Jessica Goldshteyn teknik destek için teşekkür ederiz. Şarkı laboratuvar çalışmalarında NIH grant R00NS088211 ve entelektüel ve Gelişme Bozuklukları Araştırma Merkezi (IDDRC) Yeni Program Geliştirme Ödülü tarafından finanse edilmektedir.

1. hazırlanması kültür plakaları ve şişeler
<ol><li>Üzüm suyu Ağar kaplamalar hazırlanması<ol>
<li>Agar toz, 200 mL üzüm suyu ve 192 mL GKD2O 10 g bir kabı ve mikrodalga fırında yaklaşık 4-5 dk, zaman zaman agar tamamen eriyene kadar karıştırarak ekleyin.</li>
		<li>Yaklaşık 60 ° C'ye çözüm bir duman başlık, sakin 4,2 mL % 95 etanol ve 4.0 mL buzul Asetik asit ekleyin. GKD2O. Mix ile 400 mL çözüm hacmi de ayarlayın.</li>
		<li>Her 35-mm plaka için yaklaşık 2-3 mL çözüm ekleyin. Yaklaşık 400 mL üzüm suyu agar çözüm olmak üzere toplam 120-150 tabak olun.</li>
		<li>Plakayı serin ve agar çözüm kuvvetlendirmek 10 dakika bekleyin. Üzüm suyu Ağar kaplamalar kendi kendine mühürlü kilitli torbalar içinde paketi ve ileride kullanmak üzere 4° C'de depolayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Drosophila kültür şişe hazırlanması<ol>
<li>Bir bıçak bir 1,5 cm yan uzunluğu üçgen Drosophila kültür şişe bir duvarda delik ve pamuk havalandırma için bir 2-2.5 cm çapında top ile delik doldurmak için kullanın.</li>
		<li>Bir üzüm suyu agar plaka ile 0.5 cm3 hakkında Maya hamur takıma şişe takın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Drosophila larva topluluğu
<ol><li>Yetişkin sinekler haçlar ayarla<ol>
<li>Yer 10 bakire kadın ve 5 erkek yetişkin uçar birlikte ile üzüm suyu agar plaka takılı bir kültür şişe.</li>
		<li>Sinekler yumurta üzüm suyu agar plaka üzerinde yatıyordu olacaktır böylece şişe dipleri 25 ° C'de yerleştirin. Maya yapıştır ile plaka günde en az bir kez değiştirin. 20'den fazla bakire kadın ve 10 adım 2.1.1 erkeklerde ile homojen bir gelişimsel sahne larvaları hasat veren bir 2-h koleksiyonu süre başlar.</li>
		<li>Kültür plaka 60 mm Petri kabına ıslak peçete ile 25° c, % 0.5 propiyonik asit çözümde batırılmış. Oksijen akışını engellemek değil doku düzenleyin. Not: Propionik asit çözüm çanak nem korumak ve küf oluşumunu önlemek için kullanılır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Belirli bir yaş larvaları hasat<ol>
<li>Forseps çifti Maya Yapıştır olmadan yeni bir üzüm suyu agar plakasına larva istenen sahne alanı, örneğin, 2nd 3rd INSTAR larva 48-72 saat sonra yumurta (AEL), döşeme için aktarmak için kullanın.</li>
		<li>Maya larva'nın cilt onlara izin vererek potansiyel Maya lazer axotomy ve görüntüleme ile engellemesini önlemek için yeni tabakta etrafında gezinme kaldırmak. Alternatif olarak, iyice larvalar PBS bir tabak içinde yıkama ve kısaca doku kağıt parçasına kurutma temizleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. İki fotonlu yaralanma ve Confocal görüntüleme
<ol><li>Mikroskop Kur Not: mikroskop ile iki fotonlu lazer tarama confocal lazer bu deneme için kullanılan, ancak eşdeğer bir kurulum diğer sistemlerle de yeterli olacaktır. İki fotonlu lazer (930 nm) yaralanma ve Argon lazer teslim etmek için kullanılan (488 nm) GFP confocal görüntüleme için kullanıldı.<ol>
<li>Her oturumun başlangıcında İki fotonlu lazer ve/veya confocal lazer ve mikroskop açın. Görüntüleme yazılımını açın.</li>
		<li>İki fotonlu yaralanma için 930 adlı iki fotonlu lazer ile GFP görüntüleme için aşağıdaki parametreleri ayarla nm (1.950 mW).<ol>
<li>Satır tarama modu seçin. İğne deliği kadar sonuna kadar açın. ~ % 20 lazer yoğunluk artmak (390 mW).</li>
			<li>512 x 512 çerçeve tarama olarak seçin. Maksimum tarama hızı (genellikle ile piksel Işınma Zamanı, 0,77 µs) kullanın. Ortalama numarası 1'dir ve bit derinliği 8 bit olduğundan emin olun.</li>
			<li>~ 750 ve uzaklık 0 set kazanç.</li>
			<li>Deneysel protokol bırakmak için kolay 2 P GFP 930 ablasyon, olarak yeniden gelecekte bu önceden ayarlanmış deneyleri.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Confocal görüntüleme için 488, Argon lazer ile GFP görüntüleme için aşağıdaki parametreleri ayarla nm:<ol>
<li>Satın alma sekmesini ve ardından Z-yığınıseçin.</li>
			<li>"Lazeraltında", 488 nm Argon lazer için açın.</li>
			<li>Gidin kanalları, 488 mm lazer seçin ve % 5-10 lazer gücünü arttırın. İğne deliği ve sondaj için 1-2 havadar birimi (AU) kullanın. 650 kazanç ayarlayın.</li>
			<li>Toplama modu, 1024 x 1024 çerçeve tarama kadar seçin, kullanmak en yüksek tarama hızı, ortalama sayısı 2 ve 8 Bit bit derinliği.</li>
			<li>Bu önceden belirlenmiş deneysel protokol GFP Imagingkaydedin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Larva anestezi Dietil eter ve montaj ile<ol>
<li>Bir duman başlık, 60 mm cam tabak 15 cm plastik Petri kabına yerleştirin. Kat ve doku kağıt cam tabak dibinde yatıyordu sonra doku üzerinde bir üzüm suyu agar tabak yerleştirin. Dietil eter cam tabak içine noktası burada dokulu kağıt ıslatılır ve sıvı eter tabakta kalan bir katmanı ekleyin. Ağzını her zaman tut.</li>
		<li>Halocarbon bir damla ile bir cam slayt merkezi 27 petrol hazırlayın. 4 noktalar üzerine daha sonra coverslip desteklemek için slayt, dört köşesine vakum yağ ekleyin.</li>
		<li>Forseps kullanmak kadar temizlenmiş bir larva almak ve agar plaka 60 mm cam tabak yerleştirin. Cam çanak kapağı ile kapak ve larva hareket etmeyi durdurana kadar bekleyin. PNS yaralanma/görüntülemesi için kuyruğunu seğirmesi durur larva sok. MSS için tüm larva hareketsiz, hale gelinceye kadar bekleyin özellikle baş kesimleri. Not: Eter pozlama zamanlaması çok önemlidir. Tartışma bakın.</li>
		<li>Dikkatle imzalat larva kadar almak ve kafa-dik halocarbon petrol slayt üzerinde damla içine yerleştirin. Bir coverslip slayt üzerine ekleyin. Hafif basınç larva (şekil 1A) dokunana kadar coverslip üzerinde aşağı doğru itin için kullanın.</li>
		<li>Böylece nöron/axon/dendrite ilgi en iyi ve en yakın mikroskop objektif yavaşça coverslip sola veya sağa larva, rulo doğru iterek larva'nın pozisyonunu ayarlayýn.</li>
		<li>Her iki tracheas görünecek şekilde PNS yaralanma için larva dorsal tarafta, binin. Daha sonra larva Sınıf III da nöron akson (şekil 1B ve 1 C), sınıf IV da nöron akson (şekil 1B ve 1E) yaralamak için 90 derece veya yaralanmasına sınıf IV da nöron dendrites () için ~ 30 derece yaralamak için soldaki ~ 30 derece alın Şekil 2A).</li>
		<li>CNS yaralanma için faiz mikroskop objektif z düzlemde yakın olan bölgedir (şekil 3A), mükemmel ventral taraftan olmak larva konumlandırın.</li>
	</ol></li>
	<li>İki fotonlu lazer yaralanma<ol>
<li>Mikroskop altında larva içeren slaydı yerleştirin ve Sahne Alanı'nda ile slayt sahibi yerine sabitleyin. Larva bulmak için kullanım 10 X (0.3 NA) amaç.</li>
		<li>Objektif yağ coverslip üzerine 1 damla eklemek, geçiş (1.3 NA) X 40 amaç ve odağı ayarlayın.</li>
		<li>Tarama moduna geçirin ve deneysel protokol 2 P GFP 930 ablasyonyeniden kullanabilirsiniz. İğne deliği ve sondaj ta açıldığında emin olun. Not: Yapılandırma en iyi şekilde bireysel sistemlere dayalı gerekiyor.</li>
		<li>Faiz (ROI) bölge bulmak için Live modda başlatma ve uygun zoom ile iyi bir görüntü kalitesi elde etmek için ayarları ayarlama. Not: Bu adımın amacı en iyi kalitede görüntü alarak yerine zarar için nöron/axon/dendrite bulmak mümkün. Bu nedenle, en az ayarlar hedef alan görselleştirmek için yeterli dozun veya photobleaching önlemek için kullanın.</li>
		<li>Kırp düğmesini-ecek var olmak elde edilebilir Live tarama, durdurun. Yol haritası hizmet sabit görüntü ver. Ekin işlevi seçin ve hedef üzerinde yaralı olmak odaklanmak için tarama penceresi ayarlamak.</li>
		<li>Yaralanma potansiyel sitesinin olarak yatırım Getirisi azaltmak. Örneğin, bir akson veya yaralanma duyarlığını sağlamak ve komşu dokulara zarar azaltmak için bir dendrite genişliğini kapsar. İstenirse, yatırım Getirisi üzerinde kırpmadan önce daha kesin yaralanma için izin zum.</li>
		<li>Yeni bir görüntü penceresini açın. İnceden inceye gözden geçirmek hız azaltmak ve lazer yoğunluk artmak. Live modda taranan doku Floresans sinyal dayalı lazer yoğunluk artışı belirlemek.</li>
		<li>Genellikle, PNS yaralanma için % 25 ve 50-%100 VNC zarar görme başlayarak iki fotonlu lazer yoğunluğu ayarlanabilir. PNS axon yaralanma için lazer yoğunluğu ~ 480 mW ve piksel olması Işınma Zamanı 8.19 μs. VNC axon yaralanma için lazer yoğunluğu ve piksel Işınma Zamanı genellikle 965-1930 mW ve 8.19 32.77 μs, sırasıyla olması.</li>
		<li>Sürekli tarama başlatır. Sürekli düğmenin üzerine hovering imleç bırakın. Resmine bir göz kulak olun ve floresan ciddi bir artış gözlenen Taramayı durdurmak. Not: Otomatik-floresan yaralanma sitesinde Floresans iğnenin görünümü kaynaklanmaktadır.</li>
		<li>Tekrar canlı moduna ayarların yeniden kullanarak geçiş. Sadece odak noktası ayarlayarak hedef aldı faiz bölgesini bulun. Not: Küçük krater, yüzük benzeri yapıda veya yaralanma yerinde tam yerelleştirilmiş enkaz görünümünü başarılı yaralanma iyi bir göstergesidir.</li>
		<li>Sonraki nöron geçin ve birden çok tek bir hayvan nöronlarda incitmek 3.3.5, adım. Veya 3.3.5 yavaş yavaş artan gücü ve/veya ilk yaralanma yetersiz olsaydı tarama hızını azaltarak süre arasındaki adımları yineleyin. Not: Bu da lazer güç durumda yüksek, büyük hasarlı bölgeyi sonrası yaralanma canlı tarama görüntü görünür. Çok fazla yaralanma larva ölüm sebebi.</li>
		<li>Dikkatle coverslip kaldırarak ve Maya yapıştır ile yeni bir plaka üzerine yaralı larva transfer larva kurtarmak. Birkaç mağara agar plaka üzerinde Forseps ile hendek; Alternatif olarak, agar adasını bütün tabağı tabak dışarı sürünerek larva olasılığını azaltmak için kullanmak yerine tabak içinde olun.</li>
		<li>Islak mendil (% 0.5 propiyonik asit çözüm batırılmış) ve kültür oda sıcaklığında veya 25 ° c ile 60 mm kabında plaka koymak Not: Larva larva aşamasında yaklaşık, oda sıcaklığında (22 ° C) 25 ° C'de göre fazladan bir gün kalır</li>
	</ol></li>
	<li>Sonrası yaralanma confocal görüntüleme<ol>
<li>Görüntü anestezi ve montaj adım 3.2, confocal lazer ile görüntüleme gibi aynı yordam kullanılarak larva hazırlanıyor tarafından istenen saat noktalarda yaralı larva. Not: larva aksonal yaralanma onaylamak için yaralanma (AI) sonra 24 saat ve 48 h AI (sınıf IV da nöronlar) veya 72 h rejenerasyon değerlendirmek için AI (sınıf III da nöronlar) görüntü.</li>
		<li>10 X amacı istimal larva bulun, sonra geçiş için bir 25 X (0.8 NA) amaç. Deneysel iletişim kuralı GFP Imagingyeniden.</li>
		<li>Live düğmesini tıklatın ve daha önce yaralı aynı nöron bulmak.</li>
		<li>İlk ve son Z pozisyonları canlı tarama penceresinde ayarlayın. Dur tuşuna basın ve Z-yığın görüntü elde etmek için deneme Başlat'ı tıklatın. Not: bir normalleştirme noktası (axon yakınsak nokta) miktar rejenerasyon mümkündür görüntüleri yakalarken dahil olduğundan emin olun (şekil 1 d, 1F) – bu anlatılan veri analiz bölümünde daha fazla.</li>
		<li>Görüntü işlemeiçin geçiş, yeni çekilen görüntüyü seçin ve en fazla yoğunluk projeksiyon oluşturmak. Z-yığın ve maksimum yoğunluk projeksiyon görüntüleri kaydetmek.</li>
	</ol></li>
</ol>4. veri analizi
<ol><li>İşleme ve görüntüleme yazılımı veya ImageJ kullanarak görüntüleri ölçmek.</li>
	<li>Miktar PNS axon rejenerasyon<ol>
<li>Rejenerasyon yüzdeyüzde aksonlar lesioned akson arasında Yenileyici anlamına gelir, hesaplar. Yaralanma sitesi regrows sürece Yenileyici olarak bir akson puan.</li>
		<li>Axon uzunluğu artış olan ölçü rejenerasyon uzunluğu. ImageJ ile miktarının rejenere axon izlemek için Parçalı çizgi aracını kullanın ve ölçü birimi Çözümle açılır menüsünde rejenere axon temsil eden çizgiyi uzunluğunu elde etmek için kullanın.</li>
		<li>Yeniden oluşturma işlemi dizin, normalleştirilmiş axon uzunluğu artış olduğu hesaplanır. Not: Axon uzunluğu hücre beden ve noktası (DCAC)-axon uzunluğu/DCAC (şekil 1 d ve 1F) yakınsak akson arasındaki mesafeye göre normalleştirilmiş. Bu değer hesabı larva ölçekleme nedeniyle herhangi bir aksonal büyüme için yardımcı olur. Değeri yeniden oluşturma işlemi temsil eden, 0 değeri yok yenilenme anlamına gelir ve negatif bir değer geri çekilmesi anlamına gelir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Miktar dendrite rejenerasyon<ol>
<li>Açık dendrite büyütme göstermek bu kopmuş arasında da nöronların yüzde olan rejenerasyon yüzdesini, hesaplar. Not: Eğer yeni olumlu dendrites dışarı retrakte dendritik kök ve yaralanma sitesi ötesinde regrow gibi Dendrite büyütme attı. Yaralanma sitesi tarafından yerler ve bazı durumlarda belirlenir, kalan yaralanma kaynaklı autofluorescence nedeniyle kolayca görülebilir.</li>
		<li>Yeni dendritik şube noktaları eklenmesinden sonra yaralanma sayar şube noktaları artırmak, hesaplayın.</li>
		<li>Yaralanma sonra eklenen tüm yeni dendrites toplam uzunluğu olan Toplam dendrite uzunluğunu artırmak, hesaplayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Miktar MSS axon rejenerasyon Not: bir lezyon site görüntüsü ilk kez noktada (şekil 3B) dejenerasyonu gösteriyorsa, rejenerasyon uzunluk ve hızı analizinde eklenecektir.<ol>
<li>Regrowing akson uzunluğu olan ölçü rejenerasyon uzunluğu. Not: bir tek lezyon sitesinin regrowing akson yaralanma önce özgün axon yol kapalı kaynaklı olarak tanımlanır.</li>
		<li>NORMALIZED yenilenme uzunluğuolan komissür kesimin - commissures ( şekil 3A ve 3B"Y") arasındaki boyuna mesafe uzunluğu rejenerasyon uzunluğa normalleştirir, hesaplayın. Not: Bu değer doğru larva boyutu farklılıklar etkisi için yardımcı olur.</li>
		<li>Kesimleri arasında belirli bir genotip yenilenme kapasitesi yansıtacak şekilde lesioned tüm kesimlerini Yenileyici yüzde yenilenme oranı, hesaplayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yakura, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Recovery following spinal cord injury. , (1996).</li><li>Harel, N. Y., Strittmatter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+regenerating+axons+recapitulate+developmental+guidance+during+recovery+from+spinal+cord+injury?.">Can regenerating axons recapitulate developmental guidance during recovery from spinal cord injury?.</a> Nature reviews. Neuroscience. 7, 603-616 (2006).</li><li>Jurewicz, A., Matysiak, M., Raine, C. S., Selmaj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+Nogo-A,+an+inhibitor+of+axonal+regeneration,+as+a+biomarker+for+multiple+sclerosis.">Soluble Nogo-A, an inhibitor of axonal regeneration, as a biomarker for multiple sclerosis.</a> Neurology. 68, 283-287 (2007).</li><li>Yiu, G., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+inhibition+of+CNS+axon+regeneration.">Glial inhibition of CNS axon regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 7, 617-627 (2006).</li><li>Sun, F., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+intrinsic+barriers+for+axon+regeneration+in+the+adult+CNS.">Neuronal intrinsic barriers for axon regeneration in the adult CNS.</a> Curr Opin Neurobiol. , (2010).</li><li>Liu, B. P., Cafferty, W. B., Budel, S. O., Strittmatter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+regulators+of+axonal+growth+in+the+adult+central+nervous+system.">Extracellular regulators of axonal growth in the adult central nervous system.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 361, 1593-1610 (2006).</li><li>Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+intrinsic+mechanisms+of+axon+regeneration.">Neuronal intrinsic mechanisms of axon regeneration.</a> Annu Rev Neurosci. 34, 131-152 (2011).</li><li>Schwab, M. E., Strittmatter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nogo+limits+neural+plasticity+and+recovery+from+injury.">Nogo limits neural plasticity and recovery from injury.</a> Curr Opin Neurobiol. 27, 53-60 (2014).</li><li>He, Z., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Control+of+Axon+Regeneration.">Intrinsic Control of Axon Regeneration.</a> Neuron. 90, 437-451 (2016).</li><li>Park, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+axon+regeneration+in+the+adult+CNS+by+modulation+of+the+PTEN/mTOR+pathway.">Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway.</a> Science. 322, 963-966 (2008).</li><li>Geoffroy, C. G., Hilton, B. J., Tetzlaff, W., Zheng, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+Age-Dependent+Decline+in+Axon+Regeneration+in+the+Adult+Mammalian+Central+Nervous+System.">Evidence for an Age-Dependent Decline in Axon Regeneration in the Adult Mammalian Central Nervous System.</a> Cell Rep. 15, 238-246 (2016).</li><li>Geoffroy, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+PTEN+and+Nogo+Codeletion+on+Corticospinal+Axon+Sprouting+and+Regeneration+in+Mice.">Effects of PTEN and Nogo Codeletion on Corticospinal Axon Sprouting and Regeneration in Mice.</a> J Neurosci. 35, 6413-6428 (2015).</li><li>Jin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+skilled+locomotion+by+sprouting+corticospinal+axons+induced+by+co-deletion+of+PTEN+and+SOCS3.">Restoration of skilled locomotion by sprouting corticospinal axons induced by co-deletion of PTEN and SOCS3.</a> Nat Commun. 6, 8074 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regeneration+induced+by+blockade+of+glial+inhibitors+coupled+with+activation+of+intrinsic+neuronal+growth+pathways.">Axonal regeneration induced by blockade of glial inhibitors coupled with activation of intrinsic neuronal growth pathways.</a> Exp Neurol. 237, 55-69 (2012).</li><li>Fang, Y., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+degeneration+and+regeneration:+insights+from+Drosophila+models+of+nerve+injury.">Axon degeneration and regeneration: insights from Drosophila models of nerve injury.</a> Annual review of cell and developmental biology. 28, 575-597 (2012).</li><li>Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+genes+and+cells+in+the+nervous+system+of+the+fruit+fly.">Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly.</a> Neuron. 72, 202-230 (2011).</li><li>Leyssen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+precursor+protein+promotes+post-developmental+neurite+arborization+in+the+Drosophila+brain.">Amyloid precursor protein promotes post-developmental neurite arborization in the Drosophila brain.</a> The EMBO journal. 24, 2944-2955 (2005).</li><li>MacDonald, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+cell+corpse+engulfment+receptor+Draper+mediates+glial+clearance+of+severed+axons.">The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons.</a> Neuron. 50, 869-881 (2006).</li><li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+Drosophila+sensory+neuron+axons+and+dendrites+is+regulated+by+the+Akt+pathway+involving+Pten+and+microRNA+bantam.">Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam.</a> Genes Dev. 26, 1612-1625 (2012).</li><li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+axon+regeneration+by+the+RNA+repair+and+splicing+pathway.">Regulation of axon regeneration by the RNA repair and splicing pathway.</a> Nat Neurosci. 18, 817-825 (2015).</li><li>Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glial+regenerative+response+to+central+nervous+system+injury+is+enabled+by+pros-notch+and+pros-NFkappaB+feedback.">The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by pros-notch and pros-NFkappaB feedback.</a> PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).</li><li>Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Drosophila+model+of+nerve+injury+reveals+an+essential+role+of+Nmnat+in+maintaining+axonal+integrity.">A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity.</a> Curr Biol. 22, 590-595 (2012).</li><li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+turnover+of+the+Wallenda/DLK+kinase+regulates+a+retrograde+response+to+axonal+injury.">Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury.</a> J Cell Biol. 191, 211-223 (2010).</li><li>Brace, E. J., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+axon+regeneration+in+Drosophila.">Models of axon regeneration in Drosophila.</a> Exp Neurol. 287, 310-317 (2017).</li><li>Hao, Y., Collins, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+mechanisms+for+axon+regeneration:+insights+from+injured+axons+in+Drosophila.">Intrinsic mechanisms for axon regeneration: insights from injured axons in Drosophila.</a> Curr Opin Genet Dev. 44, 84-91 (2017).</li><li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation.">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).</li><li>Sugimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+developmental+modes+and+lesion-induced+reactions+of+dendrites+of+two+classes+of+Drosophila+sensory+neurons.">Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons.</a> J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).</li><li>Yanik, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosurgery:+functional+regeneration+after+laser+axotomy.">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432, 822 (2004).</li><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+neuronal+regeneration+is+influenced+by+life+stage,+ephrin+signaling,+and+synaptic+branching.">Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15132-15137 (2007).</li><li>Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+up-regulation+of+microtubule+dynamics+and+polarity+reversal+during+regeneration+of+an+axon+from+a+dendrite.">Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite.</a> Mol Biol Cell. 21, 767-777 (2010).</li><li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons.">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129, 2867-2878 (2002).</li><li>Kang, H., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+axon+regeneration+and+muscle+reinnervation+in+young+adult+and+aged+animals.">Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals.</a> J Neurosci. 33, 19480-19491 (2013).</li><li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+regeneration+of+retinal+ganglion+cells+following+axotomy:+effects+of+osteopontin+and+mTOR+signaling.">Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling.</a> Neuron. 85, 1244-1256 (2015).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li><li>Grueber, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system:+links+with+peripheral+dendrite+morphology.">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li><li>Buss, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NG2+and+phosphacan+are+present+in+the+astroglial+scar+after+human+traumatic+spinal+cord+injury.">NG2 and phosphacan are present in the astroglial scar after human traumatic spinal cord injury.</a> BMC Neurol. 9, 32 (2009).</li><li>McKeon, R. J., Jurynec, M. J., Buck, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chondroitin+sulfate+proteoglycans+neurocan+and+phosphacan+are+expressed+by+reactive+astrocytes+in+the+chronic+CNS+glial+scar.">The chondroitin sulfate proteoglycans neurocan and phosphacan are expressed by reactive astrocytes in the chronic CNS glial scar.</a> J Neurosci. 19, 10778-10788 (1999).</li><li>Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+nanosurgery+and+cell+enucleation+using+a+picosecond+laser.">Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser.</a> J Microsc. 234, 1-8 (2009).</li><li>Hutson, M. S., Ma, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+and+cavitation+dynamics+during+pulsed+laser+microsurgery+in+vivo.">Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo.</a> Phys Rev Lett. 99, 158104 (2007).</li><li>Venugopalan, V., Guerra, A., Nahen, K., Vogel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+laser-induced+plasma+formation+in+pulsed+cellular+microsurgery+and+micromanipulation.">Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation.</a> Phys Rev Lett. 88, 078103 (2002).</li><li>Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+nanoaxotomy+properties+and+their+effect+on+axonal+recovery+in+C.+elegans.">Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans.</a> Opt Express. 16, 5963 (2008).</li><li>O'Brien, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Tsai, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma-mediated+ablation:+an+optical+tool+for+submicrometer+surgery+on+neuronal+and+vascular+systems.">Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 90-99 (2009).</li><li>Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+AFD+neuron+in+C.+elegans+thermotaxis+analyzed+using+femtosecond+laser+ablation.">The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation.</a> BMC Neurosci. 7, 30 (2006).</li><li>Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+a+low-budget+laser+axotomy+system+to+study+axon+regeneration+in+C.+elegans.">Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans.</a> J Vis Exp. , (2011).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Sinek kurma geçer zaman, dişi ve erkek kullanılan sayısı genotip ve belirli deneyler için gerekli larva sayısı bağlı olarak değişebilir. WT sinekler için tipik çapraz 10 kadın ve 5 erkek kullanır. Toplama penceresi, larva yönlendirmesiyle doğruluğunu bağlı olarak daralmış. Örneğin, 2-h koleksiyon dönem larva daha homojen bir nüfus ortaya çıkarır. Bu durumda, haçlar ayarlamak için 20 veya daha fazla bakire kadın kullanmak yeterli yumurta verim yardımcı olur. İlk günden verimidir genell...

Merkezi sinir sistemi (MSS), bir yaralanma sonra yeniden akson ve yetersizlik hastalarda kalıcı engelli yol açabilir ve aynı zamanda geri dönüşü olmayan nörolojik açıkları nörodejeneratif hastalıkları1,2'deki bir rol oynar ,3,4,5. CNS çevre gibi yaşarsan, içsel büyüme yetenek aksonlar travmadan sonra yeniden oluşturmak mümkün olup olmadığını belirler. Oligodendrocyte, astroglial ve fibroblastic kaynakları hücre dışı etkenler engel nöronal büyüme4,6,7,8, ama bu moleküller ortadan kaldırılması gösterilmiştir Sadece5çimlenme limited için izin verir. İçsel rejenerasyon sinyalleri rejeneratif başarı5,9 etkisi ve potansiyel tedavi hedefleri temsil, ama bu işlemler moleküler düzeyde hala iyi tanımlanmış. Trofik faktör sinyal veya Pten fosfataz10gibi endojen frenler ortadan kaldırılması artışlar aksonal rejenerasyon bazı durumlarda neden olabilir. Farklı yöntemler tek tek etkili olduğu bulundu kombinasyonları da sadece11,12,13,14bugüne kadar sınırlı genel kurtarma sağlar. Bu nedenle, ek yollar hedefe yönelik tedavi tanımlamak için umutsuz bir ihtiyaç vardır. Axon büyütme girişimi ek olarak, olup olmadığını ve nasıl aksonlar reformu synapse özgüllük, doğru hedefe yeniden tel ve elde fonksiyonel iyileşme önemli cevapsız sorular vardır.
Özet olarak, geçerli axon rejenerasyon dikte makine hala çok bölük pörçük anlaşılmasıdır. Sorunun bir parçası olduğunu axon eğitim teknik zorluk içinde gerçek-zaman memelilerde rejenerasyon, pahalı, zaman alıcı ve büyük ölçekli genetik ekranlar yürütmek için zorlu bir yaklaşım. Drosophila melanogaster, öte yandan, karmaşık biyolojik soruların incelenmesi için son derece güçlü bir sistem olduğu ispatlanmıştır. Meyve sineği genler tanımlama ve çarpıcı insanlarda korunmuş yolları sinyal vesile olmuştur ve nörodejeneratif hastalıklar, büyük moleküler genetik araçları aracılığıyla gibi insan koşulları çalışma için başarılı bir model olmuştur Gen işlev15işlemek kullanılabilir. Özellikle, meyve sinekleri genlerin sinir yaralanma ve büyütme15,16dahil keşfi için ideal bir araç olarak kabul edilir. Yetişkin kafa veya larva ventral sinir kablosu (VNC) iğneler, larva VNC veya sinir ezmek ile forseps, larva nöron lazer axotomy, koku reseptör nöron kaldırma, beyin explants yaralanma ile bıçak gibi de dahil olmak üzere birkaç sinek sinirsel hasar modelleri geliştirilmiştir, ve periferik sinir lezyonu kanat kıdem15,17,18,19,20,21,22,23tarafından. Heyecan verici, son iş kullanarak Drosophila yaralanma modelleriyle yanıt vermek için sinir yaralanmaları, bazıları24 memelilerde korunmuş gösterilen sinir sistemi tarafından kullanılan hücresel ve genetik yollar bizim anlayış gelişmiş var. ,25. Yine, bu model organizma tanımlayıcı roman mekanizmaları, sinirsel onarma yardımcı programı vurgular.
Burada açıklanan bir iki fotonlu Lazer tabanlı Drosophila larva duyusal nöron yaralanma modelidir. İki fotonlu lazer ilk Zebra balığı vivo içinde 200326aksonlar kesmek için kullanılmıştır. Aynı yıl, ilk lazer dendriotomy pulsed azot lazer27kullanarak Drosophila içinde gerçekleştirildi. Kısa süre sonra birkaç C. elegans labs femtosecond lazer axon rejenerasyon28modelleri oluşturmak için kullanılan. 2007'de, Wu ve meslektaşları ile karşılaştırıldığında ve lazerler29türleri tarafından indüklenen C. elegans lazer yaralanmaları arasındaki farklar bildirdi. 2010 yılında, akson yeniden oluşturma tamamlandıktan sonra lazer axotomy ilk Drosophila30' u gerçekleşmesi için gösterildi. Bu geniş lazer yaralanma edebiyat bina, yaralanma hedeflenen sitelere kesin indüksiyon ile komşu dokulara az pertürbasyon sağlar, İki fotonlu lazer kullanarak bir sinek sinir yaralanma modeli nispeten temiz sağlayan geliştirdiğimiz Sistem neuroregeneration tek hücreli çözünürlük ile içsel ve dışsal özelliklerini incelemek için. Özellikle, biz her iki periferik sinir sistemi (PNS) bir dizi yaralanma yöntem dendritik arborization (da) duyusal nöronlar için kurduk ve CNS. Öncelikle kendi dendrite dallanma karmaşıklığı tarafından seçkin dört farklı sınıflara da nöronların gruplandırılabilir: sınıf ı IV31. Yayımlanmış çalışmalarımız da nöron rejenerasyonu memeli yaralanma modelleri fenotipik ve moleküler düzeyde benzer gösterir: da nöronların sınıf IV ile sınıf belirli rejenerasyon özelliklerini görüntülemek ama ben veya III da nöronların yenilenme içinde sergilenmesi sınıf PNS; sınıf IV da nöron aksonlar sağlam çevre içinde yeniden ama rejeneratif potansiyellerini önemli ölçüde böylece dorsal kök gangliyon (DRG) nöronlar memelilerde benzeyen MSS azaltılır; mTOR etkinlik Pten yoluyla artırılması silme veya Akt overexpression akson rejenerasyon anında CNS19içinde geliştirir. Bu yaralanma modeli kullanmak, genetik ekranlar sahne olmuştur ve RNA işleme enzim Rtca akson hasarı hücresel stres ve RNA modifikasyon20 bağlanma axon rejenerasyon, evrimsel korunmuş bir inhibitör faktörü olarak belirledik .
Sunulan paradigmada, yaralanma lazer axotomy/dendriotomy yolu ile larva sınıf IV veya III da nöronların, ppk-CD4-tdGFP veya 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo Gal80, sırasıyla etiketli indüklenen. Yaralanma 3rd INSTAR larvaları yaklaşık 48-72 saat için 2nd (h AEL) döşeme yumurta sonra gerçekleştirilir. PNS için axotomy lezyon axon ~ 20-50 µm hücre vücuttan, CNS axotomy ~ 20 µm çapında komissür Kavşağı'nda VNC adlı bir alanı için ve dendriotomy için birincil dendritik şube noktaları bölümüne hedeflenmektedir. Aynı nöron 8-24 h sonra yaralanma (AI) tam transeksiyon onaylamak için ve 48-72 h rejenerasyon değerlendirmek için AI görüntüsü. Hızlandırılmış confocal görüntüleme yoluyla zamanla dejenerasyon ve rejenerasyon yaralı vivo içinde olmuştur bireysel aksonlar/dendrites izlenebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="919">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:444px;">Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous</td>
			<td style="width:155px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:153px;">AC615080010</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:444px;">Halocarbon 27 Oil</td>
			<td style="width:155px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:153px;">59-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS), 20x Concentrate, pH 7.5, supplier # E703-1L</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>97062-948&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar powder, Alfa Aesar, 500GM</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>AAA10752-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grape juice</td>
			<td>Welch&#8217;s</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Ethanol 95% (Reagent Alcohol 95%)</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td style="width:153px;">64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:444px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:444px;">Propionic Acid</td>
			<td style="width:155px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:153px;">U33007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:444px;">Cover Glasses: Rectangles</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">12-544-D</td>
			<td>50 mm X 22 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Zeiss LSM 880 laser scanning microscope</td>
			<td style="width:155px;">Zeiss</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Zen software</td>
			<td style="width:155px;">Zeiss</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:444px;">Chameleon Ultra II</td>
			<td style="width:155px;">Coherent</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a drosophila in vivo injury model for studying neuroregeneration in the peripheral and central nervous system

Hasarlı nöronlar büyütme kapasitesi neuroregeneration ve fonksiyonel iyileşme sinir sistemi travmadan sonra yönetir. Son birkaç on yıl boyunca, çeşitli içsel ve dışsal inhibitör faktörleri axon rejenerasyon sınırlama içinde yer tespit edilmiştir. Ancak, sadece Bu inhibitör ipuçlarını kaldırma ek yasal makine varlığını gösteren başarılı rejenerasyon için yeterli değil. Drosophila melanogaster, meyve sineği örümceklerle korunmuş genler ve sinyal yollar insanlar da dahil omurgalılar ile paylaşır. Sineklerin Tanrısı güçlü genetik araç kutusu iki fotonlu lazer axotomy/dendriotomy ile birleştirerek, biz burada Drosophila duyusal nöron-dendritik arborization (da) nöron yaralanma modeli sistematik olarak roman için eleme için bir platform olarak tarif rejenerasyon düzenleyiciler. Kısaca, bu paradigma bir) hazırlanması larva, b) lezyon indüksiyon dendrite(s) veya axon(s) kullanarak bir iki fotonlu lazer, c) canlı confocal görüntüleme sonrası yaralanma ve d) veri analizi için içerir. Bizim modeli son derece tekrarlanabilir yaralanma tek etiketli nöronlar, akson ve periferik ve santral sinir sistemi iyi tanımlanmış nöronal türlerinden dendrites olanak verir.

Da nöronların fark rejenerasyon periferik ve santral sinir sistemi, aynı zamanda arasında sınıf özgüllük potansiyel göstermek. Bu axon rejenerasyon (sınıf IV PNS yaralanma kullanarak) yanı sıra bu yenilenme (sınıf IV merkezi sinir sistemi yaralanma ve sınıf III PNS yaralanma ile) inhibitör olduğunu için gerekli olan roman faktörleri için ekran için benzersiz fırsatlar sağlar.
PNS Axon rejenerasyon
<p c...

Watch this Scientific Journal Video about A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System at JoVE.com

Periferik ve Merkezi Sinir Sisteminde Nörorejenerasyonun İncelenmesine Yönelik Bir Drosophila In Vivo Yaralanma Modeli | Tıp | Video

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Burada, duyusal nöron - vivo içinde birleştirir dendritik arborization (da) nöron yaralanma modeli, canlı görüntüleme Drosophila , İki fotonlu lazer axotomy/dendriotomy ve güçlü sinek genetik araç, olarak bir iletişim kuralı'nı mevcut olası rehberleri ve neuroregeneration inhibitörleri süzmek için bir platform.

Neuroregeneration periferik ve santral sinir sistemi çalışmak için bir Vivo Drosophila yaralanma modeli

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

a-drosophila-vivo-injury-model-for-studying-neuroregeneration

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Medicine

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Human Biology

Nervous System

SCIENTISTS IN ACTION

9.6K Görüntüleme.  The Children's Hospital of Philadelphia. Burada, duyusal nöron - vivo içinde birleştirir dendritik arborization (da) nöron yaralanma modeli, canlı görüntüleme Drosophila , İki fotonlu lazer axotomy/dendriotomy ve güçlü sinek genetik araç, olarak bir iletişim kuralı'nı mevcut olası rehberleri ve neuroregeneration inhibitörleri süzmek için bir platform.

Video: A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

An in vivo Rodent Model of Contraction-induced Injury and Non-invasive Monitoring of Recovery

Muscle strains are one of the most common complaints treated by physicians. A muscle injury is typically diagnosed from the patient history and physical exam alone, however the clinical presentation can vary greatly depending on the extent of injury, the patient's pain tolerance, etc. In patients with muscle injury or muscle disease, assessment of muscle damage is typically limited to clinical signs, such as tenderness, strength, range of motion, and more recently, imaging studies. Biological markers, such as serum creatine kinase levels, are typically elevated with muscle injury, but their levels do not always correlate with the loss of force production. This is even true of histological findings from animals, which provide a "direct measure" of damage, but do not account for all the loss of function. Some have argued that the most comprehensive measure of the overall health of the muscle in contractile force. Because muscle injury is a random event that occurs under a variety of biomechanical conditions, it is difficult to study. Here, we describe an in vivo animal model to measure torque and to produce a reliable muscle injury. We also describe our model for measurement of force from an isolated muscle in situ. Furthermore, we describe our small animal MRI procedure.

An in vivo Rodent Model of Contraction-induced Injury and Non-invasive Monitoring of Recovery

An in vivo animal model of injury is described. The method takes advantage of the subcutaneous position of the fibular nerve. Velocity, timing of muscle activation, and arc of motion are all pre-determined and synchronized using commercial software. Post injury changes are monitored in vivo using MR imaging/spectroscopy.

Bir In vivo</emDaralma indüklenen Sakatlık ve Kurtarma Non-invaziv İzleme> Kemirgen Model

Muscle strains are one of the most  common complaints treated by physicians. A muscle injury is typically diagnosed from the patient history and  physical ...

Tıp

Technical Aspects of the Mouse Aortocaval Fistula

Technical aspects of creating an arteriovenous fistula in the mouse are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made, and the aorta and inferior vena cava (IVC) are exposed. The proximal infrarenal aorta and the distal aorta are dissected for clamp placement and needle puncture, respectively. Special attention is paid to avoid dissection between the aorta and the IVC. After clamping the aorta, a 25 G needle is used to puncture both walls of the aorta into the IVC. The surrounding connective tissue is used for hemostatic compression. Successful creation of the AVF will show pulsatile arterial blood flow in the IVC. Further confirmation of successful AVF can be achieved by post-operative Doppler ultrasound.

The goal is to produce an arteriovenous fistula that is simple and reproducible. This method does not use sutures or glue adhesive. Therefore the samples can be used with the least amount of foreign materials for analysis.

Fare Aortocaval Fistül Teknik Yönleri

Technical aspects of creating an arteriovenous fistula in the mouse are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made, and the aorta ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic cerebrovascular accidents account for 80% of all strokes. A common cause of IR injury is the rapid inflow of fluids following an acute/chronic occlusion of blood, nutrients, oxygen to the tissue triggering the formation of free radicals.
Ischemic stroke is followed by blood-brain barrier (BBB) dysfunction and vasogenic brain edema. Structurally, tight junctions (TJs) between the endothelial cells play an important role in maintaining the integrity of the blood-brain barrier (BBB). IR injury is an early secondary injury leading to a non-specific, inflammatory response. Oxidative and metabolic stress following inflammation triggers secondary brain damage including BBB permeability and disruption of tight junction (TJ) integrity.
Our protocol presents an in vitro example of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) on rat brain endothelial cell TJ integrity and stress fiber formation. Currently, several experimental in vivo models are used to study the effects of IR injury; however they have several limitations, such as the technical challenges in performing surgeries, gene dependent molecular influences and difficulty in studying mechanistic relationships. However, in vitro models may aid in overcoming many of those limitations. The presented protocol can be used to study the various molecular mechanisms and mechanistic relationships to provide potential therapeutic strategies. However, the results of in vitro studies may differ from standard in vivo studies and should be interpreted with caution.

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

Bir oksijen-Glukoz Yoksunluk ve reoksijenizasyonun<em&gt; In Vitro</em&gt; İskemi-Reperfüzyon Modeli incelenmesi Kan-Beyin Bariyeri Disfonksiyon için

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Pankreas Kanseri Yeni Tedavi Stratejileri Geliştirme Hücre Özellikleri Kök incelenmesi

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

İnsan Tümör ksenogratflarının gelen Fare Hücrelerinin tükenmesi Anlamlı Hedef Hücre Alt Analizi geliştirir

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

A Repetitive Concussive Head Injury Model in Mice

Despite the concussion/ mild traumatic brain injury (mTBI) being the most frequent occurrence of traumatic brain injury, there is still a lack of knowledge on the injury and its effects. To develop a better understanding of concussions, animals are often used because they provide a controlled, rigorous, and efficient model. Studies have adapted traditional animal models to perform mTBI to stimulate mild injury severity by changing the injury parameters. These models have been used because they can produce morphologically similar brain injuries to the clinical condition and provide a spectrum of injury severities. However, they are limited in their ability to present the identical features of injuries in patients. Using a traditional impact system, a repetitive concussive injury (rCHI) model can induce mild to moderate human-like concussion. The injury degree can be determined by measuring the period of loss of consciousness (LOC) with a sign of a transient termination of breathing. The rCHI model is beneficial to use for its accuracy and simplicity in determining mTBI effects and potential treatments.

Concussion presents the most common type of traumatic brain injury. Therefore, a repetitive concussive animal model, which replicates the important features of an injury in patients, may provide a means to study concussion in a rigorous, controlled, and efficient manner.

Farelerde Bir Tekrarlanan Concussive Kafa Travması Modeli

Despite the concussion/ mild traumatic brain injury (mTBI) being the most frequent occurrence of traumatic brain injury, there is still a lack of ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. Moreover, by rupture of the defective vascular wall, atherosclerosis induces occlusive thrombus formation, which represents the main cause of myocardial infarction or stroke and the most frequent cause of death. Despite the advances in the cardiovascular field, many questions remain unanswered, and additional basic research is essential to improve our understanding of the molecular mechanisms during atherosclerosis and its effects. Due to limited clinical studies, there is a need for representative animal models recreating atherosclerotic conditions such as neointima formation after stent implantation, balloon angioplasty, or endarterectomy. Since the mouse presents many advantages and is the most frequently used model for studying molecular processes, the current study proposes an invasive procedure of endothelial denudation, also known as the wire-injury model, which is representative of the human condition of neointima formation in arteries after revascularization procedures.

This study describes an invasive procedure for the induction of accelerated atherosclerosis in mice. In comparison to other methods using electric- or cryo-induced injury, mechanical-induced injury mimics the human condition of restenosis after revascularization therapies and is ideal for the study of the molecular mechanisms involved.

Farelerde Hızlandırılmış Ateroskleroz Indüksiyonu: "Tel-Yaralanma" Modeli

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute respiratory distress syndrome (ARDS), characterized by neutrophilic alveolitis, and injury to both alveolar epithelium and vascular endothelium. Clinically, ARDS is defined by acute onset of hypoxemia, bilateral patchy pulmonary infiltrates and non-cardiogenic pulmonary edema. Human studies have provided us with valuable information about the physiological and inflammatory changes in the lung caused by ARDS, which has led to various hypotheses about the underling mechanisms. Unfortunately, difficulties determining the etiology of ARDS, as well as a wide range of pathophysiology have resulted in a lack of critical information that could be useful in developing therapeutic strategies.
Translational animal models are valuable when their pathogenesis and pathophysiology accurately reproduce a concept proven in both in vitro and clinical settings. Although large animal models (e.g., sheep) share characteristics of the anatomy of human trachea-bronchial tree, murine models provide a host of other advantages including: low cost; short reproductive cycle lending itself to greater data acquisition; a well understood immunologic system; and a well characterized genome leading to the availability of a variety of gene deletion and transgenic strains. A robust model of low pH induced ARDS requires a murine ALI that targets mainly the alveolar epithelium, secondarily the vascular endothelium, as well as the small airways leading to the alveoli. Furthermore, a reproducible injury with wide differences between different injurious and non-injurious insults is important.
The murine gastric acid aspiration model presented here using hydrochloric acid employs an open tracheostomy and recreates a pathogenic scenario that reproduces the low pH pneumonitis injury in humans. Additionally, this model can be used to examine interaction of a low pH insult with other pulmonary injurious entities (e.g., food particles, pathogenic bacteria).

This protocol induces acute lung injury in a mouse that has close fidelity to the pathogenesis of acid pneumonitis observed in humans. We generate a maximal acute nonlethal low pH lung injury and account for differences in rodent-human anatomic respiratory structure using an open tracheostomy coupled with circumferential pressure release.

Akut Akciğer Hasarı Açık Trakeostomi Gastrik Asit Aspirasyon Fare Modeli Maksimal Akut Ölümcül olmayan Akciğer Hasarı Sonuçlar

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues contributes to type 2 diabetes mellitus (T2DM) development and appetite regulation in the hypothalamus. Chemokine CCL5 and C-C chemokine receptor type 5 (CCR5) levels have been suggested to mediate arteriosclerosis and glucose intolerance in type 2 diabetes mellitus (T2DM). In addition, CCL5 plays a neuroendocrine role in the hypothalamus by regulating food intake and body temperature, thus, prompting us to investigate its function in hypothalamic insulin signaling and the regulation of peripheral glucose metabolism.
The micro-osmotic pump brain infusion system is a quick and precise way to manipulate CCL5 function and study its effect in the brain. It also provides a convenient alternative approach to generating a transgenic knockout animal. In this system, CCL5 signaling was blocked by intracerebroventricular (ICV) infusion of its antagonist, MetCCL5, using a micro-osmotic pump. The peripheral glucose metabolism and insulin responsiveness was detected by the Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT). Insulin signaling activity was then analyzed by protein blot from tissue samples derived from the animals.
After 7-14 days of MetCCL5 infusion, the glucose metabolism and insulin responsiveness was impaired in mice, as seen in the results of the OGTT and ITT. The IRS-1 serine302 phosphorylation was increased and the Akt activity was reduced in mice hypothalamic neurons following CCL5 inhibition. Altogether, our data suggest that blocking CCL5 in the mouse brain increases the phosphorylation of IRS-1 S302 and interrupts hypothalamic insulin signaling, leading to a decrease in insulin function in peripheral tissues as well as the impairment of glucose metabolism.

This protocol studies the role of chemokine (C-C motif) ligand 5 (CCL5) in the hypothalamus by delivering an antagonist, MetCCL5, into the mouse brain using a micro-osmotic pump brain infusion system. This transient inhibition of CCL5 activity interrupted hypothalamic insulin signaling, leading to glucose intolerance and peripheral systemic insulin sensitivity.

Hipotalamik insülin sinyal fare beyin içine sürekli uyuşturucu infüzyon sistemi ile periferik glikoz intoleransı için eğitim

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues ...

Tracking Superparamagnetic Iron Oxide-labeled Mesenchymal Stem Cells using MRI after Intranasal Delivery in a Traumatic Brain Injury Murine Model

Stem cell-based therapies for brain injuries, such as traumatic brain injury (TBI), are a promising approach for clinical trials. However, technical hurdles such as invasive cell delivery and tracking with low transplantation efficiency remain challenges in translational stem-based therapy. This article describes an emerging technique for stem cell labeling and tracking based on the labeling of the mesenchymal stem cells (MSCs) with superparamagnetic iron oxide (SPIO)&#160;nanoparticles, as well as intranasal delivery of the labeled MSCs. These nanoparticles are fluorescein isothiocyanate (FITC)-embedded and safe to label the MSCs, which are subsequently delivered to the brains of TBI-induced mice by the intranasal route. They are then tracked non-invasively in vivo by real-time magnetic resonance imaging (MRI). Important advantages of this technique that combines SPIO for cell labeling and intranasal delivery include (1) non-invasive, in vivo MSC tracking after delivery for long tracking periods, (2) the possibility of multiple dosing regimens due to the non-invasive route of MSC delivery, and (3) possible applications to humans, owing to the safety of SPIO, non-invasive nature of the cell-tracking method by MRI, and route of administration.

Presented here is a protocol for non-invasive mesenchymal stem cell (MSC) delivery and tracking in a mouse model of traumatic brain injury. Superparamagnetic iron oxide&#160;nanoparticles are employed as a magnetic resonance imaging (MRI) probe for MSC labeling and non-invasive in vivo tracking following intranasal delivery using real-time MRI.

Travmatik Beyin Hasarı Murine Modelinde İntranazal Doğum sonrası MRG kullanarak Süperparamanyetik Demir Oksit etiketli Mezenkimal Kök Hücrelerin Takibi

Stem cell-based therapies for brain injuries, such as traumatic brain injury (TBI), are a promising approach for clinical trials. However, technical ...