هذه الطرق دمج الجيل التالي تسلسل وتدفق تحليل التصوير القياسات الخلية. يمكن أن يساعد في الإجابة على أسئلة مثيرة للاهتمام ، مثل ما إذا كانت بعض التعديلات الظاهرية متورطة ، بدلاً من النص ، خاصة في بيئة التعرض للملوثات. والميزة الرئيسية لهذه الطريقة البسيطة بالنسبة لنا هي أننا يمكن أن نستخدمها لقياس التكلس من البروتين المهم بيولوجيا، لتفسير نتائج التعبير الجيني التفاضلي الرئيسي على المستوى الوظيفي.
تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو تشخيص النتائج المرضية والسمية. كنظرية تصويرية، فإن Forsee لديه القدرة على ربط التعبير الجيني بوظيفة البروتين. عموما، سوف الأفراد جديدة لهذه الطريقة النضال بسبب المطالب التقنية العالية من التصوير والتحليل النسخي.
لتسلسل مكتبة الخلايا المتسخة المشتقة من الدنوديتية البشرية ، قم أولاً بتحميل الكواشف التسلسلية وفهرستها على رفوف الكشف الحيوي المتسلسلة وفهرسةها ، على التوالي ، ووضع الرفوف في حمام مائي من الدرجة المختبرية لمدة ساعة واحدة ، حتى يذوب كل الجليد ، ويتم خلط الكواشف تمامًا. أثناء ذوبان الكواشف، الطاقة على المنظم، توصيل الكمبيوتر إلى محرك أقراص شبكة عند ظهور محرك الأقراص عدم إخراج، ثم تشغيل برنامج التحكم المنظم. المقبل، إضافة حوالي 100 ملليلتر من محلول غسل الصيانة لكل من الزجاجات في رف مُكشف التركيب الحيوي التسلسلي، وبرغي غطاء قمع على كل زجاجة.
إضافة ما يقرب من 12 ملليلتر من محلول غسل الصيانة لكل أنبوب مخروطي 15 ملليلتر في رف الكاشف الفهرسة، وتجاهل القبعات. ثم قم بتحميل كلا الحوامل على جهاز التسلسل. حدد الصيانة غسل داخل برنامج التحكم المنظم، واتبع التعليمات لتنظيف نظام السائل المنظم.
استخدام مصباح يدوي لفحص بصريا الخلية تدفق للفقاعات التي تمر عبر الممرات، للتأكد من عدم وجود تسرب. عند الانتهاء من تسلسل الغسيل، افتح علامة التبويب تسلسل، ثم ابدأ تشغيل جديد، وتوجيه بيانات الإخراج إلى محرك أقراص شبكة. قم بتحميل ورقة عينة لـ demultiplexing، وأدخل معلومات الكاشف المناسبة.
استخدم خلية تدفق مستخدمة لرُد النظام، مع الكواشف التسلسلية. بمجرد اكتمال إنشاء الكتلة، قم بإزالة خلية التدفق. ورش بخفة الخلية بالماء.
امسح خلية التدفق الجافة بورق العدسة، متبوعاً برذاذ خفيف مع 95٪ إيثانول. بعد مسح خلية التدفق الجافة مرة أخرى، تحقق من سطح الخلية تدفق ضد الضوء للتأكد من أنها نظيفة، دون الحطام أو بقايا الملح. عند الانتهاء من الخطوة الرئيسية تحميل خلية تدفق متفاوت المسافات، وبدء التسلسل.
سيتم تشغيل برنامج عارض تحليل التسلسل تلقائيًا. وبعد حوالي 26 ساعة، قم بمراقبة جودة بيانات التسلسل من خلال برنامج التحكم في التسلسل العالي، وبرمجيات عرض تحليل التسلسل لتقييم جودة البيانات، ولأي استكشاف للأعطال وإصلاحها. ثم، عند الانتهاء من تسلسل، تغيير طوقا الخلية تدفق، وإجراء غسل الصيانة قبل البدء في تشغيل المقبل.
بعد تدفق التصوير السيتري للخلايا التشعبية المعرضة للملوثات، افتح ImageJ فيجي، ودمج صور الخلايا المحفوظة 100 لمجموعات عينات الخلايا الجذعية البشرية غير المكشوفة والملوثة في ملفات فردية وفقًا لمجموعة المعالجة. لتحليل CD1d، و كولويبلييشن Lamp1 داخل المجموعتين السكانيتين، افتح صورة الخلايا المدمجة المُعرّضة للملوثات 100، وحدد قنوات الصورة واللون والانقسام لتقسيم الصورة إلى صورتين فرديتين مع فلوفور واحد لكل قناة. لإنشاء مخطط مبعثر من بكسل ا colocalized حدد تحليل و كولكاليسيشن عتبة، واضغط على شاشة الطباعة لحفظ مؤامرة مبعثر.
لحساب معامل التكلس الخاص بـ Mander لكل صورة خلوية مفردة، استخدم أداة التحديد البيضاوي لتحديد صورة أحادية الخلية على ملف الصورة باستخدام القنوات المنقسمة، وحدد تحليل، وتكلسية، وعتبة التكلس مرة أخرى. ثم حدد القناة 1 من مربع الحوار لمنطقة الاهتمام، ثم انقر فوق موافق. عند حساب المعامل لكافة صور الخلايا 100، قم باستيراد النتائج إلى جدول بيانات مناسب، وكرر التحليل الخاص بعيّنة الخلايا غير المكشوفة للتحكم. وباستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي وتحليلات البيانات المستنسخة، تم تحديد العديد من مجموعات الجينات المتغيرة الرئيسية، بما في ذلك استقلاب الدهون ووظائف الغدد الصماء في البلدان النامية المعرضة للملوثات.
على مستوى صورة الخلية الفردية، يمكن أن تكون مسور HLADR إيجابية CD11c الخلايا التشعب إيجابية، وفقا لC1D بهم وDed1 coexpression. السيطرة على الخلايا التشعبية غير المكشوفة تظهر الحد الأدنى CD1d و Lamp1 بروتين التكلس, مما يدل على مستوى القاعدي للاتجار بـ CD1d endocytic, ومستوى عال من التعبير السطحي في ظل الظروف الفسيولوجية. في حين يتم الاحتفاظ CD1d في الأجزاء المتأخرة من الخلايا التشعبية المعرضة للملوثات، مما يؤكد تغيير ملفات الجينات endocytic في هذه الخلايا التجريبية.
بعد دمج الصور الخلوية الفردية في ملف صورة واحدة ، يمكن تقسيم الصور الفردية وفقًا لتعبير الفلوروفور ، ويمكن تصور التكلس من كثافة البكسل بين القناتين في مؤامرة مبعثرة. ويمكن بعد ذلك تحديد درجة التكلس بين بروتينات CD1d وDed1 في مجموعتي المعالجة، وذلك باستخدام معاملات ماندر. إذا كانت كثافة البروتين هي هيسترجينيوس بين المناطق الضخمة وغير الضخمة، فإن الكثافة الهائلة لن تكون موازية للمناطق ذات التكلس، ولذلك من المهم أيضًا إجراء تقييم إضافي لتكلس البروتينين، استنادًا إلى كثافة البكسل.
بمجرد اتقانها، يمكن إكمال تحليل الصورة في ساعتين، ويمكن إكمال إعداد تسلسل الحمض النووي الريبي في ثلاث ساعات، إذا تم تنفيذ كل تقنية بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر للتأكد من أن يتم تحميل جميع الكواشف بشكل صحيح في المواضع الصحيحة، وأنه لا يوجد تسرب في المنظم. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى، مثل الحمض النووي الريبي الصغير، إكسوم، أو تسلسل الخلايا الصاري للإجابة على أسئلة إضافية حول التعبير العالمي للرنا الصغير، أو الطفرة الجينية، أو ميثيل الحمض النووي، على التوالي.
لذلك بعد تطورها ، ستساعد هذه التقنية الباحثين في مجال تحليل التصوير الخلوي ، وتسلسل الجيل التالي لاستكشاف تأثير الملوثات البيئية على التعبير الجيني ووظيفة البروتين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد تسلسل الجيل القادم ، وتحليل التصوير لتكلس البروتين. لا تنس أن العمل مع المواد الكيميائية الملوثة السامة في عينات الدم البشري يمكن أن تكون خطرة للغاية.
الاحتياطات مثل استخدام غطاء الدخان الكيميائي، ومعدات الحماية الشخصية، ينبغي دائماً اتخاذها عند تنفيذ هذه الإجراءات.
