Este estudo foi financiado por contribuições do nacional de Ciências e engenharia Research Council (NSERC, descoberta grant) e Université de Moncton, a NP. CLB gostaria de reconhecer o apoio de financiamento do Instituto canadense de pesquisa de saúde (CIHR), a Fundação de inovação de New Brunswick (NBIF) e Université de Moncton. O trabalho do EHC é apoiado pela sociedade de Alzheimer do Canadá, Canadá cérebro, NSERC, Canadian Breast Cancer Foundation, Fundação de inovação de New Brunswick, New Brunswick saúde Research Foundation e Université de Moncton.

1. preparação de reagentes
<ol><li>Prepare as seguintes soluções para dissecção e permeabilização do tecido.<ol>
<li>Preparar a solução de preservação: 2,77 mM CaK2EGTA, 7,23 mM K2EGTA, 5,77 mM Na2ATP, 6,56 mM MgCl2, 20mm taurina, 15mm fosfocreatina de2nd, imidazol 20 mM, 0.5 mM ditiotreitol e 50 mM K-MES, pH 7.1 (podem ser armazenados a-20 ° C).</li>
		<li>Preparar a solução de saponina: 5 mg de saponina em 1 mL de solução de preservação (preparar fresco diariamente).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare as seguintes soluções para a medição da respiração.<ol>
<li>Prepare o suporte de respiração: 120 mM KCl, 5mm KH2PO4, 3mm HEPES, EGTA de 1 mM, 1 mM MgCl2e BSA de 0,2% (p/v), pH 7,2.</li>
		<li>Prepare substratos, desacoplador, inibidores. Dissolver todos os substratos em H2O e dissolver o desacoplador Compararia as well os inibidores em etanol absoluto (exceto malonato que é diluído em H2O). Neutralize a maioria dos substratos os malonato (ver Tabela de materiais). Todas as concentrações que constam do protocolo são concentrações finais no interior de câmaras de 2 mL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparação e calibração do Respirometer de alta resolução.
<ol><li>Lave as câmaras, tampas e rolhas do respirometer três vezes com etanol 70% e três vezes com água destilada.</li>
	<li>Calibrar em zero concentração de oxigênio: Pipetar 2,3 mL de meio de respiração nas câmaras e adicionar 10 mg de ditionito de sódio. Embora o volume máximo da câmara é 2 mL, 2,3 mL são adicionados para garantir que nenhuma bolha de ar permaneça sob a rolha quando fechar as câmaras. Fechar as câmaras com as rolhas e medir a concentração de oxigênio de 10-20 min.. calibrar os eléctrodos em zero concentração de oxigênio com a taxa de consumo de oxigênio resultante.</li>
	<li>Lave as câmaras com água destilada, incubar em etanol absoluto por 10 min e depois enxaguar com água destilada.</li>
	<li>Calibrar a saturação do ar: Pipetar 2,3 mL de meio de respiração nas câmaras, inserir as rolhas, Aspire o excesso de meio em cima as rolhas e em seguida, retire as rolhas com o espaçador. Médio de excesso de respiração é pipetado nas câmaras (volume de 2 mL total) para evitar a presença de bolhas de ar após fechar as câmaras.</li>
	<li>Monitorar o consumo de oxigênio por 45 min a uma hora, até que a concentração de oxigênio (traço azul) é estável em torno de 250 nM a 24 ° C.</li>
</ol>3. dissecação de moscas e permeabilização do tecido
<ol><li>Certifique-se de todas as etapas são executadas no gelo.</li>
	<li>Anaesthetize seis moscas masculinas da mesma estirpe, mesma idade e erguido sobre a mesma dieta no gelo para facilitar a dissecação das moscas (selvagem-tipo w1118, 15 dias de idade, alimentados com médias de farinha de milho).</li>
	<li>Usando um bisturi e uma pinça de ponta fina, disse as moscas (retire as cabeças e os abdomes) para manter apenas o avermelhado contendo os músculos de voo. Este passo pode ser feito a olho nu. Lidar com o resultante avermelhado com pinça de ponta fina.</li>
	<li>Transferi três avermelhado dissecado em uma placa de Petri contendo 2 mL de solução de preservação gelada, usando a pinça de 25 mm.</li>
	<li>Com a pinça de ponta fina, permeabilize mecanicamente o avermelhado por inserir a ponta da pinça o avermelhado e repetidamente rasgar o tecido para obter uma rede frouxamente conectada.</li>
	<li>Em uma placa de 24, encha dois poços com 12,5 µ l da solução de saponina e 1 mL de solução de preservação para obter uma concentração final de 62,5 µ g/mL de saponina. Encha os dois poços adjacentes com 1 mL de meio de respiração.</li>
	<li>Com a pinça de ponta fina, transferir três permeabilized avermelhado para a solução de saponina diluídos e incubar com agitação suave em um agitador orbital, no gelo, por 20 min.</li>
	<li>Após a incubação este último, transferi as fibras para os poços adjacentes, preenchidos com o meio de respiração com agitação suave, no gelo, por 5 min enxaguar a saponina.</li>
</ol>4. determinação do peso seco
<ol><li>Secar o avermelhado permeabilized sobre uma superfície absorvente e virar 3 - 4 vezes usando a pinça de ponta fina para certificar-se de que toda a umidade é removida.</li>
	<li>Pese o três avermelhado juntos em uma micro-balança. Observe o peso obtido como ele será usado para normalizar as taxas de consumo de oxigênio mitocondrial.</li>
	<li>Transferi os tecidos imediatamente em uma gota de meio de respiração no gelo.</li>
</ol>5. determinação de taxas de consumo de oxigênio
<ol><li>Abra as câmaras do respirometer (retire as rolhas) e adicionar 10 mM de piruvato e de malato de 2 milímetros em cada câmara.</li>
	<li>Adicione os tecidos permeabilized directamente para as câmaras, preenchidas com o meio de respiração.</li>
	<li>Substitua as rolhas usando o espaçador.</li>
	<li>Com uma seringa de 60 mL, coletar oxigênio diretamente de um tanque de oxigênio e Injete 2-5 mL de oxigênio através do capilar de rolha de cada câmara para certificar-se de difusão de oxigênio através dos tecidos não vai limitar o consumo de oxigênio.</li>
	<li>Introduza uma seringa Hamilton capilar de cada rolha para certificar-se de que o avermelhado permanecem na câmara.</li>
	<li>Fechar as câmaras completamente quando a concentração de oxigênio é de cerca de 400 nM, alcançando níveis de oxigênio acima de saturação do ar (cerca de 160% ar saturação) dentro das câmaras.</li>
	<li>Parar e reiniciar os agitadores para verificar se há bolhas de ar nas câmaras.</li>
	<li>Insira a massa de tecido pesado anteriormente para normalizar as taxas de respiração em massa de tecido (mg), exibindo o consumo de oxigênio de massa específica (pmol O2 consumed.s-1.mg-1 do tecido).</li>
	<li>Uma vez que o consumo de oxigênio é estabilizado (traço vermelho), adicione 5 mM ADP com uma seringa de Hamilton.</li>
	<li>Após cada injeção, enxágue as seringas com água destilada, etanol a 70% e água destilada novamente.</li>
	<li>Uma vez que o consumo de oxigênio é estável novamente, injete 5 µ l de 4 mM de citocromo c.</li>
	<li>Prossiga para as injeções sequenciais dos seguintes substratos para avaliar o consumo de oxigênio mitocondrial em etapas diferentes do RCLE:<ol>
<li>Adicione 5 µ l de uma prolina 2m.</li>
		<li>Adicione 10 µ l de um succinato de 1m.</li>
		<li>Adicione 30 µ l de um M 1 glicerol-3-fosfato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injetar o Compararia desacoplador de uma forma de titulação por passos de 0,5-1 µM (2 µ l de uma solução de 1 mM) até a concentração ideal é alcançado, ou seja, a concentração para atingir o mais alto possível sem inibição de consumo de oxigênio (atenção: ver tabela de materiais).</li>
	<li>Injetar os seguintes inibidores sequencialmente para inibir totalmente o fluxo de elétrons na ETS para medir o consumo de oxigênio residual (ROX) ou seja, não respiratória reações tais como reações de oxigenase, entre outros:<ol>
<li>Adicione 1 µ l de rotenona um 1mm (atenção: ver Tabela de materiais).</li>
		<li>Adicionar 5 µ l de um malonato de 2m (atenção: ver Tabela de materiais).</li>
		<li>Adicione 1 µ l de uma antimycin de 5 mM A (atenção: ver Tabela de materiais).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione o ascorbato de 0,2 mM e 0,5 mM TMPD sequencialmente para as câmaras, começando com o ascorbato para medir o consumo de oxigênio pelo complexo IV.</li>
	<li>Adicionar 20 mM de azida de sódio para inibir o complexo IV (atenção: ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Uma vez que o sinal está estável, abrir as câmaras com o espaçador, re-oxigenar as câmaras injetando 2 mL de oxigênio puro e fechar as câmaras quando a concentração é em torno de 250-300 nmol.mL-1.</li>
	<li>Medir o sinal por 10-15 min e calcular o fundo químico, ou seja, o consumo de oxigênio devido à auto-oxidação de TMPD.</li>
</ol>6. limpeza do Respirometer
<ol><li>Após as medições, enxágue as câmaras com água destilada uma vez e lave as câmaras três vezes em etanol a 70%.</li>
	<li>Incube em etanol absoluto por 10 min inactivar os inibidores.</li>
	<li>Lavar três vezes com água destilada, encher as câmaras com 70% de etanol e substituir as rolhas e as tampas até a próxima utilização.</li>
</ol>

<ol>
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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+implications+of+mitochondrial+genetic+variation:+mitochondrial+genetic+effects+on+OXPHOS+respiration+and+mitochondrial+quantity+change+with+age+and+sex+in+fruit+flies.">Evolutionary implications of mitochondrial genetic variation: mitochondrial genetic effects on OXPHOS respiration and mitochondrial quantity change with age and sex in fruit flies.</a> Journal of Evolutionary Biology. 29 (4), 736-747 (2016).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle.">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).</li><li>Phang, J. M., Donald, S. P., Pandhare, J., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolism+of+proline,+a+stress+substrate,+modulates+carcinogenic+pathways.">The metabolism of proline, a stress substrate, modulates carcinogenic pathways.</a> Amino Acids. 35 (4), 681-690 (2008).</li><li>Bender, T., Martinou, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+pyruvate+carrier+in+health+and+disease:+To+carry+or+not+to+carry?.">The mitochondrial pyruvate carrier in health and disease: To carry or not to carry?.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (10), 2436-2442 (2016).</li><li>Divakaruni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazolidinediones+are+acute,+specific+inhibitors+of+the+mitochondrial+pyruvate+carrier.">Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).</li><li>McCommis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ancestral+role+for+the+mitochondrial+pyruvate+carrier+in+glucose-stimulated+insulin+secretion.">An ancestral role for the mitochondrial pyruvate carrier in glucose-stimulated insulin secretion.</a> Molecular Metabolism. 5 (8), 602-614 (2016).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Neste estudo, é descrito um método para a preparação da amostra antes das medições de consumo de oxigênio mitocondrial em Drosophila. Este método foi desenvolvido para superar os diferentes problemas relacionados aos protocolos usando isolamentos mitocondriais, nomeadamente em termos de duração e número de indivíduos necessários. Em vez de trabalhar com os isolamentos mitocondriais exigindo geralmente grande quantidade de tecidos provenientes de vários indivíduos, esta experiência é realizada em permeabi...

Mosca da fruta, Drosophila melanogaster, tem sido usada como um organismo modelo para pesquisa genética para mais de um século1. O estudo deste organismo não deu origem apenas significativo conhecimento fundamental sobre herança ligada ao sexo2, taxa de mutação3, o desenvolvimento do sistema neural e o celular destino determinação4, mas também recentemente emergiu como um ferramenta valiosa para estudar os mecanismos inerentes à várias doenças como Alzheimer e Parkinson5,6. Além disso, é um modelo popular para estudar o processo de envelhecimento, como eles podem ser levantados em grande número durante um curto período de tempo e têm vida curta. Eles também possuem estruturas homólogas de órgãos humanos, tais como um coração, oenocytes (hepatócitos células), corpos de gordura (funcionando da mesma forma como o tecido adiposo branco e fígado), células (equivalentes a células β-pancreáticas), produtoras de insulina, bem como a hemolinfa transporta metabólitos (análogo ao sangue de vertebrados)7. Além disso, as vias centrais do metabolismo intermediário (incluindo o fator de crescimento insulina/insulin-like, como via de sinalização e vias de alvo de rapamicina-TOR) também são altamente conservadas7. Por estas razões, a drosófila recentemente têm sido explorados para descrever os mecanismos fundamentais que controlam o metabolismo, especialmente em condições patológicas inerentes ao humanas doenças metabólicas tais como diabetes,8. Um componente importante do metabolismo é a mitocôndria que integra múltiplos caminhos e executa uma das mais importantes funções biológicas de vida, produção de ATP, através do processo de fosforilação oxidativa (OXPHOS). Considerando seu papel central no metabolismo do organismo, não é de estranhar que disfunções mitocondriais estão envolvidas em muitas doenças como9 a doença de Parkinson e doenças de Alzheimer10, bem como na esclerose lateral amiotrófica 11 , 12. eles também são determinantes fundamentais do processo de envelhecimento. Na verdade, eles são os principais produtores de espécies reativas de oxigênio (ROS) na célula, que pode ser prejudicial para a célula em alta concentração através de de danos oxidativos11. Envelhecimento também tem sido associado à acumulação de danificado ou mutado DNA mitocondrial13, mitophagy disfunções14,15 , bem como o comprometimento da biogênese mitocondrial16. As mitocôndrias são também determinantes da homeostase da célula como eles podem utilizar diferentes substratos para ajustar várias funções celulares, de acordo com a abundância ou escassez de macronutrientes17,18.
Com efeito, os diferentes nutrientes na dieta (carboidratos, lipídios e proteínas) são digeridos, absorvidos e transportados nas células. Eles são então transformados no citosol, e os substratos derivados são transportados para a matriz mitocondrial, onde produzem equivalentes redutores, tais como NADH e DANIII219. Estes redutores equivalentes são então oxidados por complexos enzimáticos diferentes do sistema de transporte de elétrons (ETS). Estes complexos são incorporados na membrana mitocondrial interna, tais como complexo I e II do complexo. Além disso, outros complexos enzimáticos, tais como o glicerol-3-fosfato desidrogenase mitocondrial e a desidrogenase de prolina representam rotas alternativas para a entrada de elétrons para o ETS20,21. Estes complexos 'alternativos' são particularmente importantes em insetos, como de acordo com a espécie, eles podem participar activamente para aumentar a respiração20,22,23,21. Elétrons destes ETS sistemas de alimentação são transferidos para a ubiquinona e posteriormente ao complexo III e depois para o complexo IV, até o aceitador final, oxigênio molecular. Esta transferência de elétrons gera uma força motriz protónica através da membrana mitocondrial interna, dirigindo a fosforilação do ADP a ATP a complexo V (Figura 1). Considerando o papel central da mitocôndria na homeostase da célula, estudar o metabolismo mitocondrial, usando o modelo relevantes d. melanogaster representa uma ferramenta poderosa para delinear os mecanismos subjacentes de vário fisiopatológicos condições ou sob tensões ambientais e celulares. Surpreendentemente, no entanto, apenas um punhado de estudos efectivamente medidos respiração mitocondrial em Drosophila24,25,26. De fato, experimentos com o objetivo de avaliar o consumo de oxigênio mitocondrial exigem o isolamento da mitocôndria. Apesar de vantajoso para a medição de diferentes funções mitocondriais (tais como a produção de ROS ou P/O rácio como marcador de eficiência mitocondrial27,28), estes isolamentos geralmente requerem quantidades bastante grandes de tecido de vários indivíduos24,29. Este requisito para grandes quantidades de tecido e indivíduos é um importante fator limitante, especialmente considerando que todos os indivíduos devem ter a mesma idade e de preferência do mesmo sexo para os experimentos, tornando a medida da respiração em horário diferente na melhor das hipóteses, aponta laborioso. Além disso, enquanto os isolamentos mitocondriais podem fornecer insights significativos sobre os mecanismos fundamentais que regulam o metabolismo mitocondrial, os métodos usados para isolar as mitocôndrias têm várias desvantagens como a dificuldade de obter resultados replicáveis , interrupção da rede mitocondrial e alteração da mitocondrial estrutura e função de29,30,31.
O objetivo deste estudo é apresentar um protocolo robusto para medir o consumo de oxigênio mitocondrial em drosófila usando apenas uma quantidade mínima de tecido de muito poucos indivíduos. Esse protocolo consiste em medir o oxigênio mitocondrial consumo em situ usando permeabilized fibras musculares29 de avermelhado de Drosophila em combinação com alta resolução respirometria32,33, 34 , 35. este método também tem vantagens adicionais em comparação com o método clássico de isolamento mitocondrial desde as interações com os outros componentes da célula, como bem como mitocondrial estrutura e função são mais preservadas em permeabilizado fibras29,31,36, que faz com que esta abordagem mais fisiologicamente relevantes. Com este protocolo, funções mitocondriais podem ser exatamente avaliadas usando respirometria de alta resolução em apenas três avermelhado de Drosophila, com substratos, permitindo a determinação do consumo de oxigênio em várias etapas diferentes do RCE. Portanto, este protocolo poderia ajudar a responder questões chave sobre os mecanismos fundamentais que controlam o metabolismo no contexto de muitas condições ambientais ou fisiopatológicos, aproveitando o modelo de Drosophila.
Para medir o consumo de oxigênio em várias etapas diferentes do RCE e avaliar como diferentes substratos contribuem para a respiração, diferentes substratos (Figura 1), desacoplador e inibidores são usados30 após a permeabilização do tecido. Especificamente, adições sequenciais de diferentes substratos são realizadas para estimular a entrada de elétrons através dos complexos diferentes do RCE. Um desacoplador, cianeto de carbonila 4-(trifluorometoxi) phenylhydrazone (FCCP), então é adicionado na concentração ideal para medir a respiração não acoplados, ou seja, a respiração não-pressões estimuladas ao consumo máximo de oxigênio. Inibições sequenciais dos complexos que i, II e III são, em seguida, executada para monitorar o consumo de oxigênio residual que é devido a reações de oxidação não-ETS. Finalmente, a capacidade de respiração máxima complexa IV pode ser avaliada através da injeção de N, N, N', N, - tetrametil - p-fenilenodiamina (TMPD), um provedor de elétron artificial e ascorbato. É importante notar que as experiências são conduzidas a 24 °C, desde que é a temperatura em que as moscas são geradas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>High-resolution respirometer Oxygraph O2K</td>
			<td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td>
			<td>10022-02</td>
			<td>Startup O2K respirometer kit 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2K-Titration Set&#160;</td>
			<td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td>
			<td>20820-03</td>
			<td>Hamilton syringes with different volumes 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Datlab software</td>
			<td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td>
			<td>20700</td>
			<td>Software for data acquisition and analysis 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped antimagnetic forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-400</td>
			<td> 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secura225D-1S-DQE</td>
			<td>Sartorius AG, Goettingen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Semi-micro balance (distributed by several companies)&#160; 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster wild-type w1118</td>
			<td>Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA</td>
			<td></td>
			<td> 
			Storage Condition: 24 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td>EGTA 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1767</td>
			<td>CAUTION: corrosive to metals, acute toxicity, skin corrosion, serious eye damage, acute aquatic toxicity. 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4830</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td> 
			Storage Condition: -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2Phosphocreatine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td> 
			Storage Condition: -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td> 
			Storage Condition: 2-8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8250</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin from quillaja bark</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7900</td>
			<td>Saponin 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: 5 mg in 1 mL of preservation solution. Prepare fresh daily.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>05470</td>
			<td> 
			Storage Condition: 2-8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2S2O4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>157953</td>
			<td>Sodium dithionite. CAUTION: self-heating substances and mixtures, acute toxicity, acute aquatic toxi chronic aquatic toxicity. 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2256</td>
			<td>Pyruvate 
			Storage Condition: 2-8 &#176;C 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Prepare fresh daily.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(-)-Malic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1000</td>
			<td>Malate 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-diphosphate monopotassium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5285</td>
			<td>ADP 
			Storage Condition: -20 &#176;C 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c from equine heart</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7752</td>
			<td>Cytochrome c 
			Storage Condition: -20 &#176;C 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380</td>
			<td>Proline 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2378</td>
			<td>Succinate 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sn-Glycerol 3-phosphate bis(cyclohexylammonium) salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7886</td>
			<td>Glycerol-3-phosphate 
			Storage Condition: -20 &#176;C 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td>FCCP. CAUTION: acute toxicity, skin sensitisation, chronic aquatic toxicity. 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in glass vials at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>CAUTION: acute toxicity, skin irritation, eye irritation, specific target organ toxicity (respir sytem), acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. 
			Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in dark vials at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1296</td>
			<td>Malonate. CAUTION: acute toxicity, serious eye damage. 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH. Prepare fresh daily.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from Streptomyces sp.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Antimycin A. CAUTION: acute toxicity, acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. 
			Storage Condition: -20 &#176;C 
			Solution Preparation: In absolute ethanol. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethyl-p-phenylenediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7394</td>
			<td>TMPD 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at&#160; -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+)-Sodium L-ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4034</td>
			<td>Ascorbate 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at&#160; -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Sodium azide. CAUTION: acute toxicity (oral and dermal), specific target organ toxicity (brain), aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity.&#160; 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of mitochondrial oxygen consumption in permeabilized fibers of drosophila using minimal amounts of tissue

Mosca da fruta, Drosophila melanogaster, representa um modelo emergente para o estudo do metabolismo. Com efeito, drosófila têm estruturas homólogas de órgãos humanos, possuem vias metabólicas altamente conservadas e têm uma duração relativamente curta que permite o estudo de diferentes mecanismos fundamentais em um curto período de tempo. No entanto, é surpreendente que um dos mecanismos essenciais para o metabolismo celular, a respiração mitocondrial, não tenha sido cuidadosamente investigado neste modelo. É provável, porque a medida da respiração mitocondrial em Drosophila geralmente requer um grande número de indivíduos e os resultados obtidos não são altamente reprodutíveis. Aqui, um método que permite a medição precisa do consumo de oxigênio mitocondrial usando quantidades mínimas de tecido da drosófila é descrito. Neste método, o avermelhado é dissecados e permeabilizado mecanicamente com Pinças afiadas e quimicamente com saponina, permitindo que diferentes compostos atravessar a membrana celular e modulam a respiração mitocondrial. Após a permeabilização, um protocolo é realizado para avaliar a capacidade dos diferentes complexos do sistema de transporte de elétrons (ETS) para oxidar substratos diferentes, bem como a sua resposta para um desacoplador e vários inibidores. Esse método apresenta muitas vantagens em comparação com métodos usando isolamentos mitocondriais, como é mais fisiologicamente relevante porque as mitocôndrias são ainda interagir com os outros componentes celulares e a morfologia mitocondrial é conservada. Além disso, os preparativos de amostra são mais rápidos, e os resultados obtidos são altamente reprodutíveis. Combinando as vantagens da drosófila como um modelo para o estudo do metabolismo com a avaliação da respiração mitocondrial, importante novas percepções podem ser reveladas, especialmente quando as moscas estão experimentando diferentes ambientais ou fisiopatológicos condições.

Um traço representativo do consumo de oxigênio mitocondrial usando o protocolo descrito acima é fornecido na Figura 2. O piruvato e malato injetado nas câmaras juntamente com as fibras musculares permeabilized são chamados para a respiração de CI-fuga, ou seja, quando o complexo I de ETS é estimulada pelo NADH produzido através da oxidação do piruvato e malato através do ciclo do ácido cítrico (CI). Durante esta taxa de respiração, o ...

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Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Neste trabalho, é descrito um método para medir o consumo de oxigênio usando respirometria de alta resolução em permeabilized avermelhado da drosófila. Esta técnica requer uma quantidade mínima de tecido, em comparação com a técnica de isolamento mitocondrial clássico e os resultados obtidos são fisiologicamente mais relevantes.

Medição do consumo de oxigênio mitocondrial nas fibras Permeabilized da drosófila usando quantidades mínimas de tecido

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

The overall goal of this procedure is to evaluate mitochondrial respiration in the common fruit fly, Drosophila Melanogaster, using high resolution respirometry.This is achieved by first dissecting the Drosophila, to collect the thorax.The thoraces containing the flight muscles are then carefully permeabilized mechanically, with sharp forceps, and incubated with saponin, for further permeabilization.The thoraces are then transferred into the chambers of a respirometer, and mitochondrial oxygen consumption is measured with a combination of different substrates, uncouplers and inhibitors.Hi, I am Chlo

measurement-mitochondrial-oxygen-consumption-permeabilized-fibers

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.7K visualizações.  Université de Moncton. The overall goal of this procedure is to evaluate mitochondrial respiration in the common fruit fly, Drosophila Melanogaster, using high resolution respirometry.This is achieved by first dissecting the Drosophila, to collect the thorax.The thoraces containing the flight muscles are then carefully permeabilized mechanically, with sharp forceps, and incubated with saponin, for further permeabilization.The thoraces are then transferred into the chambers of a respirometer, and mitochondrial oxyge...

Vídeo: Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Bioquímica

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include flavin-dependent respiratory complexes and dehydrogenases that produce a mixture of superoxide (O2&#9679;-) and hydrogen peroxide (H2O2). Accurate quantification of the ROS-producing potential of individual sites in isolated mitochondria can be challenging due to the presence of antioxidant defense systems&#160;and side reactions that also form O2&#9679;-/H2O2. Use&#160;of nonspecific inhibitors that can disrupt mitochondrial bioenergetics can also compromise measurements by altering&#160;ROS release from other sites of production. Here, we present an easy method for the simultaneous measurement of H2O2 release and nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) production by purified flavin-linked dehydrogenases. For our purposes here, we have used purified pyruvate dehydrogenase complex (PDHC) and &#945;-ketoglutarate dehydrogenase complex (KGDHC) of porcine heart origin as examples. This method allows for an accurate measure of native H2O2 release rates by individual sites of production by eliminating other potential sources of ROS and antioxidant systems. In addition, this method allows for a direct comparison of the relationship between H2O2 release and enzyme activity and the screening of the effectiveness and selectivity of inhibitors for ROS production. Overall, this approach can allow for the in-depth assessment of native rates of ROS release for individual enzymes prior to conducting more sophisticated experiments with isolated mitochondria or permeabilized muscle fiber.

Mitochondria contain several flavin-dependent enzymes that can produce reactive oxygen species (ROS). Monitoring ROS release from individual sites in mitochondria is challenging due to unwanted side reactions. We present an easy, inexpensive method for direct assessment of native rates for ROS release using purified flavoenzymes and microplate fluorometry.

Medição simultânea de peróxido de hidrogénio superóxido e produção de NADH por desidrogenases mitocondriais contendo Flavin

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert NADH and FADH into ATP. Since mitochondria are also the primary site for oxygen use and nutrient oxidation to carbon dioxide and water, how efficiently they use oxygen and produce ATP directly relates to the efficiency of nutrient metabolism, nutrient requirements of the animal, and health of the animal. The purpose of this method is to examine mitochondrial respiration, which can be used to examine the effects of different drugs, diets and environmental effects on mitochondrial metabolism. Results include oxygen consumption measured as proton dependent respiration (State 3) and proton leak dependent respiration (State 4). The ratio of State 3 / State 4 respiration is defined as respiratory control ratio (RCR) and can represent mitochondrial energetic efficiency. Mitochondrial proton leak is a process that allows dissipation of mitochondrial membrane potential (MMP) by uncoupling oxidative phosphorylation from ADP decreasing the efficiency of ATP synthesis. Oxygen and TRMP+ sensitive electrodes with mitochondrial substrates and electron transport chain inhibitors are used to measure State 3 and State 4 respiration, mitochondrial membrane PMF (or the potential to produce ATP) and proton leak. Limitations to this method are that liver tissue must be as fresh as possible and all biopsies and assays must be performed in less than 10 h. This limits the number of samples that can be collected and processed by a single person in a day to approximately 5. However, only 1 g of liver tissue is needed, so in large animals, such as dairy cattle, the amount of sample needed is small relative to liver size and there is little recovery time needed.

Here, we share methods for measuring mitochondrial oxygen consumption, a defining concept of nutritional energetics, and proton leak, the primary cause of inefficiency in mitochondrial generation of ATP. These results can account for 30% of the energy lost in nutrient utilization to help evaluate mitochondrial function.

Medição de consumo de oxigênio mitocondrial hepática e cinética de vazamento de protões para estimar a respiração mitocondrial no gado leiteiro de Holstein

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the progression of cancer, diabetes, neurodegeneration, and aging to name a few. For instance, changes in mitochondrial activity, the cell&#39;s metabolic powerhouse, have been characterized in many such diseases. Generally, the oxygen consumption rates of mitochondria were considered a reliable readout of mitochondrial activity and measurements in some of these studies were based on isolated mitochondria or cells. However, such conditions may not represent the complexity of a whole tissue. Recently, we have developed a novel method that enables the dynamic measurement of oxygen consumption rates from whole isolated fly heads. By utilizing this method, we have recorded lower oxygen consumption rates of the whole head segment in young versus aged flies. Secondly, we have discovered that lysine deacetylase inhibitors rapidly alter the oxygen consumption in the whole head. Our novel technique may therefore aid in uncovering new properties of various drugs, which may impact metabolic rates. Furthermore, our method may give a better understanding of metabolic behavior in an experimental setup that more closely resembles physiological states.

Measuring alterations in metabolic rates is central to understanding the progression of various diseases and aging. Here, we present a novel technique to measure whole head oxygen consumption that more closely resembles the physiological state and may aid in revealing novel drugs that modify mitochondrial activity.

Medindo e interpretando a taxas de consumo de oxigênio em toda a cabeça segmentos de voar

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This enables quantifications of ultrastructural aspects such as volume fractions, surface area to volume ratios, morphometry, and physical contact sites of different subcellular structures. In the 1970s, a protocol for enhanced staining of glycogen in cells was developed and paved the way for a string of studies on the subcellular localization of glycogen and glycogen particle size using transmission electron microscopy. While most analyses interpret glycogen as if it is homogeneously distributed within the muscle fibers, providing only a single value (e.g., an average concentration), transmission electron microscopy has revealed that glycogen is stored as discrete glycogen particles located in distinct subcellular compartments. Here, the step-by-step protocol from tissue collection to the quantitative determination of the volume fraction and particle diameter of glycogen in the distinct subcellular compartments of individual skeletal muscle fibers is described. Considerations on how to 1) collect and stain tissue specimens, 2) perform image analyses and data handling, 3) evaluate the precision of estimates, 4) discriminate between muscle fiber types, and 5) methodological pitfalls and limitations are included.

A modified post-fixation procedure increases the contrast of glycogen particles in tissue. This paper provides a step-by-step protocol describing how to handle the tissue, conduct the imaging, and use stereological methods to obtain unbiased and quantitative data on fiber type-specific subcellular glycogen distribution in skeletal muscle.

Quantificação da Distribuição de Glicogênio Subcelular em Fibras Musculares Esqueléticas usando Microscopia eletrônica de transmissão

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

Quantificação de alto rendimento da síntese e distribuição de mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells produce most of their ATP in the mitochondria by oxidative phosphorylation. Mitochondria are unique organelles because they have their own genome that is replicated and passed on to the next generation of cells. In contrast to the nuclear genome, there are multiple copies of the mitochondrial genome in the cell. The detailed study of the mechanisms responsible for the replication, repair, and maintenance of the mitochondrial genome is essential for understanding the proper functioning of mitochondria and whole cells under both normal and disease conditions. Here, a method that allows the high-throughput quantification of the synthesis and distribution of mitochondrial DNA (mtDNA) in human cells cultured in vitro is presented. This approach is based on the immunofluorescence detection of actively synthesized DNA molecules labeled by 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) incorporation and the concurrent detection of all the mtDNA molecules with anti-DNA antibodies. Additionally, the mitochondria are visualized with specific dyes or antibodies. The culturing of cells in a multi-well format and the utilization of an automated fluorescence microscope make it easier to study the dynamics of mtDNA and the morphology of mitochondria under a variety of experimental conditions in a relatively short time.

Autor em destaque: Quantificação baseada em imagem de alto rendimento da síntese e distribuição do DNA mitocondrial  

A procedure for studying the dynamics of mitochondrial DNA (mtDNA) metabolism in cells using a multi-well plate format and automated immunofluorescence imaging to detect and quantify mtDNA synthesis and distribution is described. This can be further used to investigate the effects of various inhibitors, cellular stresses, and gene silencing on mtDNA metabolism.

Quantificação baseada em imagens de alto rendimento da síntese e distribuição do DNA mitocondrial

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

Rastreamento de isótopos estáveis e análise LC-MS para medir as atividades de DHODH e SDH

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in mammalian cells. As oxygen (O2) is the most ubiquitous terminal electron acceptor for the mammalian ETC, the O2 consumption rate is frequently used as a proxy for mitochondrial function. However, emerging research demonstrates that this parameter is not always indicative of mitochondrial function, as fumarate can be employed as an alternative electron acceptor to sustain mitochondrial functions in hypoxia. This article compiles a series of protocols that allow researchers to measure mitochondrial function independently of the O2 consumption rate. These assays are particularly useful when studying mitochondrial function in hypoxic environments. Specifically, we describe methods to measure mitochondrial ATP production, de novo pyrimidine biosynthesis, NADH oxidation by complex I, and superoxide production. In combination with classical respirometry experiments, these orthogonal and economical assays will provide researchers with a more comprehensive assessment of mitochondrial function in their system of interest.

Autor em destaque: ensaios independentes de oxigênio para medir a função mitocondrial em mamíferos  

Here, we present a compilation of assays to directly measure mitochondrial function in mammalian cells independently of their ability to consume molecular oxygen.

Ensaios Independentes de Oxigênio para Medir a Função Mitocondrial em Mamíferos

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...