Bu yöntemler yeni nesil sıralama ve akış sitometri görüntüleme analizientegre. Bazı henotypik değişikliklerin transkripsiyon yerine, özellikle kirletici maruzkalma ortamında, karışıp karışmadığı gibi ilginç soruların yanıtlatımı yardımcı olabilir. Bu basit yöntemin bizim için en büyük avantajı, biyolojik olarak önemli proteinin kolokalizasyonunu ölçmek, anahtar diferansiyel gen ekspresyonunun sonuçlarını işlevsel düzeyde yorumlamak için kullanabilmektir.
Bu tekniğin sonuçları patolojik ve toksikolojik sonuçların tanısına kadar uzanır. Normal bir görüntüleyici yaklaşımı olarak, forsee protein fonksiyonu gen ekspresyonu bağlamak için yeteneğine sahiptir. Genel olarak, bu yönteme yeni yeni bireyler görüntüleme ve transkripsiyon analizinin yüksek teknik talepleri nedeniyle mücadele edecektir.
İnsan monositt tendritik hücre kitaplığı dizilimi için, ilk sıralama ve indeksleme reaktifleri sırasıyla biyosentez ve indeksleme reaktif rafları üzerine yükleyin ve tüm buz eriyene kadar rafları bir saat boyunca laboratuvar sınıfı su banyosuna yerleştirin ve reaktifler iyice karıştırılır. Reaktifler çözülirken, sıralayıcının gücü, Do Not Eject sürücüsü göründüğünde bilgisayarı bir ağ sürücüsüne bağlayın ve sıralayıcı kontrol yazılımını başlatın. Daha sonra, sıralama biyosentez reaktif rafındaki şişelerin her birine yaklaşık 100 mililitre bakım yıkama çözeltisi ekleyin ve her şişenin üzerine bir huni kapağı vidalayın.
İndeksleme reaktifrafındaki her 15 mililitrelik konik tüpe yaklaşık 12 mililitre bakım yıkama çözeltisi ekleyin ve kapakları atın. Sonra sıralayıcı üzerine her iki rafları yükleyin. Sıralayıcı kontrol yazılımı içinde Maintenance Wash'ı seçin ve sıralayıcı akışkan sistemini temizleme yönergelerini izleyin.
Sızıntı olmadığından emin olmak için akış hücresini şeritlerden geçen kabarcıklar için görsel olarak incelemek için bir el feneri kullanın. Yıkama sırası tamamlandığında, Sıra sekmesini açın ve çıktı verilerini bir ağ sürücüsüne yönlendirerek yeni bir çalıştırma başlatın. Demultiplexing için örnek bir sayfa yükleyin ve uygun reaktif bilgilerini girin.
Sıralama reaktifleri ile sistemi asal etmek için kullanılan bir akış hücresi kullanın. Küme oluşturma tamamlandıktan sonra, akış hücresini çıkarın. Ve hücreyi hafifçe suyla püskürtün.
Akış hücresini mercek kağıdıyla kurulayın ve ardından %95 etanol içeren hafif bir sprey püskürtün. Akış hücresini tekrar kurustuktan sonra, enkaz veya tuz kalıntısı olmadan temiz olduğundan emin olmak için akış hücresinin yüzeyini ışığa karşı kontrol edin. Asal adım tamamlandığında, kümelenmiş akış hücresini yükleyin ve sıralamaya başlayın.
Dizi analizi görüntüleyici yazılımı otomatik olarak başlatılır. Yaklaşık 26 saat sonra, veri kalitesini değerlendirmek ve herhangi bir sorun giderme için yüksek sıralı kontrol yazılımı ve sıralama analizi görüntüleme yazılımı aracılığıyla veri kalitesini izleyin. Daha sonra, sıra bittiğinde, akış hücre contasını değiştirin ve bir sonraki çalıştırmaya başlamadan önce bir bakım yıkama gerçekleştirin.
Kirletici maruz dendritik hücrelerin akış sitometrik görüntüleme sonra, ImageJ Fiji açık ve tedavi grubuna göre bireysel dosyalara maruz ve kirletici maruz kalan insan dendritik hücre örnek grupları için kaydedilen 100 hücre görüntüleri birleştirir. CD1d'yi ve Lamp1'i iki popülasyon içinde çözümlemek için, kirletici maruz kalan 100 birleştirilmiş hücre görüntüsünü açın ve görüntüyü kanal başına tek bir floroforile iki ayrı görüntüye bölmek için Görüntü, Renk ve Split Kanallarını seçin. Ortak yerelleştirilmiş piksellerin dağılım çizimini oluşturmak için Çözümle, Birlikte Yerelleştirme ve Colocalization Eşlemesi'ni seçin ve dağılım çizimini kaydetmek için Yazdırma Ekranına basın.
Her tek hücreli görüntü için Mander'in kolocalization katsayısını hesaplamak için, bölünmüş kanalları içeren görüntü dosyasında tek hücreli bir görüntü seçmek için oval seçim aracını kullanın ve yeniden Çözümleme, Birlikte Yerelleştirme ve Kolocalization Eşiğini seçin. Ardından ilgi alanı için diyalog kutusundan Kanal 1'i seçin ve Tamam'ı tıklatın. Katsayı tüm 100 hücre görüntüleri için hesaplandığında, sonuçları uygun bir elektronik tabloya aktarın ve kontrol edilemeyen hücre örneği için çözümlemesi yineleyin. RNA dizilimi ve transkripsiyonel veri analizleri kullanılarak, kirletici maruz kalan DC'lerde lipid metabolizması ve endositik fonksiyonlar da dahil olmak üzere birçok büyük değiştirilmiş gen kümesi tespit edildi.
Bireysel hücre görüntü düzeyinde, HLADR pozitif CD11c pozitif dendritik hücreler geçitli olabilir, onların CD1d ve Lamp1 coexpression göre. Kontrol maruz olmayan dendritik hücreler minimal CD1d ve Lamp1 protein kolokalizasyonu gösterir, CD1d endositik ticareti bazal düzeyde gösteren, ve fizyolojik koşullar altında yüzey ekspresyonu yüksek düzeyde. CD1d bu deneysel hücre popülasyonunda değişmiş endositik gen profilleri doğrulayan, kirletici maruz dendritik hücrelerin geç endositik bölmelerde tutulur ise.
Tek tek hücresel görüntüleri tek bir görüntü dosyasında birleştirdikten sonra, tek tek görüntüler florofor ifadelerine göre bölünebilir ve iki kanal arasındaki piksel yoğunluğunun birlikte yerelleştirilmesi bir dağılım çiziminde görselleştirilebilir. Cd1d ve Lamp1 proteinleri arasındaki kolokalizasyon derecesi iki tedavi grubundaki Mander katsayıları kullanılarak ölçülebilir. Eğer protein yoğunluğu kolokalize ve kolokalize olmayan alanlar arasında heterjen ise, kolokalize edilmiş yoğunluk kolokalize alanlara paralel olmayacaktır, bu nedenle piksel yoğunluğuna bağlı olarak iki proteinin kolokalizasyonunu daha fazla değerlendirmek de önemlidir.
Bir kez hakim, görüntü analizi iki saat içinde tamamlanabilir ve RNA sıralama kurulumu üç saat içinde tamamlanabilir, her teknik düzgün yapılırsa. Bu yordamı çalışırken, tüm reaktiflerin doğru konumlara düzgün yüklendiğinden ve sıralayıcıda sızıntı olmadığından emin olmak önemlidir. Bu prosedürü takiben, sırasıyla küresel mikro RNA ekspresyonu, gen mutasyonu veya DNA metilasyon hakkında ek soruları yanıtlamak için mikro RNA, eksom veya mast hücre dizilemesi gibi diğer yöntemler de yapılabilir.
Yani geliştirildikten sonra, bu teknik hücresel görüntüleme analizi ve yeni nesil dizileme alanında araştırmacılara çevresel kirleticinin gen ekspresyonu ve protein fonksiyonu üzerindeki etkisini keşfetmede yardımcı olacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, yeni nesil sıralamayı ve protein kolokalizasyonunun görüntüleyici analizini nasıl kurabileceğinizi iyi anlamalısınız. İnsan kanı örneklerinde zehirli kirletici kimyasallarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.
Kimyasal duman başlığı ve kişisel koruyucu ekipman kullanımı gibi önlemler, bu işlemleri gerçekleştirirken her zaman alınmalıdır.
