Wir würden gerne die Beiträge aller Kollegen und Mitarbeiter zu unserer ursprünglichen Studien, deren Ergebnisse in diesem Manuskript (zur Veranschaulichung) erwähnten anerkennen. Arbeit der Autoren wird unterstützt durch Zuschüsse aus dem nationalen Institut für zahnärztliche und Craniofacial Forschung von den National Institutes of Health (1R01DE026043), AB und an der University of California Tobacco-Related Krankheit Forschungsprogramm, das AB ( TRDRP-26IR-0015) und ST (TRDRP-25IP-0001). Die Sponsoren der Studie hatte keine Rolle im Studiendesign, Datenerhebung, Datenanalyse, Datenauswertung, Schreiben des Berichts oder in der Entscheidung zur Veröffentlichung einreichen.

1. genomischer DNA-Isolierung aus embryonalen Fibroblasten der Maus
Hinweis: Primäre Maustaste embryonalen Fibroblasten sind nach den veröffentlichten Protokoll53von Embryonen abgeleitet von BB transgenen Mäusen C57BL/6 genetischen hintergrund isoliert. Das Ausgangsmaterial für dieses Protokoll besteht aus 1 x 106 bis 1 x 107 embryonalen fibroblastenzellen mit einem Test zusammengesetzte versus Kontrolle behandelt. Die Ernte und die Zählung der diese Zellen unter Verwendung von standard-Methoden werden in Referenzen10,54,55beschrieben.
<ol><li>Bereiten Sie eine (0,3 M Saccharose 60 mM KCl, 15 mM NaCl, 60 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0,5 mM Spermidine, Spermin 0,15 mM und 2 mM EDTA)-Puffer, Puffer B (150 mM NaCl und 5 mM EDTA, pH 7,8) und C (20 mM Tris-HCl, pH 8,0-Puffer 20 mM NaCl, 20 mM EDTA und 1 % SDS) im voraus und erhalten bei Raumtemperatur (RT) für bis zu einem Jahr54,55.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie Zellen in 2 – 4 mL Puffer, die A in einem 15 mL konische Zentrifugenröhrchen durch pipettieren immer wieder nach oben und unten mit einem breiten 1.000 µL PIPETTENSPITZE trug.</li>
	<li>Fügen Sie ein Volumen (2 – 4 mL) Puffer A mit 1 % Octylphenoxypolyethoxyethanol (z.B.Nonidet P40) mit einer serologischen Glaspipette.</li>
	<li>Inkubieren Sie das Rohr für 5 min auf Eis.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Rohr auf 1.000 X g für 5 min bei RT</li>
	<li>Den überstand verwerfen und das Pellet mit 10 – 15 mL Puffer A mit einer Glaspipette serologische waschen.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie das Pellet in 2 – 4 mL Puffer B.</li>
	<li>Fügen Sie ein Volumen (2 – 4 mL) Puffer C enthält 600 µg/mL Proteinase K.</li>
	<li>Inkubieren Sie das Rohr für 3 h bei 37 ° c</li>
	<li>Hinzu kommt eine Endkonzentration von 100 µg/mL RNase A.</li>
	<li>Inkubieren Sie das Rohr für weitere 1 h bei 37 ° c</li>
	<li>Fügen Sie ein Volumen (2 – 4 mL) Phenol (durchtränkt von 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0):chloroform:isoamyl Alkohol (25:24:1 Vol/Vol). Hinweis: Phenol kann schwere gesundheitliche Gefahren und muss mit äußerster Vorsicht behandelt werden. Phenol ist hoch ätzend auf die Haut und durch es bereitwillig aufgenommen und weist andere Effekte. Beim Umgang mit Phenol, immer verwenden Sie doppelte gloving, Schutzbrille aufsetzen, und in einem chemischen Abzug arbeiten.</li>
	<li>Mischen Sie gut durch Umkehrung der Röhre für 5 min auf ein Rohr Rotator bei 4 ° c</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Rohr auf 1.000 X g für 5 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Die wässrige Phase (oberste Schicht) zu einem neuen Schlauch mit einer Glaspipette serologische zu entfernen.</li>
	<li>Wiederholen Sie Phenol: Chloroform: Isoamyl-Alkohol-Extraktion 1 bis 3 Mal, bis die wässrige Phase klar ist und das Interface nicht mehr trüben ist.</li>
	<li>Fügen Sie 1/10 Volumen (200 – 400 µL) 3M Natriumacetat, pH 5.2.</li>
	<li>Fügen Sie 2,5 Volumen (5 – 10 mL) 100 % Ethanol (gekühlt) und invertieren Sie die Röhre vorsichtig von Hand für 2 – 3 min..</li>
	<li>Die DNA mit einem Glas Haken Spool und überträgt es auf ein neues Röhrchen mit 1 – 5 mL 70 % Ethanol und gründlich waschen. Zentrifugieren Sie alternativ das Rohr mit hoher Geschwindigkeit (3.500 X g) bei 4 ° C, pellet-DNA und waschen sie gründlich mit 1 – 5 mL 70 % Ethanol.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Rohr mit hoher Geschwindigkeit (3.500 X g) bei RT, entfernen Sie den überstand zu und trocknen Sie die DNA für 10-15 Minuten an der Luft.</li>
	<li>Auflösen der DNS in 10-100 µL TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5), und bei 4 ° C (für kurze Lagerung von bis zu einem Monat) oder bei-20 ° C (für längere Lagerzeit) zu speichern. Die optimale Konzentration für DNA für die λ-Select cII -Assay ist 0,5-1,0 µg/µL (in TE-Puffer)56.</li>
</ol>2. in-vitro- Verpackung-Reaktion
<ol><li>Pro eine Verpackung Reaktion hinzufügen ~ 5 µg genomische DNA (Endvolumen: 8 – 12 µL, genomische DNA wurde in Abschnitt 1 von Maus embryonalen Fibroblasten behandelt in Vitro mit einer Testverbindung oder Steuerelement isoliert) zu einem Microcentrifuge Schlauch, enthält das erste Reaktion Mischung (~ 10 µL). Hinweis: Im Haus vorbereitet oder handelsüblichen λ Verpackung Extrakte werden in verschiedenen Labors verwendet. In der kommerziellen Verpackung Extrakt Kit verwendet hier56 (siehe die Tabelle der Materialien), Rote Rohre enthalten die erste Reaktion Mischung (~ 10 µL) und blaue Rohre enthalten die zweite Reaktion Mischung (~ 70 µL für mindestens 5 Reaktionen).</li>
	<li>Inkubieren Sie das Rohr für 90 min. bei 30 ° c</li>
	<li>Das Rohr das erforderliche Volumen (~ 12 µL) der zweite Reaktion Mischung hinzufügen.</li>
	<li>Inkubieren Sie das Rohr für eine zusätzliche 90 min. bei 30 ° c</li>
	<li>
Das Rohr 1,1 mL SM-Puffer hinzufügen. Hinweis: 1 mL dieser Lösung (z.B. Verpackung Reaktionsgemisch) wird verwendet, für das screening von λ cII-Mutanten. Der Rest wird für verschoben verwendet werden.<ol>
<li>Vorbereitung SM-Puffer durch das Mischen von 5,8 g NaCl, 2,0 g MgSO4.7H2O, 50 mL 1 M Tris-HCl (pH 7,5) und 5 mL 2 % (w/V) Gelatine. DH2O zu einem Endvolumen von 1 Liter, Autoklaven für 30 min. bei Raumtemperatur bis zu 1 Jahr Store hinzufügen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wirbel der Röhre mit der verpackte DNA-Probe für 10 s bei RT (kräftig aufschütteln).</li>
	<li>Pulse spin das Rohr in eine Microcentrifuge und speichern auf Eis bis zum Gebrauch. Wenn die Probe nicht am selben Tag der Verpackung verwendet werden soll, fügen Sie 50 µL Chloroform pro mL verpackte DNA-Probe, Wirbel sanft, und bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen aufbewahren.</li>
</ol>3. Vorbereitung der E. Coli G1250 Bakterienkultur
<ol><li>
Machen Sie mindestens zwei Tage vor der Beschichtung, ein paar bakterielle Streifen Teller von Escherichia coli (E. Coli) G1250 auf Agarplatten TB1-Kanamycin.
	<ol>
<li>TB1-Kanamycin Agarplatten wie folgt vorbereiten. Mischen Sie 5,0 g NaCl, 10,0 g Casein Pepton und 12,0 g Agar. 800 mL dH2O. Add 1 mL 0,1 % Thiamin Hydrochlorid hinzufügen. Stellen Sie pH 7.0 mit NaOH oder HCl. Add dH2O zu einem Endvolumen von 1 Liter.</li>
		<li>Mischen Sie gut und Autoklaven für 30 min. zulassen auf 55 ° c abkühlen 50,0 mg Kanamycin und verrühren. Gießen Sie in sterile Petrischalen 100 mm (20 – 25 mL pro Gericht). Shop-Platten bei 4 ° C für bis zu zwei Wochen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubieren Sie die bakterielle Streifen Platten in einem stationären 30 ° C Inkubator für mindestens 24 h.</li>
	<li>
Kombinieren Sie einen Tag vor der Beschichtung, 10 mL des flüssigen Mediums TB1 mit 100 µL 20 % (w/V) Maltose-1 M MgSO4 Lösung in einem sterilen 50 mL Schraubverschluss konische Rohr.
	<ol>
<li>TB1 flüssiges Medium wie folgt vorbereiten. Mix-5,0 g NaCl und 10,0 g Casein Pepton, dann 800 mL dH2O, 1 mL 0,1 % Thiamin Hydrochlorid, hinzufügen und anpassen den pH-Wert 7,0 mit NaOH oder HCl. Dann dH2O zu einem Endvolumen von 1 Liter hinzufügen, gut mischen und Autoklaven für 30 min. speichern das Medium bei RT für bis zu drei Monaten.</li>
		<li>20 % (w/V) Maltose-1 M MgSO4 wie folgt vorbereiten. Mischen Sie 20,0 g Maltose und 24,6 g MgSO4. 7H2O, dann fügen Sie dH2O zu einem Endvolumen von 100 mL. Filter zu sterilisieren und bei 4 ° C für bis zu 6 Monate zu speichern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Das flüssige Medium mit mehrere Kolonien von der bakteriellen Streifen-Platte mit einem sterilen Impfkeimen Schleife56zu impfen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Flüssigkultur über Nacht in einem 30 ° C schütteln Inkubator mit kräftig schütteln (250 – 300 u/min).</li>
	<li>Am Tag der Beschichtung Zentrifugieren der konischen Röhrchen mit der G1250 Flüssigkultur 1.500 x g für 10 min bei RT zu die Bakterienzellen Pellets.</li>
	<li>Den überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 10 mL 10 mM MgSO4.</li>
	<li>Messen Sie die Absorption von einem 01:10 Verdünnung der Zellsuspension bei Wellenlänge 600 nm mit einem UV-Vis Spektralphotometer (z.B., 100 µL Zellsuspension + 900 µL 10 mM MgSO4)56.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Zellsuspension auf eine endgültige OD600 von 0,5 mit 10 mM MgSO4. Die vorbereiteten Aussetzung der G1250 E. Coli mit OD600 = 0,5 wird als "G1250 Beschichtung Kultur" bezeichnet.</li>
	<li>Speichern der G1250 Beschichtung Kultur auf Eis und innerhalb von 1-2 h verwenden.</li>
</ol>(4) Beschichtung die verpackte DNA-Proben
<ol><li>
Je eine verpackte DNA-Probe bereiten Sie sechzehn steril 14 x 100 mm2 Rundboden Röhrchen und sechzehn TB1 Agarplatten vor. Zehn aus jedem Satz wird für Screening und sechs für verschoben (drei für Titer 20) und drei für Titer 100 verwendet werden.
	<ol>
<li>TB1 Agarplatten wie folgt vorbereiten. Mix-5,0 g NaCl, 10,0 g Casein Pepton und 12,0 g Agar, fügen dann 800 mL dH2O und 1 mL 0,1 % Thiamin Hydrochlorid. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 mit NaOH oder HCl, und fügen Sie dH2O zu einem Endvolumen von 1 L.</li>
		<li>Gut mischen und Autoklaven für 30 min. lassen Sie die Mischung auf 55 ° C abkühlen lassen, dann Gießen sie in sterile 100 mm Petrischalen (20 – 25 mL pro Gericht). Speichern Sie die Platten bei 4 ° C für bis zu zwei Wochen. Hinweis: TB1 Agarplatten sollte mindestens 24 Stunden vor Gebrauch vorbereitet werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aliquoten 200 µL der G1250 Beschichtung Kultur in jedem Rundboden Röhrchen.</li>
	<li>
Für verschoben, machen eine 1: 100 Verdünnung der verpackten DNA Probe und mischen Sie gut durch Vortexen (d.h., 10 µL verpackt DNA-Probe + 990 µL SM-Puffer).</li>
	<li>20 µL der 1: 100 Verdünnung hinzu kommt jedes der drei Titer 20 Rohre.</li>
	<li>Fügen Sie jedes der drei Titer 100 Rohre 100 µL der Verdünnung 1: 100 hinzu.</li>
	<li>
Für das Screening, fügen 100 µL der "unverdünnt" verpackte DNA-Probe zu jedem der zehn Screening-Röhren.</li>
	<li>Verarbeiten alle verschoben und Screening-Röhren (2 x 3 + 10 = 16 Rohre), wie folgt: Mischen Sie gut durch Vortexen für ca. 10 s, und dann bei Raumtemperatur für 30 min zu den Host E. Coli zu adsorbieren, die Phagen ermöglichen inkubieren.</li>
	<li>
2,5 mL Mikrowelle geschmolzenen TB1 top Agar (abgekühlt auf 55 ° C) zu jeder Titer oder screening-Rohr, mischen sofort durch Vortexen (sanft), hinzufügen und Gießen in die entsprechenden Titer oder screening TB1 Agarplatten.
	<ol>
<li>TB1 obere Agar wie folgt vorbereiten. Mix-5,0 g NaCl, 10,0 g Casein Pepton und 7,0 g Agar, dann 800 mL dH2O. Add 1 mL 0,1 % Thiamin Hydrochlorid, dann stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 mit NaOH oder HCl. Zu guter Letzt fügen Sie dH2O zu einem Endvolumen von 1 Liter.</li>
		<li>Mischen Sie gut und Autoklaven für 20 – 25 min. Store bei Raumtemperatur für bis zu drei Monaten.</li>
		<li>Vor dem Einsatz bereite TB1 obere Agar in der Mikrowelle schmelzen, gut mischen und auf 55 ° C im Wasserbad abkühlen lassen. Hinweis: Die geschmolzene und abgekühlte TB1-Spitze wird hinzugefügt, um den Inhalt der einzelnen Titer oder Screening-Rohr und nach dem Mischen, in die entsprechenden Titer oder Screening TB1 Agarplatten gegossen wird.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lassen Sie die Platten stehen für 15-30 min bei Raumtemperatur, bei geschlossenem Deckel einen Spalt offen, um Kondensation zu verhindern.</li>
	<li>Invertieren die Platten und die zehn Screening-Platten in einem Inkubator stationäre 24 ° C und 46 – 48 h (d.h., selektiven Bedingungen) und die sechs Titer-Platten in einem Inkubator stationäre 37 ° C inkubieren und inkubieren 24 h/Übernachtung (d. h., nicht-selektiven Bedingungen). Hinweis: Für Qualitätssicherung und Standardisierung der Ergebnisse, sind handelsübliche Phagen Steuerungslösungen mit einer Mischung aus Wildtyp und Mutanten cII mit bekannten Mutantenhäufigkeit vernickelt neben die verpackten DNA-Proben und in allen Zimmern Test läuft56.</li>
</ol>5. Prüfung der Titer und Screening-Platten um die cII Mutant Frequenz zu bestimmen
<ol><li>Im Anschluss an die 24 h/Übernachtung Inkubation bei 37 ° C Count die Anzahl der Plaketten in jeder der drei Titer 20 Platten und Titer 100 Platten gebildet. Um die Plaketten leichter identifizieren zu können, halten Sie die Platte neben einem weißen Lichtkasten und vor einem dunklen Hintergrund mit Deckel entfernen (siehe Abbildung 2).</li>
	<li>Stellen ein Durchschnitt (Mittelwert) der Zahl der Plaketten in jedem Satz der Titer 20 und Titer 100 Platten gezählt (dreifacher, jeweils).</li>
	<li>Wählen Sie die durchschnittliche Zahl aus der Menge der Titer-Platten, die am nächsten an die Reichweite von 50 – 200 Plaques pro Platte Satz fällt.</li>
	<li>Die Gesamtzahl der Plaketten gezeigt in den zehn Screening-Platten wie folgt zu berechnen: Total abgeschirmte Plaketten (mittlere Anzahl von Plaques in den gewählten Titer Platten ÷ Anzahl der µL Verdünnung pro gewählten Titer Platte verwendet) = x Verdünnungsfaktor x Anzahl der µL verpackte DNA-Probe pro Platte [100 µL/Platte] screening x Anzahl der screening-Platten [10]. Hinweis: zum Beispiel wird wenn die mittlere Anzahl von Plaques pro Platte in den Titer 20 Platten 128 ist und die entsprechende Zahl in der Menge der Titer 100 Platten 478, die Zahl 128 für die Berechnung der Gesamtzahl von Plaques gezeigt verwendet werden , wie folgt: (128 ÷ 20) X 100 [Verdünnungsfaktor] x 100 [µL/Platte] X 10 [Platten] = 640.000 Dies entspricht die mittlere Anzahl von Plaques mit 5.000 oder 1.000, multiplizieren, wenn die durchschnittliche Anzahl bzw. auf Grafen aus Titer 20 Platten oder Titer 100 Platten, basiert.</li>
	<li>Nach 46 – 48 h Inkubation bei 24 ° C die insgesamt Anzahl von Plaques in den zehn Screening-Platten (folgen Sie den Anweisungen in Abschnitt 5.1) gebildet. Hinweis: Die cII Mutantenhäufigkeit errechnet sich durch Division der Gesamtzahl von Plaques in den Screening-Platten gebildet durch die Gesamtzahl der Plaques gezeigt. Mit dem obigen Beispiel, wenn die Gesamtzahl von Plaques in den zehn Screening-Platten gezählt ist die 112, die cII Mutantenhäufigkeit für diese DNA-Probe wäre 112 ÷ 640.000 = 17,5 x 10-5.</li>
</ol>6. Überprüfung der Putative λ cII Mutanten, PCR-Amplifikation und DNA-Sequenzierung
<ol><li>Die Plakette in Frage mit einer sterilen, weite Bohrung pipettieren Spitze entkernen und in einen sterilen Microcentrifuge Schlauch mit 500 µL steriler SM-Puffer (durch pipettieren rauf und runter) zu vertreiben.</li>
	<li>Mindestens 2 h bei Raumtemperatur inkubieren Sie, oder stecken Sie bei 4 ° C über Nacht, erlauben die Phagen-Teilchen aus dem Agar eluieren.</li>
	<li>In einem sterilen 14 x 100 mm2 Rundboden Röhrchen 200 µL der G1250 Beschichtung Kultur mit 1 µL der entkernt Phagen-Lösung mischen und 30 min bei RT inkubieren</li>
	<li>Die Probe mit 2,5 mL 55 ° C geschmolzene TB1 obere Agar-Platte und inkubieren Sie die Platte bei 24 ° C 46 – 48 h (selektiven Bedingungen), wie in Abschnitte 4.8 – 4.10 beschrieben.</li>
	<li>Nach den sekundären Plaques gebildet haben, mithilfe eine PIPETTENSPITZE wählen Sie sorgfältig einen einzigen gut isolierten verifizierten λ cII-mutierten Plaque (berühren der unteren Agar). Hinweis: Die vermeintliche cII mutierten Plaques Replating dient zwei Zwecken: (i) Beschichtung Artefakte kann manchmal kleine Plaketten; verwechselt werden und (Ii) eine Agarose-Kern entnommen einer Screening-Platte kann nicht mutierte Phage(s) zusammen mit einem mutierten Phagen enthalten. Sekundäre Plaketten von geringer Dichte replating bieten eine unberührte mutierte Vorlage für PCR und anschließende DNA-Sequenzanalyse.</li>
	<li>Übertragen Sie die Plakette zu einem Microcentrifuge Schlauch mit 25 µL bidestilliertem Wasser von oben und unten pipettieren.</li>
	<li>Platzieren Sie das Rohr in kochendem Wasser für 5 Minuten.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie mit maximaler Geschwindigkeit (18.000 X g) für 3 Minuten bei RT</li>
	<li>Übertragen Sie 10 µL des Überstands sofort zu einem neuen Microcentrifuge Schlauch mit 40 µL einer PCR Mastermix, in denen die Endkonzentrationen der Reagenzien sind 1 X Taq PCR Puffer, 10 Pmol jedes der vorwärts- und Primer, 12,5 Nmol jedes dNTP, , und 2.5 U der Taq-DNA-Polymerase. Hinweis: Die Forward- und reverse Primer sind wie folgt: 5'-CCACACCTATGGTGTATG-3 "(-68 bis-50 relativ cII start Codon Positionen) und 5'-CCTCTGCCGAAGTTGAGTAT-3" (Positionen +345 zu +365 im Verhältnis zu der cII -Start-Codon), beziehungsweise.</li>
	<li>Verstärken Sie die Vorlage mit den folgenden Parametern Radsport: ein 3 min Denaturierung bei 95 ° C, gefolgt von 30 Zyklen von 30 s bei 95 ° C, 1 min bei 60 ° C und 1 min bei 72 ° C, mit der letzten Erweiterung von 10 min bei 72 ° C.</li>
	<li>Reinigen Sie das 432 bp PCR-Produkt der cII -gen enthalten und flankierenden Regionen mit handelsüblichen PCR-Reinigung-Kits, gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>DNA-Sequenzierung mit einem entsprechenden Sequenzierung Plattform durchführen und analysieren die resultierenden DNA-Sequenzen zur Erkennung von Mutationen in der cII -Transgen (siehe Hinweis unten). Hinweis: Dies wird am besten durch Ausrichtung mit der Referenz- cII -Sequenz mit einer Software, wie die Web-basierte T-Coffee Reihenfolge Ausrichtung Server erreicht. Anweisungen zur Verwendung des Programms finden Sie auf: <a href="http://tcoffee.crg.cat/">http://tcoffee.crg.cat/</a>
</li>
</ol>

Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.

Der λ-Select cII -Test dient zum Nachweis von Mutationen in der cII -Transgen erholt aus genomischer DNA von Zellen aus Organe/Gewebe von BB Nagetiere3. Das Genom dieser transgenen Tiere enthält mehrere Tandem Kopien der chromosomal integrierte λLIZ Shuttle-Vektor, der die cII trägt (294 bp) und LacI (1.080 bp) transgene, als die Mutationszucht Reporter Gene1, 2 , 25</sup...

Eine Vielzahl von transgene Tiermodelle und Mutation-Detection-Systeme wurden zu Testzwecken Mutagenität von Karzinogenen in Säugetierzellen entwickelt. Von diesen sind Transgene Mäuse Big Blue (im folgenden als BB bezeichnet) und λ Select cII Mutation Detection System von dieser Gruppe und viele andere Forschung Gruppen weltweit1,2für Mutagenität Experimente eingesetzt worden, 3,4,5,6,7,8,9. Für den vergangenen 16 Jahren haben wir die mutagenen Wirkungen von verschiedenen chemischen und/oder physikalischen Agents verwenden diese transgenen Tieren untersucht oder ihre entsprechenden embryonalen Fibroblasten Zellkulturen mit einer Testverbindung behandelt und anschließend analysiert die Phänotyp und Genotyp des Transgens cII von λ Select cII Assay und DNA-Sequenzierung, bzw.10,11,12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. das Genom dieser transgenen Tiere enthält einen Bakteriophagen λ Shuttle Vektor (λLIZ) auf Chromosom 4 als ein Multi-Kopie Head-to-Tail Concatemer1,2,25integriert. ΛLIZ Shuttle Vektor enthält zwei mutagenen Reporter Gene, nämlich der LacI und cII transgene1,2,25,26,27, 28,29,30,31,32,33,34,35,36, 37,38,39,40,41,42,43,44,45 , 46 , 47. λ Select cII Assay basiert auf der Wiederherstellung der λLIZ Shuttle-Vektoren aus genomischer DNA von Zellen aus Organe/Gewebe von transgenen Tieren1,2,25 . Die wiederhergestellten λLIZ Shuttle-Vektoren werden dann in λ-Phagen-Köpfe in der Lage, einen Indikator Host Escherichia coliInfektion verpackt. Anschließend werden die infizierten Bakterien unter selektiven Bedingungen zu ermöglichen, Bewertung und Analyse von Mutationen in der cII Transgen1,3angebaut.
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für λ Select cII Assay, bestehend aus der Isolierung der genomischen DNA von den Zellen/Organen der transgenen Tiere behandelt in Vitro/in Vivo mit einem Test Verbindung, Abruf von der λLIZ shuttle-Vektoren aus der genomischen DNA Verpacken der Vektoren in infektiösen λ-Phagen, Infektion des Wirts E. Coli mit Bakteriophagen, Identifikation von cII-Mutanten unter selektiven Bedingungen der cII Mutantenhäufigkeit bestimmen und DNA-Sequenzanalysen, die cII -Mutation-Spektrum zu etablieren. Das Protokoll kann auch auf transgenen Maus/Ratte Zelle Kulturen behandelt in Vitro mit einem chemisch/physikalische Mittel von Interesse oder Gewebe/Organe der entsprechenden Tiere behandelt in Vivo mit dem Test chemische/Agent1, 2,4,48,49,50,51,52. Eine schematische Darstellung des λ-Select cII -Assays ist in Abbildung 1dargestellt.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>MO Bio Laboratories, Inc.</td><td>12112-05</td><td>Bacteriological grade</td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4337455</td><td>None</td></tr><tr><td>Casein Peptone</td><td>Alfa Aesar</td><td>H26557</td><td>None</td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>J. T. Baker</td><td>2124-01</td><td>Powder</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 229-1 / M-13750</td><td>None</td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 9724-500</td><td>None</td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>8104</td><td>50 PCR purification reactions</td></tr><tr><td>Sodium Acetate Trihydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-15756</td><td>None</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Taq5000&lt;/em&gt; DNA Polymerase&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>201207</td><td>None</td></tr><tr><td>Thiamine Hydrochloride</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>2722-57</td><td>None</td></tr><tr><td>Transpack Packaging Extract</td><td>Stratagene Corp., Acquired by BioReliance | Sigma-Aldrich Corp.</td><td>200223</td><td>50 packaging reactions</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 152-1 / EC 201-064-4</td><td>None</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Biosciences</td><td>RC-110</td><td>None</td></tr></tbody></table>

the lambda select cii mutation detection system

Eine Reihe von transgene Tiermodelle und Mutation-Detection-Systeme wurden zu Testzwecken Mutagenität von Karzinogenen in Säugetierzellen entwickelt. Von diesen sind Transgene Mäuse und Lambda (λ) Select cII Mutation Detection System für Mutagenität Experimente von vielen Forschergruppen weltweit eingesetzt worden. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Lambda wählen Sie cII Mutation Assay, die kultivierten Zellen von transgenen Mäusen/Ratten angewendet werden können oder die entsprechenden Tiere behandelt mit einem chemisch/physikalische Mittel von Interesse. Das Protokoll besteht aus den folgenden Schritten: (1) Isolierung genomischer DNA aus den Zellen oder Organe/Gewebe von transgenen Tieren behandelt in Vitro oder in Vivo, jeweils mit einer Testverbindung; (2) Wiederherstellung des Lambda-Shuttle Vektors mit mutagenen Reportergen (d.h. cII Transgen) aus genomischer DNA; (3) Verpackung der geretteten Vektoren in infektiösen Bakteriophagen; (4) ein Host-Bakterium infizieren und Kultivierung unter selektiven Bedingungen zur Vermehrung der induzierten cII Mutationen erlauben; und (5) Bewertung der cII-Mutanten und DNA-Sequenz-Analyse zur Ermittlung der Mutantenhäufigkeit cII und Mutation Spektrum bzw..

Je nach Verteilung der Daten werden parametrische oder nicht-parametrische Tests verwendet, um die Bedeutung der Unterschied in der Mutantenhäufigkeit cII zwischen Behandlung und Kontrollgruppen (d. h.im Vergleich zu spontanen mutierten Frequenzen induziert) bestimmen . Vergleich der induzierten cII mutierten Frequenzen in ganz verschiedenen Behandlungsgruppen erfolgt durch verschiedene (paarweise) statistische Tests, soweit anwendbar. Hypergeometrische Test vo...

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The Lambda Select cII Mutation Detection System

Die Lambda wählen Sie cII Mutation-Detection-System

Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll für Lambda wählen Sie cII Mutation Assay in kultivierten Zellen von transgenen Nagetiere oder die entsprechenden Tiere behandelt mit einem chemisch/physikalische Mittel von Interesse. Dieser Ansatz hat verbreitet zu Testzwecken Mutagenität von Karzinogenen in Säugetierzellen.

A number of transgenic animal models and mutation detection systems have been developed for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells. Of ...

the-lambda-select-cii-mutation-detection-system

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Lambda Select cII Mutation Detection System

7.9K Aufrufe.  University of Southern California. Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll für Lambda wählen Sie cII Mutation Assay in kultivierten Zellen von transgenen Nagetiere oder die entsprechenden Tiere behandelt mit einem chemisch/physikalische Mittel von Interesse. Dieser Ansatz hat verbreitet zu Testzwecken Mutagenität von Karzinogenen in Säugetierzellen.

Serie: The Lambda Select cII Mutation Detection System

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

Seltenes Ereigniserkennung mit Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Forschung

Genetik

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. Fundamental to these transitions is the intrinsic flexibility of the protein, which is critically modulated by membrane lipid-composition. To better understand the structural basis of channel function, it is necessary to study protein dynamics in a physiological membrane environment. Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy is an important tool to characterize conformational transitions between functional states. In comparison to NMR and X-ray crystallography, the information obtained from EPR is intrinsically of lower resolution. However, unlike in other techniques, in EPR there is no upper-limit to the molecular weight of the protein, the sample requirements are significantly lower, and more importantly the protein is not constrained by the crystal lattice forces. Therefore, EPR is uniquely suited for studying large protein complexes and proteins in reconstituted systems. In this article, we will discuss general protocols for site-directed spin labeling and membrane reconstitution using a prokaryotic proton-gated pentameric Ligand-Gated Ion Channel (pLGIC) from Gloeobacter violaceus (GLIC) as an example. A combination of steady-state Continuous Wave (CW) and Pulsed (Double Electron Electron Resonance-DEER) EPR approaches will be described that will enable a complete quantitative characterization of channel dynamics.

This article describes methods for site-directed spin labeling and reconstitution of pentameric ligand-gated channels for Electron Paramagnetic Resonance studies. This protocol can be adapted for any membrane protein. The reconstitution method described here can also be used for patch-clamp measurements of macroscopic and single-channel currents in a defined lipid system.

Site-Directed Spin Labeling und EPR-spektroskopischen Untersuchungen von pentamerem liganden-gesteuerten Ionenkanäle

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Chemie

qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a polymorphic cluster of genes on chromosome 19. Their best-characterized ligands are the human leukocyte antigen (HLA) molecules that are encoded within the major histocompatibility complex (MHC) locus on chromosome 6. There is substantial evidence that they play a significant role in immunity, reproduction, and transplantation, making it crucial to have techniques that can accurately genotype them. However, high-sequence homology, as well as allelic and copy number variation, make it difficult to design methods that can accurately and efficiently genotype all KIR genes. Traditional methods are usually limited in the resolution of data obtained, throughput, cost-effectiveness, and the time taken for setting up and running the experiments. We describe a method called quantitative KIR semi-automated typing (qKAT), which is a high-throughput multiplex real-time polymerase chain reaction method that can determine the gene copy numbers for all genes in the KIR locus. qKAT is a simple high-throughput method that can provide high-resolution KIR copy number data, which can be further used to infer the variations in the structurally polymorphic haplotypes that encompass them. This copy number and haplotype data can be beneficial for studies on large-scale disease associations, population genetics, as well as investigations on expression and functional interactions between KIR and HLA.

Quantitative killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) semi-automated typing (qKAT) is a simple, high-throughput, and cost-effective method to copy number type KIR genes for their application in population and disease association studies.

qKAT: Quantitative Flugbuchungssystem Typisierung von Killer-Zelle Immunoglobulin-Like-Rezeptor-Gene

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the TILLING system has less applicability for insertion/deletion (Indel) detection and traditional TILLING needs more complex steps, like CEL I nuclease digestion and gel electrophoresis. To improve the throughput and selection efficiency, and to make the screening of both Indels and single base substitions (SBSs) possible, a new high-resolution melting (HRM)-based TILLING system is developed. Here, we present a detailed HRM-TILLING protocol and show its application in mutation screening. This method can analyze the mutations of PCR amplicons by measuring the denaturation of double-stranded DNA at high temperatures. HRM analysis is directly performed post-PCR without additional processing. Moreover, a simple, safe and fast (SSF) DNA extraction method is integrated with HRM-TILLING to identify both Indels and SBSs. Its simplicity, robustness and high throughput make it potentially useful for mutation scanning in rice and other crops.

In this article, we present the protocol that is described as high-resolution melting analysis (HRM)-based Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING). This method utilizes fluorescence changes during the melting of the DNA duplex and is suitable for high-throughput screening of both insertion/deletion (Indel) and single base substition (SBS).

Identifizieren von Mutationen durch hochauflösendes Schmelzen in einer TILLING-Bevölkerung von Reis

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem cells are responsible for ensuring tissue homeostasis and repair throughout life, it is reasonable to hypothesize that the stem cell population is critical for preserving genomic integrity of tissues. Therefore, significant interest has arisen in assessing the impact of endogenous and environmental factors on genomic integrity in stem cells and their progeny, aiming to understand the etiology of stem-cell based diseases.
LacI transgenic mice carry a recoverable &#955;&#160;phage vector encoding the LacI reporter system, in which the LacI gene serves as the mutation reporter. The result of a mutated LacI gene is the production of &#946;-galactosidase that cleaves a chromogenic substrate, turning it blue. The LacI reporter system is carried in all cells, including stem/progenitor cells and can easily be recovered and used to subsequently infect E. coli. After incubating infected E. coli on agarose that contains the correct substrate, plaques can be scored; blue plaques indicate a mutant LacI gene, while clear plaques harbor wild-type. The frequency of blue (among clear) plaques indicates the mutant frequency in the original cell population the DNA was extracted from. Sequencing the mutant LacI gene will show the location of the mutations in the gene and the type of mutation.
The LacI transgenic mouse model is well-established as an in vivo mutagenesis assay. Moreover, the mice and the reagents for the assay are commercially available. Here we describe in detail how this model can be adapted to measure the frequency of spontaneously occurring DNA mutants in stem cell-enriched Lin-IL7R-Sca-1+cKit++(LSK) cells and other subpopulations of the hematopoietic system.

Here we describe an in vivo mutagenesis assay for small numbers of purified hematopoietic cells using the LacI transgenic mouse model.&#160;The LacI gene can be isolated to determine the frequency, location, and type of DNA mutants&#160;spontaneously arisen or after exposure to genotoxins.

Identifizierung von DNA-Mutationen in hämatopoetischen Stammzellen Gereinigtes / Vorläuferzellen

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Immunologie und Infektion

InSET: A Novel Tool for Unbiased Genome-Wide Functional Element Discovery

Identification of Functionally-Relevant Lentivirus Integration Sites in an Insertional Mutagenesis Cell Library

The extent of functional sequences within the human genome is a pivotal yet debated topic in biology. Although high-throughput reverse genetic screens have made strides in exploring this, they often limit their scope to known genomic elements and may introduce non-specific effects. This underscores the urgent need for novel functional genomics tools that enable a deeper, unbiased understanding of genome functionality. This protocol introduces the Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET), a method for identifying lentivirus integration sites within a lentivirus-based insertional mutagenesis cell library. InSET facilitates the capture of genome-wide lentiviral integration sites, with next-generation sequencing used to detect and quantify flanking sequences. InSET's design enables the analysis of integration site abundance variations in phenotypic screens on a large scale, establishing it as a robust tool for forward genetics and for identifying functional genomic elements. A key benefit of InSET is its capacity to reveal previously unidentified genomic elements, including novel functional exons of both protein-coding and non-coding RNAs, independent of prior annotation. Overall, InSET holds significant value in studying the intricate complexity of the human genome and transcriptome, where many genomic elements await functional characterization.

Insertional mutagenesis is an essential tool in forward genetics for identifying functional genomic elements. Here, we describe the Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET), a method for detecting lentivirus integration sites within a lentivirus-based insertional mutagenesis cell library.

The extent of functional sequences within the human genome is a pivotal yet debated topic in biology. Although high-throughput reverse genetic screens ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Mutagenese und Functional Selection Protocols for Directed Evolution von Proteinen in E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Biologie

Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

The early detection of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) by citrus growers facilitates early intervention and prevents the spread of disease. A simple method for rapid and portable Huanglongbing (HLB) diagnosis is presented here that combines recombinase polymerase amplification and a fluorescent reporter utilizing the nuclease activity of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 12a (CRISPR-Cas12a) system. The sensitivity of this technique is much higher than PCR. Furthermore, this method showed similar results to qPCR when leaf samples were used. Compared with conventional CLas detection methods, the detection method presented here can be completed in 90 min and works in an isothermal condition that does not require the use of PCR machines. In addition, the results can be visualized through a handheld fluorescent detection device in the field.

Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

In this work, a rapid, sensitive, and portable detection method for Candidatus Liberibacter asiaticus based on recombinase polymerase amplification combined with CRISPR-Cas12a was developed.

Freilandfähiger Candidatus liberibacter asiaticus-Nachweis mittels Rekombinase-Polymerase-Amplifikation in Kombination mit CRISPR-Cas12a

The early detection of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) by citrus growers facilitates early intervention and prevents the spread of disease. A ...

Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations

Structural variants (SVs) (i.e., deletions, insertions, duplications, and inversions) are now known to play an important role in phenotypic variation, and consequently in processes such as disease determination or adaptation to a new environment. However, single-nucleotide variants receive much more attention than SVs, probably because they are easier to detect, and their phenotypic effects are easier to predict. The development of short- and long-read deep sequencing technologies have strongly improved the detection of SVs, but the quantification of their frequency from pooled sequencing (poolseq) data is still technically complex and expensive.
Here, we present a rather simple and inexpensive method, which allows researchers to follow the dynamics of SV allele frequency. As an example of application, we follow the frequency of an insertion sequence (IS) insertion in experimental evolution populations of bacteria. This method is based on the design of triplets of primers around the structural variant borders, such that the amplicons produced by amplification of the wild-type (WT) and derived alleles differ in size by at least 5%, and that their amplification efficiency is similar. The quantity of each amplicon is then determined by parallel capillary electrophoresis and normalized to a calibration curve. This method can be easily extended to the quantification of the frequency of other structural variants (deletions, duplications, and inversions) and to pool-seq approaches of natural populations, including within-patient pathogen populations.

We developed a cost-effective method to follow non-single nucleotide polymorphism allele dynamics that can easily be adapted to experimental evolution frozen archives. A triplet PCR technique was coupled with automated parallel capillary electrophoresis to quantify the relative frequency of an insertion allele over the course of experimental evolution.

Auf der Suche nach der Dynamik struktureller Varianten in experimentell entwickelten Populationen

Structural variants (SVs) (i.e., deletions, insertions, duplications, and inversions) are now known to play an important role in phenotypic variation, and ...

DNA Virus Detection System Based on RPA-CRISPR/Cas12a-SPM and Deep Learning

We report a fast, easy-to-implement, highly sensitive, sequence-specific, and point-of-care (POC) DNA virus detection system, which combines recombinase polymerase amplification (RPA) and CRISPR/Cas12a system for trace detection of DNA viruses. Target DNA is amplified and recognized by RPA and CRISPR/Cas12a separately, which triggers the collateral cleavage activity of Cas12a that cleaves a fluorophore-quencher labeled DNA reporter and generalizes fluorescence. For POC detection, portable smartphone microscopy is built to take fluorescent images. Besides, deep learning models for binary classification of positive or negative samples, achieving high accuracy, are deployed within the system. Frog virus 3 (FV3, genera Ranavirus, family Iridoviridae) was tested as an example for this DNA virus POC detection system, and the limits of detection (LoD) can achieve 10 aM within 40 min. Without skilled operators and bulky instruments, the portable and miniature RPA-CRISPR/Cas12a-SPM with artificial intelligence (AI) assisted classification shows great potential for POC DNA virus detection and can help prevent the spread of such viruses.

We present a protocol that combines recombinase polymerase amplification with a CRISPR/Cas12a system for trace detection of DNA viruses and builds portable smartphone microscopy with an artificial intelligence-assisted classification for point-of-care DNA virus detection.

DNA-Virusnachweissystem basierend auf RPA-CRISPR/Cas12a-SPM und Deep Learning

We report a fast, easy-to-implement, highly sensitive, sequence-specific, and point-of-care (POC) DNA virus detection system, which combines recombinase ...