Questi metodi integrano il sequenziamento di nuova generazione e l'analisi dell'imaging citometrico del flusso. Può aiutare a rispondere a domande interessanti, come se alcune alterazioni fenotipiche siano implicate, invece del trascritoma, specialmente nell'ambiente di esposizione degli inquinanti. Il vantaggio principale di questo semplice metodo per noi è che possiamo usarlo per misurare la colocalizzazione di proteine biologicamente importanti, per interpretare i risultati dell'espressione genica differenziale chiave a livello funzionale.
Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la diagnosi di esiti patologici e tossicologici. Come normale approccio imager, forsee ha la capacità di collegare l'espressione genica alla funzione proteica. Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà a causa delle elevate esigenze tecniche dell'imaging e dell'analisi trascrittamica.
Per sequenziare la libreria cellulare dendritica derivata dal monocita umano, caricare prima i reagenti di sequenziamento e indicizzazione sulla biosintesi di sequenziamento e indicizzare i rack dei reagenti, rispettivamente, e posizionare i rack in un bagno d'acqua di grado laboratorio per un'ora, fino a quando tutto il ghiaccio si è sciolto e i reagenti vengono mescolati accuratamente. Mentre i reagenti si stanno scongelando, accensione del sequencer, collegamento del computer a un'unità di rete quando viene visualizzata l'unità Do Not Eject e avvio del software di controllo sequencer. Successivamente, aggiungere circa 100 millilitri di soluzione di lavaggio di manutenzione a ciascuna delle bottiglie nel rack del reagente della biosintesi di sequenziamento e avvitare un tappo a imbuto su ogni bottiglia.
Aggiungere circa 12 millilitri di soluzione di lavaggio di manutenzione a ciascun tubo conico da 15 millilitri nel rack del reagente di indicizzazione e scartare i tappi. Quindi caricare entrambi i rack sul sequencer. Selezionate Lavaggio manutenzione (Maintenance Wash) all'interno del software di controllo del sequencer e seguite le istruzioni per la pulizia del sistema di fluidi sequenziatore.
Utilizzare una torcia elettrica per ispezionare visivamente la cella di flusso alla ricerca di bolle che attraversano le corsie, per assicurarsi che non vi siano perdite. Al termine della sequenza di lavaggio, aprire la scheda Sequenza e avviare una nuova esecuzione, indirizzando i dati di output a un'unità di rete. Caricare un foglio di esempio per la demultiplexing e immettere le informazioni di reagente appropriate.
Utilizzare una cella di flusso usata per innescare il sistema, con i reagenti di sequenziamento. Una volta completata la generazione del cluster, rimuovere la cella di flusso. E spruzzare leggermente la cella con acqua.
Asciugare la cella di flusso con carta lente, seguita da uno spray leggero con 95% di etanolo. Dopo aver asciugato nuovamente la cella di flusso, controllare la superficie della cella di flusso rispetto alla luce per assicurarsi che sia pulita, senza detriti o residui di sale. Al termine del passaggio principale, caricare la cella di flusso del cluster e iniziare la sequenza.
Il software di visualizzazione dell'analisi delle sequenze verrà avviato automaticamente. Circa 26 ore dopo, monitorare la qualità dei dati di sequenziamento tramite il software di controllo ad alta sequenza e il software di visualizzazione dell'analisi di sequenziamento per valutare la qualità dei dati e per qualsiasi risoluzione dei problemi. Quindi, al termine della sequenza, modificare la guarnizione della cella di flusso ed eseguire un lavaggio di manutenzione prima di iniziare l'esecuzione successiva.
Dopo l'imaging citometrico del flusso delle cellule dendritiche esposte agli inquinanti, apri ImageJ Fiji e unisci le 100 immagini cellulari salvate per i gruppi di campioni di cellule dendritiche umane non esposte ed esposte agli inquinanti in singoli file in base al gruppo di trattamento. Per analizzare la colocalizzazione di CD1d e Lamp1 all'interno delle due popolazioni, aprite l'immagine di cella unita 100 esposta all'inquinante e selezionate Immagine, Colore e Canali divisi per dividere l'immagine in due singole immagini con un singolo fluoroforo per canale. Per creare un grafico a dispersione dei pixel colocalizzati, selezionate Analizza, Colocalizzazione e Soglia di colocalizzazione e premete Stamp per salvare il grafico a dispersione.
Per calcolare il coefficiente di colocalizzazione del Mander per ogni immagine a singolo cellulare, usate lo strumento di selezione ovale per selezionare un'immagine a cella singola nel file di immagine con i canali divisi e selezionate nuovamente Analizza, Colocalizzazione e Soglia di colocalizzazione. Quindi selezionare Canale 1 dalla finestra di dialogo per l'area di interesse e fare clic su OK. Quando il coefficiente è stato calcolato per tutte le 100 immagini di cella, importare i risultati in un foglio di calcolo appropriato e ripetere l'analisi per il campione di celle non esposte del controllo. Utilizzando il sequenziamento dell'RNA e le analisi dei dati trascriomici, diversi importanti cluster genici alterati, tra cui il metabolismo lipidico e le funzioni endocitiche, sono stati identificati nei TC esposti agli inquinanti.
A livello di singola immagine cellulare, le cellule dendritiche positive CD11c HLADR possono essere gated, secondo la loro coespressione CD1d e Lamp1. Le cellule dendritiche non esposte di controllo dimostrano una colocalizzazione minima delle proteine CD1d e Lamp1, indicando un livello basale di traffico endocitico CD1d e un alto livello di espressione superficiale in condizioni fisiologiche. Mentre il CD1d viene conservato nei compartimenti endocitici tardivi delle cellule dendritiche esposte agli inquinanti, confermando profili genico endocitici alterati in questa popolazione cellulare sperimentale.
Dopo aver unito le singole immagini cellulari in un singolo file di immagine, le singole immagini possono essere divise in base alla loro espressione di fluoroforo e la colocalizzazione dell'intensità dei pixel tra i due canali può essere visualizzato in un grafico a dispersione. Il grado di colocalizzazione tra le proteine CD1d e Lamp1 nei due gruppi di trattamento può quindi essere quantificato utilizzando i coefficienti di Mander. Se l'intensità proteica è eterogenea tra le aree colocalizzate e non colocalizzate, l'intensità colocalizzato non sarà parallela alle aree colocalizzate, quindi è anche importante valutare ulteriormente la colocalizzazione delle due proteine, in base all'intensità dei pixel.
Una volta padroneggiata, l'analisi delle immagini può essere completata in due ore e la configurazione del sequenziamento dell'RNA può essere completata in tre ore, se ogni tecnica viene eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di assicurarsi che tutti i reagenti siano caricati correttamente nelle posizioni corrette e che non vi siano perdite nel sequencer. Seguendo questa procedura, altri metodi, come il micro RNA, l'esoma o il sequenziamento delle mastociti possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande sull'espressione globale del micro RNA, sulla mutazione genica o sulla metilazione del DNA, rispettivamente.
Quindi, dopo il suo sviluppo, questa tecnica aiuterà i ricercatori nel campo dell'analisi dell'imaging cellulare, e il sequenziamento di prossima generazione per esplorare l'effetto dell'inquinante ambientale sull'espressione genica e sulla funzione proteica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impostare il sequenziamento di nuova generazione e l'analisi dell'imager della colocalizzazione delle proteine. Non dimenticare che lavorare con sostanze chimiche inquinanti tossiche nei campioni di sangue umano può essere estremamente pericoloso.
Nell'eseguire queste procedure devono sempre essere prese precauzioni quali l'uso di una cappa aspirante chimica e di dispositivi di protezione individuale.
