Agradecemos a Jessica Goldshteyn para suporte técnico. Trabalho no laboratório de música é financiado pela concessão de NIH R00NS088211, intelectual e o prêmio de desenvolvimento de programa novo inabilidades desenvolventes Research Center (IDDRC).

1. preparação das placas de cultura e garrafas
<ol><li>Preparação de placas de ágar de suco de uva<ol>
<li>Adicione 10 g de pó de ágar-ágar, suco de uva 200 mL e 192 mL ddH2O em um copo e microondas por cerca de 4-5 min, mexendo intermitentemente até o ágar é dissolvido completamente.</li>
		<li>Em uma coifa, arrefecer a solução para cerca de 60 ° C. Adicione 4,2 mL de etanol 95% e 4,0 mL de ácido acético glacial. Ajuste o volume total da solução para 400 mL com DDQ2Mix O. bem.</li>
		<li>Para cada placa de 35 mm, adicione cerca de 2-3 mL da solução. Faz aproximadamente 120-150 placas para um total de 400 mL de solução de ágar suco de uva.</li>
		<li>Espere 10 minutos para arrefecer as placas e solidificar a solução de ágar. Embalar o suco de uva placas de ágar em sacos ziplock Self selado e armazenar a 4 ° C para uso futuro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação de frascos de cultura de Drosophila<ol>
<li>Use uma lâmina para um buraco de 1,5 cm lado comprimento triangular em uma parede do frasco de cultura da drosófila e enche o buraco com uma esfera de diâmetro de 2 a 2,5 cm de algodão para ventilação.</li>
		<li>Conecte a garrafa com uma placa de ágar de suco de uva suplementada com cerca de 0,5 cm3 de massa de levedura.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. coleção de larvas de Drosophila
<ol><li>Configurar cruzes de moscas adultas<ol>
<li>Lugar 10 fêmeas virgens e 5 masculino adulto voa juntos em um frasco de cultura ligado com uma placa de ágar de suco de uva.</li>
		<li>Coloque o fundo da garrafa a 25° C, para que moscas colocarão ovos na placa de ágar de suco de uva. Mude a placa com fermento pasta pelo menos uma vez por dia. Para um período de coleta 2-h, que permite a colheita de larvas de um grau de desenvolvimento homogêneo, comece com mais de 20 virgens fêmeas e 10 machos na etapa 2.1.1.</li>
		<li>A placa a 25° C, em um prato de Petri de 60-mm com um tecido molhado, por exemplo, embebida em solução de ácido propiônico 0,5% de cultura. Organize o tecido para que ele não bloqueia o fluxo de oxigênio. Nota: A solução de ácido propiônico é usada para manter a umidade no prato e evitar o crescimento de mofo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Larvas de colheita de uma idade específica<ol>
<li>Use um par de pinças para transferir as larvas da fase desejada, por exemplo, 2nd para 3rd ínstar larvas em 48-72 h após a postura (AEL), de ovos para uma nova placa de ágar de suco de uva sem fermento colar.</li>
		<li>Remova o fermento da pele das larvas por deixá-los rastejar ao redor na placa nova, para impedir que potenciais interferindo de levedura axotomy do laser e imagem. Em alternativa, limpe cuidadosamente as larvas por lavá-los em um prato de PBS e secagem brevemente num pedaço de papel de seda.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. dois fotões lesão e imagem latente Confocal
<ol><li>Instalação do microscópio Nota: Para este experimento, utilizou-se um laser confocal microscópio com um laser de dois fotões, mas outros sistemas com uma configuração equivalente também serão suficiente. O laser de dois fotões (930 nm) foi usado para a entrega de lesão e um laser de argônio (488 nm) foi usado para a imagem latente confocal de GFP.<ol>
<li>No início de cada sessão, ligue o laser dois fotões e/ou o laser(s) confocal e o microscópio. Abra o software de imagem.</li>
		<li>Por lesão de dois fotões, configurar os seguintes parâmetros para a imagem latente GFP com o laser de dois fotões em 930 nm (1.950 mW).<ol>
<li>Selecione o modo de varredura de linha. Abra o pinhole todo o caminho. Aumentar a intensidade do laser de ~ 20% (390 mW).</li>
			<li>Selecione 512 x 512 como a varredura de quadro. Use a máxima velocidade de digitalização (normalmente com o tempo de interrupção de pixel em 0,77 µs). Certifique-se que o número médio é 1 e profundidade de bits é de 8 bits.</li>
			<li>Jogo ganho ~ 750, e o deslocamento para 0.</li>
			<li>Salve este protocolo experimental pré-estabelecidos como 2P GFP 930 ablação, permitindo fácil reutilização experiências no futuro.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para a imagem latente confocal, configurar os seguintes parâmetros para a imagem latente GFP com o laser de argônio em 488 nm:<ol>
<li>Selecione a guia de aquisição e Z-pilha.</li>
			<li>Sob o "Laser", liga a energia do laser de argônio 488 nm.</li>
			<li>Vá para canais, selecione o laser 488 mm e aumentar a potência do laser para 5-10%. Para o pinhole, use a unidade arejado de 1-2 (AU). Ajuste o ganho a 650.</li>
			<li>No Modo de aquisição, selecione 1024 x 1024 como a varredura de quadro, use a velocidade de varredura máxima, um número médio de 2 e profundidade de bits de 8 bits.</li>
			<li>Salve este protocolo experimental pré-estabelecidos como GFP Imaging.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Anestesia de larvas com éter dietílico e montagem<ol>
<li>Em uma coifa, coloque um prato de vidro de 60mm em um prato de Petri de plástico de 15 cm. Dobra e coloque um pedaço de papel de tecido na parte inferior do prato de vidro, em seguida, coloque uma placa de ágar de suco de uva no tecido. Adicione éter dietílico para o prato de vidro, até o ponto onde o papel de tecido é encharcado e há uma camada de éter líquido restante no prato. Manter o sigilo em todos os momentos.</li>
		<li>Prepare uma lâmina de vidro com uma gota de halocarbono 27 óleo no centro. Adicione 4 manchas de graxa de vácuo para os quatro cantos do slide, para depois apoiar a lamela.</li>
		<li>Use fórceps para pegar uma larva limpa e coloque-o sobre a placa de ágar-ágar no prato de vidro 60mm. Cubra o prato de vidro com a tampa e espere até que a larva para de se mover. Para PNS lesão/imagens, tire a larva assim que sua cauda parar de tremer. Para o CNS, esperar até que a larva inteira torna-se imóvel, especialmente os segmentos de cabeça. Nota: O tempo de exposição do éter é essencial. Consulte a discussão.</li>
		<li>Cuidadosamente pegue a larva anestesiada e colocá-lo na cabeça-vertical à gota de óleo halocarbono no slide. Adicione uma lamela em cima do slide. Use pressão suave para empurrar para baixo sobre a lamela, até que toca a larva (figura 1A).</li>
		<li>Ajuste a posição da larva empurrando suavemente a lamela para a esquerda ou direita para rolar a larva, para que o neurônio/axônio/dendrito de interesse está no topo e mais próximo à lente do microscópio.</li>
		<li>Por lesão PNS, monte o lado dorsal de larva, para que ambos os tracheas são visíveis. Em seguida, rode a larva ~ 30 graus para a esquerda para ferir axônios de neurônios de classe III da (figura 1B e 1C), 90 graus para ferir axônios de neurônios de classe IV da (figura 1B e 1E) ou ~ 30 graus para ferir classe IV da neurônio dendritos ( Figura 2A).</li>
		<li>Por lesão do CNS, posicione a larva para ser perfeitamente ventral para cima (Figura 3A), para que a região de interesse é mais próxima à lente do microscópio no plano z.</li>
	</ol></li>
	<li>Lesão por dois fotões laser<ol>
<li>Coloque o slide com a larva ao microscópio e fixá-lo no lugar com o suporte do slide no palco. Objetivo de uso a 10 X (0,3 NA) para encontrar a larva.</li>
		<li>Adicione 1 gota de óleo objectiva no sentido do lamela, alterne para o 40 X (NA 1.3) objectivo e ajustar o foco.</li>
		<li>Alterne para o modo de digitalização e reutilizar o protocolo experimental 2P GFP 930 ablação. Certifique-se de que pinhole é aberto todo o caminho. Nota: A configuração precisa ser otimizado com base em sistemas individuais.</li>
		<li>Inicie no modo Live para localizar a região de interesse (ROI) e ajustar as configurações para obter boa qualidade de imagem com o zoom apropriado. Nota: O objetivo desta etapa é encontrar o neurônio/axônio/dendrito para ferir, ao invés de levar a melhor qualidade de imagem. Portanto, use as configurações mínimas suficientes para visualizar a área-alvo, a fim de evitar a superexposição ou fotobranqueamento.</li>
		<li>Interrompa a digitalização de Live , para que o botão recortar se tornará disponível. Deixe a imagem ainda servir como roteiro. Selecione a função Crop e ajustar a janela de digitalização para focar o alvo a ser ferido.</li>
		<li>Reduza o ROI para o tamanho do local da lesão em potencial. Por exemplo, apenas cobrir a largura de um axônio ou um dendrito, para assegurar a precisão da lesão e reduzir os danos aos tecidos vizinhos. Se desejado, amplie o ROI antes de cortar, permitindo a lesão mais preciso.</li>
		<li>Abra uma nova janela de imagem. Reduzir a velocidade de varredura e aumentar a intensidade do laser. Determine o aumento da intensidade do laser com base do sinal de fluorescência do tecido digitalizadas em modo Live .</li>
		<li>Normalmente, defina a intensidade de dois fotões do laser a partir de 25% para lesão PNS e 50-100% para lesões VNC. Por lesão do axônio PNS, certifique-se de que a intensidade do laser é ~ 480 mW e pixel tempo Perm é 8,19 μs. Para a lesão do axônio VNC, certifique-se de que o tempo de interrupção de pixel e intensidade do laser são geralmente 965-1930 mW e 8.19-32,77 μs, respectivamente.</li>
		<li>Começa a varredura contínua . Deixe o cursor pairando sobre o botão de contínuo . Fique de olho na imagem e interromper a digitalização como um drástico aumento na fluorescência é observado. Nota: O aparecimento do pico de fluorescência é devido ao autofluorescência no local da lesão.</li>
		<li>Alternar para o modo de viver reutilizando as configurações. Localizar a região de interesse que foi direcionada apenas ajustando o foco. Nota: Uma boa indicação de lesão bem sucedida é a aparência de uma pequena cratera, estrutura em forma de anel ou detritos localizados bem no local da lesão.</li>
		<li>Mover para o próximo neurônio e repetir da etapa 3.3.5, ferir vários neurônios em um único animal. Ou repita o passo 3.3.5 enquanto gradualmente aumentando a potência e/ou reduzir a velocidade de verificação se a lesão inicial foi insuficiente. Nota: No caso em que a potência do laser é muito alta, uma grande área danificada será visível na imagem de varredura ao vivo pós-lesão. Muito prejuízo pode causar a morte da larva.</li>
		<li>Recupere a larva cuidadosamente removendo a lamela e transferir a larva ferida em um novo prato com pasta de fermento. Vala de várias cavernas na placa de ágar com pinça; Como alternativa, fazer uma ilha de agar na placa em vez de usar a placa inteira, para reduzir a possibilidade da larva rastejando fora da placa.</li>
		<li>Colocar a placa em uma placa de Petri 60mm com tecido molhado (embebido em solução de ácido propiônico 0,5%) e da cultura em temperatura ambiente ou 25° C. Nota: A larva permanecerá na fase larval durante aproximadamente um dia extra em temperatura ambiente (22° C) em comparação com a 25° C.</li>
	</ol></li>
	<li>Imagem latente confocal pós-lesão<ol>
<li>Imagem a larva ferida em pontos de tempo desejado, preparando a larva usando o mesmo procedimento de anestesia e montagem como no passo 3.2, então a imagem com o laser confocal. Nota: A larva em 24 h após a lesão (AI) para confirmar a lesão axonal e em AI (neurônios da classe IV) de 48 h ou 72 h AI (neurônios da III classe) para avaliar a regeneração da imagem.</li>
		<li>Localize a larva usando o objectivo X 10 e, em seguida, alternar para um 25 X (0,8 NA) objectivo. Reutilize o protocolo experimental GFP Imaging.</li>
		<li>Clique no botão Live e encontrar o mesmo neurônio ferido anteriormente.</li>
		<li>Defina as posições de Z primeiras e o últimas na janela de verificação ao vivo. Pressione o botão stop e clique Iniciar experiências para adquirir uma imagem de Z-pilha. Nota: Certifique-se que uma normalização (ponto o axônio convergentes) é incluído quando a captura de imagens para que a quantificação da regeneração é possível (Figura 1, 1F) – isto é discutido mais na seção de análise de dados.</li>
		<li>Alterne para o Processamento de imagem, selecione a imagem que acaba de tomar e gerar uma projeção de intensidade máxima. Salve o z-pilha e intensidade máxima projeção imagens.</li>
	</ol></li>
</ol>4. análise de dados
<ol><li>Processar e quantificar imagens usando a imagem software ou ImageJ.</li>
	<li>Quantificação da regeneração do axônio no PNS<ol>
<li>Calcule a percentagem de regeneração, que refere-se a porcentagem de regeneração de axônios entre todos os axônios que estavam lesionados. Marca um axônio como regeneração, enquanto regrows além do local da lesão.</li>
		<li>Medida comprimento de regeneração, que é o aumento no comprimento do axônio. Se quantificar com ImageJ, use a ferramenta de Linha segmentada para rastrear o axônio regenerado e usar medida no menu suspenso Analyze para obter o comprimento da linha que representa o axônio regenerado.</li>
		<li>Calcule o Índice de regeneração, que é o aumento no comprimento do axônio normalizado. Nota: O comprimento do axônio é normalizado pela distância entre o corpo celular e axônio convergindo ponto (DCAC) – comprimento do axônio/DCAC (Figura 1 e 1F). Esse valor ajuda a conta para qualquer crescimento axonal que é devido à escamação larval. Um valor positivo representa a regeneração, um valor de 0 significa que não há regeneração e um valor negativo significa retração.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantificação da regeneração dendrito<ol>
<li>Calcule porcentagem regeneração, que é a porcentagem de neurônios entre todos aqueles cortada que mostram o óbvio dendrito regrowth. Nota: Dendrito rebrota é marcada como positivos se novas dendrites crescerem fora do tronco dendrítica retraído e além do local da lesão. O local da lesão é determinado pelos pontos de referência e, em alguns casos, é prontamente visível devido a autofluorescência induzida por lesão residual.</li>
		<li>Calcule o aumento de pontos de ramificação, que conta com a adição de novos pontos de ramificação dendrítica após lesão.</li>
		<li>Calcule o aumento do comprimento total dos dentritos, que é o comprimento cumulativo de todos os dendritos novos adicionados após a lesão.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantificação da regeneração do axônio no SNC Nota: Se um site de lesão mostra degeneração no primeiro tempo ponto fotografado (Figura 3B), ele será incluído na análise do comprimento de regeneração e taxa.<ol>
<li>Medida comprimento de regeneração, que é o comprimento do axônio renováveis. Nota: O axônio renováveis de um site de lesão única é identificado como se origina fora da rota original do axônio antes da lesão.</li>
		<li>Calcule o comprimento de regeneração Normalized, que normaliza o comprimento de regeneração para o comprimento do segmento de comissura - a distância longitudinal entre comissuras ("Y" na Figura 3A e 3B). Nota: Este valor ajuda correto para o efeito das diferenças de tamanho larval.</li>
		<li>Calcule a taxa de regeneração, que é a porcentagem de regeneração de segmentos entre todos os segmentos que foram lesados, para refletir a capacidade de regeneração de um determinado genótipo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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S., Ma, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+and+cavitation+dynamics+during+pulsed+laser+microsurgery+in+vivo.">Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo.</a> Phys Rev Lett. 99, 158104 (2007).</li><li>Venugopalan, V., Guerra, A., Nahen, K., Vogel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+laser-induced+plasma+formation+in+pulsed+cellular+microsurgery+and+micromanipulation.">Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation.</a> Phys Rev Lett. 88, 078103 (2002).</li><li>Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+nanoaxotomy+properties+and+their+effect+on+axonal+recovery+in+C.+elegans.">Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans.</a> Opt Express. 16, 5963 (2008).</li><li>O'Brien, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Tsai, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma-mediated+ablation:+an+optical+tool+for+submicrometer+surgery+on+neuronal+and+vascular+systems.">Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 90-99 (2009).</li><li>Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+AFD+neuron+in+C.+elegans+thermotaxis+analyzed+using+femtosecond+laser+ablation.">The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation.</a> BMC Neurosci. 7, 30 (2006).</li><li>Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+a+low-budget+laser+axotomy+system+to+study+axon+regeneration+in+C.+elegans.">Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans.</a> J Vis Exp. , (2011).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Quando atravessa a criação de mosca, o número de fêmeas e machos usados pode variar dependendo dos genótipos e o número de larvas que precisava para experiências específicas. Para moscas WT, típica Cruz usa 10 fêmeas e 5 machos. A janela de coleção pode ser reduzida, dependendo da precisão da larvas era necessária. Por exemplo, um período de 2-h coleção irá produzir larvas de uma população mais homogênea. Neste caso, usar 20 ou mais virgens fêmeas para configurar as cruzes ajudará a produzir ovos s...

A incapacidade de axônios de regeneração após uma lesão ao sistema nervoso central (CNS), pode causar deficiência permanente em pacientes e também desempenha um papel nos déficits neurológicos irreversíveis na de doenças neurodegenerativas1,2 ,3,4,5. O ambiente do CNS, bem como a capacidade intrínseca de crescimento de neurônios, determina se os axônios são capazes de regenerar após trauma. Fatores extracelulares do oligodendrocyte, Ralevic e fibroblástica fontes têm sido mostrados para impedir o crescimento neuronal4,6,7,8, mas a eliminação destas moléculas só permite limitada brotando5. Sinais de regeneração intrínseca podem influenciar o sucesso regenerativa5,9 e representam alvos terapêuticos, mas estes processos são ainda não bem definidos a nível molecular. Aumento do fator trófico sinalização ou eliminação de freios endógenos, tais como a fosfatase Pten10, pode resultar em regeneração axonal em determinadas circunstâncias. Combinações de diferentes métodos considerados individualmente eficazes também só fornecem recuperação global limitada à data11,12,13,14. Portanto, há uma necessidade desesperada de identificar caminhos adicionais para a terapia-alvo. Além do início do crescimento do axônio, se e como axônios re-fio para o alvo correto, especificidade de sinapse de reforma e alcançar a recuperação funcional são importantes perguntas sem resposta.
Em resumo, o entendimento atual da maquinaria ditando a regeneração do axônio ainda é muito fragmentado. Parte do problema é a dificuldade técnica de estudar o axônio regeneração em mamíferos em tempo real, uma abordagem que é caro, demorado e desafiador para a realização de telas genéticas em grande escala. Drosophila melanogaster, por outro lado, tem provado para ser um sistema extremamente poderoso para o estudo das complexas questões biológicas. Mosca da fruta tem sido fundamental na definição de genes e sinalização de caminhos que são surpreendentemente conservados em humanos e tem sido um modelo de sucesso para o estudo das condições humanas, tais como doenças neurodegenerativas, através das ferramentas de vasta genética molecular disponível para manipular o gene função15. Em particular, as moscas de fruta são consideradas para ser uma ferramenta ideal para a descoberta de genes envolvidos na lesão neural e rebrota15,16. Foram desenvolvidos vários modelos de lesão neural voar, incluindo adulto-cabeça ou larval nervo ventral cabo (VNC) esfaqueamento com agulhas, larval VNC ou esmagamento do nervo com fórceps, neurônio larval do laser axotomy, remoção de neurônio olfactory do receptor, explantes crânio-encefálico, e lesão de nervo periférico pela ala indenização15,17,18,19,20,21,22,23. Excitantemente, trabalho utilizando drosófila lesão modelos mais recentes têm avançado nossa compreensão das vias celulares e genéticas utilizados pelo sistema nervoso reagir a lesões neurais, alguns dos quais foram mostrados para ser conservada na mamíferos24 ,25. Novamente, isso enfatiza a utilidade deste organismo modelo para identificação novos mecanismos de reparação neural.
Aqui descrito é um dois fotões baseados em laser modelo de Drosophila larval neurônio sensorial lesão. Um laser de dois fotões foi usado primeiramente para cortar axônios no zebrafish na vivo em 200326. No mesmo ano, realizou-se o primeiro dendriotomy do laser em drosófila usando um laser de nitrogénio pulsado27. Logo depois, diversos laboratórios de c. elegans usado femtosecond laser para estabelecer modelos de axônio regeneração28. Em 2007, Wu e colegas comparado em relataram as diferenças entre lesões do laser em c. elegans induzido por vários tipos de lasers29. Em 2010, regeneração do axônio depois do laser axotomy primeiro foi mostrada para ocorrer em Drosophila30. Baseando-se nesta literatura de lesão extensa do laser, nós desenvolvemos um modelo de lesão neural voar usando o laser de dois fotões, que permite a indução precisa da lesão alvo sites com mínima perturbação dos vizinhos de tecidos, proporcionando um ambiente relativamente limpo sistema para estudar as propriedades intrínsecas e extrínsecas de Epilepsias com resolução de célula única. Especificamente, nós estabelecemos um conjunto de métodos de lesão para os neurônios sensoriais arborização dendrítica (da) em ambos os sistema nervoso periférico (SNP) e CNS. Os neurônios da podem ser agrupados em quatro classes distintas, distinguidas-se principalmente por suas complexidades de ramificação dendrito: classe I-IV31. Nosso trabalho publicado mostra que da regeneração de neurônio assemelha-se a modelos de mamíferos lesão a nível molecular e fenotípica: neurônios da Exibir Propriedades de regeneração específicas de classe, com classe IV mas não classe I ou neurônios III da expositora regeneração na PNS; axônios de neurônio classe IV da regeneram robustamente na periferia, mas seu potencial regenerativo é drasticamente reduzida no SNC, assemelhando-se, assim, neurônios do gânglio (DRG) raiz dorsal nos mamíferos; aumentando a atividade de mTOR através de Pten exclusão ou superexpressão Akt aumenta a regeneração do axônio na mosca da CNS19. Utilizando este modelo de lesão, vêm realizando telas genéticas e identificaram a enzima de processamento do RNA Rtca como fator inibitório evolutivamente conservado para a regeneração do axônio, vinculando a lesão do axônio ao estresse celular e modificação do RNA20 .
No paradigma apresentado, a lesão é induzida através do laser axotomy/dendriotomy de larva classe IV ou III da neurônios, rotuladas por ppk-CD4-tdGFP ou 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80, respectivamente. A lesão é executada em 2nd para 3rd ínstar larvas em cerca de 48-72 h após a postura (h AEL) de ovos. Para PNS axotomy a lesão é direcionado para a seção do axônio ~ 20-50 µm longe do corpo celular, para axotomy de CNS para uma área de ~ 20 µm de diâmetro no cruzamento comissura no VNC e dendriotomy para os pontos de ramificação dendrítica principal. O mesmo neurônio é fotografado em 8-24 h após a lesão (AI) para confirmar a transecção completa e em 48-72 h AI para avaliar a regeneração. Através da imagem latente confocal lapso de tempo, a degeneração e regeneração de axônios/dendrites individuais que foram feridos na vivo podem ser monitorados ao longo do tempo.

<table><tbody><tr><td>Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous</td><td>Acros Organics</td><td>AC615080010</td><td></td></tr><tr><td>Halocarbon 27 Oil</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-133</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS), 20x Concentrate, pH 7.5, supplier # E703-1L</td><td>VWR</td><td>97062-948&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Agar powder, Alfa Aesar, 500GM</td><td>VWR</td><td>AAA10752-36</td><td></td></tr><tr><td>Grape juice</td><td>Welch&amp;rsquo;s</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 95% (Reagent Alcohol 95%)</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Propionic Acid</td><td>J.T.Baker</td><td>U33007</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glasses: Rectangles</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td>50 mm X 22 mm</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880 laser scanning microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen software</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Ultra II</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a drosophila in vivo injury model for studying neuroregeneration in the peripheral and central nervous system

A capacidade de regeneração de neurônios danificados governa Epilepsias e recuperação funcional após trauma do sistema nervoso. Ao longo das últimas décadas, vários intrínsecos e extrínsecos inibitórios envolvido na restrição de regeneração do axônio foram identificados factores. No entanto, simplesmente removendo esses sinais inibitórios é insuficiente para regeneração bem sucedida, indicando a existência de máquinas de regulamentação adicional. Drosophila melanogaster, a mosca da fruta, compartilha genes evolutivamente conservados e vias de sinalização com vertebrados, incluindo seres humanos. Combinando a poderosa caixa de ferramentas genética de moscas com dois fotões do laser axotomy/dendriotomy, descrevemos aqui o neurônio sensorial drosófila – modelo de lesão de neurônio de arborização dendrítica (da) como uma plataforma para a seleção sistematicamente para romance reguladores de regeneração. Brevemente, este paradigma inclui um) a preparação de larvas, indução b) lesão de dendrite(s) ou axon(s), usando um laser de dois fotões, c) ao vivo confocal de imagem pós-lesão e d) análise de dados. Nosso modelo permite lesão altamente reprodutível de único rotulada de neurônios, axônios e dendritos dos subtipos neuronais bem definidos, no sistema nervoso central e periférico.

Os neurônios da mostram diferencial regeneração potencial entre o periférico e sistema nervoso central, bem como especificidade de classe. Isso oferece oportunidades únicas para a tela para novos fatores que são necessários para a regeneração do axônio (usando a classe lesão PNS IV), bem como aqueles que são inibitórios para regeneração (com lesão de classe IV CNS e classe lesão III PNS).
Regeneração do axônio n...

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Um modelo de lesão in vivo de Drosophila para estudar a neurorregeneração no sistema nervoso periférico e central | Medicina | Vídeo

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Aqui, apresentamos um protocolo utilizando a drosófila neurônio sensorial - modelo de lesão do neurônio arborização dendrítica (da), que combina na vivo ao vivo de imagens, dois fotões do laser axotomy/dendriotomy e poderoso toolbox genético mosca, como uma plataforma para a seleção de potenciais promotores e inibidores de Epilepsias.

Um modelo de lesão in vivo em Drosophila para estudar a neuroregeneração do sistema nervoso periférico e central

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

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9.7K visualizações.  The Children's Hospital of Philadelphia. Aqui, apresentamos um protocolo utilizando a drosófila neurônio sensorial - modelo de lesão do neurônio arborização dendrítica (da), que combina na vivo ao vivo de imagens, dois fotões do laser axotomy/dendriotomy e poderoso toolbox genético mosca, como uma plataforma para a seleção de potenciais promotores e inibidores de Epilepsias.

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Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative diseases because of its powerful genetics1. The fly eye in particular has been the organ of choice for neurodegeneration research, being the most accessible and life-dispensable part of the Drosophila nervous system. However the major caveat of intact eyes is the difficulty, because of the intense autofluorescence of the pigment, in imaging intracellular events, such as autophagy dynamics2, which are paramount to understanding of neurodegeneration.
We have recently used the dissection and culture of single ommatidia3 that has been essential for our understanding of autophagic dysfunctions in a fly model of Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy (DRPLA)3, 4.
We now report a comprehensive description of this technique (Fig. 1), adapted from electrophysiological studies5, which is likely to expand dramatically the possibility of fly models for neurodegeneration. This method can be adapted to image live subcellular events and to monitor effective drug administration onto photoreceptor cells (Fig. 2). If used in combination with mosaic techniques6-8, the responses of genetically different cells can be assayed in parallel (Fig. 2).

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The limiting factor in the use of the adult Drosophila eye to study neurodegeneration and cell biology is the difficult imaging of intracellular processes. We describe the dissection of single ommatidia to generate a bona-fide primary neuronal cell culture, which can be subject to drug treatment and advanced imaging.

Único Drosophila Dissection omatídeo e Imagem

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Neurociência

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

O uso de chips microfluídicos para Imagens ao vivo e estudo das respostas Lesão em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Bioengenharia

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Biologia do Desenvolvimento

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

Um Paradigma para Investigar Lesão de reparação do sistema nervoso central em<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal degeneration are remarkably similar in humans and invertebrates as are the molecular mechanisms that drive these processes. The fruit fly, Drosophila melanogaster, provides a powerful yet simple genetic model organism to study the cellular complexities of neurodegenerative diseases. In fact, approximately 70% of disease-associated human genes have a Drosophila homolog and a plethora of tools and assays have been described using flies to study human neurodegenerative diseases. More specifically the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila has proven to be an effective system to study neuromuscular diseases because of the ability to analyze the structural connections between the neuron and the muscle. Here, we report on an in vivo motor neuron injury assay in Drosophila, which reproducibly induces neurodegeneration at the NMJ by 24 h. Using this methodology, we have described a temporal sequence of cellular events resulting in motor neuron degeneration. The injury method has diverse applications and has also been utilized to identify specific genes required for neurodegeneration and to dissect transcriptional responses to neuronal injury.

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Here we describe a simple and widely accessible method to injure segmental nerves in Drosophila larvae to visualize and quantify neurodegeneration of motor neurons at the neuromuscular junction (NMJ) of third instar larvae.

Uma Metodologia de Lesão Mecânica Neuronal Simples para Estudar<em&gt; Drosophila</em&gt; Degeneração do Neurônio do Motor

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our understanding of the molecular mechanisms underlying axon degeneration remains limited. Injury-induced axon degeneration serves as a simple model to study how severed axons execute their own disassembly (axon death). Over recent years, an evolutionarily conserved axon death signaling cascade has been identified from flies to mammals, which is required for the separated axon to degenerate after injury. Conversely, attenuated axon death signaling results in morphological and functional preservation of severed axons and their synapses. Here, we present three simple and recently developed protocols that allow for the observation of axonal morphology, or axonal and synaptic function of severed axons that have been cut-off from the neuronal cell body, in the fruit fly Drosophila. Morphology can be observed in the wing, where a partial injury results in axon death side-by-side of uninjured control axons within the same nerve bundle. Alternatively, axonal morphology can also be observed in the brain, where the whole nerve bundle undergoes axon death triggered by antennal ablation. Functional preservation of severed axons and their synapses can be assessed by a simple optogenetic approach coupled with a post-synaptic grooming behavior. We present examples using a highwire loss-of-function mutation and by over-expressing dnmnat, both capable of delaying axon death for weeks to months. Importantly, these protocols can be used beyond injury; they facilitate the characterization of neuronal maintenance factors, axonal transport, and axonal mitochondria.

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Here, we provide protocols to perform three simple injury-induced axon degeneration (axon death) assays in Drosophila melanogaster to evaluate the morphological and functional preservation of severed axons and their synapses.

Avaliação morfológica e funcional de Axons e suas sinapses durante a morte de Axon em Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our ...

Stimulating and Analyzing Adult Neurogenesis in the Drosophila Central Brain

The molecular and cellular mechanisms underlying neurogenesis in response to disease or injury are not well understood. However, understanding these mechanisms is crucial for developing neural regenerative therapies. Drosophila melanogaster is a leading model for studies of neural development but historically has not been exploited to investigate adult brain regeneration. This is primarily because the adult brain exhibits very low mitotic activity. Nonetheless, penetrating traumatic brain injury (PTBI) to the adult Drosophila central brain triggers the generation of new neurons and new glia. The powerful genetic tools available in Drosophila combined with the simple but rigorous injury protocol described here now make adult Drosophila brain a robust model for neural regeneration research. Provided here are detailed instructions for (1) penetrating injuries to the adult central brain and (2) dissection, immunohistochemistry, and imaging post-injury. These protocols yield highly reproducible results and will facilitate additional studies to dissect mechanisms underlying neural regeneration.

Stimulating and Analyzing Adult Neurogenesis in the Drosophila Central Brain

This article provides detailed protocols for inflicting Penetrating Traumatic Brain Injury (PTBI) to adult Drosophila and examining the resulting neurogenesis.

Estimulando e analisando neurogênese adulta no cérebro central de Drosophila

The molecular and cellular mechanisms underlying neurogenesis in response to disease or injury are not well understood. However, understanding these ...

Two-Photon Laser-Induced Neural Injury: A Method to Observe Axon Degeneration and Regeneration in Drosophila Larvae

Source: Li, D., et al. <a href="https://www.jove.com/video/57557/" target="_blank">A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System</a>. J. Vis. Exp. (2018).
This video describes two-photon laser ablation of axons in a Drosophila melanogaster larva and an example protocol to induce injury and image the injury site.

Lesão neural induzida por laser de dois fótons: um método para observar a degeneração e regeneração do axônio em larvas de Drosophila

Source: Li, D., et al. A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System. J. Vis. Exp. 
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JoVE Encyclopedia of Experiments

Biologia

Drosophila melanogaster (mosca da fruta)

Larva

Mechanically Injuring Drosophila Larvae Segmental Nerves to Induce Neurodegeneration

Source: Danella, E. B., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56128">A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration.</a> J. Vis. Exp. (2017).
The video demonstrates inducing neurodegeneration in Drosophila larva segmental nerves via mechanical injury. The ventral cuticle of anesthetized larvae is pinched using forceps to cause injury to the segmental nerves. The injured larvae are maintained with food, allowing the injury to cause degeneration of the motor neurons in the nerves, causing disruption of their neuromuscular junctions (NMJs).

Lesão mecânica de nervos segmentares de larvas de Drosophila para induzir neurodegeneração

1. Preparation of Reagents and Equipment 

	Prepare 1x Dissection Buffer (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.02 mM CaCl2, 20 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 115 mM sucrose, ...

Neuroscience

Neuropathology

Neurodegenerative Diseases

Inducing Targeted Neuronal Injury Using a High-Power Laser in a Drosophila Larva

Source: Li, D., Li, F., et al. <a href="https://app.jove.com/v/57557">A Drosophila in vivo injury model for studying neuroregeneration in the peripheral and central nervous system.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates a method for inducing targeted neuronal injury in Drosophila larvae using a high-power laser. After positioning the larva under a microscope, a low-power laser scans for fluorescent neurons, and then the laser power is increased to induce localized damage. The injury is confirmed by increased fluorescence and a crater at the injury site.

Source: Li, D., Li, F., et al. A Drosophila in vivo injury model for studying neuroregeneration in the peripheral and central nervous system. J. Vis. Exp. ...

Um modelo de lesão in vivo em Drosophila para estudar a neuroregeneração do sistema nervoso periférico e central

Resumo

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