Эти методы интегрируют секвенирование и анализ цитометрии потока. Это может помочь ответить на интересные вопросы, как ли некоторые фенотипические изменения причастны, а не транскриптом, особенно в среде воздействия загрязняющих веществ. Основным преимуществом этого простого метода для нас является то, что мы можем использовать его для измерения колокализации биологически важного белка, для интерпретации результатов экспрессии генов ключевых дифференциалов на функциональном уровне.
Последствия этого метода распространяются на диагностику патологических и токсикологических исходов. Как нормальный подход imager, forsee имеет способность соединить выражение гена к функции протеина. Как правило, люди, новые для этого метода будет бороться из-за высоких технических требований изображения и транскриптомного анализа.
Чтобы секвенировать биоцит человека, полученный дендритной библиотекой клеток, сначала загрузите секвенирование и индексацию реагентов на секвенирование биосинтеза и индексацию реагентов, соответственно, и поместите стеллажи в ванну для воды лабораторного класса в течение одного часа, пока весь лед не растает, и реагенты тщательно перемешаны. В то время как реагенты оттаивают, питание на секвенсоре, подключение компьютера к сетевому диску, когда не выбрасывается диск появляется, и запуск программного обеспечения управления секвенсором. Далее добавьте около 100 миллилитров раствора для мытья технического обслуживания к каждой из бутылок в секвенировании биосинтеза реагентной стойки, и винт крышки воронки на каждой бутылке.
Добавьте приблизительно 12 миллилитров раствора для мытья технического обслуживания в каждую 15 миллилитровую коническую трубку в стойку для индексирования реагентов и отбросьте колпачки. Затем загрузите обе стойки на секвенсор. Выберите техническое обслуживание мыть в программном обеспечении управления секвенсором, и следовать инструкциям для очистки системы жидкости секвенсора.
Используйте фонарик, чтобы визуально проверить ячейку потока для пузырьков, проходящих через полосы движения, чтобы убедиться, что нет утечки. Когда последовательность стирки будет закончена, откройте вкладку Sequence и запустите новый запуск, направив выходные данные на сетевой диск. Загрузите образец листа для демултлексирования и введите соответствующую информацию о реагентах.
Используйте использованную ячейку потока для подготовки системы с помощью реагентов секвенирования. Как только генерация кластера будет завершена, удалите ячейку потока. И слегка распылить клетку водой.
Протрите ячейку потока сухой с бумагой объектива, а затем легкий спрей с 95%этанола. После вытирания потока ячейки сухой снова, проверить поверхность потока ячейки против света, чтобы убедиться, что она чиста, без мусора или остатков соли. Когда первый шаг будет закончен, загрузите кластерную ячейку потока и начните секвенирование.
Программное обеспечение просмотра анализа последовательности будет автоматически запущено. Около 26 часов спустя, контролировать качество секвенирования данных с помощью программного обеспечения управления высокой последовательности, и секвенирования анализа просмотра программного обеспечения для оценки качества данных, а также для любого устранения неполадок. Затем, когда последовательность закончена, измените прокладку ячейки потока и выполните ремонтную стирку перед началом следующего запуска.
После потока цитометрической визуализации загрязняющих дендритических клеток, откройте ImageJ Фиджи, и объединить 100 сохраненных изображений клеток для неразоблачных и загрязняющих веществ подвергаются человека дендритных групп клеток выборки в отдельные файлы в соответствии с группой обработки. Чтобы проанализировать CD1d и колокализацию Лампы1 в двух популяциях, откройте изображение 100 слитых клеток, подвергшихся воздействию загрязняющих веществ, и выберите каналы изображения, цвета и сплита, чтобы разделить изображение на два отдельных изображения с помощью одного флюорофора на канал. Чтобы создать участок рассеяния колокализованных пикселей, выберите Analyze, Colocalization и Colocalization Threshold, а также нажмите Print Screen, чтобы сохранить участок рассеяния.
Чтобы вычислить коэффициент колокализации Мандера для каждого одноклеточного изображения, используйте инструмент овального отбора, чтобы выбрать одноклеточное изображение в файле изображения с разделенными каналами, а также снова выбрать порог анализа, колокализации и колокализации. Затем выберите первый канал из окна диалога для области интересов и нажмите OK. Когда коэффициент был рассчитан для всех 100 изображений ячейки, импортировать результаты в соответствующую таблицу, и повторить анализ для контроля неразоблаченой выборки клеток. С помощью секвенирования РНК и анализа транскриптомных данных в ДК, подвергшихся воздействию загрязняющих веществ, были выявлены несколько крупных измененных генных кластеров, включая липидный метаболизм и эндоцитные функции.
На индивидуальном уровне изображения клетки, HLADR положительные CD11c положительные дендритные клетки могут быть закрыты, в соответствии с их CD1d и Лампа1 coexpression. Контроль неразоблаченные дендритные клетки демонстрируют минимальную колокализацию белка CD1d и Lamp1, что указывает на базальный уровень эндоцитической торговли CD1d и высокий уровень экспрессии поверхности в физиологических условиях. В то время как CD1d сохраняется в поздних эндоцитных отсеках загрязняющих дендритических клеток, подтверждая измененные профили эндоцитных генов в этой экспериментальной популяции клеток.
После слияния отдельных клеточных изображений в единый файл изображения, отдельные изображения могут быть разделены в соответствии с их выражением флюорофора, и колокализация интенсивности пикселей между двумя каналами может быть визуализирована в участке рассеяния. Степень колокализации между белками CD1d и Lamp1 в двух группах лечения может быть количественно с использованием коэффициентов Мандера. Если интенсивность белка является неоднородной между колокализованными и некокализованными областями, колокализованная интенсивность не будет параллельно колокализованным участкам, поэтому также важно дополнительно оценить колокализацию двух белков, основанную на интенсивности пикселей.
После освоения анализ изображения может быть завершен в течение двух часов, а установка секвенирования РНК может быть завершена в течение трех часов, если каждый метод выполняется должным образом. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы убедиться, что все реагенты должным образом загружены в правильном положении, и что нет утечки в секвенсоре. После этой процедуры, другие методы, такие как микро РНК, экзом, или секвенирование тучных клеток могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы о глобальной экспрессии микро РНК, мутации генов, или метилирования ДНК, соответственно.
Таким образом, после его развития, этот метод поможет исследователям в области клеточного анализа изображений, а также секвенирования следующего поколения, чтобы исследовать влияние загрязнителя окружающей среды на экспрессию генов и белковую функцию. После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как настроить следующее поколение секвенирования, и имиджер анализ белка колокализации. Не забывайте, что работа с токсичными химическими веществами загрязняющих веществ в образцах крови человека может быть чрезвычайно опасным.
Такие меры предосторожности, как использование химического дыма капот, и средства индивидуальной защиты, всегда должны быть приняты при выполнении этих процедур.
