これらの方法は、次世代シーケンシングとフローサイトメトリーイメージング解析を統合します。これは、特に汚染物質暴露環境において、トランスクリプトームの代わりに、いくつかの表記の変化が含まれているかどうかのような興味深い質問に答えるのに役立ちます。この単純な方法の主な利点は、生物学的に重要なタンパク質の共局在化を測定し、主要な遺伝子発現の結果を機能レベルで解釈できることです。
この技術の意味は、病理学的および毒物学的結果の診断に及ぶ。通常のイメージャーアプローチとして、forseeは、遺伝子発現をタンパク質機能に接続する能力を有する。一般的に、この方法に新しい個人は、イメージングおよびトランスクリプト分析の高い技術的要求のために苦労します。
ヒト単球由来樹状細胞ライブラリーを配列するには、まずシーケンシング合成試薬およびインデックス用試薬ラックにシーケンシングおよびインデックス化試薬を積み込み、すべての氷が溶けるまで1時間、実験室グレードの水浴にラックを入れ、試薬を完全に混合します。試薬が解凍されている間、シーケンサの電源を入れ、取り出す操作のドライブが表示されたらコンピュータをネットワークドライブに接続し、シーケンサ制御ソフトウェアを起動します。次に、シーケンシング生合成試薬ラックの各ボトルに約100ミリリットルのメンテナンス洗浄液を加え、各ボトルに漏斗キャップをねじ込みます。
約12ミリリットルのメンテナンス洗浄液を、インデックス用試薬ラックの15ミリリットル円錐形チューブに加え、キャップを廃棄します。次に、両方のラックをシーケンサーに積み込みます。シーケンサ制御ソフトウェアで「メンテナンスウォッシュ」を選択し、シーケンサ流体システムのクリーニング手順に従います。
フラッシュライトを使用して、フローセルの車線を通過する気泡を視覚的に検査し、漏れがないことを確認します。ウォッシュシーケンスが終了したら、[シーケンス]タブを開き、新しい実行を開始して、出力データをネットワークドライブに送ります。デマルチプレクシング用のサンプルシートをアップロードし、適切な試薬情報を入力します。
使用フローセルを使用して、シーケンシング試薬を使用してシステムをプライミングします。クラスターの生成が完了したら、フロー セルを削除します。そして、軽く水で細胞をスプレー.
フローセルをレンズペーパーで拭き、続いて95%エタノールの軽いスプレーを吹き付けます。フローセルを再び乾かした後、フローセルの表面を光に照らしてチェックし、残骸や塩残渣がなくても清潔であることを確認します。プライムステップが終了したら、クラスター化されたフローセルをロードし、シーケンスを開始します。
シーケンス解析ビューアソフトウェアが自動的に起動します。約26時間後、高シーケンス制御ソフトウェアを介してシーケンシングデータ品質を監視し、シーケンシング分析ビューソフトウェアを使用してデータ品質を評価し、トラブルシューティングを行います。そして、シーケンスが終了したら、フローセルガスケットを変更し、次の実行を開始する前にメンテナンス洗浄を行う。
汚染物質曝露樹状細胞のフローサイトメトリックイメージング後、ImageJ Fijiを開き、非暴露および汚染物質にさらされたヒト樹状細胞サンプル群の保存された100個の保存された細胞画像を、治療群に従って個々のファイルにマージする。CD1d と 2 つの集団内の Lamp1 の共局在化を分析するには、汚染物質にさらされた 100 個の結合セルイメージを開き、[画像]、[色]、[スプリット チャネル] を選択して、画像をチャンネルごとに 1 つのフルオロフォアで 2 つの個別の画像に分割します。共局化されたピクセルの散布図を作成するには、[分析]、[共局化]、[共局化のしきい値] を選択し、[印刷画面] を押して散布図を保存します。
単一セルラー画像ごとに Mander の共局在係数を計算するには、楕円選択ツールを使用して、分割チャネルを含むイメージ ファイル上の単一セル画像を選択し、分析、共局在化、および共局在化のしきい値を再度選択します。次に、対象地域のダイアログ ボックスから [チャンネル 1] を選択し、[OK] をクリックします。100 個のセルイメージすべてに対して係数が計算されたら、結果を適切なスプレッドシートにインポートし、コントロールの非公開セル サンプルの分析を繰り返します。RNAシーケンシングおよび転写データ解析を用いて、汚染物質暴露DCにおいて脂質代謝および内視鏡機能を含むいくつかの主要な遺伝子クラスターが同定された。
個々の細胞画像レベルでは、HLADR陽性CD11c陽性樹状細胞は、CD1dおよびLamp1共発現に従ってゲートすることができる。コントロール非露出樹状細胞は、CD1dおよびLamp1タンパク質共局在化を最小限に抑え、CD1dの内視鏡的人身売買の基底レベル、および生理学的条件下での高レベルの表面発現を示す。CD1dは汚染物質曝露樹状細胞の後期内視鏡区画に保持されているのに対し、この実験細胞集団における変化した内視鏡遺伝子プロファイルを確認する。
個々の細胞画像を単一の画像ファイルにマージした後、個々の画像をフルオロフォアの発現に従って分割することができ、2つのチャンネル間のピクセル強度の共局在化を散布図で視覚化することができます。2つの処理グループにおけるCD1dとLamp1タンパク質の共局在化の程度は、マンダーの係数を使用して定量化することができます。タンパク質の強度が共局領域と非共局領域の間で不均一である場合、共局化された強度は共局領域と平行ではないため、ピクセル強度に基づいて2つのタンパク質の共局在化をさらに評価することも重要である。
一度マスターすると、画像解析は2時間で完了し、RNAシーケンシングのセットアップは、各技術が適切に実行されれば、3時間で完了することができます。この手順を試みる際には、すべての試薬が正しい位置に正しくロードされ、シーケンサーに漏れがないように注意することが重要です。この手順に従って、マイクロRNA、エキソーム、またはマスト細胞シーケンシングのような他の方法を、それぞれ、グローバルなマイクロRNA発現、遺伝子変異、またはDNAメチル化に関する追加の質問に答えるために実行することができる。
開発後、この技術は、細胞イメージング分析の分野の研究者と、遺伝子発現およびタンパク質機能に対する環境汚染物質の影響を探求する次世代シーケンシングの研究に役立ちます。このビデオを見た後、次世代シーケンシングの設定方法とタンパク質共局在のイメージャー分析についてよく理解する必要があります。人間の血液サンプル中の有毒な汚染物質化学物質を使用すると、非常に危険な場合があることを忘れないでください。
これらの手順を実行する際には、化学発煙フードや個人用保護具の使用などの注意事項を必ず考慮してください。
