O9-1 hücre hattı in vitro nöral krest hücreleri incelemek için çok yararlı bir araçtır. Bu araştırma çeşitli kullanımda uygulama geniş bir yelpazede kullanım için büyük bir potansiyele sahiptir. O9-1 hücrelerinin kolay erişim ve deneyler için yeterli hücre sayılarını hızlı bir şekilde elde etme gibi bariz avantajları vardır, bu da onu nöral krest hücrelerinin in vitro çalışmalarında ücretsiz olarak güçlü bir yöntem haline getirir.
Başlamak için, metin protokolüne göre, O9-1 hücre kültürü için bazal ortam hazırlayın. Daha sonra bazal ortamı filtreleyin ve ışıktan korumak için folyoya sarın. Bundan sonra, metin protokolüne göre etkinleştirilen STO hücrelerinden koşullandırılmış bazal ortam toplayın.
İlk olarak, iki saat boyunca buz üzerinde bodrum membran matris bir aliquot eritin. Daha sonra, 0.5mg/ml nihai konsantrasyona% 10 FBS ile filtresteril DMEM ile bodrum membran matris seyreltmek. Bir saat oda sıcaklığında bodrum membran matris ile plaka katlayın.
Daha sonra, plaka yatırırken bodrum membran matris aspire. Plakaları 30 derecede 30 dakika kurutun. Taban membran matrisini tabağa eklerken, çözeltinin hücre özelliklerini korumak ve deneyler arasında gereksiz farklılıklardan kaçınmak için kuyuyu eşit şekilde kapladığından emin olun.
37 derece santigrat su banyosu içine bir kriyo-şişe yerleştirerek O9-1 hücreleri kurtarmak. Çözelti tamamen sıvıya dönene kadar şişeyi yavaşça döndürün. Bundan sonra, 15ml santrifüj tüpü için kriyo-şişe hücre çözeltisi aktarın.
Hücreleri yeniden askıya almak için tüpe %10 FBS içeren beş cilt DMEM ekleyin. Hücreleri 180 Gs'de üç dakika santrifüj edin.Sonra, peleti rahatsız etmemeye özen göstererek, süperatenti aspire edin. Daha sonra, LIF ve BFGF ile desteklenen şartlı bazal ortamda peletyeniden askıya.
Altı iyi plaka hücreleri tohum ve eşit hücreleri tohum lamak için plaka ajite. Plakayı karıştırırken, yatay ve dikey olarak yapın, çünkü plakanın dönmesi hücrelerin merkeze doğru konsantre olmasını sağlayacaktır. Ve bu hücrelerin bir gecede standart hücre kültürü kuluçka makinesine takılmasına ve büyümesine izin verin.
Ortamı değiştirmeden önce hücrelerin bağlı olduğundan emin olun. O9-1 hücreleri %80 birleştiğinde, bodrum membran matrisini eritin ve daha önce açıklandığı gibi bir bodrum membran matris kaplı plaka hazırlayın. Daha sonra membran matrisine LIF ve BFGF ile desteklenen bazal ortam ekleyin.
Kuyuları 2 ml DPBS ile iki kez hafifçe durulayın. Daha sonra hücreleri 1ml 0.05%tripsin EDTA ile 37 derecede üç dakika ayırın. Detektini % 10 FBS ile eşit miktarda DMEM ile nötralize ederek sıvıyı kuyunun tüm yüzeyine tekrar tekrar borulandırın.
Sonra, bir santrifüj tüpü için hücre çözeltisi aktarın. Ve 180 Gs.Aspire hücrelerin pelet rahatsız etmeden üç dakika santrifüj. Daha sonra, lif ve BFGF ile desteklenen şartlı bazal ortam azar lama hücre pelet yeniden askıya.
Hücreleri daha önce açıklandığı gibi kaplanmış tabağa yerleştirin. Daha sonra, hücrelerin takılmasına ve standart bir hücre kültürü kuluçka makinesinde büyümesine izin verin. İlk olarak, metin protokolüne göre 2X dondurma ortamını hazırlayın.
Daha sonra ortamı filtreleyin. Plakanın duvarlarını DPBS ile iki kez durulayın ve hücreleri kaybetmemek için hafifçe borulayın. Daha sonra hücreleri 37 derecede 37 derecede %0.05 tripsin EDTA ile üç dakika ayırın.
Tripsini %10 FBS ve DMEM ile nötralize edin. Bir santrifüj tüpü için plaka içeriğini aktarın ve 180 Gs.Then üç dakika için santrifüj, supernatent aspire ve pelet yeniden askıya almak için PBS 2ml ekleyin. Hücre çözeltisini bir kez daha santrifüj edin ve süpernatenti aspire edin.
Tüpteki bazal ortam miktarını gerektiği gibi ayarlayın ve eşit miktarda 2X dondurma ortamı ekleyin. Daha sonra, hücreleri etiketli kriyo şişelerine aktarın. En az 24 saat boyunca 80 santigrat derecede yavaş bir soğutma hızı elde etmek için bir kapak ile bir polistiren kutu içinde kriyo şişeleri yerleştirin.
O9-1 hücrelerinde SIRNA nakavt gerçekleştirmek için, kurtarmak ve hücreleri tohum. Serumsuz ortam uygun bir hacimli lipozomlar seyreltin. Daha sonra, metin protokolüne göre serumsuz ortamda SIRNA seyreltin.
Bundan sonra, seyreltilmiş SIRNA seyreltilmiş lipozomlar ekleyin, üreticinin talimatlarına göre. Çözeltiyi pipetleme ile karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, hücrelere SIRNA lipid kompleksi uygun bir hacim ekleyin.
Sonra, standart bir hücre kültürü kuluçka 24 saat boyunca hücreleri kuluçka. O9-1 hücreleri belirli farklılaşma kültürü koşulları altında farklı hücre tiplerine farklıolabilir. O9-1 hücrelerini osteoplastlara ayırmak için metin protokolüne göre osteojenik farklılaşma ortamı hazırlayın.
Son olarak, immün boyama ile farklılaşmış osteoplastlarda osteoplast belirteç osteokalsin tespit. O9-1 hücrelerini düz kas hücrelerine ayırmak için, metin protokolüne göre farklılaşma ortamı altında kültürlendirin ve düz kas aktin immüno boyama ile farklılaşmayı değerlendirin. Bu protokolde Yap'ın O9-1 hücrelerindeki fonksiyon kaybını incelemek için hem nakavt hem de yıkıp yıkma deneyi yapılmıştır.
Düz kas hücre farklılaşma koşulları altında, en vahşi tip O9-1 hücreleri düz kas aktinin pozitif düz kas hücrelerine yol açtı. Yap null hücreleri ancak genellikle SMA pozitif düz kas hücrelerine ayırt etmek için başarısız oldu. Bu, Yap'ın nöral krest hücrelerinin düz kas hücrelerine farklılaşmasında kritik bir rol oynadığını gösterir.
Bu yordamı denerken, tüm işlem boyunca O9-1 hücre hattını nazikçe ve dikkatlice işlemeyi unutmamak önemlidir. Seyreltmek ve doğru bazal membran matris kullanmak emin olun ve hücre bölünmesi için% 0.05 trypsin kullanın. O9-1 hücre kültürü için hazırlık sırasında, mitomisin c ile çalışan son derece tehlikeli olabilir unutmayın, ve bu işlemi yaparken bir laboratuvar önlüğü ve eldiven giyen gibi önlemler her zaman alınmalıdır.
