Bu protokol, hücre döngüsü aşamasını göz önünde bulundurarak DNA hasar onarım proteinlerinin mekansal ve zamansal alımını anlamaya yardımcı olur. Hücre döngüsü ayrımcılığı için, floresan protein etiketli PCNA'yı, diğer hücre döngüsü senkronizasyon yöntemleri tarafından tanıtılan eserleri atlatan S fazının bir belirteci olarak kullanırız. Bu lazer tabanlı mikro ışınlama ile birlikte DNA hasarı onarım protein kinetiğine benzersiz spatiotemporal çözünürlük verir.
Protokolümüzün rutin kullanımında başarılı olmak, temel konfokal görüntüleme bilgisine dayalıdır. Mikro ışınlamadan 24 saat önce, dört kuyulu bir kapak camına 500 mikrolitrede toplam sekize 10'a 10 mililitrelik bir ortam plakası koyun. Mikro ışınlamadan bir saat önce, normal büyüme ortamını olaparib veya DMSO gibi bir araç kontrolü içeren görüntüleme ortamıyla değiştirin.
Görüntülemeden en az dört saat önce, çevre odasını ve mikroskop bileşenlerini açın. Isıtma, karbondioksit beslemesi ve nem regülatörü açık olsun. Hücreleri mikroskopa aktarmadan en az bir saat önce lazer hatlarıyla birlikte ışık kaynaklarını başlatın.
Mikroskop hedefini yağlayın ve mikroskop altına odalı bir kapak camı yerleştirin. Zaman uyumsuz popülasyondaki S faz hücrelerini seçmek için, S fazında mPlum etiketli PCNA'nın benzersiz yerelleştirme deseni için okülere bakın ve mikro ışınlama için yeterli S faz hücresine sahip bir görüş alanı seçin. İkili hatlar eklemek için ilişkili yazılımı kullanarak mikro ışınlama için ilgi çekici bölgeyi ayarlayın.
İstenen satır ve aralık sayısını ayarlamak için ikiliyi tıklatın, sonra istediğiniz sayıda çizgi çizmek için satır ekle, daire ve elips'i seçin, sonra yatırım getirisini tıklatarak bu ikili çizgileri uyarım ROI'lerine dönüştürün, ikiliyi yatırım getirisine taşıyın, sonra ROI'lerden herhangi birine sağ tıklayın ve uyarım ROI S1 olarak kullan'ı seçin. Bu çizgileri, hücrelerin çekirdeğinden geçecek şekilde görüş alanına yerleştirin. Mikro ışınlamadan önce, daha sonra analiz için PCNA odaklarını tanımlamak için, A1 LFOV kompakt GUI ve A1 LFOV tarama alanı pencerelerinde gerekli parametreleri ayarlayarak ve ardından yakalama düğmesine basarak görüş alanının daha yüksek çözünürlüklü bir görüntüsünü alın. Mikro ışınlamayı ayarlamak için ND stimülasyon sekmesini açın, ardından galvano tarayıcılarını kullanarak bir dizi uyarım öncesi görüntü ve ardından bir dizi uyarım sonrası görüntü elde etmek için zaman çizelgesi penceresine erişin.
Zaman çizelgesi penceresinde üç aşama ayarlayın. Edinme ve stimülasyon sütununda, sırasıyla üç aşama için edinme, uyarılma ve edinmeyi seçin. Uyarılma aşaması için S1'i yatırım getirisi olarak ayarlayın.
Galvano XY penceresinde, 405 nanometre lazer hattı için %100 lazer güç çıkışını ayarlayın ve mikro ışınlama için bekleme süresini ayarlayın. İstenen zaman aralığı ve aralıkları için timelapse görüntülemeyi ayarlamak için, A1 LFOV kompakt GUI ve A1 LFOV tarama alanı pencerelerini kullanın. A1 LFOV kompakt GUI penceresinde görüntüleme sırasında fotoğraf ağartma oranını azaltmak için lazer güç yüzdesini, kazancını ve ofset ayarlarını optimize edin.
Proteinin kinetiğine bağlı olarak, zaman çizelgesi penceresinde üçüncü faz alım satırı için istenen aralığı ve süreyi ayarlayarak görüntüler arasındaki aralığı veya toplam zaman diliminin süresini uzatın veya kısaltın. Mikro ışınlamayı ve sonraki timelapse görüntülemeyi yürütmek için şimdi çalıştır'a basın. Timelapse görüntülemenin sonunda, stimülasyon ROI'lerini ayrı görüntüler olarak kaydedin, bu da analiz için kullanılan herhangi bir aşağı akış yazılımında mikro ışınlama koordinatlarını tanımlamak için yararlı olacaktır.
PCNA, G1 ve G2 fazlarında çekirdekte tamamen homojen bir dağılıma sahiptir. S fazında, PCNA çekirdekte parlak noktalar olarak görselleştirilebilen DNA replikasyon bölgelerine lokalize olur. Erken S faz hücrelerinde, lekeler nispeten küçüktür ve hücrenin çekirdeği boyunca eşit olarak dağılmıştır.
Orta S fazına ilerlerken, lekeler bulanıklaşır ve çekirdeğin ve çekirdeğin çevresine doğru daha fazla lokalize olur. Geç S aşamasında, noktalar sayıca azalır, ancak PCNA geç çoğaltma sitelerinde yoğunlaştıkça giderek daha büyük hale gelir. 1.000 mikrosaniyelik yükseklik süresi gibi düşük dozlarda enerji, çift iplikli bir mola müdahalecisi olan EGFP-FBXL10'un işe alınmasına neden olmaz, ancak oksidatif DNA hasarı bölgelerine alınan bir baz eksizyon onarım yolu proteini olan NTHL1-mCherry'nin işe alımını teşvik etmek için yeterlidir.
3.000 mikrosaniyelik bir sürede, hem EGFP-FBXL10 hem de NTHL1-mCherry işe alınarak hem oksidatif lezyonlar hem de çift iplikli kırılmalar üreten bir lazer çıkışı gösterilmiştir. EXO1b yaklaşık bir dakika içinde maksimum birikim ve mikro ışınlama bölgesi seviyesine ulaşır ve daha sonra yavaşça DNA lezyonlarından ayrılmaya başlar. Olaparib varlığında, bir dakikada lazer şeritte EXO1b birikimi araç kontrolüne kıyasla önemli ölçüde daha azdır.
Mikroskobun ısınması için geniş bir zaman verilmesi ve tutarlı sonuçlar elde etmek için kültür ve koşulların her deney için en uygun olması çok önemlidir. Ayrıca, belirli DNA lezyonlarını test etmek için lazer ayarlarınızı farklı DNA hasarı muhabirleri ile optimize etmek önemlidir. Mikro ışınlamayı takiben, sonuçları fraksiyonasyon, immün önseçim veya ChIP gibi klasik biyokimyasal yöntemlerle doğrulamayı düşünün.
Bu yaklaşımlar daha büyük bir hücre popülasyonu örnekle, böylece istatistiksel güç sağlar.
