Agradecemos o dom da tetO-YAPS127A ratos; F. Camargo R26-rtTAM2 ratos (estoque #006965) foram adquiridos a partir do laboratório de Jackson. Agradecemos a Chiara Frasson e Giuseppe Basso para ajuda com procedimentos de FACS. Este trabalho é apoiado pela AIRC especial programa Molecular oncologia clínica ' 5 milésimas ' e um AIRC PI-Grant a Samira e pelo projecto emblemático de Epigenetics CNR-Miur concede ao S.P. Este projeto recebeu financiamento do Conselho Europeu de investigação (CEI), no âmbito da União Europeia Horizonte 2020 programa de investigação e inovação (conceder o acordo DENOVOSTEM no. 670126).

<ol>
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Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Aqui apresentamos os protocolos para reprogramar ex vivo terminalmente diferenciadas células epiteliais dos diferentes tecidos em suas células progenitoras do tecido-específica correspondentes (ou ySCs) pela expressão transiente de YAP, como relatado anteriormente1. Temos detalhados dois procedimentos: um permitindo a reprogramação de células FACS-purificado através de Lentivirus vetores e um segundo, o que evita a infecção viral e aproveita-se da expressão de YAP transgénico. Cada protocolo apresenta uma estratégia eficiente de isolar e células diferenciadas primário de cultura e uma estratégia para forçar exógena YAP expressão do gene em células diferenciadas, gerando de novo somática tecido-específica expansível células-tronco (veja esquemas em Figuras 1A e 2A).
Temos demonstrado que as estratégias de isolamento aqui apresentadas efetivamente isolar uma população pura de células diferenciadas, como demonstrado pelo fato de que nós nunca detectado qualquer consequência de amostras de controlo negativo (figuras 1 e 2-C).
Os vetores de Lentivirus usados neste estudo para a reprogramação de células primárias de LD mamárias são doxiciclina inducible, oferecendo a possibilidade de um controlo apertado da expressão do transgene; Isto permite ligar e fora YAP exógena expressão na vontade. Especial atenção deve ser colocada em evitar o uso de uma excessiva concentração viral, como isso pode ser prejudicial em termos de eficiência de reprogramação. No caso de células acinares primárias, nós mudamos para uma abordagem totalmente transgênica para obter uma reprogramação de YAP-dependente com mínima manipulação. Esta última estratégia também é particularmente apropriada para primários ácinos pancreáticos, como clusters acinares isoladas são dificilmente passível de Lentivirus infecção e muito frágil. A estratégia transgénica empregada oferece a mesma vantagem de vetores de Lentivirus doxiciclina-dependente para o controle apertado de expressão gênica. Além disso, a estratégia de transgénica explorada com ácinos pancreáticos principais tem a vantagem adicional de uma eficiência muito maior reprogramação comparada ao viral induzida a reprogramação de células mamárias de LD. Além a plasticidade intrínseca diferente associada às células derivadas de tecidos diferentes, a maior taxa de reprogramação do pâncreas pode ser derivada a maior eficiência de expressão associada à expressão de YAP autônomo e uniforme em toda a células explantadas. Notavelmente, demonstrámos que YAP exógena não é mais necessária após a geração de ySCs (colônias de yMaSC e yDucts), sem afetar sua capacidade de auto-renovação. Isso ocorre porque ySCs reativar YAP/TAZ endógena e usá-los de auto-renovação quando YAP exógena é desligado1.
Nós validado a noção de que ySCs fato emergem de células diferenciadas, controlando a célula de origem de nossos experimentos reprogramação através de de validações de linhagem de rastreamento genético1.
Caracterização de extensade ySCs mostra que induzida por YAP reprogramação gera normal somática SCs1 como eu) a nível transcriptomic, ySCs exibir sobreposições maciças com SCs nativos; II) ySCs exibir o potencial de diferenciação e pode gerar uma descendência multilineage sempre restringida à identidade dos seus tecidos de origem; III) ySCs são não-transformada e não-oncogenicidade quando transplantadas em vivo.
Aqui nós também descrevem os procedimentos para manter e expandir na cultura tanto yMaSCs e yDucts como organoids incorporado na membrana basal de 100% matriz de hidrogel. Estas condições permitem a auto-organização de ySCs em organoids tridimensional que garantem a manutenção de propriedades de stemness a longo prazo em cultura, permitindo expandir estas populações à vontade para jusante análises e aplicações-tronco. Por razões desconhecidas, falha ao obter yMaSC organoids colocando infectados células LD diretamente nas condições de cultura de organoides 7 dias após o tratamento de doxiciclina em placa de cultura de tecido plástico; em outras palavras, a etapa intermediária de crescimento em condições de colônia mamária é essencial. Em nossas mãos, mesmo nativos MaSCs exigem condições de colônia mamária antes de passagem na cultura de organoides. Além disso, a consequência de organoides mais eficiente é obtida quando podemos evitar dissociando as principais colônias em células individuais, mas prefiro transferir as colônias intactas em condições de cultura organoides.
As condições de cultura organoides também têm a vantagem de dar a possibilidade de cryopreserve ySCs, desde que os organoids sejam recuperadas de suas matrizes, evitando a dissociação de células antes da criopreservação em banho de nitrogênio.
O YAP reprogramação procedimento apresentado pode converter tipos de célula diferenciada distintos derivados de diferentes tecidos adultos em suas células-tronco tecido-específica correspondentes (nós testamos usando células mamárias, pancreáticas e neuronais)1. A diferença de iPSCs ou outros esforços de reprogramação, SCs YAP/induzida podem manter as memórias de seu tecido de origem. Digno de nota, a diferenciação de células somáticas em células dotados de propriedades de haste-como é a única forma de plasticidade de célula destino e reprogramação observados in vivo, por exemplo após o dano tecidual e para oferecer suporte a5,17 de cicatrização de feridas , 18 , 19 , 20. é digno de nota que o YAP e TAZ são em grande parte dispensável para homeostase normal, mas crucial para o reparo de tecido em vários tecidos11,21. Consistentemente com uma função fisiológica das etapas reprogramação aqui descrito, YAP/TAZ recentemente demonstraram ser exigido em regeneração intestinal em modelos do rato de pacientes de colite ulcerativa, causando uma conversão de células intestinais adultas em um epitélio reparação que exibe características do intestino fetal19. YAP reprogramação assim expande as estratégias atuais de plasticidade celular induzida, fornecendo um meio de gerar células-tronco somáticas, um estado que tem sido até agora um desafio para capturar em vitro. Esta abordagem, se estendeu também para humanos-derivado de células, pode ter relevância ampla de aplicações da medicina regenerativa para o estudo do estado stemness somática e para expansão de somática tronco células em vitro.

Células-tronco tecido-específicas somáticas (SCs) são vitais para a reparação e renovação de tecidos após lesão. A possibilidade de isolar facilmente e expandir ilimitadamente ex vivo somática SCs representa um problema crítico para potenciais terapias regenerativas, bem como para aplicações de SC em pesquisa básica e modelagem de doença. Progresso nesse sentido, no entanto, tem sido limitado pela dificuldade de captura do estado de SC de vários órgãos epiteliais em vitro. Com efeito, em vários tecidos adultos residentes SCs podem não existir, ou não estar prontamente disponíveis, ou o número e o potencial regenerativo podem ser corroídas por condições de envelhecimento ou a doença. Em 2016, começamos a preencher esta lacuna relatando essa expressão de um único coactivator transcriptional, YAP (proteína associada Sim) ou sua proteína intimamente relacionada TAZ (ativador transcricional com um motivo PDZ), em células terminalmente diferenciadas eficientemente cria populações de células autólogas funcional, expansível, não-oncogenicidade que são operacionalmente e molecularmente indistinguíveis de seus correspondentes de SCs de tecido-específica1. Um pulso de sustentado YAP ou atividade TAZ por alguns dias é suficiente para induzir o aparecimento de auto renovação SCs somáticas. Esta é uma condição estável que já não é dependente da expressão do transgene contínua, como pode ser transmitido através de gerações de células sem mais expressão ectópica YAP/TAZ1. O protocolo aqui apresentados detalhes o procedimento usado para gerar de novo tronco/progenitoras epiteliais células da glândula mamária e pâncreas, a partir de células diferenciadas desses tecidos. Esse procedimento preenche uma caixa preta, na arena de reprogramação/transdiferenciação celular atual. Principais esforços nestes sentidos de fato até agora têm-se centrado na transição de célula a um estado de (iPSC) células-tronco pluripotentes induzidas, seguido pela conversão destes embrionárias e SCs pluripotentes em células mais diferenciadas. No entanto, iPSCs são oncogenicidade uma vez introduzido em tecidos adultos, aumentando a necessidade de desenvolver protocolos para sua completa e eficiente de diferenciação2. No entanto, nesta etapa de diferenciação, mesmo quando possível, tem o preço de longo prazo potenciais de repovoamento de expansibilidade, auto-organização e órgão. Estes são atributos essenciais para a regeneração de órgãos que na verdade são típicos apenas de SCs endógenas de tecido-específica e os SCs actualmente descritos induzida por YAP (ySCs). Da mesma forma, transdiferenciação celular direto do tipo de uma célula para outra por meio de coquetéis de transcrição vários fatores também geram células que falta essencial proliferativa e stemness potencial3diferenciadas.
O procedimento descrito aqui também aproveita a tecnologia de organoides recentemente introduzida, pelo qual SCs endógenas podem ser expandidos e diferenciados ex vivo4. Induzida por YAP SCs podem gerar formadoras de organoides SCs mesmo em condições experimentais, de doença ou biológico SCs endógenas em que não estão presentes. Gostaríamos de observar que, para a diferença com outros procedimentos de reprogramação, o tipo de plasticidade celular transmitido por YAP pode corresponder a única forma da reversão para um status de SC, como ocorre em tecidos vivos. Reaquisição dos traços de SC, como tem sido associada a reparação tecidual ou ativação oncogênica5. Embora dispensável para a homeostase de vários tecidos adultos, YAP e/ou TAZ é absolutamente essencial para a regeneração, o crescimento do tumor e expansão de SCs somáticas em vitro1,6,7,8 ,9,10,11,12

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1099">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">10 mL sterile syringes</td>
			<td style="width:123px;">Rays</td>
			<td style="width:112px;">10LC</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mm&#160; cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">15 mL sterile conical tubes</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">430052</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">24-well ultra low attachment plates</td>
			<td style="width:123px;">Costar</td>
			<td style="width:112px;">3473</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">40 mm cell strainers</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:112px;">352340</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">48-well multiwell plates</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">353078</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">50 mL sterile conical tubes</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">430290</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">6-well multiwell plates</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">353046</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">12634028</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504001</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BPE</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>13028014</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">Collagenase, type I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>17018029</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dispase</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">1705-041</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">Disposable scalpels</td>
			<td style="width:123px;">Swann-Morton</td>
			<td style="width:112px;">0503</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">11320033</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">DMSO</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">D2650</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DnaseI</td>
			<td style="width:123px;">Roche</td>
			<td style="width:112px;">11284932001</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9891&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">E5134</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol 100%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51976</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FACS tubes (with strainer caps)</td>
			<td style="width:123px;">Falcon</td>
			<td style="width:112px;">352235</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse CD326 (Ep-CAM)</td>
			<td style="width:123px;">BioLegend</td>
			<td style="width:112px;">118208</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUdeltaGW-rtTA&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#19780&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUW-tetO-EGFP</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84041</td>
			<td style="width:384px;">used as negative control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUW-tetO-MCS</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84008</td>
			<td style="width:384px;">used as negative control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUW-tetO-wtYAP</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84009</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:481px;">FUW-tetO-YAPS94A</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84010</td>
			<td style="width:384px;">used as negative control (transcriptionally dead YAP mutant)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMax</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">35050061</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HBSS</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">24020117</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30721</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">heparin sodium salt</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">H3149&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffer solution (1M)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">15630-056</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human R-Spondin1 (His Tag)</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>11083-H08H-5</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ITS-X</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>51500056</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">K-14 antibody</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td>Ab7800&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">K-8 antibody</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td>Ab14053&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">&#160;25030081</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lin (allophycocyanin [APC] mouse lineage antibody cocktail)</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;">51-9003632</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel&#174; Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>0402</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72340</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">non-cell adhesive 10 cm dishes (sterile polystirol petri dish &#248; 94)</td>
			<td style="width:123px;">ROLL</td>
			<td style="width:112px;">18248</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS 10x</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECM4004XL</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE Hamster Anti-Mouse CD61</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;">553347</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE-Cy5 Rat Anti-Human CD49f</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;">551129</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse/rat CD29 Antibody</td>
			<td style="width:123px;">BioLegend</td>
			<td style="width:112px;">102222</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Tail Collagen I (coating)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">122-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Tail Collagen I for 3D culture</td>
			<td>Cultrex</td>
			<td>3447-020-01&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant human FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant human Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant murine EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant murine FGF basic (bFGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td style="width:112px;">450-33</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>31870025</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SBTI (Trypsin inhibitor from Glycine max)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris BASE&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814273001</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA 0,05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Waymouth medium</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>31220023</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

de novo generation of somatic stem cells by yap/taz

Aqui nós apresentamos protocolos para isolar células diferenciadas primárias e transformá-los em células tronco/progenitoras (SCs) da mesma linhagem pela expressão transiente do factor de transcrição YAP. Com este método, luminal células diferenciadas de (LD) da glândula mamária do mouse são convertidas em células que exibem propriedades moleculares e funcionais de mamária SCs. YAP também transforma totalmente diferenciadas exócrino células pancreáticas no pâncreas ducto-como progenitoras. Da mesma forma, a SCs endógenas, naturais, induzida por YAP tronco células ("ySCs") podem ser eventualmente expandidas como organoides culturas longo prazo in vitro, sem mais necessidade de YAP/TAZ ectópica, como ySCs são dotados de um estado de SC, como auto renovadora hereditário.
O processo de reprogramação apresentado aqui oferece a possibilidade de gerar e expandir em vitro células progenitoras de várias fontes de tecido a partir de células diferenciadas. A simples expansão de células somáticas ex vivo tem implicações para a medicina regenerativa, por mecanismos de compreensão da iniciação do tumor e, mais em geral, para celular e estudos de biologia do desenvolvimento.

Geração de yMaSCs Uma visão geral da estratégia experimental para reprogramar células primárias de LD mamárias pela expressão transiente de YAP é apresentada na figura 1A. Principais células epiteliais mamárias de LD são purificadas por fluorescentes-ativado da pilha classificação13. Figura 1B representa um procedimento típico de classificação para obter três subpopulações distintas: células basais (EpCAMbaixaCD49faltaCD61–), as células progenitoras Luminal (LP) (EpCAMaltaCD49fbaixaCD61+ ) e células de LD (EpCAMaltaCD49fbaixaCD61–). Cuidado gating das três subpopulações é essencial para isolar uma pura preparação de células de LD, que são totalmente diferenciadas e completamente crescimento preso quando semeado na glândula mamária formadoras de condições (ver Figura 1, deixou o painel). Por outro lado, quando induzido a express YAP exógeno, LD células começam se proliferando para formar colônias de epiteliais densas facilmente reconhecíveis em culturas de suspensão de matriz de membrana basal de 5% (Figura 1). A eficiência de reprogramação, atestada por volta de 3% para um típico experimento, pode ser marcado por contagem do número de colônias sobre o número de células únicas originalmente semeado em culturas de suspensão de matriz de membrana basal (Figura 1). Células reprogramadas de luminal (yMaSCs) podem então ser a passagem para 100% da membrana basal matriz organoides cultura condições (ver esquema na figura 1A), auto-organização nas complexas estruturas organoides, como que se desenvolvem em torno de múltiplos lúmens e Exibir notável capacidade de auto-renovação, mesmo na ausência de doxiciclina (ou seja, na ausência de expressão de YAP transgénico) (Figura 1E). Histologicamente, derivado de yMaSC organoids exibir uma camada basal (K14 positivo), enfrentando a matriz da membrana basal reconstituído ECM e uma camada luminal (K8 positivo), enfrentando as lúmen como cavidades dentro os organoides (Figura 1F). Essa arquitetura é indistinguível da organoids formada por nativos MaSCs (Figura 1F).
Geração de yDucts Uma visão geral da estratégia experimental para reprogramar primários ácinos pancreáticos pela expressão transiente de YAP é apresentada na Figura 2A. Toda acinares clusters são a maior parte do tecido pancreático isolados por uma combinação de dissociação suave e exclusão de tamanho através de filtração. Uma preparação típica é apresentada na Figura 2B. Após o isolamento, os clusters de células acinares devem aparecer como uma suspensão de exócrinas acinares unidades de tamanho homogêneo, com nenhuma contaminação por endócrino ilhotas de Langerhans ou fragmentos da árvore ductal pancreática e dissociação mínima de células únicas. Contaminação por ilhotas endócrinas ou fragmentos Ductais é uma indicação da filtragem seletiva deficiente (etapa 2.1.10), possivelmente devido a manipulação áspera; dissociação indesejada de clusters acinares para células individuais pode ser devido ao tratamento de colagenase excessiva ou sem buffer atividade de enzimas proteolíticas, lançado pelo tecido, que pode ser controlado pelo tratamento adicional SBTI.
Um experimento de reprogramação acinares típico é apresentado na Figura 2; dentro de 5-7 dias de cultura em 3D colágeno-baseei hidrogel na presença de doxiciclina, ácinos pancreáticos derivados R26-rtTAM2/tetO-YAPS127A ratos prontamente transformar o duto, como aglomerados (que nomeamos yDucts), composto por uma fina monocamada de células epiteliais que proliferam em torno de uma cavidade central em expansão. A eficiência da reprogramação, que é de cerca de 70% para uma experiência típica, pode ser facilmente medida, marcando o número de clusters de duto, como sobre o número total de ácinos semeados (Figura 2D). Células de controlo negativo, ou seja R26-rtTAM2 / + nas células ou R26-rtTAM2/tetO-YAPS127A esquerda sem doxiciclina, invariavelmente permanecem como pós mitóticas clusters acinares nestas condições de cultura, como anteriormente relatado1 de14, ,15. YDucts reprogramadas pode então ser passado no nível da célula única em organoides Matrigel-baseado cultura condições16 (ver esquema na Figura 2A), exibindo notável capacidade de auto-renovação, mesmo na ausência de doxiciclina (ou seja, na ausência de expressão de YAP transgénico) (Figura 2E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig1.jpg"> Figura 1: Isolamento de LD mamária primária de células e indução de glândulas mamárias de células-tronco. (A) representação esquemática do procedimento experimental adotado para reprogramar células primárias de LD mamárias. (B) representante FACS-plots ilustrando um procedimento típico de classificação para purificar as células LD. i) dissociadas células são dependentes de acordo com a dispersão para a frente e lateral para células vivas (P1 azul); II) população P1 então é ainda mais fechada de acordo com seu perfil de Lin: a subpopulação de células linhagem negativa (P2; cinzento) está selecionada, excluindo células hematopoiéticas Lineage-positivo; III) população P2 então é separada em um EpCAMalta (P3; amarelo + verde) e um EpCAM subpopulações debaixo (P6; vermelho); IV) P3 e P6 são então mais fechado de acordo com seu perfil CD61/CD49f em três subpopulações: EpCAMbaixaCD49faltaCD61 células basais de– (P7; vermelho), EpCAMaltaCD49fbaixaCD61+ LP células (P8; amarelo) e EpCAMaltaCD49fbaixaCD61 células de LD– (P9; verde). (C) as imagens são ilustrativas da capacidade das células de LD, infectado com as construções indicadas, para formar colônias mamárias 15 dias após a semeadura em meio de colônia mamária. Só YAP-expressando células transforme formadoras células, Considerando que o controlo negativo células (EGFP infectados) permanecem como células únicas de crescimento-preso. Barra de escala = 50 μm. (D) a quantificação da colônia formando a capacidade das células indicadas, como em (C). Dados são apresentados como média + s.d. e representante de cinco experimentos independentes, cada uma com seis repetições de técnicas. (E) imagem representativa de YAP-reprogramado mamárias células-tronco-células (yMaSCs) depois de 12 dias em condições de cultura de organoides em fresco tridimensional 100% da membrana basal matriz hidrogel na ausência de doxiciclina. Barra de escala = 100 μm. (F) imagens de imunofluorescência representativo para o marcador basal K14 (verde) e o marcador luminal K8 (vermelho) de organoids derivem de células indicadas, depois de 12 dias em condições de cultura organoides. Barra de escala = 10 μm. Esta figura é reproduzida de Panciera et al, 20161. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig2.jpg"> Figura 2 : Isolamento de células acinares pancreáticas primárias e indução de progenitoras pancreáticas. (A) representação esquemática do procedimento experimental adotado para reprogramar células acinares exócrinas pancreáticas primárias. (B) imagem representativa dos ácinos pancreáticos primários logo após o procedimento de isolamento (etapa 2.1.14). A preparação acinares deve aparecer como uma suspensão homogênea de clusters acinares, com presença mínima de células únicas. Barra de escala = 400 μm. (C) imagens representativas de ácinos pancreáticos principais derivado R26-rtTAM2 (painéis superiores)ou R26-rtTAM2; tetO-YAPS127A (mais baixo painéis) ratos e cultivadas em 3-d colágeno eu-com base de hidrogel durante 5 dias, com ou sem Doxiciclina (doxy), conforme indicado. Só YAP-expressando primário acinar converter células crescendo como quisto-como organoides após adição de doxiciclina. Escala de barras = 70 μm. (D) a quantificação da capacidade de ácinos pancreáticos para formar organoids ductal sobre transgênico superexpressão de YAP, como em (C). Dados são apresentados como média + s.d. e representante de cinco experimentos independentes, realizados com quatro repetições de técnicas. (E) imagem representativa de YAP-reprogramada ductal células (yDucts) após três passagens em fresco tridimensional 100% da membrana basal matriz hidrogel na ausência de doxiciclina. Barra de escala = 130 μm. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Isolamento de células mamárias primários</td>
		</tr>
<tr>
<td>CA2 + quelantes solução</td>
			<td>Loja a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>0,02% w/V</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Colágeno que solução de revestimento</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ácido acético, 0.02N, pH 3,23</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Colágeno de cauda de rato (revestimento)</td>
			<td>01:50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solução de Dispase</td>
			<td>Loja a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Meio de dissociação</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Solução-mãe de hialuronidase</td>
			<td>400 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Caneta/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Colagenase solução eu</td>
			<td>600 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hemolítica solução</td>
			<td>Loja a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl solução</td>
			<td>1 peças</td>
		</tr>
<tr>
<td>TrisBase 20,6 g/L</td>
			<td>9 partes</td>
		</tr>
<tr>
<td>ajustar o pH para 7,2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS/PS</td>
			<td>Loja a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Caneta/Strep</td>
			<td>2 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solução-mãe de hialuronidase</td>
			<td>Filtro de 0,2 µm, loja a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hialuronidase de testículos de bovinos (pó)</td>
			<td>2.000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampão de fosfato de sódio 1 M pH7.3</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl solução</td>
			<td>Guarde este medicamento em T. amb.</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl</td>
			<td>7,1 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>ajustar o pH a 7,65</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Solução de classificação</td>
			<td>Filtro de 0,2 µm, loja a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0,1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>PH HEPES 7</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Lave médio #1</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Caneta/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lave médio #2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Caneta/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Meio de cultura 2D mamário</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>2%</td>
		</tr>
<tr>
<td>heparina</td>
			<td>4 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-glutamina</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>bFGF murino</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF murino</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Caneta/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Indução e Passaging de yMaSCs</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Médio de colônia mamária</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>heparina</td>
			<td>4 µ g/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-glutamina</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Matrigel (adicionar imediatamente antes da semeadura)</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>bFGF murino</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF murino</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Caneta/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Médio de organoides mamária</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12 avançada</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>GlutaMax</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>heparina</td>
			<td>4 µ g/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cabeça humana</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>murino bEGF</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF murino</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin 1</td>
			<td>1 µ g/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: geração de yMaSCs. Composição de todos os diferentes meios de cultura e soluções necessárias para isolamento de células primárias de LD mamárias e indução de yMaSCs (seção 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Isolamento de ácinos pancreáticos principais</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Meio de cultura acinares</td>
		</tr>
<tr>
<td>BPE</td>
			<td>50 µ g/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0,1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dexametasona</td>
			<td>1 µ g/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>0,1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>ITS-X</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Caneta/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>CONJUNTO.</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Médio do Waymouth</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Lavagem acinares médio</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0,1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Caneta/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Meio RPMI</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>CONJUNTO.</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Médio de recuperação acinares</td>
		</tr>
<tr>
<td>Meio de cultura acinares</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Colagenase solução A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lavagem acinares médio</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Colagenase solução eu</td>
			<td>360 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS/PS</td>
			<td>Loja a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS (tampão fosfato salino)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Caneta/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Colagenase solução eu</td>
			<td>Loja a-20 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Colagenase, tipo I (pó)</td>
			<td>6.000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Passagem de organoids do pâncreas</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Colagenase solução B</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS 1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Colagenase solução eu</td>
			<td>240 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Médio de organoides pancreático</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12 avançado</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>gastrina</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>FGF10 humana</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cabeça humana</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF murino</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-acetilcisteína</td>
			<td>1,25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nicotinamida</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Caneta/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin 1</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>CONJUNTO.</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: geração de yDucts. Composição de todos os diferentes meios de cultura e soluções necessárias para isolamento de células acinares primárias e indução e passagem de yDucts (secção 2).

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De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

Disponibilidade de SCs somáticas é crucial para a medicina regenerativa, modelagem de doença e para ganhar a introspecção em Propriedades de SC. Aqui nós apresentamos estratégias experimentais para reprogramar, em vitro, células adultas diferenciadas em suas células tronco/progenitoras expansível do tecido-específica correspondente pela expressão transiente do único ativador transcricional co YAP.

De Novo Geração de células-tronco somáticas por YAP/TAZ

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

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Research

JoVE Journal

Biology

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

8.9K visualizações.  University of Padua School of Medicine. Disponibilidade de SCs somáticas é crucial para a medicina regenerativa, modelagem de doença e para ganhar a introspecção em Propriedades de SC. Aqui nós apresentamos estratégias experimentais para reprogramar, em vitro, células adultas diferenciadas em suas células tronco/progenitoras expansível do tecido-específica correspondente pela expressão transiente do único ativador transcricional co YAP.

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Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

Geração de humanos CD40-activated células B

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Biologia

Analysis of Pluripotent Stem Cells by using Cryosections of Embryoid Bodies

Embryonic stem (ES) cells are pluripotent cells derived from the inner cell mass of blastocyst-stage early mammalian embryos 1. A crucial stage in the differentiation of ES cells is the formation of embryoid bodies (EBs) aggregates 2, 3. EB formation is based on spontaneous aggregation when ES cells are cultured in non adherent plates. Three-dimensional EB recapitulates many aspects of early mammalian embryogenesis and differentiate into the three germ layers: ectoderm, mesoderm and endoderm 4.
Immunofluorescence and in situ hybridization are widely used techniques for the detection of target proteins and mRNA present in cells of a tissue section 5, 6, 7. Here we present a simple technique to generate high quality cryosections of embryoid bodies. This approach relies on the spatial orientation of EB embedding in OCT followed by the cryosection technique. The resulting sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to characterize populations of cells containing certain proteins, RNA or DNA. In this sense, the preparation of EB cryosections (10&mu;m) are essential tools for histology staining analysis (e.g. Hematoxilin and Eosin, DAPI), immunofluorescence (e.g. Oct4, nestin) or in situ hybridization. This technique can also help to understand aspects of embryogenesis with regards to the maintenance of the tri-dimensional spherical structure of EBs.

Pluripotent stem cells growing in suspension differentiate into embryoid bodies (EBs). Here we demonstrate how to obtain high quality EB cryosections useful for studying cellular and molecular aspects of embryogenesis, while preserving their organization as aggregates.

Análise de células-tronco pluripotentes usando criosecções dos corpos embrióides

Embryonic stem (ES) cells are pluripotent cells derived from the inner cell mass of blastocyst-stage early mammalian embryos 1. A crucial stage in the ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

Reprogramação de células somáticas humanas em células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando vetor retroviral com GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific properties, such as binding affinity, agonist or antagonist behavior, or stability, relative to the native sequence. Protein design lies at the center of current advances drug design and discovery. Not only does protein design provide predictions for potentially useful drug targets, but it also enhances our understanding of the protein folding process and protein-protein interactions. Experimental methods such as directed evolution have shown success in protein design. However, such methods are restricted by the limited sequence space that can be searched tractably. In contrast, computational design strategies allow for the screening of a much larger set of sequences covering a wide variety of properties and functionality. We have developed a range of computational de novo protein design methods capable of tackling several important areas of protein design. These include the design of monomeric proteins for increased stability and complexes for increased binding affinity.
To disseminate these methods for broader use we present Protein WISDOM (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>), a tool that provides automated methods for a variety of protein design problems. Structural templates are submitted to initialize the design process. The first stage of design is an optimization sequence selection stage that aims at improving stability through minimization of potential energy in the sequence space. Selected sequences are then run through a fold specificity stage and a binding affinity stage. A rank-ordered list of the sequences for each step of the process, along with relevant designed structures, provides the user with a comprehensive quantitative assessment of the design. Here we provide the details of each design method, as well as several notable experimental successes attained through the use of the methods.

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

We developed computational de novo protein design methods capable of tackling several important areas of protein design. To disseminate these methods we present Protein WISDOM, an online tool for protein design (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>). Starting from a structural template, design of monomeric proteins for increased stability and complexes for increased binding affinity can be performed.

SABEDORIA Protein: A Workbench para<em&gt; In silico</em&gt;<em&gt; De novo</em&gt; Projeto de biomoléculas

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Indução e Análise de epitelial para mesenquimal Transição

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

In vivo Reprogramação de células adultas somáticas a pluripotência por superexpressão de Fatores de Yamanaka

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Eficiente Geração induzida pelo homem células-tronco pluripotentes a partir de células somáticas humanas com Sendai-vírus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.