この研究は、国立科学工学研究協議会 (レベル、探索許可) およびユニヴェルシテ ・ ド ・ モンクトンから NP に補助金によって賄われていた。1塩基変異は、健康研究 (機構)、ニュー ・ ブランズウィック州イノベーション財団 (NBIF) およびユニヴェルシテ ・ ド ・ モンクトンのカナダの研究所から資金調達のサポートを確認したいと思います。EHC の作業をサポートするには、カナダ、脳カナダ、レベル、カナダ乳がん基金、ニュー ・ ブランズウィック州技術革新基金、ニューブランズウィックの健康研究財団のアルツハイマー協会とユニヴェルシテ ・ ド ・ モンクトン。

1. 試薬の調製
<ol><li>解剖と組織の透過の以下のソリューションを準備します。<ol>
<li>保存液を準備: 2.77 ミリメートル CaK27.23 mM K2グリコールエーテルジアミン四酢酸、5.77 mM Na2ATP、6.56 mM MgCl2、タウリン、20 mM 15 mM Na2クレアチンリン酸、20 mM のイミダゾール、0.5 mM ジチオトレイトール グリコールエーテルジアミン四酢酸と 50 ミリメートル K-MES の pH 7.1 (格納できます。-20 ° c)。</li>
		<li>サポニン溶液の準備: 保存液の 1 mL のサポニンの 5 mg (新鮮な毎日を準備)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>呼吸の測定のための次のソリューションを準備します。<ol>
<li>呼吸メディアの準備: 120 mM KCl、5 mM KH2PO4、3 mM HEPES、1 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸、1 mM MgCl2、および 0.2 %bsa (w/v)、pH 7.2。</li>
		<li>基板、ランプ、阻害剤を準備します。H2O、すべての基板を溶解し、エタノール (H2O で希釈したマロン酸) を除いて絶対に阻害剤と同様、FCCP ランプを解散します。ほとんど、基板と同様のマロン酸 (材料の表を参照) を中和します。プロトコルは、すべての濃度は、2 mL 槽内最終濃度です。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 準備中と高解像度計のキャリブレーション。
<ol><li>洗浄室、キャップ、および蒸留水 70% エタノールで 3 回と 3 回の呼吸のストッパー。</li>
	<li>ゼロ酸素濃度調整: チャンバ内呼吸媒体の 2.3 mL ピペットで移しなさい、亜ジチオン酸ナトリウム 10 mg を追加。商工会議所の最大の量は 2 mL が、2.3 mL は、維持気泡なし、ストッパーの下チャンバーを閉じるときに追加されます。ストッパーで部屋を閉じ、酸素濃度が 10-20 分調整結果の酸素消費量と酸素濃度がゼロで電極を測定します。</li>
	<li>芳醇な水で部屋を洗って 10 分、無水エタノールで孵化させなさい蒸留水で洗い流し。</li>
	<li>空気飽和状態における調整: ピペット 2.3 mL 呼吸室、中のストッパーを挿入、ストッパーの上に余分な培地を吸引、スペーサー、ストッパーを持ち上げます。戻過剰呼吸媒体は、部屋を閉じた後、気泡の存在を避けるために室 (合計 2 mL の体積) で。</li>
	<li>酸素濃度 (ブルー トレース) が 250 前後安定するまで 1 時間 45 分の酸素消費量を監視 24 の ° C で nM</li>
</ol>3. ハエや組織の透過の郭清
<ol><li>氷の上のすべての手順を実行していることを確認します。</li>
	<li>同じ系統の六つの男性のハエを anaesthetize、同じ年齢、同じ食事 (野生型 w1118, 15 日齢、コーンミール培地に供給) ハエの解離を容易にするために氷の上で発生します。</li>
	<li>飛翔筋を含む thoraxes のみを維持する (頭と腹部を削除) ハエを解剖メスと細い鉗子を使用する。この手順は、肉眼で行うことができます。先の細いピンセットで結果の thoraxes を処理します。</li>
	<li>25 mm シャーレ、鉗子を用いた氷冷保存液 2 mL を含む 3 つの解剖 thoraxes を転送します。</li>
	<li>先の細いピンセットで機械的に鉗子の先端を挿入、thoraxes、thoraxes を permeabilize し、繰り返し緩く接続されたネットワークを取得する組織を引き裂きます。</li>
	<li>24 ウェル プレートでサポニン溶液と、サポニンの 62.5 μ G/ml の濃度が最終的な保存液 1 mL 12.5 μ L で 2 つの井戸を埋めます。呼吸中の 1 mL の 2 つの隣接する井戸を埋めます。</li>
	<li>先の細いピンセットで希釈したサポニン溶液に 3 グリセリン thoraxes を転送し、軌道シェーカーで、氷の上に 20 分間の軽度の動揺と孵化します。</li>
	<li>後者のインキュベーション後軽度の動揺、サポニンを洗うこと 5 分間氷の上で呼吸中でいっぱい隣接する井戸に繊維を転送します。</li>
</ol>4. 乾燥減量の定量
<ol><li>グリセリン thoraxes 吸収性の表面上の乾燥し、3-4 回はすべての水分が除去されるかどうかを確認する細い鉗子を使用してフリップします。</li>
	<li>発振に一緒に 3 つの thoraxes の重量を量る。ミトコンドリアの酸素消費量が正規化される、得られた重みに注意してください。</li>
	<li>氷の上、呼吸中のドロップですぐに組織を転送します。</li>
</ol>5. 酸素消費率の定量
<ol><li>呼吸度計の室を開く (ストッパーを削除) し、各チャンバーに 10 mM ピルビン酸とリンゴ酸の 2 mM を追加。</li>
	<li>呼吸の中で満たされた室に直接グリセリン組織を追加します。</li>
	<li>スペーサーを使用してストッパーを取り付けます。</li>
	<li>60 mL シリンジと酸素タンクから直接酸素を収集し、組織中の酸素拡散が酸素消費量を制限していないかどうかを確認する各商工会議所のストッパー毛細血管を通して酸素の 2-5 mL を注入します。</li>
	<li>商工会議所に、thoraxes が残っているかどうかを確認する各ストッパーの毛細血管にハミルトン シリンジを挿入します。</li>
	<li>酸素濃度が約 400 室を完全に閉じる空気飽和上の酸素のレベルを達成する nM (約 160% は飽和空気) 部屋の中。</li>
	<li>停止し、チャンバ内の空気の泡を確認するミキサーを再起動します。</li>
	<li>組織呼吸の組織 (mg) の質量質量固有の酸素消費量 (pmol O2 consumed.s-1.mg-1組織) の表示を正常化する以前の重量を量った量を入力します。</li>
	<li>酸素消費量が (赤いトレース) を安定して、5 mM ADP ハミルトン注射器を追加します。</li>
	<li>各注入の後 70% エタノール蒸留水と注射器を洗い、再び水を蒸留します。</li>
	<li>酸素消費量が再び安定、シトクロム c の 4 mM の 5 μ L を注入します。</li>
	<li>ETS のさまざまなステップでミトコンドリアの酸素消費量を評価する次の基板の連続注射を行います。<ol>
<li>2 M のプロリンの 5 μ L を追加します。</li>
		<li>1 M のコハク酸の 10 μ L を追加します。</li>
		<li>1 M グリセロール-3-リン酸の 30 μ L を追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>0.5-1 の手順で滴定方法でランプ FCCP を注入 μ M (1 mM の溶液 2 μ L) 最適な濃度までは達された、すなわち、抑制することがなく可能な限り最高の酸素消費量を達成するために濃度 (注意:テーブルを参照してください材料の)。</li>
	<li>完全 (ロックス) の残留酸素消費を測定するために ETS の電子流束を阻害する順番に次の阻害剤の注入など他の中ヘムオキシゲナーゼ反応すなわち非呼吸反応。<ol>
<li>1 mM ロテノンの 1 μ L を追加 (注意:材料の表を参照してください)。</li>
		<li>2 M のマロン酸の 5 μ L を追加 (注意:材料の表を参照してください)。</li>
		<li>5 mM アンチマイシン A の 1 μ L を追加 (注意:材料の表を参照してください)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>アスコルビン酸 0.2 mM や 0.5 mM 受けた東京都警視庁、室に順次複雑な IV による酸素消費量を測定するアスコルビン酸で始まるを追加します。</li>
	<li>複雑な IV を阻害するアジの 20 mM を追加 (注意:材料の表を参照してください)。</li>
	<li>信号が安定して、チャンバー スペーサーで、純粋な酸素の 2 mL を注射することによって部屋を再酸素開閉チャンバー濃度が 250-300 nmol.mL-1。</li>
	<li>10-15 分のための信号を測定し、化学の背景、すなわち、受けた東京都警視庁の自動酸化による酸素消費量を計算します。</li>
</ol>6. 工場の洗浄
<ol><li>測定後蒸留水でチャンバーを濯ぎ 1 回と 3 回 70% のエタノールのチャンバーをすすいでください。</li>
	<li>阻害物質を不活化する 10 分の無水エタノールで孵化させなさい。</li>
	<li>蒸留水すすぎ 3 回、70% エタノールで部屋を埋める、次利用までストッパーとキャップを交換します。</li>
</ol>

<ol>
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著者が明らかに何もありません。

本研究では、ショウジョウバエにおけるミトコンドリアの酸素消費量の測定前の試料の調製方法を説明します。このメソッドは、期間、必要な人数の面で特に、ミトコンドリアの分離を使用してプロトコルに関連するさまざまな問題を克服するために開発されました。通常いくつかの個人から得られた組織の大規模な量を必要とするミトコンドリアの分離ではなく、この実験はいくつかのシ?...

ミバエショウジョウバエは、1世紀以上の遺伝子研究のモデル生物として使用されています。この生物の研究伴性継承2、突然変異率3、ニューラル システムの開発と細胞運命決定の4の重要な基礎知識にしかつながっていないが、また最近として浮上している、アルツハイマー病やパーキンソン病の5,6などいくつかの疾患に固有のメカニズムを研究する貴重なツールです。さらに、彼らは時間の短い期間で大量に発生する可能性が、寿命が短いと老化のプロセスを勉強する人気のあるモデルです。彼らはまた、インスリン産生細胞 (β 膵細胞に相当)、脂肪体 (同様には肝と白脂肪組織として機能している)、oenocytes (肝細胞様細胞)、心臓などの臓器に相同構造を所有しているだけでなく、体液代謝産物 (脊椎動物の血に似ています)7を輸送します。また、中間代謝 (インスリン/インスリン様成長因子のようなシグナル伝達経路およびラパマイシン ターゲット TOR 経路含む) の中央の道は、また非常に節約された7です。これらの理由から、ショウジョウバエは最近8糖尿病など代謝疾患固有の病態を中心に、代謝を制御する基本的なメカニズムを記述するため悪用されています。代謝の主要なコンポーネントは酸化的リン酸化プロセス (OXPHOS) を通じて ATP 生産、ミトコンドリア複数の経路を統合し、生命の最も重要な生物学的機能のいずれかを実行します。生物の代謝の中心的な役割を考慮したそれは、ミトコンドリアの機能障害がパーキンソン病9とアルツハイマー病10のような多くの病気だけでなく、筋萎縮性側索硬化症に関与していること意外ではないです。11,12. 老化プロセスの基本的な決定要因があります。確かに、酸化損傷11を通じて高濃度の細胞に有害なことができる細胞活性酸素種 (ROS) の主要な生産者しています。高齢化はまた破損または変異ミトコンドリア DNA13mitophagy 機能障害14,15ミトコンドリア生合成16障害の蓄積に関連付けられています。ミトコンドリアは細胞の恒常性の重要要因ではまた豊富や栄養素17,18の希少性によるといくつかの細胞機能を調節する別の基板を利用することができます。
確かに、ダイエット (炭水化物、脂質および蛋白質) のさまざまな栄養素に消化され、吸収され、細胞に運ばれます。細胞質に転化し、派生の基板は NADH や FADH219などの削減の同等物を製造しているミトコンドリアのマトリックスに運ばれます。これらの削減の同等は、電子輸送システム (ETS) の異なる酵素の複合体によって酸化されてし。これらの複合体は複合体など、ミトコンドリア内膜に埋め込まれている私と複合体 II。さらに、ミトコンドリアのグリセロール-3-リン酸脱水素酵素およびプロリン脱水素酵素など他の酵素の複合体は、ETS20,21に電子のエントリの代替ルートを表します。これらの 'alternative' 複合体は昆虫、特に重要として、種に応じて彼ら積極的に参加できる呼吸20,22,23,21を増加します。これらの ETS の供給システムからの電子は、最終的なアクセプター分子酸素まで、ユビキノン、その後複合体 III にし複雑な IV が転送されます。この電子の移動は、複雑な V (図 1) で ATP を ADP のリン酸化を運転内部のミトコンドリア膜プロトン動機力を生成します。病態生理学的ミトコンドリア細胞の恒常性は、キイロショウジョウバエ関連するモデルを表しますを用いたミトコンドリア代謝の勉強の中心的な役割の様々 なメカニズムを記述する強力なツールを検討条件または細胞と環境ストレスの下で。驚くほどしかし、研究の一握りだけは実際にショウジョウバエ24,25,26のミトコンドリアの呼吸を測定しました。確かに、ミトコンドリアの酸素消費量を評価することを目指して実験はミトコンドリアの分離を必要とします。分離が一般的にむしろ大量を必要とする (活性酸素産生やミトコンドリア効率27,28のマーカーとしての P/O 率) などさまざまなミトコンドリア機能の測定のために有利、いくつか個人24,29からのティッシュ。組織や個人の多量のためのこの要件は、重要な制限要因、特にすべての個人が同じ年齢であることを考えるとできれば実験のための同性の異なる時間に呼吸のメジャーを作る最高の状態で骨の折れるポイントします。さらに、ミトコンドリアの分離は、ミトコンドリア代謝を支配する根本的なメカニズムに重要な洞察力を提供できますが、ミトコンドリアの分離に使用するメソッドはレプリケート可能な結果を得ることの難しさなどいくつか欠点を持ってください。、ミトコンドリアのネットワークおよびミトコンドリアの構造と機能29,30,31の変質の中断。
本研究の目的は、非常に少数の個人から組織の最小限の量だけを用いたショウジョウバエのミトコンドリアの酸素消費量を測定するための堅牢なプロトコルを提示することです。このプロトコルでミトコンドリアの酸素消費量測定の in situショウジョウバエ thoraxes からグリセリン筋線維29を使用して高解像度呼吸32,33,との組み合わせで構成されています34,35ですこのメソッドも古典的なミトコンドリアの分離メソッドからセルの他のコンポーネントとの相互作用としても、ミトコンドリアの構造と機能はの保存よりグリセリンに比べて利点があります。繊維29,31,36, もっと生理学的に関連するこのアプローチになります。このプロトコルで、基板 ETS のいくつかの異なる段階で酸素消費量の決定をすること、ショウジョウバエの唯一の 3 つの thoraxes で使用する高解像度の呼吸ミトコンドリア機能することができます正確に評価されます。したがって、このプロトコルはショウジョウバエ モデルの利点を生かして多くの環境または病態生理学的条件のコンテキストで代謝を制御する基本的なメカニズムに関する質問に回答キーを助けることができます。
ETS のいくつかの異なる手順で酸素消費量を測定し、どのように異なる基板を評価する呼吸、別基板 (図 1)、ランプに貢献し、阻害剤が使用される30の透過後、組織。具体的には、異なる基板上の順次追加、ETS の異なる複合体を介して電子のエントリを刺激するために実行されます。シアン化物のカルボニル、ランプ 4-(フッ素系低分子) phenylhydrazone (FCCP) は非結合呼吸を測定するための最適な濃度で追加した、すなわち、非リン酸化呼吸筋酸素消費量刺激されます。複合体 I、II、および III は ETS 非酸化反応により、残留酸素の消費量を監視する実行し、順次抑制。N, N, N の注入による複雑な IV 最大呼吸能力を評価できる最後に、'、N - テトラメチル - p-フェニレンジアミン (受けた東京都警視庁)、人工電子プロバイダーとアスコルビン酸。それはハエの発生する温度なので、24 °C で実験が行われているに注意してくださいすることが重要です。

<table><tbody><tr><td>High-resolution respirometer Oxygraph O2K</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td><td>10022-02</td><td>Startup O2K respirometer kit&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td></tr><tr><td>O2K-Titration Set&amp;nbsp;</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td><td>20820-03</td><td>Hamilton syringes with different volumes&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Datlab software</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td><td>20700</td><td>Software for data acquisition and analysis&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fine-tipped antimagnetic forceps</td><td>VWR</td><td>82027-400</td><td>&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Secura225D-1S-DQE</td><td>Sartorius AG, Goettingen, Germany</td><td></td><td>Semi-micro balance (distributed by several companies)&amp;nbsp;&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Drosophila melanogaster&lt;/em&gt; wild-type w&lt;sup&gt;1118&lt;/sup&gt;</td><td>Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA</td><td></td><td>&lt;br/&gt; Storage Condition: 24 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;,&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;,&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;&amp;prime;,&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;&amp;prime;-tetraacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>EGTA&lt;br/&gt; Storage Condition: RT</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1767</td><td>CAUTION: corrosive to metals, acute toxicity, skin corrosion, serious eye damage, acute aquatic toxicity.&lt;br/&gt; Storage Condition: RT</td></tr><tr><td>CaCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td>&lt;br/&gt; Storage Condition: RT</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td>&lt;br/&gt; Storage Condition: -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td>&lt;br/&gt; Storage Condition: RT</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td>&lt;br/&gt; Storage Condition: RT</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;Phosphocreatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td>&lt;br/&gt; Storage Condition: -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td>&lt;br/&gt; Storage Condition: RT</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td>&lt;br/&gt; Storage Condition: 2-8 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td>&lt;br/&gt; Storage Condition: RT</td></tr><tr><td>Saponin from quillaja bark</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7900</td><td>Saponin&lt;br/&gt; Storage Condition: RT&lt;br/&gt; Solution Preparation: 5 mg in 1 mL of preservation solution. Prepare fresh daily.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>&lt;br/&gt; Storage Condition: RT</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>&lt;br/&gt; Storage Condition: RT</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>&lt;br/&gt; Storage Condition: RT</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05470</td><td>&lt;br/&gt; Storage Condition: 2-8 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;S&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>157953</td><td>Sodium dithionite. CAUTION: self-heating substances and mixtures, acute toxicity, acute aquatic toxi chronic aquatic toxicity.&lt;br/&gt; Storage Condition: RT</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td>Pyruvate&lt;br/&gt; Storage Condition: 2-8 &amp;deg;C&lt;br/&gt; Solution Preparation: In MilliQ water. Prepare fresh daily.</td></tr><tr><td>L-(-)-Malic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td>Malate&lt;br/&gt; Storage Condition: RT&lt;br/&gt; Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Adenosine 5&#039;-diphosphate monopotassium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td>ADP&lt;br/&gt; Storage Condition: -20 &amp;deg;C&lt;br/&gt; Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -80 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Cytochrome c from equine heart</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td>Cytochrome c&lt;br/&gt; Storage Condition: -20 &amp;deg;C&lt;br/&gt; Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0380</td><td>Proline&lt;br/&gt; Storage Condition: RT&lt;br/&gt; Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Sodium succinate dibasic hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td>Succinate&lt;br/&gt; Storage Condition: RT&lt;br/&gt; Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>sn-Glycerol 3-phosphate bis(cyclohexylammonium) salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7886</td><td>Glycerol-3-phosphate&lt;br/&gt; Storage Condition: -20 &amp;deg;C&lt;br/&gt; Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -80 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td>FCCP. CAUTION: acute toxicity, skin sensitisation, chronic aquatic toxicity.&lt;br/&gt; Storage Condition: RT&lt;br/&gt; Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in glass vials at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>CAUTION: acute toxicity, skin irritation, eye irritation, specific target organ toxicity (respir sytem), acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity.&lt;br/&gt; Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in dark vials at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Malonic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1296</td><td>Malonate. CAUTION: acute toxicity, serious eye damage.&lt;br/&gt; Storage Condition: RT&lt;br/&gt; Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH. Prepare fresh daily.</td></tr><tr><td>Antimycin A from &lt;em&gt;Streptomyces sp&lt;/em&gt;.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>Antimycin A. CAUTION: acute toxicity, acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity.&lt;br/&gt; Storage Condition: -20 &amp;deg;C&lt;br/&gt; Solution Preparation: In absolute ethanol. Store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;,&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;,&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;&amp;prime;,&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;&amp;prime;-Tetramethyl-&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-phenylenediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7394</td><td>TMPD&lt;br/&gt; Storage Condition: RT&lt;br/&gt; Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at&amp;nbsp; -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>(+)-Sodium L-ascorbate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td>Ascorbate&lt;br/&gt; Storage Condition: RT&lt;br/&gt; Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at&amp;nbsp; -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Sodium azide. CAUTION: acute toxicity (oral and dermal), specific target organ toxicity (brain), aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity.&amp;nbsp;&lt;br/&gt; Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 &amp;deg;C.</td></tr></tbody></table>

measurement of mitochondrial oxygen consumption in permeabilized fibers of drosophila using minimal amounts of tissue

ショウジョウバエ、キイロショウジョウバエ代謝の研究のための新たなモデルを表します。確かに、ショウジョウバエは、構造の人間の臓器に相同性を持つし、非常に節約された代謝経路を持っている時間の短い期間で別の基礎的メカニズムの研究を可能にする比較的短い寿命を持っています。しかし、意外な細胞の代謝、ミトコンドリア呼吸に不可欠なメカニズムの 1 つは徹底的に触れられていないこのモデルです。ショウジョウバエにおけるミトコンドリア呼吸の測定は通常非常に多数の個人を必要とし、得られた結果が再現性が高いのでそうです。ここでは、ショウジョウバエから組織の最小限の量を使用してミトコンドリアの酸素消費量の正確な測定を許可する方法を説明します。この方法では、thoraxes を切除し、両方鋭い鉗子で機械的と化学的にサポニン、異なる化合物は細胞膜を通過し、ミトコンドリア呼吸を調節することができますグリセリンです。透過処理、したプロトコルが、ランプといくつかの阻害剤に彼らの対応だけでなく、異なる基質を酸化する電子輸送システム (ETS) の異なる複合体のキャパシティを評価する実行されます。このメソッドは、ミトコンドリアがまだ他の細胞成分との相互作用とミトコンドリアの形態が保存されているので、それはもっと生理学的に関連するとミトコンドリアの分離を用いた方法と比較して多くの利点を示します。また、サンプル準備の速度が速い、得られた結果が再現性が高い。ミトコンドリア呼吸性と代謝の研究のためのモデルとしてショウジョウバエの利点を組み合わせることにより新たな洞察が、発表することができます重要な特にときハエが発生している異なる環境や病態生理学的条件。

上記で説明したプロトコルを使用してミトコンドリアの酸素消費量の代表的なトレースは、図 2で提供しています。ピルビン酸とリンゴ酸グリセリン筋線維とともにチャンバーに注入、呼ばれる CI リーク呼吸、すなわち、複雑な ETS の私がによって刺激されるとき、NADH 生産にピルビン酸とリンゴ酸による酸化を介して、トリカルボン酸 (C...

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Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

本稿で、ショウジョウバエのグリセリン thoraxes による高解像度の呼吸の酸素消費量を測定する方法を説明します。この手法は古典的なミトコンドリアの分離法と比較して組織の最小限の量を必要として得られた結果、もっと生理学的に関連します。

ショウジョウバエのティッシュの最小限の量を使用してのグリセリンの繊維でミトコンドリアの酸素消費量の測定

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.8K ビュー.  Université de Moncton. 本稿で、ショウジョウバエのグリセリン thoraxes による高解像度の呼吸の酸素消費量を測定する方法を説明します。この手法は古典的なミトコンドリアの分離法と比較して組織の最小限の量を必要として得られた結果、もっと生理学的に関連します。

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Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.

The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用して

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

発生生物学

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the progression of cancer, diabetes, neurodegeneration, and aging to name a few. For instance, changes in mitochondrial activity, the cell&#39;s metabolic powerhouse, have been characterized in many such diseases. Generally, the oxygen consumption rates of mitochondria were considered a reliable readout of mitochondrial activity and measurements in some of these studies were based on isolated mitochondria or cells. However, such conditions may not represent the complexity of a whole tissue. Recently, we have developed a novel method that enables the dynamic measurement of oxygen consumption rates from whole isolated fly heads. By utilizing this method, we have recorded lower oxygen consumption rates of the whole head segment in young versus aged flies. Secondly, we have discovered that lysine deacetylase inhibitors rapidly alter the oxygen consumption in the whole head. Our novel technique may therefore aid in uncovering new properties of various drugs, which may impact metabolic rates. Furthermore, our method may give a better understanding of metabolic behavior in an experimental setup that more closely resembles physiological states.

Measuring alterations in metabolic rates is central to understanding the progression of various diseases and aging. Here, we present a novel technique to measure whole head oxygen consumption that more closely resembles the physiological state and may aid in revealing novel drugs that modify mitochondrial activity.

測定と酸素消費量全体の解釈飛ぶ頭セグメント

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

生化学

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, Drosophila research lacks popularity in developing countries, possibly due to the misinformed idea that establishing a lab and performing relevant experiments with such tiny insects is difficult and requires expensive, specialized apparatuses. Here, we describe how to build an affordable flylab to quantitatively analyze a myriad of behavioral parameters in D. melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We provide protocols to build in-house vial racks, courtship arenas, apparatuses for locomotor assays, etc., to be used for general fly maintenance and to perform behavioral experiments using adult flies and larvae. We also provide protocols on how to use more sophisticated systems, such as a high resolution oxygraph, to measure mitochondrial oxygen consumption in larval samples, and show its association with behavioral changes in the larvae upon the xenotopic expression of the mitochondrial alternative oxidase (AOX). AOX increases larval activity and mitochondrial leak respiration, and accelerates development at low temperatures, which is consistent with a thermogenic role for the enzyme. We hope these protocols will inspire researchers, especially from developing countries, to use Drosophila to easily combine behavior and mitochondrial metabolism data, which may lead to information on genes and/or environmental conditions that may also regulate human physiology and disease states.

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

We provide protocols for anyone with a "maker culture" mind to start building a flylab for quantitative analysis of a myriad of behavioral parameters in Drosophila melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We also describe a high resolution respirometry protocol using larvae to combine behavioral and mitochondrial metabolism data.

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, ...

行動学

Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple causes, including autoimmune diseases, diabetes, infections, inherited disorders, and tumors. Assessing mitochondrial function in mouse peripheral nerves can be challenging due to the small sample size, a limited number of mitochondria present in the tissue, and the presence of a myelin sheath. The technique described in this work minimizes these challenges by using a unique permeabilization protocol adapted from one used for muscle fibers, to assess sciatic nerve mitochondrial function instead of isolating the mitochondria from the tissue. By measuring fluorimetric reactive species production with Amplex Red/Peroxidase and comparing different mitochondrial substrates and inhibitors in saponin-permeabilized nerves, it was possible to detect mitochondrial respiratory states, reactive oxygen species (ROS), and the activity of mitochondrial complexes simultaneously. Therefore, the method presented here offers advantages compared to the assessment of mitochondrial function by other techniques.

High-resolution respirometry coupled to fluorescence sensors determines mitochondrial oxygen consumption and reactive oxygen species (ROS) generation. The present protocol describes a technique to assess mitochondrial respiratory rates and ROS production in the permeabilized sciatic nerve.

高解像度呼吸法による坐骨神経のミトコンドリア機能の評価

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...

ショウジョウバエのミトコンドリア生理学と生体エネルギー学の解析

Analyzing Mitochondrial Function in a Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutant Using High-resolution Respirometry

Neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s Disease (PD), and cellular disturbances such as cancer are some of the disorders that disrupt energy metabolism with impairment of mitochondrial functions. Mitochondria are organelles that control both energy metabolism and cellular processes involved in cell survival and death. For this reason, approaches to evaluate mitochondrial function can offer important insights into cellular conditions in pathological and physiological processes. In this regard, high-resolution respirometry (HRR) protocols allow evaluation of the whole mitochondrial respiratory chain function or the activity of specific mitochondrial complexes. Furthermore, studying mitochondrial physiology and bioenergetics requires genetically and experimentally tractable models such as Drosophila melanogaster.
This model presents several advantages, such as its similarity to human physiology, its rapid life cycle, easy maintenance, cost-effectiveness, high throughput capabilities, and a minimized number of ethical concerns. These attributes collectively establish it as an invaluable tool for dissecting complex cellular processes. The present work explains how to analyze mitochondrial function using the Drosophila melanogaster PINK1B9-null mutant. The pink1 gene is responsible for encoding PTEN-induced putative kinase 1, through a process recognized as mitophagy, which is crucial for the removal of dysfunctional mitochondria from the mitochondrial network. Mutations in this gene have been associated with an autosomal recessive early-onset familial form of PD. This model can be used to study mitochondrial dysfunction involved in the pathophysiology of PD.

著者スポットライト:Drosophila melanogasterを使用したミトコンドリア機能と化学的毒性の探索 

Here we present a high-resolution respirometry protocol to analyze bioenergetics in PINK1B9-null mutant fruit flies. The method uses the Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT) protocol.

ショウ ジョウバエのmelanogaster PINK1B9-Null変異体のミトコンドリア機能の解析(高分解能スピロメトリー)

Neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s Disease (PD), and cellular disturbances such as cancer are some of the disorders that disrupt energy ...

Mitochondrial Functional Assessment in Brush Lizard Liver Mitochondria

Assessment of Mitochondrial Oxygen Consumption Using a Plate Reader-based Fluorescent Assay

Mitochondria serve many important functions, including cellular respiration, ATP production, controlling apoptosis, and acting as a central hub of metabolic pathways. Therefore, experimentally assessing mitochondrial functionality can provide insight into variations among different populations or disease states. Additionally, it is valuable to assess whether isolated mitochondria are healthy enough to proceed with experiments. One characteristic often used to compare mitochondrial function in different samples is the rate of oxygen consumption. Oxygen consumption and subsequent calculation of the respiratory control ratio in either intact cells or mitochondria isolated from tissue can serve all three purposes. Using mitochondria isolated from the livers of brush lizards in conjunction with a phosphorescent probe that is sensitive to the fluctuations in oxygen concentration of a solution, we measured oxygen consumption using a fluorescent plate reader. This method is not only quick and efficient but also can be conducted with a small amount of mitochondria and without the need for specialized equipment. The step-by-step protocol described here increases the accessibility of mitochondrial functional assessment to researchers.

Assessment of oxygen consumption provides integral information about mitochondrial function. Using a phosphorescent probe with a fluorescent plate reader, accurate and reproducible data can be obtained easily without specialized equipment. This assay enables any lab to measure the oxygen consumption of isolated mitochondria and calculate respiratory control ratios.

Mitochondria serve many important functions, including cellular respiration, ATP production, controlling apoptosis, and acting as a central hub of ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

単離ミトコンドリアマウス心臓における透水性遷移孔の開口部のマルチパラメータ測定

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

生物学

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

キイロショウジョウバエ幼虫と大人の脳の代謝解析

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

ショウジョウバエのティッシュの最小限の量を使用してのグリセリンの繊維でミトコンドリアの酸素消費量の測定

要約

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ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用して

測定と酸素消費量全体の解釈飛ぶ頭セグメント

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

高解像度呼吸法による坐骨神経のミトコンドリア機能の評価

ショウジョウバエのmelanogaster PINK1^B9-Null変異体のミトコンドリア機能の解析(高分解能スピロメトリー)

ショウジョウバエのmelanogaster PINK1^B9-Null変異体のミトコンドリア機能の解析(高分解能スピロメトリー)

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Assessment of Mitochondrial Oxygen Consumption Using a Plate Reader-based Fluorescent Assay

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