F. Camargo tetO YAPS127A farelerhediye için teşekkür ederim; R26-rtTAM2 fareler (stok #006965) Jackson laboratuardan satın. Chiara Frasson ve Giuseppe Basso FACS yordamlar ile yardım için teşekkür. Bu eser AIRC özel Program moleküler klinik Onkoloji '' mille başına 5'' tarafından desteklenen ve bir AIRC PI-Grant S.P için ve epigenetik amiral gemisi projesi CNR-Miur tarafından S.P. için verir Bu proje Avrupa Birliği'nin ufuk 2020 araştırma ve yenilik programı (hibe sözleşmesi DENOVOSTEM No 670126) altında Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) üzerinden fon aldı.

<ol>
	<li>Panciera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Expandable+Tissue-Specific+Stem/Progenitor+Cells+through+Transient+Expression+of+YAP/TAZ.">Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ.</a> Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).</li><li>Bar-Nur, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+conversion+induced+by+pluripotency+factors+involves+transient+passage+through+an+iPSC+stage.">Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage.</a> Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).</li><li>Xu, J., Du, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+reprogramming:+strategies,+mechanisms,+and+applications.">Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications.</a> Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+plasticity.+Plasticity+of+epithelial+stem+cells+in+tissue+regeneration.">Stem cell plasticity. Plasticity of epithelial stem cells in tissue regeneration.</a> Science. 344 (6189), 1242281 (2014).</li><li>Bai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yes-associated+protein+regulates+the+hepatic+response+after+bile+duct+ligation.">Yes-associated protein regulates the hepatic response after bile duct ligation.</a> Hepatology. 56 (3), 1097-1107 (2012).</li><li>Cai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+signaling+pathway+restricts+the+oncogenic+potential+of+an+intestinal+regeneration+program.">The Hippo signaling pathway restricts the oncogenic potential of an intestinal regeneration program.</a> Genes Dev. 24 (21), 2383-2388 (2010).</li><li>Elbediwy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+signalling+regulates+YAP+and+TAZ+to+control+skin+homeostasis.">Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis.</a> Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).</li><li>Taniguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gp130-Src-YAP+module+links+inflammation+to+epithelial+regeneration.">A gp130-Src-YAP module links inflammation to epithelial regeneration.</a> Nature. 519 (7541), 57-62 (2015).</li><li>Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downstream+of+mutant+KRAS,+the+transcription+regulator+YAP+is+essential+for+neoplastic+progression+to+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Downstream of mutant KRAS, the transcription regulator YAP is essential for neoplastic progression to pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Sci Signal. 7 (324), ra42 (2014).</li><li>Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP/TAZ+at+the+Roots+of+Cancer.">YAP/TAZ at the Roots of Cancer.</a> Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).</li><li>Azzolin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP/TAZ+incorporation+in+the+beta-catenin+destruction+complex+orchestrates+the+Wnt+response.">YAP/TAZ incorporation in the beta-catenin destruction complex orchestrates the Wnt response.</a> Cell. 158 (1), 157-170 (2014).</li><li>Stingl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells.">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).</li><li>Means, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+epithelial+plasticity+mediated+by+acinar+cell+transdifferentiation+and+generation+of+nestin-positive+intermediates.">Pancreatic epithelial plasticity mediated by acinar cell transdifferentiation and generation of nestin-positive intermediates.</a> Development. 132 (16), 3767-3776 (2005).</li><li>Shi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+acinar+cell+organization+is+critical+to+preventing+Kras-induced+acinar-ductal+metaplasia.">Maintenance of acinar cell organization is critical to preventing Kras-induced acinar-ductal metaplasia.</a> Oncogene. 32 (15), 1950-1958 (2013).</li><li>Huch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> EMBO J. 32, 2708-2721 (2013).</li><li>Fernandez Vallone, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trop2+marks+transient+gastric+fetal+epithelium+and+adult+regenerating+cells+after+epithelial+damage.">Trop2 marks transient gastric fetal epithelium and adult regenerating cells after epithelial damage.</a> Development. 143 (9), 1452-1463 (2016).</li><li>Yanger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cellular+reprogramming+occurs+spontaneously+during+liver+regeneration.">Robust cellular reprogramming occurs spontaneously during liver regeneration.</a> Genes Dev. 27 (7), 719-724 (2013).</li><li>Yui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP/TAZ-Dependent+Reprogramming+of+Colonic+Epithelium+Links+ECM+Remodeling+to+Tissue+Regeneration.">YAP/TAZ-Dependent Reprogramming of Colonic Epithelium Links ECM Remodeling to Tissue Regeneration.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li><li>Pan, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+patterns+of+multipotentiality+in+Ptf1a-expressing+cells+during+pancreas+organogenesis+and+injury-induced+facultative+restoration.">Spatiotemporal patterns of multipotentiality in Ptf1a-expressing cells during pancreas organogenesis and injury-induced facultative restoration.</a> Development. 140 (4), 751-764 (2013).</li><li>Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+YAP+and+TAZ+in+physiology+and+disease.">Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 758-770 (2017).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

Burada YAP, geçici ifade tarafından daha önce1bildirildiği gibi ölümcül ayrıştırılan ex vivo epitel hücreleri farklı dokuların onların karşılık gelen doku özgü progenitör hücreler (ya da ySCs) yeniden programlamak için protokolleri mevcut. Biz iki yordam ayrıntılı: bir lentiviral Vektörler ve viral enfeksiyon önler ve alan avantaj transgenik YAP ifade ikinci bir FACS saf hücrelerinin yeniden programlama sağlar. Her iletişim kuralı izole etmek için etkili bir strateji sunar ve farklı hücrelerde de novo somatik doku özgü Genişletilebilir kök hücreleri (bkz: üreten gen ekspresyonu YAP kültür birincil farklılaşmış hücreler ve eksojen zorlamak için bir strateji düzenleri rakamlar 1A ve 2A).
Burada etkin bir şekilde sunulan yalıtım stratejileri farklılaştırılmış hücrelerin saf bir nüfus ayrı bir şekilde negatif kontrol örnekleri (rakamlar 1 c ve 2 C) üzerinden herhangi bir çıkıntı hiç tespit ettik Aslında gösterdiği gibi gösterdi.
Bu çalışmada birincil meme LD hücrelerinin yeniden programlama için kullanılan lentiviral vektörleridir Doksisiklin transgene ifade sıkı bir kontrol imkanı sunan indüklenebilir; Bu açmak için izin verir ve eksojen YAP ifade eder. Bu verimlilik yeniden programlama açısından zararlı olabilir gibi özellikle dikkat aşırı bir viral titresi kullanımı kaçınarak yer almalıdır. Birincil acinar hücreleri söz konusu olduğunda, bir YAP-bağımlı ile en az manipülasyonlar yeniden programlama elde etmek için tam transgenik bir yaklaşım için açık. İzole acinar kümeleri pek müsait lentiviral enfeksiyon ve çok kırılgan olduğu gibi bu ikinci strateji de birincil pankreas acini için özellikle uygundur. İstihdam transgenik strateji Doksisiklin bağımlı lentiviral vektörler gen ekspresyonu sıkı kontrolü için aynı avantajı sunuyor. Ayrıca, birincil pankreas acini ile istismar transgenik strateji viral kaynaklı meme LD hücrelerinin yeniden programlama için göre bir çok daha yüksek programlama verimlilik avantajı taşımaktadır. Hücrelere farklı dokular elde ilişkili farklı iç plastisite pankreas yeniden programlama daha yüksek oranda daha yüksek verim ilişkili tüm üniforma ve özerk YAP ifade için ifade türetilen explanted hücreleri. Özellikle, eksojen YAP artık ySCs (yMaSC kolonileri ve yDucts), bir nesil sonra kendi kendini yenileme kapasitesi etkilemeden gerekli olduğunu göstermiştir. Bunun nedeni ySCs endojen YAP/TAZ yeniden etkinleştirin ve eksojen YAP1adet açık olduğunda onları öz-yenileme için kullanın.
YSCs gerçekten de ortaya farklılaştırılmış hücrelerden programlama deneylerimiz ile genetik soy izleme doğrulamaları1menşe hücre kontrol ederek kavramı geçerliliği.
Geniş karakterizasyonuySCs gösterir YAP kaynaklı yeniden programlama normal somatik SCs1 ben oluşturur) transcriptomic düzeyinde ySCs ile yerli SCs; büyük programların çakışmasını görüntülemek. II) ySCs farklılaşma potansiyeli görüntülemek ve her zaman onların doku kökenli kimlik için sınırlı bir multilineage döl oluşturabilir; III) sigara dönüştürülmüş ySCs ve tumorigenic zaman içinde vivonakledilmektedir.
Burada da korumak ve kültürde genişletmek için yordamlar açıklar yMaSCs ve yDucts organoids olarak % 100 membran matris hydrogels içinde gömülü. Bu koşullar için kendi kendine organizasyon olanak verir stemness özellikleri kültürde uzun vadeli bakım sağlamak üç boyutlu organoids içine ySCs nüfus aşağı akım analizleri ve uygulamalar için diledikleri kaynaklanıyor bunlar genişletmek için etkinleştirme. Bilinmeyen nedenlerden dolayı yMaSC alamadı yerleştirerek organoids enfekte LD hücreleri organoid kültür koşullarda doğrudan plastik doku kültürü plaka; Doksisiklin tedavi sonrası 7 gün başka bir deyişle, ara büyüme meme koloniyi koşulları temel adımdır. Bizim ellerde bile yerli MaSCs organoid kültür passaging önce meme koloniyi koşullar gerektirir. Ayrıca, biz birincil kolonileri tek hücrelere dissociating önlemek, ancak oldukça sağlam koloniler organoid kültür koşullar aktarmak en verimli organoid sonucu elde edilir.
Organoid kültür koşulları da şartıyla organoids hücre ayrılma dondurma azot banyo önce kaçınarak onların matrisler kurtarıldı ySCs, cryopreserve imkanı veren avantajı ayı.
Sunulan yordam yeniden programlama YAP farklı farklı hücre tipleri farklı yetişkin dokulardan (biz-si olmak sınav meme, pankreas ve nöronal hücre kullanarak) karşılık gelen doku özgü kök hücreler türetilmiş dönüştürebilirsiniz1. İPSCs veya diğer programlama çabaları farklılık, YAP/indüklenen SCs doku kökenli anıları koruyabilirsiniz. Dikkat, kök gibi özelliklerle donatılmış hücrelere somatik hücre de-farklılaşma hücre kader plastisite tek biçimidir ve yeniden programlama örneğin sonra doku hasarı ve5,17 şifa yara desteklemek için içinde vivo gözlenen , 18 , 19 , 20. bu önemli YAP ve TAZ için normal homeostazı büyük ölçüde gereksiz ama birden fazla doku11,21doku onarımı için çok önemli değil. Sürekli burada açıklanan programlama adımları fizyolojik fonksiyonu ile YAP/TAZ son zamanlarda gösterilmiştir bir dönüşüm yetişkin bağırsak hücrelerinin neden olarak bağırsak rejenerasyon Ülseratif Kolit hastalarının fare modellerinde gerekli için fetal gut19özelliklerini görüntüler tamir epitel. YAP yeniden programlama böylece geçerli indüklenen hücre plastisite stratejileri sağlayarak kuruluşlarınızdaki defa içinde vitroyakalamak için zorlu bir devlet, somatik kök hücre üretmek için genişler. Bu yaklaşım, aynı zamanda insan kaynaklı hücrelere genişletilmiş geniş ilgi somatik stemness devletin çalışma rejeneratif tıp uygulamalarından olan ve somatik genişlemesi için kök hücreleri vitro.

Doku özel somatik kök hücreleri (SCs) yaralanma sonra doku yenileme ve onarım için kritik öneme sahiptir. Kolayca ayırmak ve unlimitedly ex vivo somatik SCs temsil SC uygulamalarında temel araştırma ve hastalık modelleme yanı sıra potansiyel rejeneratif tedaviler için kritik bir sorunu genişletin imkanı. Bu yönde ilerleme ancak, çeşitli epitelyal organları içinde vitroSC durumunu yakalayan zorluk tarafından sınırlıdır. Gerçekten de, birçok yetişkin dokularda ikamet SCs var veya kullanıma hazır olur olmaz veya kendi numarası ve rejeneratif potansiyel ya da yaşlanma hastalığı koşullar tarafından aşınmış olabilir. Bu ifade, tek bir transkripsiyon coactivator bildirerek bu boşluğu doldurmak başladık 2016 yılında YAP (Evet ilişkili protein) veya onun yakından ilişkili protein TAZ (transkripsiyon harekete geçirmek PDZ motifi ile), ölümcül farklılaşmış hücreler verimli bir şekilde onların karşılık gelen doku özgü SCs1operasyonel ve tatlı ayırt edilemez işlev, genişletilebilir, Sigara tumorigenic, Otolog hücre popülasyonlarının oluşturur. Bir darbe YAP sürekli veya TAZ birkaç gündür somatik SCs kendini sürekli yenileyen görünümü ikna etmek yeterli bir faaliyettir. Bu gibi daha fazla ifade Ektopik YAP/TAZ1olmadan cep nesilden bulaşabilir artık sürekli transgene ifade üzerinde bağımlı değil istikrarlı bir durumdur. Protokol burada yordam de novo epitel kök/progenitor hücreler meme bezi ve pankreas, bu dokuların farklılaştırılmış hücrelerden başlangıç üretmek için kullanılan ayrıntıları sundu. Bu yordamı geçerli yeniden programlama/transdifferentiation arenada bir kara kutu doldurur. Bu yönde ana çabaları gerçekten defa bu embriyonik dönüşüm tarafından takip bir İndüklenmiş pluripotent kök hücre (IPSC) durumuna hücre geçiş merkezli ve pluripotent SCs içine daha hücreleri ayrıştırılan. Ancak, iPSCs bir kez onların tam ve verimli farklılaşması2protokollerde geliştirme ihtiyacı yükselterek yetişkin dokularda ortaya tumorigenic. Ancak, bu farklılaşma adımı bile mümkün olduğunda, uzun vadeli genişletilebilirlik, kendi kendine organizasyon ve organ repopulation potansiyelleri bedeli vardır. Aslında tipik sadece endojen doku özgü SCs ve şu anda açıklanan YAP kaynaklı SCs (ySCs) temel öznitelikleri organ rejenerasyon için bunlar. Benzer şekilde, doğrudan transdifferentiation bir hücre türü kokteyller ve çeşitli transkripsiyon faktörleri de oluşturmak kullanarak başka bir temel proliferatif stemness potansiyel ve3eksikliği hücreleri ayrıştırılan.
Burada açıklanan yordamı da endojen SCs genişletilebilir ve ex vivo4farklı son zamanlarda tanıtılan organoid teknoloji yararlanır. SCs YAP kaynaklı endojen SCs mevcut değildir bile deneysel, biyolojik ya da hastalık koşullarında organoid oluşturan SCs oluşturabilir. Diğer programlama yordamları ile farkı, reversion canlı dokularda oluşan bir SC benzeri durum için sadece formu YAP tarafından öğretilir hücre plastisite tür karşılık, notu istiyorum. Reacquisition SC gibi özelliklerin doku onarım veya oncogenic harekete geçirmek5ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Birkaç Yetişkin dokuların homeostazı için gereksiz olmasına rağmen YAP ve/veya TAZ kesinlikle yeniden oluşturma işlemi, tümör büyüme ve in vitro1,6,7,8 somatik SCs genişlemesi için gereklidir ,9,10,11,12

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1099">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">10 mL sterile syringes</td>
			<td style="width:123px;">Rays</td>
			<td style="width:112px;">10LC</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mm&#160; cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">15 mL sterile conical tubes</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">430052</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">24-well ultra low attachment plates</td>
			<td style="width:123px;">Costar</td>
			<td style="width:112px;">3473</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">40 mm cell strainers</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:112px;">352340</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">48-well multiwell plates</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">353078</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">50 mL sterile conical tubes</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">430290</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">6-well multiwell plates</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">353046</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">12634028</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504001</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BPE</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>13028014</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">Collagenase, type I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>17018029</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dispase</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">1705-041</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">Disposable scalpels</td>
			<td style="width:123px;">Swann-Morton</td>
			<td style="width:112px;">0503</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">11320033</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">DMSO</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">D2650</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DnaseI</td>
			<td style="width:123px;">Roche</td>
			<td style="width:112px;">11284932001</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9891&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">E5134</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol 100%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51976</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FACS tubes (with strainer caps)</td>
			<td style="width:123px;">Falcon</td>
			<td style="width:112px;">352235</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse CD326 (Ep-CAM)</td>
			<td style="width:123px;">BioLegend</td>
			<td style="width:112px;">118208</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUdeltaGW-rtTA&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#19780&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUW-tetO-EGFP</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84041</td>
			<td style="width:384px;">used as negative control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUW-tetO-MCS</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84008</td>
			<td style="width:384px;">used as negative control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUW-tetO-wtYAP</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84009</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:481px;">FUW-tetO-YAPS94A</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84010</td>
			<td style="width:384px;">used as negative control (transcriptionally dead YAP mutant)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMax</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">35050061</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HBSS</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">24020117</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30721</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">heparin sodium salt</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">H3149&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffer solution (1M)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">15630-056</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human R-Spondin1 (His Tag)</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>11083-H08H-5</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ITS-X</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>51500056</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">K-14 antibody</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td>Ab7800&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">K-8 antibody</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td>Ab14053&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">&#160;25030081</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lin (allophycocyanin [APC] mouse lineage antibody cocktail)</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;">51-9003632</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel&#174; Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>0402</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72340</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">non-cell adhesive 10 cm dishes (sterile polystirol petri dish &#248; 94)</td>
			<td style="width:123px;">ROLL</td>
			<td style="width:112px;">18248</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS 10x</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECM4004XL</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE Hamster Anti-Mouse CD61</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;">553347</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE-Cy5 Rat Anti-Human CD49f</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;">551129</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse/rat CD29 Antibody</td>
			<td style="width:123px;">BioLegend</td>
			<td style="width:112px;">102222</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Tail Collagen I (coating)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">122-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Tail Collagen I for 3D culture</td>
			<td>Cultrex</td>
			<td>3447-020-01&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant human FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant human Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant murine EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant murine FGF basic (bFGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td style="width:112px;">450-33</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>31870025</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SBTI (Trypsin inhibitor from Glycine max)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris BASE&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814273001</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA 0,05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Waymouth medium</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>31220023</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

de novo generation of somatic stem cells by yap/taz

Burada birincil farklılaşmış hücreler ve çevirmek onları içine kök/progenitor hücreler (SCs) transkripsiyon faktörü geçici ifade tarafından aynı soydan YAP izole etmek için protokolleri mevcut. Bu yöntemle, moleküler ve fonksiyonel özelliklerini meme SCs. YAP sorun da tam ayrıştırılan döner pankreas ekzokrin hücrelere Pankreatik kanal benzeri oluşturan hücrelere luminal farklılaştırılmış (LD) hücreler fare meme bezinin dönüştürülür ataları. YSCs kalıtsal bir kendi kendini yenileyerek SC gibi devlet ile donatılmış olan gibi benzer şekilde, endojen, doğal SCs için YAP kaynaklı kök benzeri hücreler ("ySCs") sonunda organoid kültürler uzun vadeli in vitro Ektopik YAP/TAZ, daha fazla ihtiyacı olmadan olarak genişletilebilir.
Burada sunulan programlama yordamı oluşturmak ve vitro progenitör hücre farklılaştırılmış hücrelerden başlayarak çeşitli doku kaynaklarının genişletmek imkanı sunuyor. Somatik hücre ex vivo basit genişlemesi rejeneratif tıp, anlayış mekanizmaları tümör inisiyasyon ve daha fazlası için genel olarak, hücre ve gelişim biyolojisi çalışmaları için etkiler.

YMaSCs nesil Şekil 1A' deneysel strateji birincil meme LD hücreleri YAP geçici ifade tarafından yeniden programlamak için genel bir bakış sunulmaktadır. Birincil meme LD epitel hücreleri floresan aktif hücre tarafından13sıralama saf. Şekil 1B temsil eden üç ayrı altgrupları elde etmek için normal bir sıralama yordama: Bazal hücreler (EpCAMdüşükCD49fyüksekCD61-), Luminal Dede (LP) hücreleri (EpCAMyüksekCD49fdüşükCD61+ ) ve LD hücreleri (EpCAMyüksekCD49fdüşükCD61-). Dikkatli üç altgrupları çoğunluğuna LD hücrelerin saf bir hazırlık yalıtmak için önemlidir, bu tam olarak ayırt ve tamamen büyüme koşullara (bakınız şekil 1 cpanel yaptı,) oluşturan meme bezi kolonisinde seribaşı zaman tutuklandı. Tersine, zaman eksojen YAP ifade etmek için indüklenen, kolayca tanınabilir yoğun epitel koloniler halinde % 5 membran matris süspansiyon kültürler (şekil 1 c) oluşturmak üzere Proliferasyona LD hücreleri başlar. Yeniden programlama, verimliliği tespit için tipik bir yaklaşık % 3 deneme, kolonileri başlangıçta membran matris süspansiyon kültürlerde (şekil 1 d) numaralı seribaşı tek hücre sayısı üzerinden sayılması tarafından attı. Programlanmış luminal hücreleri (yMaSCs) o zaman geçit birden fazla Lümen geliştirmek karmaşık organoid benzeri yapılar kendi kendini düzenleme ( şekil 1Adüzeninde) % 100 membran matris organoid kültür koşullara bakınız, içine olabilir ve Doksisiklin (Yani transgenik YAP ifade yokluğunda) yokluğunda bile dikkate değer kendini yenileme yeteneği görüntülemek (şekil 1E). Histolojik olarak, yMaSC elde edilen organoids Bazal tabaka (K14 pozitif) ekran, membran matris karşı karşıya ECM ve Lümen benzeri boşluklar organoid (şekil 1F) içinde karşı karşıya luminal Katmanı (K8 pozitif), yeniden düzenlendi. Bu mimari bu yerel MaSCs (şekil 1F) tarafından kurulan organoids dan ayırt edilemez olduğunu.
YDucts nesil Deneysel strateji birincil pankreas acini YAP geçici ifade tarafından yeniden programlamak için genel bir bakış şekil 2Asunulur. Tüm acinar kümeleri pankreas dokusunun toplu bir arada hafif ayrılma ve boyutu dışlama filtrasyon yoluyla tarafından izole edilmiştir. Tipik bir hazırlık şekil 2Biçinde sunulur. Yalıtım sonra acinar hücre kümeleri yok kirlenme endokrin Langerhans adacıkları veya pankreas duktal ağaç ve tek hücrelere en az ayrılma parçaları ile homojen boyutta ekzokrin acinar birimlerinin bir süspansiyon olarak görünmelidir. Kirlenme endokrin adacıkları veya duktal parçaları eksik Seçici Filtrasyon (Adım 2.1.10), büyük olasılıkla sert işleme nedeniyle bir göstergesidir; Tek Kişilik hücrelere acinar kümelerinin istenmeyen ayrılma aşırı collagenase tedavi veya tamponsuz etkinliğini proteolitik enzimler tarafından ek SBTI tedavi sınırlama doku tarafından yayımlanan nedeniyle olabilir.
Tipik bir acinar programlama deney şekil 2Ciçinde sunulur; 3D kollajen kültüründe 5-7 gün içinde-hidrojel Doksisiklin huzurunda dayalı, pankreas acini R26-rtTAM2/tetO-YAPS127A fareler kolayca elde açmak kanalı gibi kümeler halinde ( yDuctsadını verdik ki), oluşan ince bir monolayer epitel hücrelerinin genişleyen bir merkez kavite çoğalırlar. Tipik bir deneme için % 70 civarındadır, programlama verimliliği numaralı seribaşı acini (şekil 2B) toplam sayısı üzerinden kanal benzeri küme sayısı puanlama tarafından kolayca ölçülebilir. Negatif kontrol hücreleri, yani R26-rtTAM2 / + Doksisiklin, hücreleri veya R26-rtTAM2/tetO-YAPS127A hücreleri sola kaçınılmaz kalır daha önce bildirilen bu koşullarda kültür,1 sonrası Mitotik acinar kümeleri ,14,15. Programlanmış yDucts sonra passaged tek hücre düzeyinde Matrigel tabanlı organoid kültür koşulları16 (bkz. şekil 2Adüzeninde) olağanüstü kendini yenileme yeteneği bile Doksisiklin (Yani yokluğunda görüntüleme transgenik YAP ifade yokluğunda) (şekil 2E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig1.jpg"> Şekil 1: Birincil meme LD izolasyon hücreler ve meme indüksiyon kök hücre. (A) deneysel işlemin şematik gösterimi kabul birincil meme LD hücreleri yeniden programlamak için. LD hücreleri arındırmak için (B) temsilcisi FACS-araziler tipik bir sıralama yordam gösteren. i) Disosiye hücreleri canlı hücreler (P1; mavi) için ileriye doğru ve yan dağılım göre geçişli II) nüfus P1 sonra daha fazla kapı onun Lin tercihe göre: Lineage pozitif hematopoetik hücrelerin; hariç subpopulation Lineage negatif hücre (P2; gri) seçilir III) nüfus P2 sonra içine bir EpCAMyüksek (P3; sarı + yeşil) ve bir EpCAMdüşük (P6; kırmızı) altgrupları ayrılmaktadır; IV) P3 ve P6 o zaman daha fazla kapı onların CD61/CD49f tercihe göre üç altgrupları: EpCAMdüşükCD49fyüksekCD61- Bazal hücreler (P7; kırmızı), EpCAMyüksekCD49fdüşükCD61+ LP hücreleri (P8; sarı) ve EpCAMyüksekCD49fdüşükCD61- LD hücreleri (P9; yeşil). (C) meme kolonileri meme koloniyi ortamda tohum sonra 15 gün oluşturmak için yetenek belirtilen yapıları ile enfekte LD hücrelerinin açıklayıcı görüntülerdir. Sadece YAP ifade hücreleri dönüşte koloni oluşturan hücreleri, (EGFP-enfekte) negatif kontrol hücreleri, ancak kalır tek hücreler olarak büyüme tutuklandı. Ölçek çubuğu 50 mikron =. (D) miktar yeteneği olduğu gibi (C) belirtilen hücre oluşturan Colony. Verileri ortalama + SD sunulmaktadır ve beş bağımsız deneyler, her altı teknik çoğaltır ile temsilcisi. (E) temsili resim YAP yeniden programlanan meme kök hücre benzeri hücre (yMaSCs) organoid kültür koşullarda taze üç boyutlu % 100 membran matris hidrojel yokluğunda Doksisiklin içine 12 gün sonra. Ölçek çubuğu 100 mikron =. (F) temsilcisi ayirt görüntüleri için Bazal işaretçiyi K14 (yeşil) ve luminal marker K8 (kırmızı) organoids organoid kültür koşullar içine 12 gün sonra belirtilen hücrelerden türetilmiş. Ölçek çubuğu 10 mikron =. Bu rakam Panciera vd., 20161' den yeniden oluşturulur. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig2.jpg"> Resim 2 : Yalıtım birincil pankreas acinar hücreleri ve pankreas ataları indüksiyon. (A) deneysel işlemin şematik gösterimi kabul birincil pankreas ekzokrin acinar hücreleri yeniden programlamak için. (B) temsilcisi görüntü yalıtım yordamı (Adım 2.1.14) hemen sonra birincil pankreas acini. Acinar hazırlık tek hücreleri en az varlığı ile acinar kümeleri, homojen bir süspansiyon görünmesi gerekir. Ölçek çubuğu 400 mikron =. (C) birincil pankreas acini temsilcisi görüntüleri elde edilen R26-rtTAM2 (üst panelleri)veya R26-rtTAM2; tetO YAPS127A (alt paneller) fareler ve 3-b kolajen kültürlü-5 gün ile ya da ezelî hidrojel dayalı Doksisiklin (şırfıntı) belirtildiği gibi. Yalnızca birincil acini YAP ifade kist benzeri organoid Doksisiklin eklenmesinden sonra büyüyen hücreler için dönüştürün. Ölçek çubukları 70 mikron =. (D) miktar pankreas acini yeteneği transgenik YAP overexpression (C) olduğu gibi üzerine duktal organoids oluşturmak için. Verileri ortalama + SD sunulmaktadır ve dört teknik çoğaltır ile gerçekleştirilen beş bağımsız deneyler temsilcisi. (E) temsili resim YAP reprogramed duktal benzeri hücre (yDucts) üç pasajlar taze üç boyutlu % 100 membran matris hidrojel Doksisiklin yokluğunda sonra. Ölçek çubuğu 130 μm kalınlığında =. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Birincil meme hücre izolasyon</td>
		</tr>
<tr>
<td>Çözüm şelat Ca2 +</td>
			<td>Mağaza 4 ° c</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>%0,02 w/V</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Kollajen ben çözüm kaplama</td>
		</tr>
<tr>
<td>Asetik asit 0.02N, pH 3,23</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Sıçan kuyruğu kollajen (kaplama)</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase çözüm</td>
			<td>Mağaza 4 ° c</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Ayrılma orta</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase hisse senedi çözüm</td>
			<td>400 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalem/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hisse senedi çözüm collagenase ben</td>
			<td>600 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hemolitik çözüm</td>
			<td>Mağaza 4 ° c</td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl çözüm</td>
			<td>1 parçalar</td>
		</tr>
<tr>
<td>TrisBase 20.6 g/L</td>
			<td>9 parça</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH 7.2 için ayarlamak</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS/PS</td>
			<td>Mağaza 4 ° c</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalem/Strep</td>
			<td>2 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase hisse senedi çözüm</td>
			<td>Filtre 0.2 µm, mağaza 4 ° c</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase sığır testisler (toz) üzerinden</td>
			<td>2.000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sodyum fosfat tampon 1 M pH7.3</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl çözüm</td>
			<td>T. amb saklayın.</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl</td>
			<td>7.1 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>7,65 pH ayarlama</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Çözüm sıralama</td>
			<td>Filtre 0.2 µm, mağaza 4 ° c</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>% 0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES pH 7</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Orta #1 yıkama</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalem/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Orta #2 yıkama</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>% 5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalem/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Meme 2D kültür orta</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>% 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>heparin</td>
			<td>4 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-glutamin</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>fare bFGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>fare EGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalem/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">İndüksiyon ve yMaSCs Passaging</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Meme koloniyi orta</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>% 5</td>
		</tr>
<tr>
<td>heparin</td>
			<td>4 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-glutamin</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Matrigel (hemen önce tohum ekleyin)</td>
			<td>% 5</td>
		</tr>
<tr>
<td>fare bFGF</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>fare EGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalem/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Meme Organoid orta</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gelişmiş DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>GlutaMax</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>heparin</td>
			<td>4 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hepes</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>İnsan kafa</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>fare bEGF</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>fare EGF</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin 1</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: yMaSCs nesil. Kompozisyon tüm farklı kültür medya ve yalıtım birincil meme LD hücre ve yMaSCs (Bölüm 1) indüksiyon için gerekli çözümleri
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Birincil pankreas acini yalıtım</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acinar kültür orta</td>
		</tr>
<tr>
<td>BPE</td>
			<td>50 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>% 0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Deksametazon</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>% 0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>ITS-X</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalem/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Waymouth'ın orta</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acinar yıkama orta</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>% 0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalem/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>RPMI orta</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acinar kurtarma orta</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acinar kültür orta</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>% 30</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Collagenase ben çözüm A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acinar yıkama orta</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Hisse senedi çözüm collagenase ben</td>
			<td>360 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS/PS</td>
			<td>Mağaza 4 ° c</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS (fosfat tamponlu tuz)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalem/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hisse senedi çözüm collagenase ben</td>
			<td>Mağaza-20 ° c</td>
		</tr>
<tr>
<td>Collagenase, türü ben (toz)</td>
			<td>6000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Pankreas organoids passaging</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Collagenase ben çözüm B</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS 1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Hisse senedi çözüm collagenase ben</td>
			<td>240 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Pankreas Organoid orta</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gelişmiş DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>gastrin</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>insan FGF10</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>İnsan kafa</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>fare EGF</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>1,25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nikotinamid</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalem/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin 1</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: yDucts nesil. Kompozisyon tüm farklı kültür medya ve yalıtım birincil acinar hücreleri ve indüksiyon ve yDucts (Bölüm 2.) passaging için gerekli çözümleri

Watch this Scientific Journal Video about De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ at JoVE.com

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

Rejeneratif tıp için çok önemli olduğunu somatik SCs hastalığı modelleme ve SC özellikleri anlayış kazanmak için. Burada yeniden programlamak için deneysel stratejiler mevcut, içinde vitro, yetişkin hücreler karşılık gelen Genişletilebilir doku özgü kök/progenitor hücreler tek transkripsiyon co aktivatörü YAP geçici ifade tarafından ayrıştırılan.

De Novo Somatik kök hücreleri tarafından YAP/TAZ nesil

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

de-novo-generation-of-somatic-stem-cells-by-yaptaz

Research

JoVE Journal

Biology

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

8.9K Görüntüleme.  University of Padua School of Medicine. Rejeneratif tıp için çok önemli olduğunu somatik SCs hastalığı modelleme ve SC özellikleri anlayış kazanmak için. Burada yeniden programlamak için deneysel stratejiler mevcut, içinde vitro, yetişkin hücreler karşılık gelen Genişletilebilir doku özgü kök/progenitor hücreler tek transkripsiyon co aktivatörü YAP geçici ifade tarafından ayrıştırılan.

Video: De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

İnsan CD40 aktive B hücreleri üretilmesi

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Biyoloji

Analysis of Pluripotent Stem Cells by using Cryosections of Embryoid Bodies

Embryonic stem (ES) cells are pluripotent cells derived from the inner cell mass of blastocyst-stage early mammalian embryos 1. A crucial stage in the differentiation of ES cells is the formation of embryoid bodies (EBs) aggregates 2, 3. EB formation is based on spontaneous aggregation when ES cells are cultured in non adherent plates. Three-dimensional EB recapitulates many aspects of early mammalian embryogenesis and differentiate into the three germ layers: ectoderm, mesoderm and endoderm 4.
Immunofluorescence and in situ hybridization are widely used techniques for the detection of target proteins and mRNA present in cells of a tissue section 5, 6, 7. Here we present a simple technique to generate high quality cryosections of embryoid bodies. This approach relies on the spatial orientation of EB embedding in OCT followed by the cryosection technique. The resulting sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to characterize populations of cells containing certain proteins, RNA or DNA. In this sense, the preparation of EB cryosections (10&mu;m) are essential tools for histology staining analysis (e.g. Hematoxilin and Eosin, DAPI), immunofluorescence (e.g. Oct4, nestin) or in situ hybridization. This technique can also help to understand aspects of embryogenesis with regards to the maintenance of the tri-dimensional spherical structure of EBs.

Pluripotent stem cells growing in suspension differentiate into embryoid bodies (EBs). Here we demonstrate how to obtain high quality EB cryosections useful for studying cellular and molecular aspects of embryogenesis, while preserving their organization as aggregates.

Embriyoid Kuruluşlar Cryosections kullanarak Pluripotent Kök Hücre Analizi

Embryonic stem (ES) cells are pluripotent cells derived from the inner cell mass of blastocyst-stage early mammalian embryos 1. A crucial stage in the ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

GFP Retroviral Vector kullanarak İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin (iPSCs) içine İnsan somatik hücreleri yeniden programlama

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific properties, such as binding affinity, agonist or antagonist behavior, or stability, relative to the native sequence. Protein design lies at the center of current advances drug design and discovery. Not only does protein design provide predictions for potentially useful drug targets, but it also enhances our understanding of the protein folding process and protein-protein interactions. Experimental methods such as directed evolution have shown success in protein design. However, such methods are restricted by the limited sequence space that can be searched tractably. In contrast, computational design strategies allow for the screening of a much larger set of sequences covering a wide variety of properties and functionality. We have developed a range of computational de novo protein design methods capable of tackling several important areas of protein design. These include the design of monomeric proteins for increased stability and complexes for increased binding affinity.
To disseminate these methods for broader use we present Protein WISDOM (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>), a tool that provides automated methods for a variety of protein design problems. Structural templates are submitted to initialize the design process. The first stage of design is an optimization sequence selection stage that aims at improving stability through minimization of potential energy in the sequence space. Selected sequences are then run through a fold specificity stage and a binding affinity stage. A rank-ordered list of the sequences for each step of the process, along with relevant designed structures, provides the user with a comprehensive quantitative assessment of the design. Here we provide the details of each design method, as well as several notable experimental successes attained through the use of the methods.

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

We developed computational de novo protein design methods capable of tackling several important areas of protein design. To disseminate these methods we present Protein WISDOM, an online tool for protein design (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>). Starting from a structural template, design of monomeric proteins for increased stability and complexes for increased binding affinity can be performed.

Protein AKIL: A Tezgahı<em&gt; Siliko olarak</em&gt;<em&gt; De novo</emBiyomoleküllerin&gt; Tasarım

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Mezenkimal Geçiş indüksiyon ve Epitel Analizi

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Sendai-virüs ile İnsan Somatik Verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.