Name: the lambda select cii mutation detection system
Uploaded: 2018-04-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
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Wir würden gerne die Beiträge aller Kollegen und Mitarbeiter zu unserer ursprünglichen Studien, deren Ergebnisse in diesem Manuskript (zur Veranschaulichung) erwähnten anerkennen. Arbeit der Autoren wird unterstützt durch Zuschüsse aus dem nationalen Institut für zahnärztliche und Craniofacial Forschung von den National Institutes of Health (1R01DE026043), AB und an der University of California Tobacco-Related Krankheit Forschungsprogramm, das AB ( TRDRP-26IR-0015) und ST (TRDRP-25IP-0001). Die Sponsoren der Studie hatte keine Rolle im Studiendesign, Datenerhebung, Datenanalyse, Datenauswertung, Schreiben des Berichts oder in der Entscheidung zur Veröffentlichung einreichen.

1. genomischer DNA-Isolierung aus embryonalen Fibroblasten der Maus
Hinweis: Primäre Maustaste embryonalen Fibroblasten sind nach den veröffentlichten Protokoll53von Embryonen abgeleitet von BB transgenen Mäusen C57BL/6 genetischen hintergrund isoliert. Das Ausgangsmaterial für dieses Protokoll besteht aus 1 x 106 bis 1 x 107 embryonalen fibroblastenzellen mit einem Test zusammengesetzte versus Kontrolle behandelt. Die Ernte und die Zählung der diese Zellen unter Verwendung von standard-Methoden werden in Referenzen10,54,55beschrieben.
<ol><li>Bereiten Sie eine (0,3 M Saccharose 60 mM KCl, 15 mM NaCl, 60 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0,5 mM Spermidine, Spermin 0,15 mM und 2 mM EDTA)-Puffer, Puffer B (150 mM NaCl und 5 mM EDTA, pH 7,8) und C (20 mM Tris-HCl, pH 8,0-Puffer 20 mM NaCl, 20 mM EDTA und 1 % SDS) im voraus und erhalten bei Raumtemperatur (RT) für bis zu einem Jahr54,55.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie Zellen in 2 – 4 mL Puffer, die A in einem 15 mL konische Zentrifugenröhrchen durch pipettieren immer wieder nach oben und unten mit einem breiten 1.000 µL PIPETTENSPITZE trug.</li>
	<li>Fügen Sie ein Volumen (2 – 4 mL) Puffer A mit 1 % Octylphenoxypolyethoxyethanol (z.B.Nonidet P40) mit einer serologischen Glaspipette.</li>
	<li>Inkubieren Sie das Rohr für 5 min auf Eis.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Rohr auf 1.000 X g für 5 min bei RT</li>
	<li>Den überstand verwerfen und das Pellet mit 10 – 15 mL Puffer A mit einer Glaspipette serologische waschen.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie das Pellet in 2 – 4 mL Puffer B.</li>
	<li>Fügen Sie ein Volumen (2 – 4 mL) Puffer C enthält 600 µg/mL Proteinase K.</li>
	<li>Inkubieren Sie das Rohr für 3 h bei 37 ° c</li>
	<li>Hinzu kommt eine Endkonzentration von 100 µg/mL RNase A.</li>
	<li>Inkubieren Sie das Rohr für weitere 1 h bei 37 ° c</li>
	<li>Fügen Sie ein Volumen (2 – 4 mL) Phenol (durchtränkt von 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0):chloroform:isoamyl Alkohol (25:24:1 Vol/Vol). Hinweis: Phenol kann schwere gesundheitliche Gefahren und muss mit äußerster Vorsicht behandelt werden. Phenol ist hoch ätzend auf die Haut und durch es bereitwillig aufgenommen und weist andere Effekte. Beim Umgang mit Phenol, immer verwenden Sie doppelte gloving, Schutzbrille aufsetzen, und in einem chemischen Abzug arbeiten.</li>
	<li>Mischen Sie gut durch Umkehrung der Röhre für 5 min auf ein Rohr Rotator bei 4 ° c</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Rohr auf 1.000 X g für 5 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Die wässrige Phase (oberste Schicht) zu einem neuen Schlauch mit einer Glaspipette serologische zu entfernen.</li>
	<li>Wiederholen Sie Phenol: Chloroform: Isoamyl-Alkohol-Extraktion 1 bis 3 Mal, bis die wässrige Phase klar ist und das Interface nicht mehr trüben ist.</li>
	<li>Fügen Sie 1/10 Volumen (200 – 400 µL) 3M Natriumacetat, pH 5.2.</li>
	<li>Fügen Sie 2,5 Volumen (5 – 10 mL) 100 % Ethanol (gekühlt) und invertieren Sie die Röhre vorsichtig von Hand für 2 – 3 min..</li>
	<li>Die DNA mit einem Glas Haken Spool und überträgt es auf ein neues Röhrchen mit 1 – 5 mL 70 % Ethanol und gründlich waschen. Zentrifugieren Sie alternativ das Rohr mit hoher Geschwindigkeit (3.500 X g) bei 4 ° C, pellet-DNA und waschen sie gründlich mit 1 – 5 mL 70 % Ethanol.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Rohr mit hoher Geschwindigkeit (3.500 X g) bei RT, entfernen Sie den überstand zu und trocknen Sie die DNA für 10-15 Minuten an der Luft.</li>
	<li>Auflösen der DNS in 10-100 µL TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5), und bei 4 ° C (für kurze Lagerung von bis zu einem Monat) oder bei-20 ° C (für längere Lagerzeit) zu speichern. Die optimale Konzentration für DNA für die λ-Select cII -Assay ist 0,5-1,0 µg/µL (in TE-Puffer)56.</li>
</ol>2. in-vitro- Verpackung-Reaktion
<ol><li>Pro eine Verpackung Reaktion hinzufügen ~ 5 µg genomische DNA (Endvolumen: 8 – 12 µL, genomische DNA wurde in Abschnitt 1 von Maus embryonalen Fibroblasten behandelt in Vitro mit einer Testverbindung oder Steuerelement isoliert) zu einem Microcentrifuge Schlauch, enthält das erste Reaktion Mischung (~ 10 µL). Hinweis: Im Haus vorbereitet oder handelsüblichen λ Verpackung Extrakte werden in verschiedenen Labors verwendet. In der kommerziellen Verpackung Extrakt Kit verwendet hier56 (siehe die Tabelle der Materialien), Rote Rohre enthalten die erste Reaktion Mischung (~ 10 µL) und blaue Rohre enthalten die zweite Reaktion Mischung (~ 70 µL für mindestens 5 Reaktionen).</li>
	<li>Inkubieren Sie das Rohr für 90 min. bei 30 ° c</li>
	<li>Das Rohr das erforderliche Volumen (~ 12 µL) der zweite Reaktion Mischung hinzufügen.</li>
	<li>Inkubieren Sie das Rohr für eine zusätzliche 90 min. bei 30 ° c</li>
	<li>
Das Rohr 1,1 mL SM-Puffer hinzufügen. Hinweis: 1 mL dieser Lösung (z.B. Verpackung Reaktionsgemisch) wird verwendet, für das screening von λ cII-Mutanten. Der Rest wird für verschoben verwendet werden.<ol>
<li>Vorbereitung SM-Puffer durch das Mischen von 5,8 g NaCl, 2,0 g MgSO4.7H2O, 50 mL 1 M Tris-HCl (pH 7,5) und 5 mL 2 % (w/V) Gelatine. DH2O zu einem Endvolumen von 1 Liter, Autoklaven für 30 min. bei Raumtemperatur bis zu 1 Jahr Store hinzufügen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wirbel der Röhre mit der verpackte DNA-Probe für 10 s bei RT (kräftig aufschütteln).</li>
	<li>Pulse spin das Rohr in eine Microcentrifuge und speichern auf Eis bis zum Gebrauch. Wenn die Probe nicht am selben Tag der Verpackung verwendet werden soll, fügen Sie 50 µL Chloroform pro mL verpackte DNA-Probe, Wirbel sanft, und bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen aufbewahren.</li>
</ol>3. Vorbereitung der E. Coli G1250 Bakterienkultur
<ol><li>
Machen Sie mindestens zwei Tage vor der Beschichtung, ein paar bakterielle Streifen Teller von Escherichia coli (E. Coli) G1250 auf Agarplatten TB1-Kanamycin.
	<ol>
<li>TB1-Kanamycin Agarplatten wie folgt vorbereiten. Mischen Sie 5,0 g NaCl, 10,0 g Casein Pepton und 12,0 g Agar. 800 mL dH2O. Add 1 mL 0,1 % Thiamin Hydrochlorid hinzufügen. Stellen Sie pH 7.0 mit NaOH oder HCl. Add dH2O zu einem Endvolumen von 1 Liter.</li>
		<li>Mischen Sie gut und Autoklaven für 30 min. zulassen auf 55 ° c abkühlen 50,0 mg Kanamycin und verrühren. Gießen Sie in sterile Petrischalen 100 mm (20 – 25 mL pro Gericht). Shop-Platten bei 4 ° C für bis zu zwei Wochen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubieren Sie die bakterielle Streifen Platten in einem stationären 30 ° C Inkubator für mindestens 24 h.</li>
	<li>
Kombinieren Sie einen Tag vor der Beschichtung, 10 mL des flüssigen Mediums TB1 mit 100 µL 20 % (w/V) Maltose-1 M MgSO4 Lösung in einem sterilen 50 mL Schraubverschluss konische Rohr.
	<ol>
<li>TB1 flüssiges Medium wie folgt vorbereiten. Mix-5,0 g NaCl und 10,0 g Casein Pepton, dann 800 mL dH2O, 1 mL 0,1 % Thiamin Hydrochlorid, hinzufügen und anpassen den pH-Wert 7,0 mit NaOH oder HCl. Dann dH2O zu einem Endvolumen von 1 Liter hinzufügen, gut mischen und Autoklaven für 30 min. speichern das Medium bei RT für bis zu drei Monaten.</li>
		<li>20 % (w/V) Maltose-1 M MgSO4 wie folgt vorbereiten. Mischen Sie 20,0 g Maltose und 24,6 g MgSO4. 7H2O, dann fügen Sie dH2O zu einem Endvolumen von 100 mL. Filter zu sterilisieren und bei 4 ° C für bis zu 6 Monate zu speichern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Das flüssige Medium mit mehrere Kolonien von der bakteriellen Streifen-Platte mit einem sterilen Impfkeimen Schleife56zu impfen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Flüssigkultur über Nacht in einem 30 ° C schütteln Inkubator mit kräftig schütteln (250 – 300 u/min).</li>
	<li>Am Tag der Beschichtung Zentrifugieren der konischen Röhrchen mit der G1250 Flüssigkultur 1.500 x g für 10 min bei RT zu die Bakterienzellen Pellets.</li>
	<li>Den überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 10 mL 10 mM MgSO4.</li>
	<li>Messen Sie die Absorption von einem 01:10 Verdünnung der Zellsuspension bei Wellenlänge 600 nm mit einem UV-Vis Spektralphotometer (z.B., 100 µL Zellsuspension + 900 µL 10 mM MgSO4)56.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Zellsuspension auf eine endgültige OD600 von 0,5 mit 10 mM MgSO4. Die vorbereiteten Aussetzung der G1250 E. Coli mit OD600 = 0,5 wird als "G1250 Beschichtung Kultur" bezeichnet.</li>
	<li>Speichern der G1250 Beschichtung Kultur auf Eis und innerhalb von 1-2 h verwenden.</li>
</ol>(4) Beschichtung die verpackte DNA-Proben
<ol><li>
Je eine verpackte DNA-Probe bereiten Sie sechzehn steril 14 x 100 mm2 Rundboden Röhrchen und sechzehn TB1 Agarplatten vor. Zehn aus jedem Satz wird für Screening und sechs für verschoben (drei für Titer 20) und drei für Titer 100 verwendet werden.
	<ol>
<li>TB1 Agarplatten wie folgt vorbereiten. Mix-5,0 g NaCl, 10,0 g Casein Pepton und 12,0 g Agar, fügen dann 800 mL dH2O und 1 mL 0,1 % Thiamin Hydrochlorid. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 mit NaOH oder HCl, und fügen Sie dH2O zu einem Endvolumen von 1 L.</li>
		<li>Gut mischen und Autoklaven für 30 min. lassen Sie die Mischung auf 55 ° C abkühlen lassen, dann Gießen sie in sterile 100 mm Petrischalen (20 – 25 mL pro Gericht). Speichern Sie die Platten bei 4 ° C für bis zu zwei Wochen. Hinweis: TB1 Agarplatten sollte mindestens 24 Stunden vor Gebrauch vorbereitet werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aliquoten 200 µL der G1250 Beschichtung Kultur in jedem Rundboden Röhrchen.</li>
	<li>
Für verschoben, machen eine 1: 100 Verdünnung der verpackten DNA Probe und mischen Sie gut durch Vortexen (d.h., 10 µL verpackt DNA-Probe + 990 µL SM-Puffer).</li>
	<li>20 µL der 1: 100 Verdünnung hinzu kommt jedes der drei Titer 20 Rohre.</li>
	<li>Fügen Sie jedes der drei Titer 100 Rohre 100 µL der Verdünnung 1: 100 hinzu.</li>
	<li>
Für das Screening, fügen 100 µL der "unverdünnt" verpackte DNA-Probe zu jedem der zehn Screening-Röhren.</li>
	<li>Verarbeiten alle verschoben und Screening-Röhren (2 x 3 + 10 = 16 Rohre), wie folgt: Mischen Sie gut durch Vortexen für ca. 10 s, und dann bei Raumtemperatur für 30 min zu den Host E. Coli zu adsorbieren, die Phagen ermöglichen inkubieren.</li>
	<li>
2,5 mL Mikrowelle geschmolzenen TB1 top Agar (abgekühlt auf 55 ° C) zu jeder Titer oder screening-Rohr, mischen sofort durch Vortexen (sanft), hinzufügen und Gießen in die entsprechenden Titer oder screening TB1 Agarplatten.
	<ol>
<li>TB1 obere Agar wie folgt vorbereiten. Mix-5,0 g NaCl, 10,0 g Casein Pepton und 7,0 g Agar, dann 800 mL dH2O. Add 1 mL 0,1 % Thiamin Hydrochlorid, dann stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 mit NaOH oder HCl. Zu guter Letzt fügen Sie dH2O zu einem Endvolumen von 1 Liter.</li>
		<li>Mischen Sie gut und Autoklaven für 20 – 25 min. Store bei Raumtemperatur für bis zu drei Monaten.</li>
		<li>Vor dem Einsatz bereite TB1 obere Agar in der Mikrowelle schmelzen, gut mischen und auf 55 ° C im Wasserbad abkühlen lassen. Hinweis: Die geschmolzene und abgekühlte TB1-Spitze wird hinzugefügt, um den Inhalt der einzelnen Titer oder Screening-Rohr und nach dem Mischen, in die entsprechenden Titer oder Screening TB1 Agarplatten gegossen wird.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lassen Sie die Platten stehen für 15-30 min bei Raumtemperatur, bei geschlossenem Deckel einen Spalt offen, um Kondensation zu verhindern.</li>
	<li>Invertieren die Platten und die zehn Screening-Platten in einem Inkubator stationäre 24 ° C und 46 – 48 h (d.h., selektiven Bedingungen) und die sechs Titer-Platten in einem Inkubator stationäre 37 ° C inkubieren und inkubieren 24 h/Übernachtung (d. h., nicht-selektiven Bedingungen). Hinweis: Für Qualitätssicherung und Standardisierung der Ergebnisse, sind handelsübliche Phagen Steuerungslösungen mit einer Mischung aus Wildtyp und Mutanten cII mit bekannten Mutantenhäufigkeit vernickelt neben die verpackten DNA-Proben und in allen Zimmern Test läuft56.</li>
</ol>5. Prüfung der Titer und Screening-Platten um die cII Mutant Frequenz zu bestimmen
<ol><li>Im Anschluss an die 24 h/Übernachtung Inkubation bei 37 ° C Count die Anzahl der Plaketten in jeder der drei Titer 20 Platten und Titer 100 Platten gebildet. Um die Plaketten leichter identifizieren zu können, halten Sie die Platte neben einem weißen Lichtkasten und vor einem dunklen Hintergrund mit Deckel entfernen (siehe Abbildung 2).</li>
	<li>Stellen ein Durchschnitt (Mittelwert) der Zahl der Plaketten in jedem Satz der Titer 20 und Titer 100 Platten gezählt (dreifacher, jeweils).</li>
	<li>Wählen Sie die durchschnittliche Zahl aus der Menge der Titer-Platten, die am nächsten an die Reichweite von 50 – 200 Plaques pro Platte Satz fällt.</li>
	<li>Die Gesamtzahl der Plaketten gezeigt in den zehn Screening-Platten wie folgt zu berechnen: Total abgeschirmte Plaketten (mittlere Anzahl von Plaques in den gewählten Titer Platten ÷ Anzahl der µL Verdünnung pro gewählten Titer Platte verwendet) = x Verdünnungsfaktor x Anzahl der µL verpackte DNA-Probe pro Platte [100 µL/Platte] screening x Anzahl der screening-Platten [10]. Hinweis: zum Beispiel wird wenn die mittlere Anzahl von Plaques pro Platte in den Titer 20 Platten 128 ist und die entsprechende Zahl in der Menge der Titer 100 Platten 478, die Zahl 128 für die Berechnung der Gesamtzahl von Plaques gezeigt verwendet werden , wie folgt: (128 ÷ 20) X 100 [Verdünnungsfaktor] x 100 [µL/Platte] X 10 [Platten] = 640.000 Dies entspricht die mittlere Anzahl von Plaques mit 5.000 oder 1.000, multiplizieren, wenn die durchschnittliche Anzahl bzw. auf Grafen aus Titer 20 Platten oder Titer 100 Platten, basiert.</li>
	<li>Nach 46 – 48 h Inkubation bei 24 ° C die insgesamt Anzahl von Plaques in den zehn Screening-Platten (folgen Sie den Anweisungen in Abschnitt 5.1) gebildet. Hinweis: Die cII Mutantenhäufigkeit errechnet sich durch Division der Gesamtzahl von Plaques in den Screening-Platten gebildet durch die Gesamtzahl der Plaques gezeigt. Mit dem obigen Beispiel, wenn die Gesamtzahl von Plaques in den zehn Screening-Platten gezählt ist die 112, die cII Mutantenhäufigkeit für diese DNA-Probe wäre 112 ÷ 640.000 = 17,5 x 10-5.</li>
</ol>6. Überprüfung der Putative λ cII Mutanten, PCR-Amplifikation und DNA-Sequenzierung
<ol><li>Die Plakette in Frage mit einer sterilen, weite Bohrung pipettieren Spitze entkernen und in einen sterilen Microcentrifuge Schlauch mit 500 µL steriler SM-Puffer (durch pipettieren rauf und runter) zu vertreiben.</li>
	<li>Mindestens 2 h bei Raumtemperatur inkubieren Sie, oder stecken Sie bei 4 ° C über Nacht, erlauben die Phagen-Teilchen aus dem Agar eluieren.</li>
	<li>In einem sterilen 14 x 100 mm2 Rundboden Röhrchen 200 µL der G1250 Beschichtung Kultur mit 1 µL der entkernt Phagen-Lösung mischen und 30 min bei RT inkubieren</li>
	<li>Die Probe mit 2,5 mL 55 ° C geschmolzene TB1 obere Agar-Platte und inkubieren Sie die Platte bei 24 ° C 46 – 48 h (selektiven Bedingungen), wie in Abschnitte 4.8 – 4.10 beschrieben.</li>
	<li>Nach den sekundären Plaques gebildet haben, mithilfe eine PIPETTENSPITZE wählen Sie sorgfältig einen einzigen gut isolierten verifizierten λ cII-mutierten Plaque (berühren der unteren Agar). Hinweis: Die vermeintliche cII mutierten Plaques Replating dient zwei Zwecken: (i) Beschichtung Artefakte kann manchmal kleine Plaketten; verwechselt werden und (Ii) eine Agarose-Kern entnommen einer Screening-Platte kann nicht mutierte Phage(s) zusammen mit einem mutierten Phagen enthalten. Sekundäre Plaketten von geringer Dichte replating bieten eine unberührte mutierte Vorlage für PCR und anschließende DNA-Sequenzanalyse.</li>
	<li>Übertragen Sie die Plakette zu einem Microcentrifuge Schlauch mit 25 µL bidestilliertem Wasser von oben und unten pipettieren.</li>
	<li>Platzieren Sie das Rohr in kochendem Wasser für 5 Minuten.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie mit maximaler Geschwindigkeit (18.000 X g) für 3 Minuten bei RT</li>
	<li>Übertragen Sie 10 µL des Überstands sofort zu einem neuen Microcentrifuge Schlauch mit 40 µL einer PCR Mastermix, in denen die Endkonzentrationen der Reagenzien sind 1 X Taq PCR Puffer, 10 Pmol jedes der vorwärts- und Primer, 12,5 Nmol jedes dNTP, , und 2.5 U der Taq-DNA-Polymerase. Hinweis: Die Forward- und reverse Primer sind wie folgt: 5'-CCACACCTATGGTGTATG-3 "(-68 bis-50 relativ cII start Codon Positionen) und 5'-CCTCTGCCGAAGTTGAGTAT-3" (Positionen +345 zu +365 im Verhältnis zu der cII -Start-Codon), beziehungsweise.</li>
	<li>Verstärken Sie die Vorlage mit den folgenden Parametern Radsport: ein 3 min Denaturierung bei 95 ° C, gefolgt von 30 Zyklen von 30 s bei 95 ° C, 1 min bei 60 ° C und 1 min bei 72 ° C, mit der letzten Erweiterung von 10 min bei 72 ° C.</li>
	<li>Reinigen Sie das 432 bp PCR-Produkt der cII -gen enthalten und flankierenden Regionen mit handelsüblichen PCR-Reinigung-Kits, gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>DNA-Sequenzierung mit einem entsprechenden Sequenzierung Plattform durchführen und analysieren die resultierenden DNA-Sequenzen zur Erkennung von Mutationen in der cII -Transgen (siehe Hinweis unten). Hinweis: Dies wird am besten durch Ausrichtung mit der Referenz- cII -Sequenz mit einer Software, wie die Web-basierte T-Coffee Reihenfolge Ausrichtung Server erreicht. Anweisungen zur Verwendung des Programms finden Sie auf: <a href="http://tcoffee.crg.cat/">http://tcoffee.crg.cat/</a>
</li>
</ol>

Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.

Der λ-Select cII -Test dient zum Nachweis von Mutationen in der cII -Transgen erholt aus genomischer DNA von Zellen aus Organe/Gewebe von BB Nagetiere3. Das Genom dieser transgenen Tiere enthält mehrere Tandem Kopien der chromosomal integrierte λLIZ Shuttle-Vektor, der die cII trägt (294 bp) und LacI (1.080 bp) transgene, als die Mutationszucht Reporter Gene1, 2 , 25</sup...

Eine Vielzahl von transgene Tiermodelle und Mutation-Detection-Systeme wurden zu Testzwecken Mutagenität von Karzinogenen in Säugetierzellen entwickelt. Von diesen sind Transgene Mäuse Big Blue (im folgenden als BB bezeichnet) und λ Select cII Mutation Detection System von dieser Gruppe und viele andere Forschung Gruppen weltweit1,2für Mutagenität Experimente eingesetzt worden, 3,4,5,6,7,8,9. Für den vergangenen 16 Jahren haben wir die mutagenen Wirkungen von verschiedenen chemischen und/oder physikalischen Agents verwenden diese transgenen Tieren untersucht oder ihre entsprechenden embryonalen Fibroblasten Zellkulturen mit einer Testverbindung behandelt und anschließend analysiert die Phänotyp und Genotyp des Transgens cII von λ Select cII Assay und DNA-Sequenzierung, bzw.10,11,12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. das Genom dieser transgenen Tiere enthält einen Bakteriophagen λ Shuttle Vektor (λLIZ) auf Chromosom 4 als ein Multi-Kopie Head-to-Tail Concatemer1,2,25integriert. ΛLIZ Shuttle Vektor enthält zwei mutagenen Reporter Gene, nämlich der LacI und cII transgene1,2,25,26,27, 28,29,30,31,32,33,34,35,36, 37,38,39,40,41,42,43,44,45 , 46 , 47. λ Select cII Assay basiert auf der Wiederherstellung der λLIZ Shuttle-Vektoren aus genomischer DNA von Zellen aus Organe/Gewebe von transgenen Tieren1,2,25 . Die wiederhergestellten λLIZ Shuttle-Vektoren werden dann in λ-Phagen-Köpfe in der Lage, einen Indikator Host Escherichia coliInfektion verpackt. Anschließend werden die infizierten Bakterien unter selektiven Bedingungen zu ermöglichen, Bewertung und Analyse von Mutationen in der cII Transgen1,3angebaut.
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für λ Select cII Assay, bestehend aus der Isolierung der genomischen DNA von den Zellen/Organen der transgenen Tiere behandelt in Vitro/in Vivo mit einem Test Verbindung, Abruf von der λLIZ shuttle-Vektoren aus der genomischen DNA Verpacken der Vektoren in infektiösen λ-Phagen, Infektion des Wirts E. Coli mit Bakteriophagen, Identifikation von cII-Mutanten unter selektiven Bedingungen der cII Mutantenhäufigkeit bestimmen und DNA-Sequenzanalysen, die cII -Mutation-Spektrum zu etablieren. Das Protokoll kann auch auf transgenen Maus/Ratte Zelle Kulturen behandelt in Vitro mit einem chemisch/physikalische Mittel von Interesse oder Gewebe/Organe der entsprechenden Tiere behandelt in Vivo mit dem Test chemische/Agent1, 2,4,48,49,50,51,52. Eine schematische Darstellung des λ-Select cII -Assays ist in Abbildung 1dargestellt.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>MO Bio Laboratories, Inc.</td><td>12112-05</td><td>Bacteriological grade</td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4337455</td><td>None</td></tr><tr><td>Casein Peptone</td><td>Alfa Aesar</td><td>H26557</td><td>None</td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>J. T. Baker</td><td>2124-01</td><td>Powder</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 229-1 / M-13750</td><td>None</td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 9724-500</td><td>None</td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>8104</td><td>50 PCR purification reactions</td></tr><tr><td>Sodium Acetate Trihydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-15756</td><td>None</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Taq5000&lt;/em&gt; DNA Polymerase&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>201207</td><td>None</td></tr><tr><td>Thiamine Hydrochloride</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>2722-57</td><td>None</td></tr><tr><td>Transpack Packaging Extract</td><td>Stratagene Corp., Acquired by BioReliance | Sigma-Aldrich Corp.</td><td>200223</td><td>50 packaging reactions</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 152-1 / EC 201-064-4</td><td>None</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Biosciences</td><td>RC-110</td><td>None</td></tr></tbody></table>

the lambda select cii mutation detection system

Eine Reihe von transgene Tiermodelle und Mutation-Detection-Systeme wurden zu Testzwecken Mutagenität von Karzinogenen in Säugetierzellen entwickelt. Von diesen sind Transgene Mäuse und Lambda (λ) Select cII Mutation Detection System für Mutagenität Experimente von vielen Forschergruppen weltweit eingesetzt worden. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Lambda wählen Sie cII Mutation Assay, die kultivierten Zellen von transgenen Mäusen/Ratten angewendet werden können oder die entsprechenden Tiere behandelt mit einem chemisch/physikalische Mittel von Interesse. Das Protokoll besteht aus den folgenden Schritten: (1) Isolierung genomischer DNA aus den Zellen oder Organe/Gewebe von transgenen Tieren behandelt in Vitro oder in Vivo, jeweils mit einer Testverbindung; (2) Wiederherstellung des Lambda-Shuttle Vektors mit mutagenen Reportergen (d.h. cII Transgen) aus genomischer DNA; (3) Verpackung der geretteten Vektoren in infektiösen Bakteriophagen; (4) ein Host-Bakterium infizieren und Kultivierung unter selektiven Bedingungen zur Vermehrung der induzierten cII Mutationen erlauben; und (5) Bewertung der cII-Mutanten und DNA-Sequenz-Analyse zur Ermittlung der Mutantenhäufigkeit cII und Mutation Spektrum bzw..

Je nach Verteilung der Daten werden parametrische oder nicht-parametrische Tests verwendet, um die Bedeutung der Unterschied in der Mutantenhäufigkeit cII zwischen Behandlung und Kontrollgruppen (d. h.im Vergleich zu spontanen mutierten Frequenzen induziert) bestimmen . Vergleich der induzierten cII mutierten Frequenzen in ganz verschiedenen Behandlungsgruppen erfolgt durch verschiedene (paarweise) statistische Tests, soweit anwendbar. Hypergeometrische Test vo...

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The Lambda Select cII Mutation Detection System

Die Lambda wählen Sie cII Mutation-Detection-System

Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll für Lambda wählen Sie cII Mutation Assay in kultivierten Zellen von transgenen Nagetiere oder die entsprechenden Tiere behandelt mit einem chemisch/physikalische Mittel von Interesse. Dieser Ansatz hat verbreitet zu Testzwecken Mutagenität von Karzinogenen in Säugetierzellen.

A number of transgenic animal models and mutation detection systems have been developed for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells. Of ...

the-lambda-select-cii-mutation-detection-system

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Lambda Select cII Mutation Detection System

7.8K Aufrufe.  University of Southern California. Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll für Lambda wählen Sie cII Mutation Assay in kultivierten Zellen von transgenen Nagetiere oder die entsprechenden Tiere behandelt mit einem chemisch/physikalische Mittel von Interesse. Dieser Ansatz hat verbreitet zu Testzwecken Mutagenität von Karzinogenen in Säugetierzellen.

Serie: The Lambda Select cII Mutation Detection System

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging resistance mutations during therapy, or when patients have few circulating tumor cells. Wild-type blocking PCR followed by sequencing analysis offers high sensitivity, flexibility, and simplicity as a methodology for detecting these low frequency mutations. By adding a custom designed locked nucleic acid oligonucleotide to a new or previously established conventional PCR based sequencing assay, sensitivities of approximately 1 mutant allele in a background of 1,000 WT alleles can be achieved (1:1,000). Sequencing artifacts associated with deamination events commonly found in formalin fixed paraffin embedded tissues can be partially remedied by the use of uracil DNA glycosylase during extraction steps. The optimized protocol here is specific for detecting MYD88 mutation, but can serve as a template to design any WTB-PCR assay. Advantages of the WTB-PCR assay over other commonly utilized assays for the detection of low frequency mutations including allele specific PCR and real-time quantitative PCR include fewer occurrences of false positives, greater flexibility and ease of implementation, and the ability to detect both known and unknown mutations.

Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

Wildtyp-Blockierung PCR mit direkter Sequenzierung als hochempfindliche Methode Kombiniert zum Nachweis von Low-Frequency somatischer Mutationen

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Forschung

Genetik

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. However, the application of this method is challenging due to its low sensitivity in analyzing the trace amount of ctDNA in the blood. Furthermore, the method may generate false positive and negative results from this sequencing and subsequent analysis. To improve the feasibility and reliability of ctDNA detection in the clinic, here we present a technique which enriches rare mutations for sequencing, Enrich Rare Mutation Sequencing (ER-Seq). ER-Seq can distinguish a single mutation out of 1 x 107 wild-type nucleotides, which makes it a promising tool to detect extremely low frequency genetic alterations and thus will be very useful in studying disease heterogenicity. By virtue of the unique sequencing adapter&#39;s ligation, this method enables an efficient recovery of ctDNA molecules, while at the same time correcting for errors bidirectionally (sense and antisense). Our selection of 1021 kb probes enriches the measurement of target regions that cover over 95% of the tumor-related driver mutations in 12 tumors. This cost-effective and universal method enables a uniquely successful accumulation of genetic data. After efficiently filtering out background error, ER-seq can precisely detect rare mutations. Using a case study, we present a detailed protocol demonstrating probe design, library construction, and target DNA capture methodologies, while also including the data analysis workflow. The process to carry out this method typically takes 1-2 days.

This manuscript describes a technique for detecting mutations of low frequency in ctDNA, ER-Seq. This method is differentiated by its unique use of two-directional error correction, a special background filter, and efficient molecular acquirement.

Nachweis von seltenen Mutationen im CtDNA mit Next Generation Sequencing

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

Krebsforschung

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

Seltenes Ereigniserkennung mit Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation into thousands of nano-sized water-in-oil individual reactions. Recently, ddPCR has become one of the most accurate and sensitive tools for circulating tumor DNA (ctDNA) detection. One of the major limitations of the standard ddPCR technique is the restricted number of mutations that can be screened per reaction, as specific hydrolysis probes recognizing each possible allelic version are required. An alternative methodology, the drop-off ddPCR, increases throughput, since it requires only a single pair of probes to detect and quantify potentially all genetic alterations in the targeted region. Drop-off ddPCR displays comparable sensitivity to conventional ddPCR assays with the advantage of detecting a greater number of mutations in a single reaction. It is cost-effective, conserves precious sample material, and can also be used as a discovery tool when mutations are not known a priori.

Here, we present a protocol to accurately quantify multiple genetic alterations of a target region in a single reaction using drop-off ddPCR and a unique pair of hydrolysis probes.

Einzelne Tropfen digitale Polymerase-Kettenreaktion für umfassende und gleichzeitigen Nachweis von Mutationen im Hotspot-Regionen

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these epigenetic marks is accomplished by sequential oxidation by ten-eleven translocation dioxygenases (TET1-3), followed by the thymine-DNA glycosylase-dependent base excision repair. Inactivation of the TET2 gene due to genetic mutations or by other epigenetic mechanisms is associated with a poor prognosis in patients with diverse cancers, especially hematopoietic malignancies. Here, we describe an efficient single step purification of enzymatically active untagged human TET2 dioxygenase using cation exchange chromatography. We further provide a liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) approach that can separate and quantify the four normal DNA bases (A, T, G, and C), as well as the four modified cytosine bases (5-methyl, 5-hydroxymethyl, 5-formyl, and 5-carboxyl). This assay can be used to evaluate the activity of wild type and mutant TET2 dioxygenases.

Here, we present a protocol for an efficient single step purification of the active untagged human ten-eleven translocation-2 (TET2) 5-methylcytosine dioxygenase using ion-exchange chromatography and its assay using a liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)-based approach.

Effiziente Reinigung und LC-MS/MS-basierten Assay-Entwicklung für zehn-elf Translokation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

Biochemie

qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a polymorphic cluster of genes on chromosome 19. Their best-characterized ligands are the human leukocyte antigen (HLA) molecules that are encoded within the major histocompatibility complex (MHC) locus on chromosome 6. There is substantial evidence that they play a significant role in immunity, reproduction, and transplantation, making it crucial to have techniques that can accurately genotype them. However, high-sequence homology, as well as allelic and copy number variation, make it difficult to design methods that can accurately and efficiently genotype all KIR genes. Traditional methods are usually limited in the resolution of data obtained, throughput, cost-effectiveness, and the time taken for setting up and running the experiments. We describe a method called quantitative KIR semi-automated typing (qKAT), which is a high-throughput multiplex real-time polymerase chain reaction method that can determine the gene copy numbers for all genes in the KIR locus. qKAT is a simple high-throughput method that can provide high-resolution KIR copy number data, which can be further used to infer the variations in the structurally polymorphic haplotypes that encompass them. This copy number and haplotype data can be beneficial for studies on large-scale disease associations, population genetics, as well as investigations on expression and functional interactions between KIR and HLA.

Quantitative killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) semi-automated typing (qKAT) is a simple, high-throughput, and cost-effective method to copy number type KIR genes for their application in population and disease association studies.

qKAT: Quantitative Flugbuchungssystem Typisierung von Killer-Zelle Immunoglobulin-Like-Rezeptor-Gene

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem cells are responsible for ensuring tissue homeostasis and repair throughout life, it is reasonable to hypothesize that the stem cell population is critical for preserving genomic integrity of tissues. Therefore, significant interest has arisen in assessing the impact of endogenous and environmental factors on genomic integrity in stem cells and their progeny, aiming to understand the etiology of stem-cell based diseases.
LacI transgenic mice carry a recoverable &#955;&#160;phage vector encoding the LacI reporter system, in which the LacI gene serves as the mutation reporter. The result of a mutated LacI gene is the production of &#946;-galactosidase that cleaves a chromogenic substrate, turning it blue. The LacI reporter system is carried in all cells, including stem/progenitor cells and can easily be recovered and used to subsequently infect E. coli. After incubating infected E. coli on agarose that contains the correct substrate, plaques can be scored; blue plaques indicate a mutant LacI gene, while clear plaques harbor wild-type. The frequency of blue (among clear) plaques indicates the mutant frequency in the original cell population the DNA was extracted from. Sequencing the mutant LacI gene will show the location of the mutations in the gene and the type of mutation.
The LacI transgenic mouse model is well-established as an in vivo mutagenesis assay. Moreover, the mice and the reagents for the assay are commercially available. Here we describe in detail how this model can be adapted to measure the frequency of spontaneously occurring DNA mutants in stem cell-enriched Lin-IL7R-Sca-1+cKit++(LSK) cells and other subpopulations of the hematopoietic system.

Here we describe an in vivo mutagenesis assay for small numbers of purified hematopoietic cells using the LacI transgenic mouse model.&#160;The LacI gene can be isolated to determine the frequency, location, and type of DNA mutants&#160;spontaneously arisen or after exposure to genotoxins.

Identifizierung von DNA-Mutationen in hämatopoetischen Stammzellen Gereinigtes / Vorläuferzellen

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Immunologie und Infektion

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi) holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable cancer cell vulnerabilities. Limiting the potential of this technology is the inability to rapidly delineate the mechanistic basis of phenotypic outcomes and thus inform the development of molecularly targeted therapeutic strategies. We outline here methods to deconstruct cellular phenotypes induced by RNAi-mediated gene targeting using multiplexed reporter systems that allow monitoring of key cancer cell-associated processes. This high-content screening methodology is versatile and can be readily adapted for the screening of other types of large molecular libraries.

Achieving a systems level understanding of cellular processes is a goal of modern-day cell biology. We describe here strategies for multiplexing luciferase reporters of various cellular function end-points to interrogate gene function using genome-scale RNAi libraries.

Ein Multiplex-Luciferase-basierte Screening-Plattform zur Abfrage Krebs-assoziierte Signaltransduktion in kultivierten Zellen

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

Medizin

Naked-Eye Detection of Rare Point Mutations in DNA

The protocol describes a naked-eye colorimetric test for the detection of somatic point mutations in an excess of wild type DNA. The future foreseen application of the method is the identification of rare mutations in circulating cell-free DNA from liquid biopsies, with a relevance in cancer diagnostics and stratification of oncological patients for personalized therapy. As a proof of concept, the test has been designed to detect the BRAFV600E mutation in the BRAF gene, which is important to identify the sub-group of melanoma patients that can benefit from targeted therapies with BRAF inhibitors. However, this colorimetric test can be easily generalized to other somatic mutations of clinical relevance due to the use of universal detection probes, thus providing strong potential in oncological diagnostics.
The test detects 0.5% of BRAFV600E in an excess of BRAFWT DNA, which matches the sensitivity of some commercial instrumental assays. Such sensitivity is clinically relevant for diagnostic purposes, allowing the early identification of drug-sensitive patients. In contrast to commercial assays based on real-time PCR, this test requires minimal instrumentation and processing, as it can be performed on DNA amplified with a standard PCR (or isothermal techniques) and provides a naked-eye readout with a one-tube reaction of a few steps in only one hour. At present, the test has been used only on synthetic DNA samples. However, the latter have been designed to mimic a real sample amplified from circulating cell-free DNA, to favor the translation of the test to clinical diagnostics.

This protocol permits the naked-eye identification of point mutated DNA in a 200-fold excess of wild type DNA molecules, by exploiting gold nanoparticles and paramagnetic microparticles.

The protocol describes a naked-eye colorimetric test for the detection of somatic point mutations in an excess of wild type DNA. The future foreseen ...