Bu çalışmada NP Ulusal Bilimler ve mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC, keşif grant) ve Université de Moncton hibe tarafından finanse edildi. LHB Kanada Enstitüsü Sağlık Araştırma (CIHR), New Brunswick yenilik Vakfı (NBIF) ve Université de Moncton finansman desteğinden kabul etmek istiyorum. EHC çalışmalarını Université de Moncton ve Alzheimer Derneği Kanada, beyin Kanada, NSERC, Kanadalı göğüs kanseri Vakfı, New Brunswick yenilik Vakfı, New Brunswick sağlık Araştırmaları Vakfı tarafından desteklenmektedir.

1. reaktifler hazırlık
<ol><li>Aşağıdaki çözümleri diseksiyon ve permeabilization doku için hazırlayın.<ol>
<li>Koruma çözüm hazırlamak: 2.77 mM CaK2EGTA, 7.23 mM K2EGTA, 5,77 mM Na2ATP, 6.56 mM MgCl2, 20 mM taurin, 15 mM Na2phosphocreatine, 20 mM imidazole, 0,5 mM dithiothreitol ve 50 mM K-MES, pH 7.1 (saklanabilir -20 ° C'de).</li>
		<li>Saponin çözüm hazırlamak: saponin koruma çözümü 1 ml 5 mg (taze günlük hazırlamak).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aşağıdaki çözümleri Solunum ölçüm için hazırlayın.<ol>
<li>Solunum orta hazırlamak: 120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 3 mM HEPES, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2ve % 0,2 BSA (w/v), pH 7.2.</li>
		<li>Hazırlamak yüzeylerde, uncoupler, inhibitörleri. H2O tüm yüzeylerde dağıtılması ve uncoupler FCCP yanı sıra inhibitörleri (malonat H2O seyreltilmiş) dışında mutlak etanol içinde çözülür. En yüzeylerde hem de malonat ( Tablo malzemelerigörmek) etkisiz hale getirin. Tüm konsantrasyonları iletişim kuralında verilen 2 mL Odaları içinde son konsantrasyonları vardır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. hazırlık ve yüksek çözünürlüklü Respirometer kalibrasyonu.
<ol><li>Chambers, kapaklar ve stoper respirometer % 70 etanol ile üç kez ve üç kez distile su ile yıkayın.</li>
	<li>Sıfır oksijen konsantrasyonu kalibre: solunum orta odalarında 2.3 mL damlalıklı ve 10 mg sodyum dithionite ekleyin. Odası maksimum hacmi 2 mL olsa da, 2.3 mL hiçbir hava kabarcığı odaları kapatırken tıpa altında kalmasını sağlamak için eklenir. Chambers stoper ile kapatın ve oksijen konsantrasyonu 10-20 dk. Ayarla'ya elektrotlar, sıfır oksijen konsantrasyonu ile elde edilen oksijen tüketim oranını ölçmek.</li>
	<li>Odaları distillated su ile yıkama, 10 min için mutlak etanol içinde kuluçkaya ve sonra distile su ile durulayın.</li>
	<li>Hava doygunluk ayarlama: solunum orta odalarında, 2.3 mL damlalıklı stoper yerleştirin, stoper üstüne fazla orta Aspire edin ve daha sonra stoper rondela ile kaldırın. Aşırı solunum orta odasında (2 mL toplam hacmi) odaları kapattıktan sonra hava kabarcıkları varlığı önlemek için pipetted.</li>
	<li>45 dk kadar oksijen konsantrasyonu (Mavi izle) 250 istikrarlı bir saat için oksijen tüketimini izlemek 24 ° C'de nM</li>
</ol>3. diseksiyon sinekler ve doku Permeabilization
<ol><li>Buz üzerinde gerçekleştirilen tüm adımlar emin olun.</li>
	<li>Altı erkek sinek aynı baskı uyuşturan, aynı yaş ve aynı diyet (vahşi tipi w1118, 15 günlükken, Mısır unu ortamda beslenen) Sineklerin Tanrısı disseksiyon kolaylaştırmak için buz üzerinde büyüdü.</li>
	<li>Bir neşter ve ince uçlu forseps kullanarak, (başkanları ve abdomens kaldırmak) sinekler sadece uçuş kasları içeren thoraxes tutmak için incelemek. Bu adım-ebilmek kılınmak çıplak gözle. Elde edilen thoraxes ince uçlu Forseps ile başa.</li>
	<li>Üç disseke thoraxes 25 mm 2 mL forseps kullanarak buz gibi koruma çözeltisi içeren Petri kabına aktarın.</li>
	<li>İnce uçlu Forseps ile mekanik forseps ucu thoraxes ekleyerek thoraxes permeabilize ve art arda gevşek bağlı ağı elde etmek için doku altını üstüne getirin.</li>
	<li>24-şey tabak içinde iki kuyu 12.5 µL saponin çözüm ve 1 mL saponin 62.5 µg/mL nihai bir konsantrasyon elde etmek için koruma çözeltisi ile doldurun. İki bitişik wells solunum orta 1 mL ile doldurulması.</li>
	<li>İnce uçlu Forseps ile seyreltilmiş saponin çözüm içine üç permeabilized thoraxes transfer ve üzerinde bir orbital Çalkalayıcı, buz üzerinde 20 dk hafif ajitasyon ile kuluçkaya.</li>
	<li>Sonra ikinci kuluçka, lifler buzda saponin durulama 5 min için hafif ajitasyon ile solunum orta dolu bitişik kuyu içine aktarın.</li>
</ol>4. kuru ağırlığı tayini
<ol><li>Emici bir yüzeyi permeabilized thoraxes kuru ve 3 - 4 kez tüm nem kaldırılır emin olmak için ince uçlu forseps kullanarak ters çevirin.</li>
	<li>Üç thoraxes birlikte bir microbalance üzerinde tartın. Mitokondrial oksijen tüketim oranları normalleştirmek için kullanılacak elde edilen ağırlık not edin.</li>
	<li>Solunum orta bir damla ve dokularda hemen buza aktarın.</li>
</ol>5. oksijen tüketim oranları belirlenmesi
<ol><li>Respirometer odaları açın (stoper kaldırmak) ve 10 mM pyruvate ve malat 2 mM her odanın içine ekleyin.</li>
	<li>Permeabilized dokuları doğrudan solunum orta ile dolu odaları içine ekleyin.</li>
	<li>Stoper spacer kullanarak değiştirin.</li>
	<li>60 mL şırınga ile oksijen doğrudan bir oksijen tankından toplamak ve 2-5 mL oksijen tıpa kılcal Oksijen difüzyon yoluyla doku oksijen tüketimini sınırlamak değil emin olmak için her odası yoluyla enjekte.</li>
	<li>Bir Hamilton şırınga thoraxes odasında kalır emin olmak için her tıpa kılcal takın.</li>
	<li>Oksijen konsantrasyonu yaklaşık 400 olduğunda odaları tamamen kapatmak nM, hava doygunluk oksijen seviyeleri elde (yaklaşık %160 hava doygunluk) Odalar içinde.</li>
	<li>Durdurun ve hava kabarcıkları odalarında denetlemek için karıştırıcı başlatın.</li>
	<li>Daha önce kitle özgü oksijen tüketimi (pmol O2 consumed.s-1.mg-1 doku) görüntüleme solunum oranları doku (mg), kitle tarafından normalize etmek tartılır doku kütlesi girin.</li>
	<li>Oksijen tüketimi (kırmızı izle) stabil bir kez, 5 mM ADP Hamilton şırınga ile ekleyin.</li>
	<li>Şırınga ile distile su, % 70 etanol, her enjeksiyon sonra durulama ve tekrar distile su.</li>
	<li>Oksijen tüketimi daha istikrarlı bir kez, 4 mm sitokrom c 5 µL enjekte et.</li>
	<li>ETS mitokondrial oksijen tüketimi farklı adımları değerlendirmek için aşağıdaki yüzeylerde sıralı enjeksiyon için devam edin:<ol>
<li>2 M prolin 5 µL ekleyin.</li>
		<li>1 M süksinat 10 µL ekleyin.</li>
		<li>Bir 1 M gliserol-3-fosfat 30 µL ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Titrasyon şekilde uncoupler FCCP 0.5-1 adımlarla enjekte µM (1 mM çözüm 2 µL) en iyi toplama kadar olduğunu ulaştı, Yani, en yüksek oksijen tüketimi inhibisyon mümkün ulaşmak için konsantrasyon (dikkat: tablo bkz: malzemelerin).</li>
	<li>Ardışık olarak tamamen kalan oksijen tüketimi (ROX) ölçmek için ETS elektron akı etkisizleştirmek için aşağıdaki inhibitörü enjekte Siklooksijenaz reaksiyonlar diğerleri arasında gibi yani sigara-solunum reaksiyonları:<ol>
<li>1 mM rotenon 1 µL ekleyin (dikkat: Tablo malzemelerigörmek).</li>
		<li>2 M malonat 5 µL ekleyin (dikkat: Tablo malzemelerigörmek).</li>
		<li>5 mM antimycin A 1 µL ekleyin (dikkat: Tablo malzemelerigörmek).</li>
	</ol>
</li>
	<li>0.2 mM askorbat ve 0,5 karmaşık IV oksijen tüketimi ölçmek için askorbat ile başlayan mM TMPD Odaları, sırayla içine ekleyin.</li>
	<li>Karmaşık IV etkisizleştirmek için sodyum azid 20 mM ekleyin (dikkat: Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Sinyal sabit olduğunda, odaları rondela ile açık odaları 2 mL saf oksijen enjekte edilerek yeniden oksijen ve konsantrasyonu etrafta olduğunda odaları yakın 250-300 nmol.mL-1.</li>
	<li>10-15 dk işaretimi ölçmek ve kimyasal arka planda, Yani, TMPD autoxidation nedeniyle oksijen tüketimini hesaplamak.</li>
</ol>6. Respirometer temizlik
<ol><li>Ölçümler sonra bir kez chambers distile su ile durulayın ve odalarında üç kez % 70 etanol durulayın.</li>
	<li>İnhibitörleri devre dışı bırakabilirsiniz için 10 dakika için mutlak etanol içinde kuluçkaya.</li>
	<li>Üç kez distile su ile durulayın, odaları ile % 70 etanol doldurmak ve Tıpalar ve kapaklar sonraki kullanımı kadar değiştirebilirsiniz.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Stephenson, R., Metcalfe, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster:+a+fly+through+its+history+and+current+use.">Drosophila melanogaster: a fly through its history and current use.</a> The journal of the Royal College of Physicians of Edinburgh. 43 (1), 70-75 (2013).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+attempt+to+analyze+the+constitution+of+the+chromosomes+on+the+basis+of+sex-limited+inheritance+in+Drosophila.">An attempt to analyze the constitution of the chromosomes on the basis of sex-limited inheritance in Drosophila.</a> Journal of Experimental Zoology. 11 (4), 365-413 (1911).</li><li>Dobzhansky, T., Wright, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Natural+Populations.+V.+Relations+between+Mutation+Rate+and+Accumulation+of+Lethals+in+Populations+of+Drosophila+Pseudoobscura.">Genetics of Natural Populations. V. Relations between Mutation Rate and Accumulation of Lethals in Populations of Drosophila Pseudoobscura.</a> Genetics. 26 (1), 23-51 (1941).</li><li>Zipursky, S. L., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Neuronal+Cell+Fate:+Lessons+from+the+R7+Neuron+of+Drosophila.">Determination of Neuronal Cell Fate: Lessons from the R7 Neuron of Drosophila.</a> Annual Review of Neuroscience. 17 (1), 373-397 (1994).</li><li>Costa, R., Speretta, E., Crowther, D. C., Cardoso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+the+therapeutic+potential+of+doxycycline+in+a+Drosophila+melanogaster+model+of+Alzheimer+disease.">Testing the therapeutic potential of doxycycline in a Drosophila melanogaster model of Alzheimer disease.</a> The Journal of biological chemistry. 286 (48), 41647-41655 (2011).</li><li>Blandini, F., Armentero, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Parkinson's+disease.">Animal models of Parkinson's disease.</a> FEBS Journal. 279 (7), 1156-1166 (2012).</li><li>Baker, K. D., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+Larvae+and+Obese+Flies-Emerging+Studies+of+Metabolism+in+Drosophila.">Diabetic Larvae and Obese Flies-Emerging Studies of Metabolism in Drosophila.</a> Cell Metabolism. 6 (4), 257-266 (2007).</li><li>Morris, S. N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+diet-induced+insulin+resistance+in+adult+Drosophila+melanogaster.">Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1822 (8), 1230-1237 (2012).</li><li>Abou-Sleiman, P. M., Muqit, M. M. K., Wood, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+insights+of+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease.">Expanding insights of mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (3), 207-219 (2006).</li><li>McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+an+in+vivo+model+for+human+neurodegenerative+disease.">Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease.</a> Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).</li><li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li><li>Carri, M. T., Valle, C., Bozzo, F., Cozzolino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+mitochondrial+damage:+importance+in+non-SOD1+ALS.">Oxidative stress and mitochondrial damage: importance in non-SOD1 ALS.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 1-6 (2015).</li><li>Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+oxidants,+and+aging.">Mitochondria, oxidants, and aging.</a> Cell. 120 (4), 483-495 (2005).</li><li>Szibor, M., Holtz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ageing.">Mitochondrial ageing.</a> Basic Research in Cardiology. 98 (4), 210-218 (2003).</li><li>Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+mitophagy+and+mitochondrial+biogenesis+during+ageing+in+C.+elegans.">Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans.</a> Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).</li><li>L&#243;pez-Lluch, G., Irusta, P. M., Navas, P., de Cabo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+biogenesis+and+healthy+aging.">Mitochondrial biogenesis and healthy aging.</a> Experimental Gerontology. 43 (9), 813-819 (2008).</li><li>Muoio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+inflexibility:+When+mitochondrial+indecision+leads+to+metabolic+gridlock.">Metabolic inflexibility: When mitochondrial indecision leads to metabolic gridlock.</a> Cell. 159 (6), 1253-1262 (2014).</li><li>Efeyan, A., Comb, W. C., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient-sensing+mechanisms+and+pathways.">Nutrient-sensing mechanisms and pathways.</a> Nature. 517 (7534), 302-310 (2015).</li><li>Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+respiration+and+ATP+synthesis+in+mammalian+mitochondria+and+cells.">Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells.</a> The Biochemical journal. 284 (1), 1-13 (1992).</li><li>McDonald, A. E., Pichaud, N., Darveau, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&amp;#34;Alternative&amp;#34;+fuels+contributing+to+mitochondrial+electron+transport:+Importance+of+non-classical+pathways+in+the+diversity+of+animal+metabolism.">&amp;#34;Alternative&amp;#34; fuels contributing to mitochondrial electron transport: Importance of non-classical pathways in the diversity of animal metabolism.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. , (2017).</li><li>Soares, J. B. R. C., Gaviraghi, A., Oliveira, M. F., Veuthey, J., Zamboni, N., Westermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Physiology+in+the+Major+Arbovirus+Vector+Aedes+aegypti:+Substrate+Preferences+and+Sexual+Differences+Define+Respiratory+Capacity+and+Superoxide+Production.">Mitochondrial Physiology in the Major Arbovirus Vector Aedes aegypti: Substrate Preferences and Sexual Differences Define Respiratory Capacity and Superoxide Production.</a> PLOS ONE. 10 (3), e0120600 (2015).</li><li>Newell, C., Kane, C. L., Kane, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+substrate+specificity+in+beetle+flight+muscle:+assessing+respiratory+oxygen+flux+in+small+samples+from+Dermestes+maculatus+and+Tenebrio+molitor.">Mitochondrial substrate specificity in beetle flight muscle: assessing respiratory oxygen flux in small samples from Dermestes maculatus and Tenebrio molitor.</a> Physiological Entomology. 41 (2), 96-102 (2016).</li><li>Teulier, L., Weber, J. M., Crevier, J., Darveau, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proline+as+a+fuel+for+insect+flight:+enhancing+carbohydrate+oxidation+in+hymenopterans.">Proline as a fuel for insect flight: enhancing carbohydrate oxidation in hymenopterans.</a> Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 283 (1834), 20160333 (2016).</li><li>Ferguson, M., Mockett, R. J., Shen, Y., Orr, W. C., Sohal, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+decline+in+mitochondrial+respiration+and+electron+transport+in+Drosophila+melanogaster.">Age-associated decline in mitochondrial respiration and electron transport in Drosophila melanogaster.</a> The Biochemical journal. 390 (2), 501-511 (2005).</li><li>Miwa, S., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+topology+of+superoxide+production+by+complex+III+and+glycerol+3-phosphate+dehydrogenase+in+Drosophila+mitochondria.">The topology of superoxide production by complex III and glycerol 3-phosphate dehydrogenase in Drosophila mitochondria.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1709 (3), 214-219 (2005).</li><li>Katewa, S. D., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sympatric+Drosophila+simulans+flies+with+distinct+mtDNA+show+difference+in+mitochondrial+respiration+and+electron+transport.">Sympatric Drosophila simulans flies with distinct mtDNA show difference in mitochondrial respiration and electron transport.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 37 (3), 213-222 (2007).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>St-Pierre, J., Buckingham, J. A., Roebuck, S. J., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topology+of+superoxide+production+from+different+sites+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain.">Topology of superoxide production from different sites in the mitochondrial electron transport chain.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 44784-44790 (2002).</li><li>Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N., Saks, V., Margreiter, R., Kunz, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers,+tissues+and+cells.">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle.+New+perspectives+of+mitochondrial+physiology.">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).</li><li>Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+isolation,+structure+and+function.">Mitochondria: isolation, structure and function.</a> The Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).</li><li>Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+sensitivity+of+mitochondrial+functions+in+permeabilized+muscle+fibers+from+two+populations+of+Drosophila+simulans+with+divergent+mitotypes.">Thermal sensitivity of mitochondrial functions in permeabilized muscle fibers from two populations of Drosophila simulans with divergent mitotypes.</a> American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 301 (1), R48-R59 (2011).</li><li>Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+mitochondrial+dna+haplotypes+exhibit+metabolic+differences:+insight+into+functional+properties+of+mitochondria.">Naturally occurring mitochondrial dna haplotypes exhibit metabolic differences: insight into functional properties of mitochondria.</a> Evolution. 66 (10), 3189-3197 (2012).</li><li>Pichaud, N., Messmer, M., Correa, C. C., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet+influences+the+intake+target+and+mitochondrial+functions+of+Drosophila+melanogaster+males.">Diet influences the intake target and mitochondrial functions of Drosophila melanogaster males.</a> Mitochondrion. 13 (6), 817-822 (2013).</li><li>Wolff, J. N., Pichaud, N., Camus, M. F., C&#244;t&#233;, G., Blier, P. U., Dowling, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+implications+of+mitochondrial+genetic+variation:+mitochondrial+genetic+effects+on+OXPHOS+respiration+and+mitochondrial+quantity+change+with+age+and+sex+in+fruit+flies.">Evolutionary implications of mitochondrial genetic variation: mitochondrial genetic effects on OXPHOS respiration and mitochondrial quantity change with age and sex in fruit flies.</a> Journal of Evolutionary Biology. 29 (4), 736-747 (2016).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle.">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).</li><li>Phang, J. M., Donald, S. P., Pandhare, J., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolism+of+proline,+a+stress+substrate,+modulates+carcinogenic+pathways.">The metabolism of proline, a stress substrate, modulates carcinogenic pathways.</a> Amino Acids. 35 (4), 681-690 (2008).</li><li>Bender, T., Martinou, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+pyruvate+carrier+in+health+and+disease:+To+carry+or+not+to+carry?.">The mitochondrial pyruvate carrier in health and disease: To carry or not to carry?.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (10), 2436-2442 (2016).</li><li>Divakaruni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazolidinediones+are+acute,+specific+inhibitors+of+the+mitochondrial+pyruvate+carrier.">Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).</li><li>McCommis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ancestral+role+for+the+mitochondrial+pyruvate+carrier+in+glucose-stimulated+insulin+secretion.">An ancestral role for the mitochondrial pyruvate carrier in glucose-stimulated insulin secretion.</a> Molecular Metabolism. 5 (8), 602-614 (2016).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu çalışmada, Drosophila mitokondrial oksijen tüketimi ölçümleri önce numune hazırlama için bir yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntem özellikle süresi ve gerekli bireylerin sayısı açısından mitokondriyal izolasyonların kullanarak iletişim kuralları ile ilgili farklı sorunların üstesinden gelmek için geliştirilmiştir. Mitokondrial izolasyonların genellikle çeşitli bireyler elde edilen dokular, büyük miktarda gerektiren çalışma yerine, bu deney kaç Drosophila thoraxes permeabilized kas ...

Meyve sineği Drosophila melanogaster, bir model organizma genetik araştırma için bir yüzyıl1kullanılmıştır. Bu organizma çalışmanın yalnızca önemli temel bilgi sex-linked miras2, mutasyon oranı3, sinir sisteminin geliştirilmesi ve hücre kader tayini4hakkında yol açmıştır değil ama aynı zamanda son zamanlarda ortaya çıkmıştır bir 5,6Alzheimer ve Parkinson gibi çeşitli hastalıklara doğal mekanizmaları incelemek için değerli bir araç. Ayrıca, yaşlanma sürecini çalışma boşluğunda büyük numara kısa bir süre içinde yükseltilebilir ve kısa bir ömrü var gibi popüler modelidir. Onlar da bir kalp, oenocytes (hepatosit benzeri hücreleri), yağ (karaciğer ve beyaz yağ dokusu benzer şekilde işleyen) organları, insülin üreten hücreleri (β-pankreas hücreleri eşdeğeri), gibi insan organlarını homolog yapılara sahip yanı sıra metabolitler (omurgalılar kan için benzer)7taşıma hemolymph. Ayrıca, ara metabolizma (insülin/İnsülin benzeri büyüme faktörü benzeri sinyal yolu ve hedef Rapamycin-TOR yolları dahil olmak üzere) Merkezi yollar da son derece korunmuş7vardır. Bu nedenlerden dolayı Drosophila son zamanlarda istismar metabolizmasında, patolojik koşulları diyabet8gibi insan metabolik hastalıklar için doğal özellikle kontrol temel mekanizmaları açıklamak için. Metabolizma bir büyük mitokondri ATP üretimi, oksidatif fosforilasyon süreci (OXPHOS) ile birden çok yolları entegre ve hayatın en önemli biyolojik işlevlerden birini gerçekleştiren bileşendir. Organizmanın metabolizma onların merkezi rolü göz önüne alındığında, mitokondriyal işlev bozuklukları Parkinson9 ve Alzheimer hastalıkları10gibi birçok hastalığın yanı sıra amyotrofik lateral skleroz katılmaktadırlar şaşırtıcı değil. 11 , 12. onlar da yaşlanma sürecini temel belirleyicileri bulunmaktadır. Nitekim, hücresinde, hücre-oksidatif hasar11yüksek konsantrasyon, zararlı olabilen Reaktif oksijen türleri (ROS) ana ürete ülkelerdir. Yaşlanma da zarar görmüş veya mutasyona uğramış mitokondrial DNA13, mitophagy işlev bozuklukları14,15 yanı sıra mitokondrial Biyogenez16bozulma birikimi ilişkili olduğu düşünülmektedir. Onlar-ebilmek kullanmak belgili tanımlık bolluk ya da kıtlık macronutrients17,18göre çeşitli hücresel fonksiyonları ayarlamak için farklı yüzeylerde gibi mitokondri anahtar hücrenin homeostazı belirleyicileri de vardır.
Gerçekten de, diyet (karbonhidratlar, yağlar ve proteinler) farklı besinleri sindirmek, emilir ve hücrelere taşınan. O zaman içinde sitozol dönüştürülür ve türetilmiş yüzeylerde NADH ve FADH219gibi azalan bakiyeli eşdeğerleri nerede ürettikleri mitokondrial matris içine taşınır. Bu azalan bakiyeli eşdeğerleri sonra elektron taşıma sistemi (ETS) farklı enzimatik kompleksleri tarafından okside. Bu komplekslerin mitokondriyal iç zar gibi karmaşık katıştırılır ben ve karmaşık II. Ayrıca, mitokondrial gliserol-3-fosfat dehidrogenaz ve prolin dehidrojenaz gibi enzimatik diğer kompleksler elektron girileceği alternatif rotalar ETS20,21temsil eder. 'Alternatif' Bu komplekslerin böcekler, özellikle önemlidir olarak tür göre onlar aktif olarak solunum20,22,23,21artırmak için katılabilir. Besleme sistemleri bu ETS elektron ubiquinone ve daha sonra karmaşık III ve sonra için karmaşık IV, son alıcısı, moleküler oksijen kadar aktarılır. Bu elektron transferi karmaşık V (şekil 1), ATP ADP fosforilasyon giderken iç mitokondri zar arasında bir proton-güdü güç oluşturur. Mitokondri içinde hücrenin Homeostazı, mitokondriyal metabolizma ilgili modeli D. melanogaster temsil kullanarak eğitim merkezi rolü çeşitli temel mekanizmaları betimlemek için güçlü bir araç patofizyolojik dikkate alınarak koşullar veya hücresel ve çevresel stres altında. Şaşırtıcı ancak, çalışmalar sadece bir avuç aslında Drosophila24,25,26mitokondrial solunum ölçülür. Nitekim, mitokondrial oksijen tüketimi değerlendirmek amaçlayan deneyler mitokondri yalıtımı. Farklı mitokondrial işlevleri (örneğin, ROS üretim veya P/O oranına işaret mitokondrial verimliliği27,28) ölçümü için avantajlı olmasına rağmen bu izolasyonların genel olarak oldukça büyük miktarda gerektirir dokusunun birkaç bireyler24,29. Önemli bir sınırlayıcı faktör, özellikle tüm kişiler aynı yaşta olmalıdır dikkate alınarak ve tercihen deneyler için aynı Cinsiyeti, solunum farklı zamanda ölçüsü yapım yüksek miktarda doku ve bireyler için bu gereklidir En iyi ihtimalle zahmetli işaret eder. Mitokondrial izolasyonların mitokondriyal metabolizma yöneten temel mekanizmaları önemli içgörü sağlayabilir, Ayrıca, mitokondri ayırmak için kullanılan yöntemleri yinelenebilir sonuçları elde etmek için zorluk gibi çeşitli dezavantajları vardır , bozulma mitokondrial ağın ve değişiklik mitokondri yapısı ve fonksiyonu29,30,31.
Bu çalışmada dokudan çok kaç kişi en az bir miktarda kullanarak Drosophila mitokondrial oksijen tüketimini ölçmek için sağlam bir protokolü sunmaktır. Bu iletişim kuralı mitokondrial oksijen tüketimi in situ permeabilized kas lifleri29 Drosophila thoraxes üzerinden yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri32,33, ile birlikte kullanarak ölçme oluşur 34 , 35. bu yöntem aynı zamanda diğer bileşenlerle etkileşimleri hücrenin de mitokondri yapısı ve fonksiyonu daha içinde korunur gibi permeabilized bu yana klasik mitokondrial izolasyon yöntemine göre ek avantajları vardır Bu yaklaşım daha fizyolojik ilgili yapan lifleri29,31,36. Bu iletişim kuralıyla, mitokondriyal işlev doğru yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri Drosophila, sadece üç thoraxes içinde oksijen tüketimi belirlenmesi ETS birkaç farklı adımları izin yüzeyler ile değerendirilmek. Bu nedenle, bu iletişim kuralını Drosophila modeli yararlanarak metabolizma birçok çevresel veya patofizyolojik durum bağlamında kontrol temel mekanizmaları hakkında önemli sorulara cevap yardımcı olabilir.
ETS birkaç farklı adımlar oksijen tüketimini ölçmek ve ne kadar farklı yüzeylerde değerlendirmek için katkıda solunum, farklı yüzeylerde (şekil 1), uncoupler ve inhibitörleri vardır kullanılan30 sonra permeabilization doku. Özellikle, farklı yüzeylerde sıralı eklemeler elektronları ETS farklı kompleksleri ile giriş uyarmak için yapılır. Bir uncoupler karbonil siyanür 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), sonra sigara birleştiğinde solunum ölçmek için en uygun konsantrasyonu ekledi, Yani, sigara phosphorylating solunum maksimal oksijen tüketimi teşvik. Sıralı engellemeler konut projeleri ı, II ve III sonra sigara-ETS oksidasyon tepkiler nedeniyle kalan oksijen tüketimini izlemek için gerçekleştirilir. Son olarak, karmaşık IV maksimal solunum kapasitesi N, N, N iğne ile değerlendirilebilir ', N, - Tetramethyl - p-boya (TMPD), bir yapay elektron sağlayıcı ve askorbat. Ondan beri onun'hangi sinekler yetiştirilir sıcaklık deneyleri 24 °C yürütülen unutmamak gerekir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>High-resolution respirometer Oxygraph O2K</td>
			<td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td>
			<td>10022-02</td>
			<td>Startup O2K respirometer kit 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2K-Titration Set&#160;</td>
			<td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td>
			<td>20820-03</td>
			<td>Hamilton syringes with different volumes 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Datlab software</td>
			<td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td>
			<td>20700</td>
			<td>Software for data acquisition and analysis 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped antimagnetic forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-400</td>
			<td> 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secura225D-1S-DQE</td>
			<td>Sartorius AG, Goettingen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Semi-micro balance (distributed by several companies)&#160; 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster wild-type w1118</td>
			<td>Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA</td>
			<td></td>
			<td> 
			Storage Condition: 24 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td>EGTA 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1767</td>
			<td>CAUTION: corrosive to metals, acute toxicity, skin corrosion, serious eye damage, acute aquatic toxicity. 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4830</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td> 
			Storage Condition: -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2Phosphocreatine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td> 
			Storage Condition: -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td> 
			Storage Condition: 2-8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8250</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin from quillaja bark</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7900</td>
			<td>Saponin 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: 5 mg in 1 mL of preservation solution. Prepare fresh daily.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>05470</td>
			<td> 
			Storage Condition: 2-8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2S2O4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>157953</td>
			<td>Sodium dithionite. CAUTION: self-heating substances and mixtures, acute toxicity, acute aquatic toxi chronic aquatic toxicity. 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2256</td>
			<td>Pyruvate 
			Storage Condition: 2-8 &#176;C 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Prepare fresh daily.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(-)-Malic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1000</td>
			<td>Malate 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-diphosphate monopotassium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5285</td>
			<td>ADP 
			Storage Condition: -20 &#176;C 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c from equine heart</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7752</td>
			<td>Cytochrome c 
			Storage Condition: -20 &#176;C 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380</td>
			<td>Proline 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2378</td>
			<td>Succinate 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sn-Glycerol 3-phosphate bis(cyclohexylammonium) salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7886</td>
			<td>Glycerol-3-phosphate 
			Storage Condition: -20 &#176;C 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td>FCCP. CAUTION: acute toxicity, skin sensitisation, chronic aquatic toxicity. 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in glass vials at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>CAUTION: acute toxicity, skin irritation, eye irritation, specific target organ toxicity (respir sytem), acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. 
			Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in dark vials at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1296</td>
			<td>Malonate. CAUTION: acute toxicity, serious eye damage. 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH. Prepare fresh daily.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from Streptomyces sp.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Antimycin A. CAUTION: acute toxicity, acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. 
			Storage Condition: -20 &#176;C 
			Solution Preparation: In absolute ethanol. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethyl-p-phenylenediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7394</td>
			<td>TMPD 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at&#160; -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+)-Sodium L-ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4034</td>
			<td>Ascorbate 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at&#160; -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Sodium azide. CAUTION: acute toxicity (oral and dermal), specific target organ toxicity (brain), aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity.&#160; 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of mitochondrial oxygen consumption in permeabilized fibers of drosophila using minimal amounts of tissue

Meyve sineği Drosophila melanogaster, metabolizma incelenmesi için gelişmekte olan bir modeli temsil eder. Nitekim, drosophila yapıları için insan organlarını homolog var, son derece korunmuş metabolik yollar sahip ve farklı temel mekanizmaları çalışmanın kısa bir süre içinde sağlar nispeten kısa bir ömrü var. Ancak, bir hücre metabolizması, mitokondrial solunum için gerekli mekanizmaları iyice bu modelde araştırmış değil ki şaşırtıcı olduğunu. Çünkü Drosophila mitokondrial solunum ölçüsü genellikle bireylerin çok sayıda gerektirir ve elde edilen sonuçlar son derece tekrarlanabilir değildir muhtemeldir. Burada, hassas ölçüm Drosophila dokudan en az miktarda kullanarak mitokondrial oksijen tüketimi sağlayan bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntemde, thoraxes disseke ve hem keskin Forseps ile mekanik ve kimyasal olarak farklı bileşikleri hücre zarı geçmek ve mitokondrial solunum modüle izin saponin ile permeabilized. Permeabilization sonra bir uncoupler ve birkaç inhibitörleri onların yanıt yanı sıra farklı yüzeylerde, okside için farklı kompleksler elektron taşıma sistemi (ETS) kapasitesini değerlendirmek için bir iletişim kuralı gerçekleştirilir. Bu yöntem olarak daha fizyolojik ilgili çünkü mitokondri hala hücresel diğer bileşenlerle etkileşim vardır ve mitokondrial Morfoloji korunmuş mitokondrial izolasyonları, kullanma yöntemlerine göre birçok avantajı sunuyor. Ayrıca, örnek hazırlıklar daha hızlı, ve elde edilen sonuçlar son derece tekrarlanabilir. Metabolizma çalışma ile mitokondrial solunum değerlendirilmesi için bir model olarak Drosophila avantajları birleştirerek, önemli yeni bir bilgi-ebilmek var olmak örtüsünü açmak, özellikle ne zaman sinekler karşılaşan farklı çevresel veya patofizyolojik koşullar.

Yukarıda açıklanan protokolünü kullanarak mitokondrial oksijen tüketimi temsilcisi bir iz Şekil 2' de verilmiştir. Pyruvate ve odalarında permeabilized kas lifleri ile birlikte enjekte malat denir ne zaman karmaşık ben ETS tarafından uyarılır NADH pyruvate ve malat yolu ile oksidasyon yoluyla üretilen CI-sızıntı solunum için Yani, tricarboxylic asit döngüsü (CI). Bu solunum hızı sırasında mitokondrial oksijen çoğunlukla pr...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue at JoVE.com

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Bu yazıda, oksijen tüketimi yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri Drosophila permeabilized thoraxes içinde kullanarak ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bu teknik doku klasik mitokondrial yalıtım tekniği için karşılaştırıldığında çok az bir miktar gerektirir ve elde edilen sonuçlar daha fizyolojik ilgilidir.

Doku çok az miktarda kullanarak Drosophila Permeabilized liflerinin mitokondrial oksijen harcama ölçme noktalar

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

measurement-mitochondrial-oxygen-consumption-permeabilized-fibers

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.8K Görüntüleme.  Université de Moncton. Bu yazıda, oksijen tüketimi yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri Drosophila permeabilized thoraxes içinde kullanarak ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bu teknik doku klasik mitokondrial yalıtım tekniği için karşılaştırıldığında çok az bir miktar gerektirir ve elde edilen sonuçlar daha fizyolojik ilgilidir.

Video: Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Biyokimya

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include flavin-dependent respiratory complexes and dehydrogenases that produce a mixture of superoxide (O2&#9679;-) and hydrogen peroxide (H2O2). Accurate quantification of the ROS-producing potential of individual sites in isolated mitochondria can be challenging due to the presence of antioxidant defense systems&#160;and side reactions that also form O2&#9679;-/H2O2. Use&#160;of nonspecific inhibitors that can disrupt mitochondrial bioenergetics can also compromise measurements by altering&#160;ROS release from other sites of production. Here, we present an easy method for the simultaneous measurement of H2O2 release and nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) production by purified flavin-linked dehydrogenases. For our purposes here, we have used purified pyruvate dehydrogenase complex (PDHC) and &#945;-ketoglutarate dehydrogenase complex (KGDHC) of porcine heart origin as examples. This method allows for an accurate measure of native H2O2 release rates by individual sites of production by eliminating other potential sources of ROS and antioxidant systems. In addition, this method allows for a direct comparison of the relationship between H2O2 release and enzyme activity and the screening of the effectiveness and selectivity of inhibitors for ROS production. Overall, this approach can allow for the in-depth assessment of native rates of ROS release for individual enzymes prior to conducting more sophisticated experiments with isolated mitochondria or permeabilized muscle fiber.

Mitochondria contain several flavin-dependent enzymes that can produce reactive oxygen species (ROS). Monitoring ROS release from individual sites in mitochondria is challenging due to unwanted side reactions. We present an easy, inexpensive method for direct assessment of native rates for ROS release using purified flavoenzymes and microplate fluorometry.

Süperoksit/hidrojen peroksit ve NADH üretim mitokondriyal Dehydrogenases Flavin içeren tarafından eş zamanlı ölçüm

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ability to accurately measure the influx and efflux of Ca2+ from mitochondria is important for determining the role of mitochondrial Ca2+ handling in these processes. In this report, we present two methods for the measurement of mitochondrial Ca2+ handling in both isolated mitochondria and cultured cells. We first detail a plate reader-based platform for measuring mitochondrial Ca2+ uptake using the Ca2+ sensitive dye calcium green-5N. The plate reader-based format circumvents the need for specialized equipment, and the calcium green-5N dye is ideally suited for measuring Ca2+ from isolated tissue mitochondria. For our application, we describe the measurement of mitochondrial Ca2+ uptake in mitochondria isolated from mouse heart tissue; however, this procedure can be applied to measure mitochondrial Ca2+ uptake in mitochondria isolated from other tissues such as liver, skeletal muscle, and brain. Secondly, we describe a confocal microscopy-based assay for measurement of mitochondrial Ca2+ in permeabilized cells using the Ca2+ sensitive dye Rhod-2/AM and imaging using 2-dimensional laser-scanning microscopy. This permeabilization protocol eliminates cytosolic dye contamination, allowing for specific recording of changes in mitochondrial Ca2+. Moreover, laser-scanning microscopy allows for high frame rates to capture rapid changes in mitochondrial Ca2+ in response to various drugs or reagents applied in the external solution. This protocol can be applied to measure mitochondrial Ca2+ uptake in many cell types including primary cells such as cardiac myocytes and neurons, and immortalized cell lines.

Here, we present two protocols for the measurement of mitochondrial Ca2+ influx in isolated mitochondria and cultured cells. For isolated mitochondria, we detail a plate reader-based Ca2+ import assay using the Ca2+ sensitive dye calcium green-5N. For cultured cells, we describe a confocal microscopy method using the Ca2+ dye Rhod-2/AM.

Mitokondrial kalsiyum akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri analizleri

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert NADH and FADH into ATP. Since mitochondria are also the primary site for oxygen use and nutrient oxidation to carbon dioxide and water, how efficiently they use oxygen and produce ATP directly relates to the efficiency of nutrient metabolism, nutrient requirements of the animal, and health of the animal. The purpose of this method is to examine mitochondrial respiration, which can be used to examine the effects of different drugs, diets and environmental effects on mitochondrial metabolism. Results include oxygen consumption measured as proton dependent respiration (State 3) and proton leak dependent respiration (State 4). The ratio of State 3 / State 4 respiration is defined as respiratory control ratio (RCR) and can represent mitochondrial energetic efficiency. Mitochondrial proton leak is a process that allows dissipation of mitochondrial membrane potential (MMP) by uncoupling oxidative phosphorylation from ADP decreasing the efficiency of ATP synthesis. Oxygen and TRMP+ sensitive electrodes with mitochondrial substrates and electron transport chain inhibitors are used to measure State 3 and State 4 respiration, mitochondrial membrane PMF (or the potential to produce ATP) and proton leak. Limitations to this method are that liver tissue must be as fresh as possible and all biopsies and assays must be performed in less than 10 h. This limits the number of samples that can be collected and processed by a single person in a day to approximately 5. However, only 1 g of liver tissue is needed, so in large animals, such as dairy cattle, the amount of sample needed is small relative to liver size and there is little recovery time needed.

Here, we share methods for measuring mitochondrial oxygen consumption, a defining concept of nutritional energetics, and proton leak, the primary cause of inefficiency in mitochondrial generation of ATP. These results can account for 30% of the energy lost in nutrient utilization to help evaluate mitochondrial function.

Karaciğer mitokondrial oksijen tüketimi ve Proton sızıntı kinetik Holstein süt sığır mitokondrial solunum tahmin etmek için ölçme

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the progression of cancer, diabetes, neurodegeneration, and aging to name a few. For instance, changes in mitochondrial activity, the cell&#39;s metabolic powerhouse, have been characterized in many such diseases. Generally, the oxygen consumption rates of mitochondria were considered a reliable readout of mitochondrial activity and measurements in some of these studies were based on isolated mitochondria or cells. However, such conditions may not represent the complexity of a whole tissue. Recently, we have developed a novel method that enables the dynamic measurement of oxygen consumption rates from whole isolated fly heads. By utilizing this method, we have recorded lower oxygen consumption rates of the whole head segment in young versus aged flies. Secondly, we have discovered that lysine deacetylase inhibitors rapidly alter the oxygen consumption in the whole head. Our novel technique may therefore aid in uncovering new properties of various drugs, which may impact metabolic rates. Furthermore, our method may give a better understanding of metabolic behavior in an experimental setup that more closely resembles physiological states.

Measuring alterations in metabolic rates is central to understanding the progression of various diseases and aging. Here, we present a novel technique to measure whole head oxygen consumption that more closely resembles the physiological state and may aid in revealing novel drugs that modify mitochondrial activity.

Ölçme ve oksijen Tüketim oranları tamamen yorumlama kafa kesimleri sinek

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays

The assessment of the target engagement, defined as the interaction of a drug with the protein it was designed for, is a basic requirement for the interpretation of the biological activity of any compound in drug development or in basic research projects. In epigenetics, target engagement is most often assessed by the analysis of proxy markers instead of measuring the union of the compound to the target. Downstream biological readouts that have been analyzed include the histone mark modulation or gene expression changes. KDM1A is a lysine demethylase that removes methyl groups from mono- and dimethylated H3K4, a modification associated with the silencing of gene expression. Modulation of the proxy markers is dependent on the cell type and function of the genetic make-up of the cells investigated, which can make interpretation and cross-case comparison quite difficult. To circumvent these problems, a versatile protocol is presented to assess the dose effects and dynamics of the direct KDM1A target engagement. The assay described makes use of a KDM1A chemoprobe to capture and quantify uninhibited enzyme, can be broadly applied to cells or tissue samples without the need for genetic modification, has an excellent window of detection, and can be used both for basic research and analysis of clinical samples.

Here, we present a protocol to measure KDM1A target engagement in a human or animal cell, tissue or blood samples treated with KDM1A inhibitors. The protocol employs chemoprobe tagging of the free KDM1A enzyme and direct quantification of the target occupation using chemoprobe-based immunoassays and can be used in preclinical and clinical studies.

Chemoprobe tabanlı bağışıklık sistemini kullanarak KDM1A hedef etkileşimi doğrudan ölçümü

The assessment of the target engagement, defined as the interaction of a drug with the protein it was designed for, is a basic requirement for the ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective denaturation of proteins from RNA, 3) ribonuclease inactivation, and 4) removal of contamination from DNA, proteins, and carbohydrates. However, it is very laborious to maintain the integrity of RNA when there are high levels of RNase in the tissue. Spontaneous autolysis makes it very difficult to extract RNA from pancreatic tissue without damaging it. Thus, a practical RNA extraction method is needed to maintain the integrity of pancreatic tissues during the extraction process. An experimental and comparative study of existing protocols was carried out by obtaining 20-30 mg of rat pancreatic tissues in less than 2 minutes and extracting the RNA. The results were assessed by electrophoresis. The experiments were carried out three times for generalization of the results. Immersing pancreatic tissue in RNA stabilization reagent at -80 &#176;C for 24 h yielded high integrity RNA, when the RNA extraction reagent was used as the reagent. The results obtained were comparable to the results obtained from commercial kits with spin column bindings.

The purity and integrity of the isolated RNA is a vital step in RNA dependent assays. Here, we present a practical, rapid, and inexpensive method to extract RNA from a small quantity of undamaged pancreatic tissue.

Rat Pankreas Dokusunun Hızlı ve Uygun Maliyetli RNA Ekstraksiyonu

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes

The mitochondrial electron transfer complex (ETC) profile is modified in the heart tissue of the offspring born to an exercised sow. The hypothesis proposed and tested was that a regular maternal exercise of a sow during pregnancy would increase the mitochondrial efficiency of offspring heart bioenergetics. This hypothesis was tested by isolating mitochondria using a mild-isolation procedure to assess mitochondrial ETC and supercomplex profiles. The procedure described here allowed for the processing of previously frozen archived heart tissues and eliminated the necessity of fresh mitochondria preparation for the assessment of mitochondrial ETC complexes, supercomplexes, and ETC complex activity profiles. This protocol describes the optimal ETC protein complex measurement in multiplexed antibody-based immunoblotting and super complex assessment using blue-native gel electrophoresis.

Preparation of mitochondria-enriched samples from previously frozen archived solid tissues allowed the investigators to perform both functional and analytical assessments of mitochondria in various experimental modalities. This study demonstrates how to prepare mitochondria-enriched preparations from frozen heart tissue and perform analytical assessments of mitochondria.

Daha Önce Dondurulmuş Kardiyak Dokudaki Mitokondriyal Elektron Transfer Komplekslerinin Sow'un Yavrularından Ölçülmesi: Egzersize Bağlı Mitokondriyal Biyoenergetik Değişikliklerini Değerlendirmek için Bir Model

The mitochondrial electron transfer complex (ETC) profile is modified in the heart tissue of the offspring born to an exercised sow. The hypothesis ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This enables quantifications of ultrastructural aspects such as volume fractions, surface area to volume ratios, morphometry, and physical contact sites of different subcellular structures. In the 1970s, a protocol for enhanced staining of glycogen in cells was developed and paved the way for a string of studies on the subcellular localization of glycogen and glycogen particle size using transmission electron microscopy. While most analyses interpret glycogen as if it is homogeneously distributed within the muscle fibers, providing only a single value (e.g., an average concentration), transmission electron microscopy has revealed that glycogen is stored as discrete glycogen particles located in distinct subcellular compartments. Here, the step-by-step protocol from tissue collection to the quantitative determination of the volume fraction and particle diameter of glycogen in the distinct subcellular compartments of individual skeletal muscle fibers is described. Considerations on how to 1) collect and stain tissue specimens, 2) perform image analyses and data handling, 3) evaluate the precision of estimates, 4) discriminate between muscle fiber types, and 5) methodological pitfalls and limitations are included.

A modified post-fixation procedure increases the contrast of glycogen particles in tissue. This paper provides a step-by-step protocol describing how to handle the tissue, conduct the imaging, and use stereological methods to obtain unbiased and quantitative data on fiber type-specific subcellular glycogen distribution in skeletal muscle.

İskelet Kas Liflerinde Subsellüler Glikojen Dağılımının İletim Elektron Mikroskobu Kullanılarak Ölçülmesi

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

Generation of Tissue Spheroids via a 3D Printed Stamp-Like Device

Advances in 3D cell culture have developed more physiologically relevant in vitro models, such as tissue spheroids. Cells cultivated as spheroids have more realistic biological responses that resemble the in vivo environment. Due to their advantages, tissue spheroids represent an emerging trend toward superior, more reliable, and more predictive study models with a broad range of biotechnological applicability. However, reproducible platforms that can achieve large-scale production of tissue spheroids have become an unmet need in fully exploring and boosting their potential. Herein, the large-scale production of homogeneous tissue spheroids is reported using a low-cost and time-effective methodology. A 3D printed stamp-like device is developed to generate up to 4,716 spheroids per 6-well plate. The device is fabricated by the stereolithography method using a photocurable resin. The final device is composed of cylindrical micropins, with a height of 1.3 mm and a width of 650 &#181;m. This approach allows the fast generation of homogeneous spheroids and co-cultured spheroids with uniform shape and size and &gt;95% cell viability. Moreover, the stamp-like device is tunable for different sizes of well plates and Petri dishes. It is easily sterilized and can be reused for long periods. The efficient large-scale production of homogeneous tissue spheroids is essential to leverage their translation for multiple areas of industry, such as tissue engineering, drug development, disease modeling, and on-demand personalized medicine.

<meta charset="utf8"></head><body>3D baskılı damga benzeri bir cihaz aracılığıyla doku sferoidlerinin üretilmesi

The present protocol describes a technique to produce tissue spheroids on a large scale cost-effectively using a 3D printed stamp-like device.

3D baskılı damga benzeri bir cihaz aracılığıyla doku sferoidlerinin üretilmesi

Advances in 3D cell culture have developed more physiologically relevant in vitro models, such as tissue spheroids. Cells cultivated as spheroids have ...