DNA üzerindeki transkripsiyon faktörlerinin faz ayrımını gözlemlemek için tek bir molekül testi sağlıyoruz Bu teknik, DNA üzerinde sıvı damlacık olarak toplanan transkripsiyon faktörlerinin dinamik sürecinin gerçek zamanlı olarak gerçekleştirilmesini sağlar. EWS-FL1, Ewing sarkomu tümörigenezinde en sık tutulan füzyon genlerinden biridir. Araştırmamız, DNA motif numarası ile tümör hücrelerinde çorak bir gen transkripsiyonu ile ilişkili olan ve belki de prognoz için yararlı olan EWS-FL1 kondens oluşumu arasındaki ilişkiyi tanımlayabilir.
Bu yöntem, P53 ve MED1 gibi in vitro herhangi bir transkripsiyon kondensatını veya kompleksini incelemek için uygulanabilir. Bir DNA perdesi deneyi için zikzak nano fabrikasyon bariyerlere sahip bir akış hücresi hazırlamak için, giriş ve çıkış tüplerini doğru yönde bağlayın. Daha sonra akış hücresini, iki adet üç mililitrelik şırınga kullanarak 2,5 mililitre lipit tamponu ile yıkayın, böylece akış hücresinde kabarcık olmadığından emin olun.
Şırıngayı çıktıdan çıkarın ve her enjeksiyon arasında beş dakikalık bir inkübasyonla üç kez bir mililitre lipozom çözeltisi enjekte edin. İyileşme için, akış hücresini 2,5 mililitre lipit tamponu ile yavaşça yeniden yıkayın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Kuluçka sırasında, BSA tamponunu metin yazısında belirtildiği gibi hazırlayın.
Daha sonra 30 dakikalık iyileşmeden sonra, akış hücresini çıkış tarafından 2,5 mililitre BSA tamponu ile yıkayın. Daha sonra, giriş tarafından akış hücresine 800 mikrolitre streptavidin tamponunu, her adımdan sonra 10 dakikalık bir inkübasyonla iki adımda enjekte edin. Daha sonra tüm serbest streptavidin moleküllerini çıkarmak için akış hücresini 2,5 mililitre BSA tamponu ile yıkayın.
Daha sonra, BSA tamponu kullanarak biyotin Lambda DNA'sını klonlanmış motiflerle seyreltin ve beş dakikalık aralıklarla dört kez yavaşça enjekte edin. Enjeksiyon sırasında, bilimsel ücretsiz metal oksit yarı iletken sistemindeki mikroskobu açın. Daha sonra boruyu 10 mililitre çift damıtılmış suyla yıkayın ve prizmayı ve boru konektörünü su,% 2 sıvı küvet temizleyici ve% 99 etanol ile durulayın.
Daha sonra, görüntüleme tamponunun en az 20 mililitresini 30 mililitrelik bir şırıngaya çekin. Akış hücresini mikroskop aşamasına yerleştirin ve mikroakışkan sisteme bağlayın. Dakikada 0.03 mililitrelik bir akış hızı kullanarak, DNA moleküllerini 10 dakika boyunca bariyere yıkayın.
Ardından mikroakışkan sistemi kapatın ve 30 dakika boyunca inkübe edin. akış durdu ve DNA'nın yanal olarak yayılmasına izin verdi. DNA perdeleri üzerindeki EWS-FLI1 yoğuşma oluşumunu görüntülemek için, görüntüleme yazılımını açın ve parlak alan altındaki dokuz zikzak deseninin konumlarını bulun ve işaretleyin.
Ardından, DNA'yı 10 dakika boyunca çift sarmallı DNA boyasıyla boyamak için akışı dakikada 0.2 mililitrede açın. Daha sonra, mCherry EWS-FLI1 proteinini görüntüleme tamponu ile 100 mikrolitrede 100 nanomol konsantrasyonunda seyreltin. Daha sonra protein numunesini valften 100 mikrolitrelik bir cam şırıngayla yükleyin ve akış hızını dakikada 0,4 mililitre olarak değiştirin.
488 nanometre lazeri açtıktan sonra, DNA dağılım durumunu kontrol etmek ve DNA moleküllerinin eşit olarak dağıldığı bölgeyi seçmek için her bölgeyi önceden tarayın. Ardından lazer gücünü 488 nanometre lazer için %10 ve 561 nanometre lazer için %20 olarak ayarlayın. Güç ölçeri kullanarak, prizmanın yakınındaki gerçek lazer gücünü ölçün.
Aynı anda hem 488 hem de 561 nanometre lazerlerle iki saniyelik aralıklarla görüntü almaya başlayın. Ardından, görüntüleme tamponunun protein numunesini 60 saniye sonra akış hücresine yıkamasına izin vermek için valfi manuel moddan enjeksiyon moduna değiştirin. Serbest EWS-FLI1'i çıkarmak için, akış hücresini görüntüleme tamponuyla yalnızca 561 nanometre lazer açıkken beş dakika boyunca yıkamaya devam edin.
Sonra akışı durdurun ve 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. 10 dakika sonra, DNA'nın genişlemesine izin vermek için akışı dakikada 0,4 mililitrede açın ve EWS-FLI1 kondens oluşumunun yüksek verimli verilerini elde etmek için farklı çerçeveler arasında iki saniyelik aralıklarla görüntüler elde edin. EWS-FLI1 molekülleri, 561 nanometre lazerle elde edilen mCherry etiketli EWS-FLI1 sinyallerini tespit ederek görselleştirildi.
DNA substratındaki 25 GGAA tekrarının bulunduğu yerde EWS-FLI1 kondensatının in vitro oluşumu doğrudan görselleştirilebilir. DNA perdelerinde kullanılan mCherry EWS-FLI1'in özgüllüğü, 25 GGAA tekrarı olan ve olmayan bir DNA şablonu kullanılarak elektroforetik hareketlilik kayma testi ile doğrulandı. EWS-FLI1 konsantrasyonu 20 ila 500 nanomol arasında titre edildiğinde, EWS-FLI1 yoğunluğu çarpıcı bir şekilde artmıştır.
FLI bir DBD yoğunluğundaki değişim, proteinler GGAA tekrarlarını kapsayacak şekilde doyurulduğunda ihmal edilebilirken, EWS-FLI1'in DNA üzerinde yoğuşmalar oluşturduğunu düşündürmektedir. Enjeksiyon çok yavaş ve yumuşak olmalıdır, böylece lipozom ve DNA akış hücresine eşit olarak dağılabilir. Saflaştırılmış bir transkripsiyon faktörünün özellikle in vitro hedef sekansla bağlandığını doğrulamak için MSA yapmak önemlidir.
Bu teknik, insanların kondensatın transkripsiyon faktörlerinin hedef aramasını kolaylaştırıp kolaylaştırmayacağını ve transkripsiyon üzerindeki etkisini keşfetmelerini sağlar.
