM-Daten der einzelnen SM-Arten durch LC-ESI-MS/MS-Analyse, wie unter Punkt 2.2.4 beschrieben.</li>
		<li>Mit der Software für Datenintegration MRM Daten verarbeiten und die Daten der Peakfläche für die extrahierten Ion Chromatogramm der einzelnen SM-Arten zu erhalten.<ol>
<li>Doppelklick auf das Icon für die Datenintegration in der quantitativen Analyse, klicken Sie auf die Registerkarte "Bearbeiten" und wählen Sie Benutzer standardmäßig Integration. Festlegen Sie "glockenförmig" glatte Breite als 1,0 Punkte, und klicken Sie auf "OK". Klicken Sie auf die Registerkarte "Bearbeiten" und wählen Sie "Neue Tabelle". Wählen Sie das Beispiel integriert werden, klicken Sie auf einen Pfeil, und klicken Sie auf "Weiter". Wählen Sie "Erstellen neue Methode", legen Sie den Namen der Methode, und klicken Sie auf "Weiter". Klicken Sie auf "Weiter" und aktivieren Sie das Kontrollkästchen D18:1 /(D31)-16:0 SM ist, klicken Sie auf "Weiter", und klicken Sie auf "Fertig stellen".</li>
			<li>Klicken Sie auf "Zeigt den Gipfel-Beitrag" und bestätigen Sie, dass die Chromatogramm Gipfel entsprechend anerkannt werden. Ist anzumerken, dass die Verweilzeit des D18:1 /(D31)-16:0 SM ist in der Regel um kleiner ~ 0,3 min im Vergleich zu der eines der 34-1 SM (in der Regel besteht der D18:1 / 16:0 SM).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Jede SM-Art entsprechend dem Verhältnis der Spitze der einzelnen SM-Arten, die D18:1 /(D31)-16 zu quantifizieren: 0 SM interner Standard.<ol>
<li>Klicken Sie auf die Registerkarte "Datei", wählen Sie "Exportieren", wählen Sie "Tabelle", bestätigen Sie das Format als "MultiQuant", Spalten, wie "alle Spalten"Exportieren", Zeilen wie"Alle Zeilen außer diesen explizit versteckte "Exportieren", und klicken Sie dann auf "OK".</li>
			<li>Öffnen Sie die exportierte Datei in die Excel-Software. Das Gebiet des Ziels SM-Arten durch die Fläche des IS zu normalisieren (D18:1 /(D31)-16:0 SM). Multiplizieren Sie dann mit der theoretischen Menge des IS in der injizierten Probe zur Berechnung des Ziels SM-Arten in der injizierten Probe.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Erstellung der Standardkurve<ol>
<li>Die MRM Daten von D18:1 /(D9)-18:1 SM und D18:1 /(D31)-16:0 SM in den Proben für das Konstruieren der Standardkurve von LC-ESI-MS/MS-Analyse, wie in Schritt 2.3.1-2.3.4 beschrieben.</li>
		<li>Die Daten der Peakfläche des D18:1 /(D9)-18:1 SM und D18:1 /(D31)-16:0 SM wie in Schritt 2.3.5 beschrieben.</li>
		<li>Berechnen Sie die Menge der D18:1 /(D9)-18:1 SM in der injizierten Probe gemäß Schritt 2.3.6.</li>
		<li>Die Trendlinie zu konstruieren, durch Festlegen der X-Achse und die Y-Achse als der Nominalbetrag und berechnete Menge an D18:1 /(D9)-18:1 SM und erhalten die Trendlinie-Formel.</li>
	</ol></li>
	<li>Die quantitative Methode mit Excel Software Validierung<ol>
<li>Für die Validierung der Methode, die Menge der D18:1 /(D9)-18 zu quantifizieren: 1 SM und D18:1 /(D31)-16:0 SM in der QC Proben durch die Analyse jedes QC Probe mindestens dreimal in 1 Tag, und wiederholen Sie mindestens 3 Tage, wie in Schritt 2.3.1-2.3.4 beschrieben.</li>
		<li>Die Spitze Bereich Daten und berechnen Sie die Menge der D18:1 /(D9)-18:1 SM in der injizierten Probe gemäß Schritt 2.3.5 und 2.3.6.</li>
		<li>Nach der Eichkurve erhalten, berechnen die Höhe der D18:1 /(D9)-18:1 SM in der injizierten Probe.</li>
		<li>Bewertung der Genauigkeit<ol>
<li>Berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung der Höhe der D18:1 /(D9)-18:1 SM erhaltenen in Schritt 2.5.3 auf das Dataset die Intra-day und Inter Tag mit Excel-Software.</li>
			<li>Der Durchschnitt in Schritt 2.5.4.1 erhaltenen ist geteilt durch die Standardabweichung und ausgedrückt als %.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bewertung der Genauigkeit<ol>
<li>Berechnen Sie die Richtigkeit der einzelnen Angaben wie folgt: [(Die berechneten Betrag im Schritt 2.5.3.) / (Nominalbetrag) - 1] × 100(%)</li>
			<li>Berechnen Sie den Mittelwert der Absolute Wert der Genauigkeit für das Dataset die Intra-und Inter Tag.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Huitema, K., van den Dikkenberg, J., Brouwers, J. F., Holthuis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+family+of+animal+sphingomyelin+synthases.">Identification of a family of animal sphingomyelin synthases.</a> EMBO J. 23 (1), 33-44 (2004).</li><li>Kihara, Y., Mizuno, H., Chun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophospholipid+receptors+in+drug+discovery.">Lysophospholipid receptors in drug discovery.</a> Exp Cell Res. 333 (2), 171-177 (2015).</li><li>Kihara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+degradation+pathways,+functions,+and+pathology+of+ceramides+and+epidermal+acylceramides.">Synthesis and degradation pathways, functions, and pathology of ceramides and epidermal acylceramides.</a> Prog Lipid Res. 63, 50-69 (2016).</li><li>Merrill, A. H., Sullards, M. C., Allegood, J. C., Kelly, S., Wang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipidomics:+high-throughput,+structure-specific,+and+quantitative+analysis+of+sphingolipids+by+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry.">Sphingolipidomics: high-throughput, structure-specific, and quantitative analysis of sphingolipids by liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Methods. 36 (2), 207-224 (2005).</li><li>Houjou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+selective+identification+of+molecular+species+in+phosphatidylcholine+and+sphingomyelin+by+conditional+neutral+loss+scanning+and+MS3.">Rapid and selective identification of molecular species in phosphatidylcholine and sphingomyelin by conditional neutral loss scanning and MS3.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 18 (24), 3123-3130 (2004).</li><li>Hama, K., Fujiwara, Y., Tabata, H., Takahashi, H., Yokoyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Quantitation+Using+Two+Stable+Isotopically+Labeled+Species+and+Direct+Detection+of+N-Acyl+Moiety+of+Sphingomyelin.">Comprehensive Quantitation Using Two Stable Isotopically Labeled Species and Direct Detection of N-Acyl Moiety of Sphingomyelin.</a> Lipids. , (2017).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification.">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).</li><li>Gu, H., Liu, G., Wang, J., Aubry, A. F., Arnold, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+the+correct+weighting+factors+for+linear+and+quadratic+calibration+curves+with+least-squares+regression+algorithm+in+bioanalytical+LC-MS/MS+assays+and+impacts+of+using+incorrect+weighting+factors+on+curve+stability,+data+quality,+and+assay+performance.">Selecting the correct weighting factors for linear and quadratic calibration curves with least-squares regression algorithm in bioanalytical LC-MS/MS assays and impacts of using incorrect weighting factors on curve stability, data quality, and assay performance.</a> Anal Chem. 86 (18), 8959-8966 (2014).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> J Biol Chem. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Thomas, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ozone-induced+dissociation:+elucidation+of+double+bond+position+within+mass-selected+lipid+ions.">Ozone-induced dissociation: elucidation of double bond position within mass-selected lipid ions.</a> Anal Chem. 80 (1), 303-311 (2008).</li><li>Baba, T., Campbell, J. L., Le Blanc, J. C., Baker, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+sphingomyelin+characterization+using+electron+impact+excitation+of+ions+from+organics+and+mass+spectrometry.">In-depth sphingomyelin characterization using electron impact excitation of ions from organics and mass spectrometry.</a> J Lipid Res. 57 (5), 858-867 (2016).</li><li>Ryan, E., Nguyen, C. Q. N., Shiea, C., Reid, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+Structural+Characterization+of+Sphingolipids+via+193+nm+Ultraviolet+Photodissociation+and+Ultra+High+Resolution+Tandem+Mass+Spectrometry.">Detailed Structural Characterization of Sphingolipids via 193 nm Ultraviolet Photodissociation and Ultra High Resolution Tandem Mass Spectrometry.</a> J Am Soc Mass Spectrom. , (2017).</li><li>Pham, H. T., Ly, T., Trevitt, A. J., Mitchell, T. W., Blanksby, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+complex+lipid+isomers+by+radical-directed+dissociation+mass+spectrometry.">Differentiation of complex lipid isomers by radical-directed dissociation mass spectrometry.</a> Anal Chem. 84 (17), 7525-7532 (2012).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenskonflikt.

In dem vorliegenden qualitativen Verfahren, die wir erhalten, MS3 Produkt Ionen eine SPC und ein N-Acyl Glyko-. Es ist wichtig, richtig ordnen Sie eine SPC und ein N-Acyl Glyko-. Zu diesem Zweck sollte angemerkt werden, dass andere phosphorylcholin-haltige Moleküle auch als MS3 Produkt Ionen nachgewiesen werden können. Diacyl-Phosphatidylcholin (PC) und Plasmalogen-PC sind reichlich vorhanden in Säugetierzellen und ihre Hydrophobie ist ähnlich dem von SM. Daher können Diacyl-P...

Sphingomyelin (SM) ist eine gemeinsame Sphingolipid in Säugetierzellen. SM ist synthetisiert intrazellulär1 und Gegenwart als Vorstufe für andere Sphingolipide wie ein Sphingosine-1-Phosphat und ein Ceramid, die entscheidende Rolle im Immunsystem haben-Handel Handy und Barriere Homöostase, bzw.2Haut, 3. Daher ist die genaue Analyse des Stoffwechsels SM wichtig für die Aufklärung der physiologischen und pathologischen Rollen der Sphingolipide.
SM besteht aus einem Ceramid und ein phosphorylcholin, die mit 1-hydroxy-Gruppe von der Ceramid weiter ein Sphingosine und ein Nbesteht-Acyl Glyko-. Eine Vielzahl der Kohlenstoff- und Doppelbindung in der Sphingosine und NZahlen-Acyl Glyko-ergibt sich die Anzahl der Ceramid (und SM) Arten. Jüngste Fortschritte in der LC-ESI-MS/MS ermöglichte die quantitative und qualitative Analyse der SM4,5. In der qualitativen Analyse wurde die Anzahl der Kohlenstoff und Doppelbindungen der ein Sphingoid LCB SM identifiziert, durch die Zuordnung von Produkt Ion Spektren des LCB. Jedoch Strukturinformation der N-Acyl Glyko-wurde nicht direkt erhalten, weil die entsprechenden Produkt-Ionen nicht gemeldet worden sind, und daher N-Acyl-Moieties wurden durch differenzierte Analyse zwischen Vorläufer Ionen abgeleitet und Produkt-Ionen entsprechend LCB in sowohl positive als auch negative Ionen-Modi4,5. In diesem Bericht präsentieren wir eine Methode zur Erkennung der Produkt-Ionen des LCB und N-Acyl Glyko-gleichzeitig in MS3 -Modus mit triple Quadrupol und Quadrupol lineare Ionenfalle Massenspektrometrie, die die genaue Struktur erleichtert Spekulationen über jedes SM-Arten-6.
Die Ionen-Unterdrückung (oder Erweiterung) Auswirkungen verursacht durch die Matrix in biologischen Proben behindern die genaue Quantifizierung in LC-ESI-MS-Analyse, und daher ist es wünschenswert, Kalibrierkurven für alle Analyten von Interesse in der identischen Matrix erstellen von der biologischen Probe. Diese Strategie ist jedoch nicht zumutbar, weil es fast unmöglich, alle Arten von SM in biologischen Proben, vor allem in der umfassenden Analyse vorzubereiten. So ist es praktisch, eine Kalibrierungskurve zu konstruieren und den quantitativen Bereich mit einer repräsentativen SM Art versetzt in den biologischen Proben zu bestimmen. Wir verwendet zwei isotopischer beschriftet SM-Arten, um eine Kalibrierungskurve zu konstruieren; einer war für einen internen Standard und die andere für eine Standard-Verbindung verwendet. Wir haben eine kleine Menge SM-Art isotopischer beschriftet als standard Verbindung versetzt in biologischen Proben und erfolgreich eine Kalibrationskurve und quantitativen Bereich6festgestellt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:737px;" width="738">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">PBS</td>
			<td style="width:131px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">10010023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">100 mm tissue culture dish</td>
			<td style="width:131px;">IWAKI</td>
			<td style="width:119px;">3020-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:131px;">IWAKI</td>
			<td style="width:119px;">9000-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Siliconized 2.0 mL tube</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-681-321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Test tube</td>
			<td style="width:131px;">IWAKI</td>
			<td style="width:119px;">TST SCR 16-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Teflon-lined screw cap</td>
			<td style="width:131px;">IWAKI</td>
			<td style="width:119px;">9998CAP415-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Disposable glass tube</td>
			<td style="width:131px;">IWAKI</td>
			<td style="width:119px;">9832-1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:321px;">CAPCELL PAK C18 ACR 3 &#181;m 1.5 mm I.D. x 100 mm</td>
			<td style="width:131px;">Shiseido</td>
			<td style="width:119px;">92223</td>
			<td>Guard cartridge is inserted into cartridge holder, and linked to C18 column</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:321px;">CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm GUARD CARTRIDGE</td>
			<td style="width:131px;">Shiseido</td>
			<td style="width:119px;">12197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Cartridge holder</td>
			<td style="width:131px;">Shiseido</td>
			<td style="width:119px;">12415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:131px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">018-19853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">2-Propanol (Isopropyl Alcohol)</td>
			<td style="width:131px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">161-09163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Methanol</td>
			<td style="width:131px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">134-14523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Formic acid</td>
			<td style="width:131px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">066-00466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">28% Ammonia water</td>
			<td style="width:131px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">016-03146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Sonicator (bath type)</td>
			<td style="width:131px;">SHARP</td>
			<td style="width:119px;">UT-206H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Vortex mixer for glass test tube</td>
			<td style="width:131px;">TAITEC</td>
			<td style="width:119px;">Mix-EVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">1.4 mL glass vial</td>
			<td style="width:131px;">Tomsic</td>
			<td style="width:119px;">500-1982</td>
			<td>Samples are stored in 1.4 mL glass vial sealed with screw cap and 8 mm septum at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">8 mm septum</td>
			<td style="width:131px;">Tomsic</td>
			<td style="width:119px;">200-3322</td>
			<td>When samples are analyzed, screw caps are replaced with screw caps with slit septum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Screw cap for 1.4 mm glass vial</td>
			<td style="width:131px;">Tomsic</td>
			<td style="width:119px;">500-2762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Screw cap with slit septum</td>
			<td style="width:131px;">Shimadzu GLC</td>
			<td style="width:119px;">GLCTV-803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">PVDF 0.22 &#181;m filter</td>
			<td style="width:131px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLGVR04NL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:321px;">Triple quadrupole and quadrupole linear ion trap mass spectrometry</td>
			<td style="width:131px;">SCIEX</td>
			<td style="width:119px;">QTRAP4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:321px;">The software for data acquisition and analysis of product ion spectra</td>
			<td style="width:131px;">SCIEX</td>
			<td style="width:119px;">Analyst</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:321px;">The software for data integration in quantitative analysis</td>
			<td style="width:131px;">SCIEX</td>
			<td style="width:119px;">MultiQuant</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">HPLC system</td>
			<td style="width:131px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:119px;">Nexera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Glass bottle</td>
			<td style="width:131px;">Sansyo</td>
			<td style="width:119px;">85-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">d18:1/24:0 sphingomyelin</td>
			<td style="width:131px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">860592P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Sphingosylphosphorylcholine</td>
			<td style="width:131px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">567735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:131px;">ThermoFisher&#160;</td>
			<td style="width:119px;">26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:131px;">ThermoFisher&#160;</td>
			<td style="width:119px;">25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Penicillin and streptomycin</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eagle&#8217;s minimum essential medium</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M4655</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative and qualitative method for sphingomyelin by lc-ms using two stable isotopically labeled sphingomyelin species

Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Analyse von Sphingomyelin (SM) qualitativ und quantitativ durch flüssige Chromatographie-Electrospray Ionisierung-Tandem-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS/MS). SM ist eine gemeinsame Sphingolipid bestehend aus einem phosphorylcholin und ein Ceramid als hydrophile und hydrophobe Komponente, beziehungsweise. Eine Reihe von SM-Arten sind in Säugerzellen aufgrund einer Vielzahl in der Sphingoid lange Kette base (LCB) und eine N-Acyl Glyko-in die Ceramid. In diesem Bericht zeigen wir eine Methode zur Schätzung der Zahl der Kohlenstoff und Doppelbindungen in einem LCB und eine N-Acyl Glyko-basierend auf ihren entsprechenden Produkt-Ionen in MS/MS/MS (MS3) Experimente. Darüber hinaus präsentieren wir eine Quantitative Analyse-Methode für SM mit zwei stabilen isotopisch beschriftete SM Arten, die erleichtert die Bestimmung der Reichweite in SM Quantifizierung verwendet. Das vorliegende Verfahren werden bei der Charakterisierung der SM Artenvielfalt in biologischen Proben und industrielle Produkte wie Kosmetika.

Chemisch synthetisiert D18:1 / 24:0 cm (Abbildung 1A) und D18:1 / 24:0 SM in Lipid-Proben von HeLa-Zellen (Abbildung 1B) extrahiert wurden durch LC-ESI-MS3 [M + HCOO]– und [M-CH3] analysiert- als ersten und zweiten Vorläufer Ionen, beziehungsweise. Beachten Sie, dass die Spektrum Intensität der demethylated-Sphingosylphosphorylcholine (SPC) (m/Z...

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Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

Quantitative und Qualitative Methode für Sphingomyelin von LC-MS mit zwei stabilen isotopischer beschriftet Sphingomyelin Arten

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu quantifizieren und zu einzelnen Sphingomyelin Arten mit mehreren Reaktionskontrolle zu qualifizieren und MS/MS/MS-Modus, beziehungsweise.

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

quantitative-qualitative-method-for-sphingomyelin-lc-ms-using-two

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.7K Aufrufe.  Teikyo University. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu quantifizieren und zu einzelnen Sphingomyelin Arten mit mehreren Reaktionskontrolle zu qualifizieren und MS/MS/MS-Modus, beziehungsweise.

Serie: Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as industrial materials. Gene expression profiles are powerful tools for investigating metabolic regulation in plant cells. Therefore, detailed, accurate gene expression profiles during seed development are required for crop breeding. Acquiring highly purified RNA is essential for producing these profiles. Efficient methods are needed to isolate highly purified RNA from seeds. Here, we describe a method for isolating RNA from seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method enables highly purified RNA to be obtained from seeds without the use of phenol, chloroform, or additional processes for RNA purification. This method is applicable to Arabidopsis, rapeseed, and soybean seeds. Our method will be useful for monitoring the expression patterns of low level transcripts in developing and mature seeds.

We have succeeded in establishing a method for RNA isolation from plant seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method is suitable for monitoring the expression of genes with low level transcripts in seeds.

Eine effiziente Methode zur Isolierung von Highly Purified RNA aus Samen für die Verwendung in Quantitative Transkriptomanalyse

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Forschung

Biochemie

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. Moreover, even cultures of a single cell type may contain cells in distinct metabolic states, such as resting or cycling cells. Methods for measuring metabolic activities of such subpopulations are valuable tools for understanding cellular metabolism. Complex cell populations are most commonly separated using a cell sorter, and subpopulations isolated by this method can be analyzed by metabolomics methods. However, a problem with this approach is that the cell sorting procedure subjects cells to stresses that may distort their metabolism.
To overcome these issues, we reasoned that the mass isotopomer distributions (MIDs) of metabolites from cells cultured with stable isotope-labeled nutrients are likely to be more stable than absolute metabolite concentrations, because MIDs are formed over longer time scales and should be less affected by short-term exposure to cell sorting conditions. Here, we describe a method based on this principle, combining cell sorting with liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS). The procedure involves analyzing three types of samples: (1) metabolite extracts obtained directly from the complex population; (2) extracts of "mock sorted" cells passed through the cell sorter instrument without gating any specific population; and (3) extracts of the actual sorted populations. The mock sorted cells are compared against direct extraction to verify that MIDs are indeed not altered by the cell sorting procedure itself, prior to analyzing the actual sorted populations. We show example results from HeLa cells sorted according to cell cycle phase, revealing changes in nucleotide metabolism.

This article describes a method for studying cellular metabolism in complex communities of multiple cell types, using a combination of stable isotope tracing, cell sorting to isolate specific cell types, and mass spectrometry.

Ein Verfahren zur Messung des Metabolismus in sortierter Subpopulationen von komplexen Zell Gemeinschaften Verwendung stabiler Isotopen-Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in regulating transcription. These include the direct interaction with transcription factors, the covalent modification of histones and other proteins, and the occasional chromatin conformation alteration. Accordingly, establishing relatively quick methods for identifying proteins that interact within this network is crucial to enhancing our understanding of the underlying regulatory mechanisms. LC-MS/MS-mediated protein binding partner identification is a validated technique used to analyze protein-protein interactions. By immunoprecipitating a previously-identified member of a protein complex with an antibody (occasionally with an antibody for a tagged protein), it is possible to identify its unknown protein interactions via mass spectrometry analysis. Here, we present a method of protein preparation for the LC-MS/MS-mediated high-throughput identification of protein interactions involving nuclear cofactors and their binding partners. This method allows for a better understanding of the transcriptional regulatory mechanisms of the targeted nuclear factors.

We have established a method for the purification of coregulatory interaction proteins using the LC-MS/MS system.

Ein Protein Herstellungsverfahren für die Hochdurchsatz-Identifizierung von Proteinen Interagieren mit nuklearen Cofaktor LC-MS / MS-Analyse

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis can be characterized using an in vitro DNA synthesis assay followed by polyacrylamide gel electrophoresis. The goal of this assay is to quantify synthesis of both natural DNA and modified DNA (M-DNA). These approaches are particularly useful for resolving oligonucleotides with single nucleotide resolution, enabling observation of individual steps during enzymatic oligonucleotide synthesis. These methods have been applied to the evaluation of an array of biochemical and biophysical properties such as the measurement of steady-state rate constants of individual steps of DNA synthesis, the error rate of DNA synthesis, and DNA binding affinity. By using modified components including, but not limited to, modified nucleoside triphosphates (NTP), M-DNA, and/or mutant DNA polymerases, the relative utility of substrate-DNA polymerase pairs can be effectively evaluated. Here, we detail the assay itself, including the changes that must be made to accommodate nontraditional primer DNA labeling strategies such as near-infrared fluorescently labeled DNA. Additionally, we have detailed crucial technical steps for acrylamide gel pouring and running, which can often be technically challenging.

This protocol describes the characterization of DNA polymerase synthesis of modified DNA through observation of changes to near-infrared fluorescently labeled DNA using gel electrophoresis and gel imaging. Acrylamide gels are used for high resolution imaging of the separation of short nucleic acids, which migrate at different rates depending on size.

DNA-Polymerase-Aktivität Assay mit Nahinfrarot-Leuchtstoff beschrifteten DNA durch Acrylamid Gelelektrophorese sichtbar gemacht

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides an alternative strategy, capillary isoelectric focusing (cIEF), with many advantages compared to conventional immunoblotting. This is an antibody-based, automated, rapid, and quantitative method in which a complete western blotting procedure takes place inside an ultrathin capillary. This technique does not require a gel to transfer to a membrane, stripping of blots, or x-ray films, which are typically required for conventional immunoblotting. Here, proteins are separated according to their charge (isoelectric point; pI), using less than a microliter (400 nL) of total protein lysate. After electrophoresis, proteins are immobilized onto the capillary walls by ultraviolet light treatment, followed by primary and secondary (horseradish peroxidase (HRP) conjugated) antibody incubation, whose binding is detected through enhanced chemiluminescence (ECL), generating a light signal that can be captured and recorded by a charge-coupled device (CCD) camera. The digital image can be analyzed and quantified (peak area) using software. This high throughput procedure can handle 96 samples at a time; is highly sensitive, with protein detection in the picogram range; and produces highly reproducible results because of automation. All of these aspects are extremely valuable when the quantity of samples (e.g., tissue samples and biopsies) is a limiting factor. The technique has wider applications as well, including screening of drugs or antibodies, biomarker discovery, and diagnostic purposes.

Capillary isoelectric focusing is an antibody-based, ultrasensitive, high throughput technique, enabling detailed characterization of proteins and their isoforms from extremely small biological samples. The following describes a protocol for detection and quantification of specific proteins and their isoforms in an automated and robotized manner.

Hochsensible und quantitativen Nachweis von Proteinen und deren Isoformen durch Kapillare isoelektrischen Fokussierung Methode

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a key pathological feature of HD is the aberrant accumulation of mutant HTT (mHTT) protein into high molecular weight complexes and intracellular inclusion bodies composed of fragments and other proteins. Conventional methods to measure and understand the contributions of various forms of mHTT-containing aggregates include fluorescence microscopy, western blot analysis, and filter trap assays. 
However, most of these methods are conformation specific, and therefore may not resolve the full state of mHTT protein flux due to the complex nature of aggregate solubility and resolution.
For the identification of aggregated mHTT and various modified forms and complexes, separation and solubilization of the cellular aggregates and fragments is mandatory. Here we describe a method to isolate and visualize soluble mHTT, monomers, oligomers, fragments, and an insoluble high molecular weight (HMW) accumulated mHTT species. HMW mHTT tracks with disease progression, corresponds with mouse behavior readouts, and has been beneficially modulated by certain therapeutic interventions1. This approach can be used with mouse brain, peripheral tissues, and cell culture but may be adapted to other model systems or disease contexts.

A method is described for fractionation of insoluble and soluble mutant huntingtin species from mouse brain and cell culture. The method described is useful for characterization and quantification of huntingtin protein flux and aids in analyzing protein homeostasis in disease pathogenesis and in the presence of perturbations

Fraktionierung für Auflösung von löslichen und unlöslichen Huntingtin-Arten

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these epigenetic marks is accomplished by sequential oxidation by ten-eleven translocation dioxygenases (TET1-3), followed by the thymine-DNA glycosylase-dependent base excision repair. Inactivation of the TET2 gene due to genetic mutations or by other epigenetic mechanisms is associated with a poor prognosis in patients with diverse cancers, especially hematopoietic malignancies. Here, we describe an efficient single step purification of enzymatically active untagged human TET2 dioxygenase using cation exchange chromatography. We further provide a liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) approach that can separate and quantify the four normal DNA bases (A, T, G, and C), as well as the four modified cytosine bases (5-methyl, 5-hydroxymethyl, 5-formyl, and 5-carboxyl). This assay can be used to evaluate the activity of wild type and mutant TET2 dioxygenases.

Here, we present a protocol for an efficient single step purification of the active untagged human ten-eleven translocation-2 (TET2) 5-methylcytosine dioxygenase using ion-exchange chromatography and its assay using a liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)-based approach.

Effiziente Reinigung und LC-MS/MS-basierten Assay-Entwicklung für zehn-elf Translokation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances in both basic and clinical research. However, as with many similar experimental techniques, the outcome of Western blot analyses is easily influenced by choices made in the design and execution of the experiment. Specific housekeeping proteins have traditionally been used to normalize protein levels for quantification, however, these have a number of limitations and have therefore been increasingly criticized over the past few years. Here, we describe a detailed protocol that we have developed to allow us to undertake complex comparisons of protein expression variation across different tissues, mouse models (including disease models), and developmental timepoints. By using a fluorescent total protein stain and introducing the use of an internal loading standard, it is possible to overcome existing limitations in the number of samples that can be compared within experiments and systematically compare protein levels across a range of experimental conditions. This approach expands the use of traditional western blot techniques, thereby allowing researchers to better explore protein expression across different tissues and samples.

This method describes a robust and reproducible approach for the comparison of protein levels in different tissues and at different developmental timepoints using a standardized quantitative western blotting approach.

Robuste Vergleich der Proteingehalte in Gewebe und in der gesamten Entwicklung mit standardisierten quantitativen Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The protocol outlined here takes advantage of the di-glycine (-GG) modification left after the tryptic digestion of ubiquitin incorporated in a chain. By quantifying these topology-characteristic peptides the relative abundance of each ubiquitin chain topology can be determined. The steps required to quantify these peptides by a parallel reaction monitoring experiment are reported taking into consideration the stabilization of ubiquitin chains. Preparation of heavy controls, cell lysis, and digestion are described along with the appropriate mass spectrometer setup and data analysis workflow. An example data set with perturbations in ubiquitin topology is presented, accompanied by examples of how optimization of the protocol can affect results. By following the steps outlined, a user will be able to perform a global assessment of the ubiquitin topology landscape within their biological context.

This method describes the assessment of global changes in ubiquitin chain topology. The assessment is performed by the application of a mass spectrometry-based targeted proteomics approach.

Ubiquitin-Kettenanalyse durch Parallelreaktionsüberwachung

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 (FET) family of fusion oncoproteins, is one of the most frequently involved fusion genes in Ewing sarcoma. These FET family fusion proteins typically harbor a low-complexity domain (LCD) of FET protein at their N-terminus and a DNA-binding domain (DBD) at their C-terminus. EWS-FLI1 has been confirmed to form biomolecular condensates at its target binding loci due to LCD-LCD and LCD-DBD interactions, and these condensates can recruit RNA polymerase II to enhance gene transcription. However, how these condensates are assembled at their binding sites remains unclear. Recently, a single-molecule biophysics method-DNA Curtains-was applied to visualize these assembling processes of EWS-FLI1 condensates. Here, the detailed experimental protocol and data analysis approaches are discussed for the application of DNA Curtains in studying the biomolecular condensates assembling on target DNA.

Here, we describe the use of the single-molecule imaging method, DNA Curtains, to study the biophysical mechanism of EWS-FLI1 condensates assembling on DNA.

Einzelmolekül-Bildgebung von EWS-FLI1-Kondensaten auf DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...