우리는 모든 동료의 기여 금 및 그 결과에 추천 된이 원고 (예시)에 대 한 우리의 원래 연구에 공동 작업자를 인정 하 고 싶습니다. 작가 작품은 AB (California Tobacco-Related 질병 연구 프로그램의 대학 및 국립 연구소의 치과 Craniofacial 연구는 건강의 국가 학회 (1R01DE026043) ab의 교부 금에 의해 지원 TRDRP-26IR-0015)와 세인트 (TRDRP-25IP-0001). 연구의 스폰서 연구 설계, 데이터 수집, 데이터 분석, 데이터 해석, 보고서의 작성 또는 게시를 위해 제출 하는 결정에 있는 역할을 했다.

1. 게놈 DNA 절연 마우스 미 발달 섬유 아 세포에서
참고: 기본 마우스 미 발달 섬유 아 세포는53게시 된 프로토콜 따라 BB 유전자 변형 마우스 C57BL/6 유전 배경에서 파생 된 배아에서 격리 됩니다. 1 x 107 배아 섬유 아 세포 세포 제어 복합 대 테스트와 치료 1 x 106 이 프로토콜에 대 한 시작 물자에 의하여 이루어져 있다. 참조10,,5455는 수확 하 고 표준 방법을 사용 하 여 이러한 셀의 계산을 참조 하십시오.
<ol><li>준비는 (0.3 M 자당, 60 m m KCl, 15 mM NaCl, 60 mM Tris HCl, pH 8.0, 0.5 m m spermidine, 0.15 m m spermine와 2 mM EDTA) 버퍼, 버퍼 B (150 m m NaCl 및 5 m m EDTA, pH 7.8), 및 C (20 mM Tris HCl, pH 8.0 버퍼 20 mM NaCl, 20 mM EDTA, 그리고 1 %SDS) 미리, 및 최대 1 년54,55실 온 (RT)에서 보존.</li>
	<li>넓은 사용 하 여 위아래로 pipetting 반복 하 여 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에서 내경 1000 µ L 피 펫 팁 2-4 mL 버퍼에 셀 resuspend</li>
	<li>한 볼륨 (2-4 mL) 버퍼 A 포함 1 %octylphenoxypolyethoxyethanol (예를 들어, Nonidet P40) 추가 유리 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여.</li>
	<li>5 분 동안 얼음에 튜브를 품 어.</li>
	<li>1000 x g 실시간에 5 분 동안에 관을 원심</li>
	<li>삭제는 상쾌한 고 10-15 mL 버퍼 유리 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하는 펠 릿을 세척.</li>
	<li>2-4 mL 버퍼 B. 펠 릿 resuspend</li>
	<li>한 볼륨 (2-4 mL)가 버퍼 C에 포함 600 µ g/mL 가수분해 K. 추가</li>
	<li>37 ° c.에 3 h에 대 한 튜브를 품 어</li>
	<li>100 µ g/mL의 최종 농도에 RNase A를 추가 합니다.</li>
	<li>37 ° c.에 추가 1 시간에 대 한 튜브를 품 어</li>
	<li>추가 한 볼륨 (2-4 mL) 페 놀 (0.1에서 포화 M Tris HCl, pH 8.0):chloroform:isoamyl 알코올 (25:24:1 vol/vol). 참고: 페 놀 심각한 건강 위험 포즈 수 있습니다 고 극단주의 함께 처리 되어야 합니다. 페 놀 피부에 높게 부식성 이며, 그것을 통해 쉽게 흡수 하 고 다른 효과 전시. 이중 gloving 사용 항상 페 놀, 처리, 보호 안경 착용 및 화학 증기 두건.</li>
	<li>튜브 회전에서 4 ° c.에 5 분 동안 튜브를 거꾸로 하 여 잘 혼합</li>
	<li>1000 x g 4 ° c.에서 5 분 동안에 관을 원심</li>
	<li>수성 단계 (상위 계층) 유리 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 새 튜브를 제거 합니다.</li>
	<li>수성 단계는 명확 하 고 인터페이스는 더 이상 탁 될 때까지 페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜 추출 1 ~ 3 회 반복 합니다.</li>
	<li>1/10 볼륨 (200-400 µ L) 3 M 아세트산 나트륨, pH 5.2 추가 합니다.</li>
	<li>(냉장) 2.5 볼륨 (5-10 mL) 100% 에탄올을 추가 하 고 2-3 분 위해 손으로 부드럽게 튜브를 반전.</li>
	<li>유리 걸이를 가진 DNA 스풀 및 70 %1-5 mL를 포함 하는 새로운 관에 전송 에탄올 철저 하 게 씻어. 또는, 고속 (3500 x g) 튜브 DNA를 작은 그것을 70 %1-5 mL을 철저 하 게 세척 하 4 ° C에서 원심 에탄올.</li>
	<li>RT에 고속 (3500 x g) 튜브 원심, 상쾌한, 제거 하 고 10-15 분에 대 한 DNA를 건조.</li>
	<li>10-100 µ L TE 버퍼 (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5), DNA를 녹이 고 또는 (더 긴 저장 기간) 동안-20 ° C에서 4 ° C (최대 1 개월의 짧은 스토리지)에 저장. Λ 선택 cII 분석 결과 대 한 DNA에 대 한 최적 농도 0.5-1.0 µ g / µ L (에 테 버퍼)56.</li>
</ol>2. 포장 반응 생체 외에서
<ol><li>1 개 포장 반응 당 ~ 5 µ g 게놈 DNA를 추가 (최종 볼륨: 8-12 µ L, genomic DNA에서 마우스 미 발달 섬유 아 세포 치료 생체 외에서 시험 화합물 이나 컨트롤 섹션 1 에 분리 되었습니다) 첫 번째를 포함 하는 microcentrifuge 튜브를 반응 혼합 (~ 10 µ L)입니다. 참고: 자체 준비 또는 상용 λ 포장 추출 다른 실험실에 사용 됩니다. 상업 포장에 추출 키트 사용 여기56 ( 테이블의 자료를 참조), 빨간 튜브 포함 된 첫 번째 반응 혼합 (~ 10 µ L) 및 파란색 튜브 포함 된 두 번째 반응 혼합 (적어도 5 반응 ~ 70 µ L).</li>
	<li>30 ° c.에 90 분에 대 한 튜브를 품 어</li>
	<li>튜브를 두 번째 반응 혼합의 필요한 볼륨 (~ 12 µ L)를 추가 합니다.</li>
	<li>30 ° c.에 추가 90 분에 대 한 튜브를 품 어</li>
	<li>
튜브를 SM 버퍼의 1.1 mL를 추가 합니다. 참고:이 솔루션 (즉, 포장 반응 혼합물)의 1 mL 사용 됩니다 λ cII심사-돌연변이. 나머지 titering 사용 될 것입니다.<ol>
<li>5.8 g NaCl, 2.0 g MgSO4.7H2O, 50 mL를 혼합 하 여 SM 버퍼 를 준비 1 M Tris HCl (pH 7.5), 그리고 5 mL 2% (w/v) 젤라틴. DH2O 1 리터, 최대 1 년 동안 실 온에서 30 분이 게에 대 한 고압의 최종 볼륨을 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>와 10에 대 한 패키지 DNA 샘플을 포함 하는 관 동 RT (활기찬 vortexing)에 s.</li>
	<li>펄스를 사용할 준비가 될 때까지 microcentrifuge에 게 얼음에 튜브를 회전 합니다. 샘플 포장의 같은 날에 내에서 사용 하려고 하지 않습니다, 경우 추가 포장된 DNA의 mL 당 클로 프롬의 50 µ L 샘플, 소용돌이 부드럽게, 그리고 4 ° C에서 최대 2 주 동안 저장.</li>
</ol>3. 준비 대장균 G1250 세균성 문화
<ol><li>
최소 2 일 전에 도금, TB1-대 한 천 배지에서 대장균 (대장균) G1250에서 몇 가지 세균성 줄무늬 접시를 확인 합니다.
	<ol>
<li>TB1-대 한 천 배지를 다음과 같이 준비 합니다. 믹스 5.0 g NaCl, 10.0 g 카 세 인 펩, 그리고 12.0 g 한 천. 800 mL dH2오 추가 1 mL 0.1% 티 아민 염 산 염을 추가 합니다. NaOH와 HCl 추가 7.0에 pH를 조정 dH2O 1 리터의 최종 볼륨을.</li>
		<li>믹스 잘와 30 분 55 ° c에 냉각 하는 허용에 대 한 오토 클레이 브 대 50.0 mg을 추가 하 고 혼합. 살 균 100 mm 페 트리 접시 (접시 당 20-25 mL)에 부 어. 2 주 동안 4 ° C에서 접시를 저장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>적어도 24 h에 대 한 고정 30 ° C 배양 기에서 세균성 줄무늬 접시를 품 어.</li>
	<li>
도금, 전에 1 일 TB1 액체 매체의 10 mL를 100 µ L 살 균 50 mL 스크류 캡 원뿔 관에서 20% (w/v) 맥 아당 1 M MgSO4 솔루션의 결합.
	<ol>
<li>TB1 액체 매체를 다음과 같이 준비 합니다. 믹스 5.0 g NaCl 및 10.0 g 카 세 인 펩, 800 mL dH2O, 1 mL 0.1% 티 아민 염 산 염을 추가 하 고 NaOH와 HCl 7.0에 pH를 조정. 다음 1 리터의 최종 볼륨을 dH2O를 추가, 최대 3 개월까지 잘하고 압력솥 30 분 저장소 RT에서 매체에 대 한 믹스.</li>
		<li>20% (w/v) 맥 아당 1 M MgSO4 를 다음과 같이 준비 합니다. 20.0 g 맥 아당과 24.6 g MgSO4혼합. 7 H2O, dH2O 100 mL의 최종 볼륨을 추가 합니다. 필터를 소독 하 고 최대 6 개월까지 4 ° C에서 저장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>살 균 inoculating 루프56를 사용 하 여 세균성 줄무늬 접시에서 여러 식민지와 액체 매체 접종</li>
	<li>활기찬 동요 (250-300 rpm)으로 인큐베이터를 떨고 30 ° C에서 하룻밤 액체 문화를 품 어.</li>
	<li>도금의 날, 작은 세균 세포를 실시간에 10 분 동안 1500 x g 에서 G1250 액체 문화를 포함 하는 원뿔 튜브 원심.</li>
	<li>삭제는 상쾌한 고 10mm MgSO410 mL에 셀 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>1시 10분의 흡 광도 측정 파장 600 nm 대 일 분 광 광도 계 (예를 들어, 100 µ L 세포 현 탁 액 + 900 µ L 10 m m MgSO4)56를 사용 하 여 세포 현 탁 액의 희석.</li>
	<li>10mm MgSO4로 0.5의 최종 세600 세포 현 탁 액을 희석. OD600 와 G1250 대장균 의 준비 정지 = 0.5 'G1250 도금 문화' 라고 합니다.</li>
	<li>얼음에 G1250 도금 문화를 저장 하 고 1-2 시간 이내에 사용.</li>
</ol>4. 도금 패키지 DNA 샘플
<ol><li>
한 패키지 DNA 샘플 당 16 살 균 14 x 100 m m2 라운드-하단 튜브와 16 TB1 한 천 배지를 준비 합니다. 각 세트에서 10 개 심사 및 6 titering (Titer 20 3) 및 Titer 100 세에 대 한 사용 됩니다.
	<ol>
<li>TB1 한 천 배지를 다음과 같이 준비 합니다. 믹스 5.0 g NaCl, 10.0 g 카 세 인 펩, 12.0 g 한 천, 다음 추가 800 mL dH2O, 그리고 1 mL 0.1% 티 아민 염 산 염. NaOH와 HCl, 7.0에 pH를 조정 하 고 추가 dH2O l. 1의 최종 볼륨을</li>
		<li>잘 혼합 하 고 30 분에 대 한 고압 수 55 ° C에 냉각 후 살 균 100 mm 페 트리 접시 (접시 당 20-25 mL)에 부 어 혼합. 2 주 동안 4 ° C에서 접시를 저장. 참고: TB1 한 천 배지 적어도 24 h 사용 하기 전에 준비 되어야 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aliquot 200 µ L의 각 라운드 하단 튜브에 G1250 도금 문화.</li>
	<li>
Titering에 대 한, 포장된 DNA 샘플의 1: 100 희석 만들고 vortexing (즉, 10 µ L 포장 DNA 샘플 + 990 µ L SM 버퍼)에 의해 잘 혼합.</li>
	<li>각 3 Titer 20 튜브의 1: 100 희석의 20 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>각 3 Titer 100 튜브의 1: 100 희석의 100 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>
심사에 대 한, 100 µ L의 추가 'undiluted' 10 심사 관의 각 포장된 DNA 샘플.</li>
	<li>모든 titering 및 심사 관 처리 (2 x 3 + 10 = 16 관), 다음과 같이: 대략 10에 대 한 vortexing에 의해 잘 섞어 s, 그리고 다음 호스트는 페이지 adsorb 대장균 수 있도록 30 분 동안 실내 온도에 품 어.</li>
	<li>
Microwaved 녹은 TB1 (55 ° C에 냉각) 한 천 각 titer 위쪽 또는 심사 관, 혼합 즉시 vortexing (부드럽게), 2.5 mL를 추가 하 고 적절 한 titer에 붓는 또는 TB1 한 천 배지를 심사.
	<ol>
<li>TB1 최고 천 다음과 같이 준비 합니다. 믹스 5.0 g NaCl, 10.0 g 카 세 인 펩, 및 7.0 g 한 천, 800 mL dH2오 추가 1 mL 0.1% 티 아민 염 산 염, 추가 다음 NaOH와 HCl 7.0에 pH를 조정 합니다. 마지막으로, 1 리터의 최종 볼륨을 dH2O를 추가 합니다.</li>
		<li>최대 3 개월까지 잘하고 압력솥 실 온에서 20-25 분 저장소에 대 한 믹스.</li>
		<li>사용 전에 전자 레인지에 준비 TB1 최고 한 천 녹, 잘, 혼합 하 고 물 욕조에 55 ° C에 냉각 허용. 참고: 용융 냉각된 TB1 가기 각 titer 또는 심사 관의 내용에 추가 되 고 혼합 후, 적절 한 titer 또는 심사 TB1 한 접시에 부 어 있다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>접시 뚜껑 열려 응축을 방지 하기 위해 실 온에서 15-30 분 동안 서 보자.</li>
	<li>번호판을 반전 및 10 심사 플레이트 고정 24 ° C 인큐베이터에 배치 및 46-48 h (즉, 선택적 조건) 및 6 titer 플레이트 고정 37 ° C 배양 기에서 품 어와 24 h에 대 한 품 어 / (즉, 하룻밤 선택적 비 조건)입니다. 참고: 품질 보증 및 결과의 표준화, 상용 컨트롤 페이지 솔루션 알려진 돌연변이 주파수 wildtype 돌연변이 cII 의 혼합물을 포함 하는 패키지 DNA 샘플 함께 도금 및 모두에 포함 분석 결과56을실행합니다.</li>
</ol>5. 검사 Titer 상영 판 cII 돌연변이 주파수를 결정 하
<ol><li>37 ° C에서 24 h/하룻밤 인큐베이션, 다음 수 패의 수 각각 3 Titer 20 접시 및 Titer 100 판 형성. 플 라크를 쉽게 식별 하려면 잡고 접시와 어두운 배경 흰색 빛 상자 옆 뚜껑 ( 그림 2참조) 제거.</li>
	<li>확인 플 라크의 숫자의 평균 (평균) Titer 20 접시와 Titer 100 플레이트의 각 집합에서 계산 (triplicate, 각각).</li>
	<li>접시 세트 당 50-200 플 라크의 범위에 가장 가까운 폭포 titer 격판덮개의 세트에서 평균을 선택 합니다.</li>
	<li>다음과 같이 10 상영 판에서 상영 하는 플 라크의 총 수를 계산. 상영 패 총 (titer 접시 ÷ µ L 희석의 수가 선택한 titer 접시 당 사용의 선택한 세트에서 플 라크의 평균 수) = 희석 요인 x x 판 [100 µ L/접시] 심사 당 포장된 DNA 샘플의 µ L의 수 접시 [10] 상영의 x 숫자. 참고: 예를 들어 Titer 20 접시 세트에서 접시 당 패의 평균 수는 128와 Titer 100 격판덮개의 세트에 상응 하는 숫자는 478, 번호 128 사용 됩니다 상영 하는 플 라크의 총 수의 계산 다음과 같이: (128 ÷ 20) x 100 [희석 요소] x 100 [µ L/판] x 10 [플레이트] 640,000 = 이것은 평균 수 기반 이면 Titer 20 또는 Titer 100 판에서 각각 5000 또는 1, 000, 플 라크의 평균 수를 곱한 것과 같습니다.</li>
	<li>46-48 h 24 ° C에 외피, 다음 10 심사 접시 (섹션 5.1에서 제공 하는 지침에 따라)에 형성 된 플 라크의 총 수를 계산 합니다. 참고: cII 돌연변이 주파수 상영 하는 플 라크의 총 수로 심사 격판덮개에 형성 된 플 라크의 총 수를 나누어 계산 됩니다. 112는 플 라크의 총 수 10 심사 접시에 계산 하는 경우에 위의 예제를 사용 하 여,이 DNA 샘플 cII 돌연변이 주파수 112 ÷ 640,000 = 17.5 x 10-5.</li>
</ol>6. Putative λ cII 돌연변이의 확인, PCR 확대, 및 DNA 시퀀싱
<ol><li>코어에 살 균, 넓은 구멍 피펫으로 팁과 질문에 플 라크와 살 균 SM 버퍼의 500 µ L을 포함 살 균 microcentrifuge 관으로 (아래로 pipetting)에 의해 추방.</li>
	<li>실 온에서 2 h 이상 incubate 또는 4 ° c 하룻밤, 살 균 소 입자는 agar에서 elute를 허용 하도록 연결 합니다.</li>
	<li>살 균 14 x 100 m m2 라운드-하단 튜브에서 코드 페이지 솔루션의 1 µ L 200 µ L G1250 도금 문화의 혼합 하 고 실시간에 30 분 동안 품 어</li>
	<li>55 ° C 용융 TB1 최고 agar의 2.5 mL를 사용 하 여 샘플 접시 하 고 섹션 4.8-4.10에 설명 된 대로 46-48 h (선택 조건), 24 ° C에서 접시를 품 어.</li>
	<li>일단 보조 플 라크 형성, 피 펫 팁을 사용 하 여 단일 잘 격리 된 검증된 λ cII를 신중 하 게 선택-돌연변이 패 (낮은 agar를 만지지 마십시오). 참고: 두 가지 목적을 제공 Replating putative cII 돌연변이 패: (i) 유물을 도금 수 있습니다 가끔 오인 될 소형 패; 그리고 (ii) 검열 판에서 가져온 agarose 코어 비 돌연변이 phage(s) 돌연변이 살 균 소에 함께 포함 될 수 있습니다. 저밀도 replating에서 2 차 패 PCR 및 후속 DNA 순서 분석에 대 한 오염된 돌연변이 서식 파일을 제공 합니다.</li>
	<li>아래로 pipetting으로 25 µ L 이중 증 류 물을 포함 하는 microcentrifuge 튜브에 플 라크를 전송.</li>
	<li>끓는 5 분 동안 물에 튜브를 놓습니다.</li>
	<li>최대 속도 (18000 x g)에 실시간에 3 분간 원심</li>
	<li>시 약의 최종 농도 1 x Taq PCR 버퍼, 10 pmol 각 정방향 및 역방향 뇌관의 각 dNTP의 12.5 nmol PCR mastermix의 40 µ L을 포함 하는 새로운 microcentrifuge 관에는 상쾌한의 10 µ L를 즉시 전송 및 2.5 U Taq DNA 중 합 효소의. 참고: 정방향 및 역방향 뇌관은 다음과 같습니다: 5'-CCACACCTATGGTGTATG-3' ( cII 기준-50-68 시작 codon 위치) 및 5'-CCTCTGCCGAAGTTGAGTAT-3' (위치 cII 시작 codon 기준으로 365 +345), 각각.</li>
	<li>다음 자전거 매개 변수를 사용 하 여 템플릿을 증폭: 95 ° C에서 3 분 변성 30 30 사이클 뒤에 s 95 ° C, 60 ° C에서 1 분에 72 ° c.에서 10 분의 최종 확장명이 72 ° C에서 1 분</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 cII 유전자를 포함 하 고 상업적으로 이용 가능한 PCR 정화 키트를 사용 하 여 영역을 노릴 432 bp PCR 제품을 정화.</li>
	<li>적절 한 시퀀싱 플랫폼을 사용 하 여 DNA 시퀀싱을 수행 하 고 cII transgene의 돌연변이 검색 결과 DNA 시퀀스 분석 (아래 참고 참조). 참고:이 최고의 T 커피 시퀀스 정렬 웹 기반 서버 소프트웨어를 사용 하 여 참조 cII 시퀀스와 정렬에 의해 달성 된다. 프로그램을 사용 하는 방법에 대 한, 방문: <a href="http://tcoffee.crg.cat/">http://tcoffee.crg.cat/</a>
</li>
</ol>

모든 저자는 충돌의 관심을 선언합니다.

Λ 선택 cII 분석 결과 BB 설치류3의 장기/조직에서 파생 된 세포의 게놈 DNA에서 복구 cII transgene에 변이의 탐지를 위해 사용 됩니다. 이러한 유전자 변형 동물의 게놈 cII 운반 하는 chromosomally 통합된 λLIZ 셔틀 벡터의 여러 탠덤 복사본이 포함 (294 bp)와 lacI (1080 bp) transgenes mutational 리포터 유전자1, 2 , <sup c...

다양 한 유전자 변형 동물 모델 및 돌연변이 탐지 시스템 변이 포유류 세포에서 발암 물질의 테스트를 위해 개발 되었습니다. 이들의 유전자 변형 (라고도 BB) 빅 블루 마우스 및 돌연변이 탐지 시스템 λ 선택 cII 있다 변이 실험에 의해 고용 되었다이 그룹 및 많은 다른 연구 그룹 전세계1,2, 3,,45,6,7,,89. 지난 16 년 동안, 우리가이 유전자 변형 동물을 사용 하 여 다양 한 화학 및 물리적 에이전트의 변이 원 성 영향 조사 또는 자신의 해당 미 발달 섬유 아 세포 세포 배양 시험 화합물으로 치료 하 고 이후에 분석은 표현 형 및 λ 선택 cII 분석 결과와 DNA 시퀀싱, 각각10,,1112,,1314 cII transgene의 유전자 형 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. 유전자 변형 동물의 게놈 다중 복사 머리-투-꼬리 concatemer1,,2254 염색체에 통합 된 살 균 소 λ 셔틀 벡터 (λLIZ) 포함 되어 있습니다. ΛLIZ 셔틀 벡터 운반 두 mutational 리포터 유전자, 즉 lacI 및 cII transgenes1,2,25,,2627, 28,29,30,31,32,33,,3435,36, 37,38,39,40,41,42,43,,4445 , 46 , 47. λ 선택 cII 분석 결과 유전자 변형 동물1,2,25의 기관/조직에서 파생 된 세포의 게놈 DNA에서 λLIZ 셔틀 벡터의 회복에 따라 . 복구 된 λLIZ 셔틀 벡터 다음 λ 살 균 소 머리 표시기 호스트 대장균감염의 수에 포장 됩니다. 그 후, 감염 된 박테리아는 점수 및 cII transgene1,3에 있는 돌연변이의 분석에 대 한 수 있도록 선택적 조건 하에서 성장 된다.
여기, 우리가 치료 하는 유전자 변형 동물에 체 외에서의 셀/기관에서 게놈 DNA의 분리를 이루어져 있는 λ 선택 cII 분석 결과 대 한 자세한 프로토콜 설명 /vivo에 는 λLIZ의 시험 화합물, 검색으로 셔틀 벡터 genomic DNA에서 전염 성 λ 페이지, 살 균 소, cII의 id와 호스트 대장균 의 감염에는 벡터의 포장- cII 돌연변이 주파수를 결정 하는 선택적 조건 돌연변이 및 CII 돌연변이 스펙트럼을 설정할 DNA 순서 분석. 프로토콜 유전자 변형 마우스/쥐 셀 문화 치료 체 외에 관심, 화학/물리 에이전트에 적용할 수 또는 해당 동물의 조직/장기에서 치료 vivo에서 테스트 화학/에이전트1, 2,4,48,49,50,,5152. Λ 선택 cII 분석 결과의 프레 젠 테이 션이 회로도 그림 1에 표시 됩니다.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>MO Bio Laboratories, Inc.</td><td>12112-05</td><td>Bacteriological grade</td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4337455</td><td>None</td></tr><tr><td>Casein Peptone</td><td>Alfa Aesar</td><td>H26557</td><td>None</td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>J. T. Baker</td><td>2124-01</td><td>Powder</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 229-1 / M-13750</td><td>None</td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 9724-500</td><td>None</td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>8104</td><td>50 PCR purification reactions</td></tr><tr><td>Sodium Acetate Trihydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-15756</td><td>None</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Taq5000&lt;/em&gt; DNA Polymerase&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>201207</td><td>None</td></tr><tr><td>Thiamine Hydrochloride</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>2722-57</td><td>None</td></tr><tr><td>Transpack Packaging Extract</td><td>Stratagene Corp., Acquired by BioReliance | Sigma-Aldrich Corp.</td><td>200223</td><td>50 packaging reactions</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 152-1 / EC 201-064-4</td><td>None</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Biosciences</td><td>RC-110</td><td>None</td></tr></tbody></table>

the lambda select cii mutation detection system

유전자 변형 동물 모델 및 돌연변이 탐지 시스템의 수 변이 포유류 세포에서 발암 물질의 테스트를 위해 개발 되었습니다. 이들의 유전자 변형 생쥐와 돌연변이 탐지 시스템 람다 (λ) 선택 cII 되었습니다 고용 했다 변이 실험에 대 한 전 세계 많은 연구 그룹에 의해. 여기, 우리가 선택 하는 람다 cII 돌연변이 분석 결과, 유전자 변형 쥐/쥐의 배양된 세포에 적용 될 수 있는 대 한 자세한 프로토콜 설명 또는 해당 동물의 화학/물리적 에이전트와 치료. 프로토콜은 다음 단계로 구성 됩니다: 세포에서 게놈 DNA의 (1) 절연 또는 유전자 변형 동물의 기관/조직 치료 생체 외에서 또는 vivo에서각각, 시험 화합물; (2) 게놈 DNA;에서 mutational 리포터 유전자 (즉, cII transgene) 들고 람다 셔틀 벡터의 복구 (3) 포장 구조 벡터의 전염 성 살 균 소;에 (4) 호스트 박테리아를 감염 하 고 유도 cII 돌연변이;의 전파 수 있도록 선택적 조건 하에서 배양 그리고 (5) 득점 cII-돌연변이 DNA 순서 분석을 cII 돌연변이 주파수 및 돌연변이 스펙트럼, 각각.

데이터 배포에 따라 패라메트릭 또는 비-파라 메 트릭 테스트 치료 및 제어 그룹 (즉, 자연 스러운 돌연변이 주파수 대 유도) cII 돌연변이 주파수 차이의 중요성을 결정 하기 위해 사용 됩니다. . 다른 치료 그룹 유도 cII 돌연변이 주파수의 비교에 의해 이루어집니다 다양 한 (인덱스도) 적용으로 통계적 테스트. 주파수를 비교 하는 χ2 테스트 또?...

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The Lambda Select cII Mutation Detection System

선택 하는 람다 cII 돌연변이 탐지 시스템

우리는 유전자 변형 쥐의 배양된 세포에 람다 선택 cII 돌연변이 분석 결과 또는 해당 동물의 화학/물리적 에이전트 처리에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 이 접근은 변이 포유류 세포에서 발암 물질의 테스트를 위한 널리 사용 되었습니다.

A number of transgenic animal models and mutation detection systems have been developed for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells. Of ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Lambda Select cII Mutation Detection System

7.8K 조회수.  University of Southern California. 우리는 유전자 변형 쥐의 배양된 세포에 람다 선택 cII 돌연변이 분석 결과 또는 해당 동물의 화학/물리적 에이전트 처리에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 이 접근은 변이 포유류 세포에서 발암 물질의 테스트를 위한 널리 사용 되었습니다.

비디오: The Lambda Select cII Mutation Detection System

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific molecular profiles of a tumor may predict responsiveness to therapeutic agents or provide knowledge about prognosis. At our institution a tumor genotyping program was established as part of routine clinical care, screening both hematologic and solid tumors for a wide spectrum of mutations using two next-generation sequencing (NGS) panels: a custom, 33 gene hematological malignancies panel for use with peripheral blood and bone marrow, and a commercially produced solid tumor panel for use with formalin-fixed paraffin-embedded tissue that targets 47 genes commonly mutated in cancer. Our workflow includes a pathologist review of the biopsy to ensure there is adequate amount of tumor for the assay followed by customized DNA extraction is performed on the specimen. Quality control of the specimen includes steps for quantity, quality and integrity and only after the extracted DNA passes these metrics an amplicon library is generated and sequenced. The resulting data is analyzed through an in-house bioinformatics pipeline and the variants are reviewed and interpreted for pathogenicity. Here we provide a snapshot of the utility of each panel using two clinical cases to provide insight into how a well-designed NGS workflow can contribute to optimizing clinical outcomes.

This manuscript describes clinical protocols for two next-generation sequencing panels. One panel interrogates hematologic malignancies while the other panel targets genes commonly mutated in solid tumors. Molecular classification of driver mutations in human malignancies offers valuable prognostic and predictive information.

고체 및 액체 종양에서 실행 가능한 돌연변이의 검출을위한 차세대 시퀀싱

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

연구

암 연구학

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging resistance mutations during therapy, or when patients have few circulating tumor cells. Wild-type blocking PCR followed by sequencing analysis offers high sensitivity, flexibility, and simplicity as a methodology for detecting these low frequency mutations. By adding a custom designed locked nucleic acid oligonucleotide to a new or previously established conventional PCR based sequencing assay, sensitivities of approximately 1 mutant allele in a background of 1,000 WT alleles can be achieved (1:1,000). Sequencing artifacts associated with deamination events commonly found in formalin fixed paraffin embedded tissues can be partially remedied by the use of uracil DNA glycosylase during extraction steps. The optimized protocol here is specific for detecting MYD88 mutation, but can serve as a template to design any WTB-PCR assay. Advantages of the WTB-PCR assay over other commonly utilized assays for the detection of low frequency mutations including allele specific PCR and real-time quantitative PCR include fewer occurrences of false positives, greater flexibility and ease of implementation, and the ability to detect both known and unknown mutations.

Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

와일드 형은 PCR은 낮은 주파수 체세포 돌연변이의 검출을위한 고감도 방법으로 직접 시퀀싱과 결합 블로킹

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

유전학

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. However, the application of this method is challenging due to its low sensitivity in analyzing the trace amount of ctDNA in the blood. Furthermore, the method may generate false positive and negative results from this sequencing and subsequent analysis. To improve the feasibility and reliability of ctDNA detection in the clinic, here we present a technique which enriches rare mutations for sequencing, Enrich Rare Mutation Sequencing (ER-Seq). ER-Seq can distinguish a single mutation out of 1 x 107 wild-type nucleotides, which makes it a promising tool to detect extremely low frequency genetic alterations and thus will be very useful in studying disease heterogenicity. By virtue of the unique sequencing adapter&#39;s ligation, this method enables an efficient recovery of ctDNA molecules, while at the same time correcting for errors bidirectionally (sense and antisense). Our selection of 1021 kb probes enriches the measurement of target regions that cover over 95% of the tumor-related driver mutations in 12 tumors. This cost-effective and universal method enables a uniquely successful accumulation of genetic data. After efficiently filtering out background error, ER-seq can precisely detect rare mutations. Using a case study, we present a detailed protocol demonstrating probe design, library construction, and target DNA capture methodologies, while also including the data analysis workflow. The process to carry out this method typically takes 1-2 days.

This manuscript describes a technique for detecting mutations of low frequency in ctDNA, ER-Seq. This method is differentiated by its unique use of two-directional error correction, a special background filter, and efficient molecular acquirement.

다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 CtDNA에서 희소 한 변이의 탐지

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

드문 이벤트 감지 오류 수정 DNA와 RNA 시퀀싱을 사용 하 여

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation into thousands of nano-sized water-in-oil individual reactions. Recently, ddPCR has become one of the most accurate and sensitive tools for circulating tumor DNA (ctDNA) detection. One of the major limitations of the standard ddPCR technique is the restricted number of mutations that can be screened per reaction, as specific hydrolysis probes recognizing each possible allelic version are required. An alternative methodology, the drop-off ddPCR, increases throughput, since it requires only a single pair of probes to detect and quantify potentially all genetic alterations in the targeted region. Drop-off ddPCR displays comparable sensitivity to conventional ddPCR assays with the advantage of detecting a greater number of mutations in a single reaction. It is cost-effective, conserves precious sample material, and can also be used as a discovery tool when mutations are not known a priori.

Here, we present a protocol to accurately quantify multiple genetic alterations of a target region in a single reaction using drop-off ddPCR and a unique pair of hydrolysis probes.

하나의 물방울 디지털 연쇄 반응 핫스팟 지역에서 돌연변이의 포괄적이 고 동시 검색

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these epigenetic marks is accomplished by sequential oxidation by ten-eleven translocation dioxygenases (TET1-3), followed by the thymine-DNA glycosylase-dependent base excision repair. Inactivation of the TET2 gene due to genetic mutations or by other epigenetic mechanisms is associated with a poor prognosis in patients with diverse cancers, especially hematopoietic malignancies. Here, we describe an efficient single step purification of enzymatically active untagged human TET2 dioxygenase using cation exchange chromatography. We further provide a liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) approach that can separate and quantify the four normal DNA bases (A, T, G, and C), as well as the four modified cytosine bases (5-methyl, 5-hydroxymethyl, 5-formyl, and 5-carboxyl). This assay can be used to evaluate the activity of wild type and mutant TET2 dioxygenases.

Here, we present a protocol for an efficient single step purification of the active untagged human ten-eleven translocation-2 (TET2) 5-methylcytosine dioxygenase using ion-exchange chromatography and its assay using a liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)-based approach.

효율적인 정화와 10-11 전-2 5-Methylcytosine Dioxygenase에 대 한 LC-MS/MS 기반 분석 결과 개발

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

생화학

qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a polymorphic cluster of genes on chromosome 19. Their best-characterized ligands are the human leukocyte antigen (HLA) molecules that are encoded within the major histocompatibility complex (MHC) locus on chromosome 6. There is substantial evidence that they play a significant role in immunity, reproduction, and transplantation, making it crucial to have techniques that can accurately genotype them. However, high-sequence homology, as well as allelic and copy number variation, make it difficult to design methods that can accurately and efficiently genotype all KIR genes. Traditional methods are usually limited in the resolution of data obtained, throughput, cost-effectiveness, and the time taken for setting up and running the experiments. We describe a method called quantitative KIR semi-automated typing (qKAT), which is a high-throughput multiplex real-time polymerase chain reaction method that can determine the gene copy numbers for all genes in the KIR locus. qKAT is a simple high-throughput method that can provide high-resolution KIR copy number data, which can be further used to infer the variations in the structurally polymorphic haplotypes that encompass them. This copy number and haplotype data can be beneficial for studies on large-scale disease associations, population genetics, as well as investigations on expression and functional interactions between KIR and HLA.

Quantitative killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) semi-automated typing (qKAT) is a simple, high-throughput, and cost-effective method to copy number type KIR genes for their application in population and disease association studies.

qKAT: 킬러 세포 같은 면역 글로불린 수용 체 유전자의 양적 반자동 입력

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem cells are responsible for ensuring tissue homeostasis and repair throughout life, it is reasonable to hypothesize that the stem cell population is critical for preserving genomic integrity of tissues. Therefore, significant interest has arisen in assessing the impact of endogenous and environmental factors on genomic integrity in stem cells and their progeny, aiming to understand the etiology of stem-cell based diseases.
LacI transgenic mice carry a recoverable &#955;&#160;phage vector encoding the LacI reporter system, in which the LacI gene serves as the mutation reporter. The result of a mutated LacI gene is the production of &#946;-galactosidase that cleaves a chromogenic substrate, turning it blue. The LacI reporter system is carried in all cells, including stem/progenitor cells and can easily be recovered and used to subsequently infect E. coli. After incubating infected E. coli on agarose that contains the correct substrate, plaques can be scored; blue plaques indicate a mutant LacI gene, while clear plaques harbor wild-type. The frequency of blue (among clear) plaques indicates the mutant frequency in the original cell population the DNA was extracted from. Sequencing the mutant LacI gene will show the location of the mutations in the gene and the type of mutation.
The LacI transgenic mouse model is well-established as an in vivo mutagenesis assay. Moreover, the mice and the reagents for the assay are commercially available. Here we describe in detail how this model can be adapted to measure the frequency of spontaneously occurring DNA mutants in stem cell-enriched Lin-IL7R-Sca-1+cKit++(LSK) cells and other subpopulations of the hematopoietic system.

Here we describe an in vivo mutagenesis assay for small numbers of purified hematopoietic cells using the LacI transgenic mouse model.&#160;The LacI gene can be isolated to determine the frequency, location, and type of DNA mutants&#160;spontaneously arisen or after exposure to genotoxins.

정제 된 조혈 줄기 / 전구 세포에 DNA 돌연변이를 확인

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

면역학 및 감염병학

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi) holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable cancer cell vulnerabilities. Limiting the potential of this technology is the inability to rapidly delineate the mechanistic basis of phenotypic outcomes and thus inform the development of molecularly targeted therapeutic strategies. We outline here methods to deconstruct cellular phenotypes induced by RNAi-mediated gene targeting using multiplexed reporter systems that allow monitoring of key cancer cell-associated processes. This high-content screening methodology is versatile and can be readily adapted for the screening of other types of large molecular libraries.

Achieving a systems level understanding of cellular processes is a goal of modern-day cell biology. We describe here strategies for multiplexing luciferase reporters of various cellular function end-points to interrogate gene function using genome-scale RNAi libraries.

배양 세포에서 암과 연관된 신호 전달을 심문위한 멀티 플렉스 루시 페라 기반 스크리닝 플랫폼

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...