Yazarlar hiçbir katkıda bulunanlar var.

Burada kullanılan genetik materyal etik kullanım için ofise için çocuk HREC (insan Araştırma Etik Komitesi) (CDF/07/492), insan Hizmetleri HREC bölümü kabul edildi (10/07) ve Royal Children's Hospital (RCH) HREC (27047).
1. çoğaltılmış tahlil tasarlama
<ol><li>SNP listesini tahlil tasarımı için hazır olun.<ol>
<li>Hedef bölge Haploview (https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads) tagger işlevi girdi. LD (korelasyon, r2) arasında hedef bölgesi kapsayan SNPs gerekli türevleri en az sayıda ile istenen bölgesinin tam kapsama alanı sağlar SNPs, listesini oluşturmak için kullanın. Öyle ki yakalanması için tüm allelleri bir Kullanıcı tanımlı eşik correlated SNPs listesini oluşturmak (Örn., r2 ≥0.8).</li>
	</ol></li>
	<li>İleri, geri ve uzantısı astar için uygun sıralarını tanımlaması<ol>
<li>SNPs oluşturulan liste seçim tahlil tasarım aracı girin. Not: Aşağıdaki talimatlar tahlil tasarım aracı Tablo reçetesibelirtildiği gibi temsilcisi sonuçlar üretmek için kullanılan geçerli.</li>
		<li>Bir kez başlatılan tahlil tasarım aracı, Yeni Genotipleme tasarımıseçin. Tasarım ad alanına tahlil tasarımı için bir ad girin.</li>
		<li>1.1.1. adımda Metin girişi düzenleme yönergeleri ile rs veya FASTA düğmesinin solunda düğmesini tıklatarak oluşturulan SNP listesi sağlamak. Not: SNPs edilebilir başvuru (rs) SNP kimlikleri bir metin listesi olarak girilen veya FASTA biçiminde tarih veya araç tarafından SNP grup dosya biçimi kullanılır. Bu biçimlerdeki dosyaları yüklemek için Dosya Yükle düğmesini seçin. Üst 'iyi' olarak adlandırdığı bir tek tahlil içine tasarlanmış değişik 40 SNPs sınırıdır. Çalıştır başlamadan önce önceliğimizdir tasarımı için SNPs belirtmek mümkündür; Bunlar-ecek var olmak ressam ilk. Denetim SNPs belirtilebilir: Örneğin, cinsiyet örnek mix ups veya bu yeterli şablonu belirlemek için bir denetim durumunda algılamak için bir tahlil eklendi düşük veya fakir kalite DNA'sı ile çalışıyormuş. Ancak, denetim ve öncelik SNPs kullanarak tek bir iyi tasarlanmış SNPs sayısını azaltabilir unutulmamalıdır.</li>
		<li>Hazır ayarı menüsünden yüksek çoğullama iPLEX hazır ayarı seçeneğini belirleyin. Organizma menüde genotyped olmak için DNA türetir içinden organizma. Burada sunulan temsilcisi sonuçları için bu insan oldu. Not: Fare ve sığır organizmalar da aracı ile uyumludur. Ayrıca diğer bitki veya mikrop gibi alternatif bir organizma ile çalışıyorsanız birini seçebilirsiniz; Ancak, proksimal SNPs ve en uygun astar alanları bulmak için otomatik adımları başvuru genom yokluğu nedeniyle kullanılamaz.</li>
		<li>Veritabanı menüsünde genom en son sürüme veya gerekirse, Kimya menüsünden alternatif bir yapı seçin. İPLEX seçin ve Çok katmanlı düzeyi alanı için çoğullama en yüksek düzeyini girin: 40. Şimdi, Başlamak Çalıştır' ı seçin. "Adım 1" aracının başlayacaktır. Not: Adım 1 sırasında araç alır ve SNP dizileri biçimlendirir. Burada, hataları hangi durumda FASTA dosya olmalı kontrol ve gerektiğinde yeniden biçimlendirilmiş ve FASTA dosyasını biçimlendirme içerebilir. Başka bir hata birleştirilmiş SNP rs hangi durumda rs numarası SNP veritabanı yeni SNP rs numarasını belirlemek için NCBI'ın dbSNP gibi aranması bir başka rs numarasıyla rakamıdır. SNP çevresinde dizileri ile astar tasarım engelleyebilir bilinen herhangi bir proksimal SNPs aranır. Potansiyel PCR astar siteleri non-spesifik amplifikasyon genom içinde birden fazla isabet nedeniyle önlemek için genom karşı karşılaştırılır.</li>
		<li>"Adım 2" proksimal SNPs belirlenecektir tasarım aracı / tamamlanması bekliyor. Not: Bu bilgi varsa bu adımı tarafından desteklenmeyen bir organizma kullanıyorsanız, IUPAC Not içinde proksimal SNPs sıralarıyla açıklama ekleyin. Nadiren bu adımı sırasında hataları vardır; Ancak, hataları yanlış başvuru organizma veya genom seçiliyse veya genomik DNA yerine cDNA dizileri girdiyseniz meydana gelebilir. Adım 2, Gelişmiş ayarlar, en iyi duruma getirmek için belirli bir nüfus içinde çalışıyorsanız bir nüfusu temel alarak SNPs filtrelemek mümkündür. Nadir SNPs Ayrıca bir frekans % 1 aşağıda olanlar hariç tutarak filtre uygulanabilir. Son olarak, doğrulanmış bir durum var mı veya nüfus bilgileri var mı SNPs istenirse de dışlabilir.</li>
		<li>"Adım 3" en uygun astar tanımlayan tasarım aracı / bölgeler tamamlanması bekliyor. Astar konumu tanımlanmamıştır tercih veya farklı bir organizma ile çalışıyorsanız, el ile astar mekanlar giriş dizisi (SNP grup dosyaları) ek açıklama ekleme tarafından tercih edilen astar bölgeler büyük harfli ve alt sırada kalan giriş Case, select Korumak durumunda Bu adım için Gelişmiş ayarlar menüsünden. Not: Adım 2 ve 3 için hataları içerebilir: (1) A proksimal SNP bir astar tasarım şablonu tabanı ile maske ve bir oligo Isonine gibi evrensel bir tabanı ile sipariş veya her Zi gen ile iki astar tasarım için varlık çözümü ile engelleme Al SNP veya tasarım bir astar ile ortak alleli sadece. (2) başka bir yaygın hata astar için benzersiz bir site benzersiz bir site tanımlamak için amplicon uzunlukta değiştirmeye olmak çözüm ile tanımlamak için başarısız olduğunu. Bu kağıt için kullanılan Aracı'nda, 80-120 bp varsayılandır. Bu gelişmiş ayarlar diyalog "3. Amplicon uzunluk ayarı altında 60-400 bp den değiştirilebilir En uygun astar alanları belirlemek"ve aynı zamanda sekmesi altında yer alan Amplicon "4. Tasarım deneyleri." Her ikisi de değiştirilir emin olun. Ancak, kullanarak DNA bozulmuş amplicon uzunluğunu artırma tavsiye edilmez unutulmamalıdır.</li>
		<li>Tahlil tasarım adım ("Adım 4" tasarım aracı) tamamlanması bekliyor, burada aracı uzantısı astar ve çoğaltılmış tasarımlarında bütün SNPs alelleri arasında en iyi pass ayrılık sağlamayı amaçlamaktadır. Bu adım tamamlandıktan sonra seçtiğiniz satıcı sipariş bir oligo kolay sipariş vermek için biçimlendirilmiş Oligo sıra dosyası dışa aktarın. Not: Amplifikasyon astar (ileri (F) ve (R) ters) 80-120 en uygun amplicon boyutunu üretmek için tasarlanmıştır bp. Amplifikasyon astar gerekir kitle farklı uzantı astar ve kütle spektrumu böylece genel PCR performansı için çakışan sonuçları önlemek için ürün. Uzantısı astar 3' ucu çok biçimlilik sitesine bitişik eklemek olacaktır tasarlanmıştır 15 ila 30 nükleotit uzun (4.500-9.000 Da) olmalıdır. Bu ayarların tümü temsilcisi sonuçlar üretmek için kullanılan araç otomatik olarak ayarlanır.</li>
	</ol></li>
	<li>Seçilen araç ve sipariş astar bir oligomer sağlayıcısından tasarım verilecek: 25 nmol her PCR astar (ileri ve geri) ve her birinin uzantısı astar 100 nmol. Temsil edici sonuçlar üretmek için kullanılan astar bkz. Tablo 1 .</li>
</ol>2. Genotipleme (1-2 gün)
<ol><li>Amplifikasyon astar hazırlayın.<ol>
<li>Liyofilize astar sipariş ettiyseniz, moleküler sınıf su ile yeniden oluşturma. 100 μm kalınlığında/μL bir konsantrasyon ileriye ve geriye doğru astar ve 500 mikron/μL uzantısı için kullanın.</li>
		<li>Havuzu astar her astar, 0,5 mM bir konsantrasyon içeren bir hisse senedi astar karışımı içine her çoğaltılmış tahlil için ileri ve geriye doğru. Not: Örneğin, 400 reaksiyonlar için 400 μL astar havuzu: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57601/57601eq1v2.jpg"> 100 μm kalınlığında/μL, konsantrasyon, her astar 2 μL hisse senedi astar havuzu için gereklidir. 60 ileriye ve geriye doğru astar ile 30-plex tahlil için astar 120 μL toplam olurdu (konsantre astar havuzu) gerekli. 280 μL moleküler düzeyde su sonra mix son hacmi 400 μL astar yapmak için eklenebilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) kullanarak amplifikasyon
	<ol>
<li>100 içeren PCR için ana bir karışım yapmak nM astar Mix detaylı dNTPs, 2 mM MgCl2500 mikron ve 0,5 U bir DNA polimeraz enziminin yukarıda. 1 U 26-plex deneyleri daha büyük için gereklidir. Tablo 2' ye bakın.</li>
		<li>Her şey 384-şey PCR plaka ile birlikte 5-10 ng/μL bir konsantrasyon, genomik DNA'ın 1 μL 4 μL bu karışımı ekleyin. Not: kalite denetimleri de bir şablon denetim ve daha önce de tahlil ile (bir test çalışması sırasında) gerçekleştirmiş olan olumlu denetim gibi plaka üzerinde bulunmalıdır. Birden çok çalışan, diğer plate(s) Örneğinbirden fazla DNA örnekleri., nüsha arası plate değişkenliği için Teknik denetimleri olarak çalıştırmanız gerekir.</li>
		<li>200 x g tüm sıvı plaka kuyu alt kısmında yer alan sağlamak için bir plaka kapak ile Oda sıcaklığında 1 dk. için plaka santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>PCR ile aşağıdaki thermocycler koşullar çalıştırın: 4 dk kuluçka 94 ° C'de DNA polimeraz; etkinleştirmek için Aşağıdaki 45 devir (20 94 ° C'de denatürasyon s, 30 s ve uzantısı için 1 dk 72 ° C'de 56 ° C'de tavlama) ve PCR programa Tablo 3' te 3 dk. öner için 72 ° C'de sonra son bir uzantısı.</li>
		<li>DNA amplifikasyon başarılı olduğundan emin olmak için özel jel elektroforez gerçekleştirin. 1 µL PCR ürününün (ile 3 µL yükleme arabelleği) özel toz ve % 0,5 Tris bor EDTA (TBE) tampon, karıştırılarak yapılan bir %2 (w/v) özel jel kullanın ve için 45 dk 100 V çalıştırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Karides alkalen fosfataz (SAP) arıtma adım Not: Bu adımı unincorporated nükleotit kaldırmak için kullanılır. SAP enzim aşırı astar ve adi dNTPs yaklaşan uzantısı tepki olarak engellemesini önlemek için fosfat grupları cleaves.<ol>
<li>Bir master 1.7 birimleri/μL karides alkalin fosfataz (SAP) enzim, 10 x SAP arabellek içeren mix ve moleküler düzeyde su ile cilt için makyaj yapmak. Tablo 4' e bakın.</li>
		<li>2 ekleyin μL kadar SAP taze yapılmış, her şey zaten PCR reaksiyon gelen 5 μL içeren plaka, karışıma usta. Kısaca santrifüj kapasitesi ve thermocycler 40 dk 37 ° C'de ve sonra 85 ° c enzim inactivation için 5 min için geri dönün. Tablo 5' e bakın.</li>
	</ol></li>
	<li>Astar uzantısı tepki Not: Uzantısı astar uzantısı astar karışımında konsantrasyonu (Linear astar ayar-LPA) boyutuna göre ayarlanması gerekir. En yüksek yoğunluk (üzerinde kitle spectra) ve ürün ters bir ilişki olduğundan budur kitle. Uzantısı astar konsantrasyon düzeltilmesi eşit yoğunluklarda doruklarına üretmek bu ilişki için düzeltir. Tablo 6 & 7içinde sağlanan sonuçlar temsilcisi oluşturmak için kullanılan astar ayarlanabilir. 1.5 mL uzantısı astar karışımı oluşturmak için sağlanan birimleri vardır.<ol>
<li>Seyreltme faktörler Agena Biosciences ('doğrusal astar ayarlaması'), kütle ve astar ve astar çoğaltılmış tepki (bkz: toplam sayısı konsantrasyon için ayarlar edinilebilir degrade bir algoritma kullanarak her astar için hesaplamak Tablo 6 & 7). UEP kitle için her astar Linear astar ayar sayfası UEP_MASS alanına girin. Not: Astar için kitle ayarlanan konsantrasyonu hücre üstbilgi metni "Hedef tepki konsantrasyon (µM)" ile otomatik olarak hesaplanır Birimin astar astar havuzuna eklemek için üstbilgi metni "Havuzu (µL) eklenecek birim hisse senedi astar." altında hücredeki çıktısı Hesaplanan konsantrasyonları kadar yapmak için astar havuzu eklenecek su hacmi hücre metninin yanında "olmak PCR sınıf RNase free H2O hacmi astar Havuzu (µL) eklenir." çıktı</li>
		<li>Birimin her astar belirtildiği gibi Linear astar ayar dosyasında götürüp bir astar Havuzu. 2.4.1. adımda belirlenen astar havuzu sulandırmak için algoritması tarafından hesaplanan su hacmi ekleyin. Not: degrade algoritması Yöntem kullanılamıyorsa düşük kütle ve yüksek kitle astar bölmek ve çift konsantrasyonu yüksek kitle astar göreceli olarak düşük kitle grup eklemek için başka bir yöntem olur. Üç veya dört grup yüksek-plex tayini için gerekli olabilir (diğer bir deyişle, daha fazla 19 SNPs). Ancak, bu yöntem en iyi arama ücretleri degrade algoritması yöntemi olarak olarak vermez.</li>
		<li>Uzantısı ana karışımı bir araya getirin. Düşük plex tahlil için (1-18 parça) arabelleği 0.2 μL, 0.1 μL fesih Mix, 0,94 μL ayarlanabilir LPA astar mix ve (buzda hazır) enzim 0.0205 μL ekleyin. Yüksek plex tahlil için (19-36 parça) fesih mix ve enzim (fesih mix 0,2 μL ve iPLEX enzim 0.041 μL) Çift Kişilik konsantrasyon ekleyin. Tablo 8' e bakın.</li>
		<li>Uzantısı tepki ana Mix 2 μL plakasına toplam hacim 9 μL iyi ücret için konuşmanın önceki tepki ekleyin. Kısaca santrifüj kapasitesi ve yer içinde thermocycler: 94 ° C için bir 30 s ilk kuluçka, 1 x 94 ° C 40 döngüleri için 5 s ile 5 x (52 ° C 5 için 80 ° C 5 ardından s, s) ve sonra 72 ° C 3 dk. Tablo 9bakın.</li>
	</ol></li>
	<li>Arıtma reçine. Not: Aşırı tuzları artık reçine ile belgili tanımlık kullanma tepkiden kaldırılabilir.<ol>
<li>16 μL deiyonize su kuyuları tarihinde erişilmiştir plaka, plaka 25 μL kadar ses getiren ekleyin.</li>
		<li>Reçine, genellikle 6 mg (ayrı olarak satın), Gamze Reçine plaka bütün tabağı için eşit olarak uygulanır. Reçine çukur tabak, oda sıcaklığında 20 dakika içinde tepki plakasına uygulamadan önce kuru reçine bırakın. Reçine eklenmesinden sonra plaka oda sıcaklığında 5 min için el ile veya yavaş hızda bir süspansiyon karıştırıcılı döndürme (Örn., 7.5 devir/dakika). Not: Genotipleme analit Genotipleme çip üzerine önce yükleme, örnekleri ve tahlil düzeni yazılım arayüzü içine giriş gerekir. Bu tahlil tasarım aracı tasarım Özeti dosyasını kullanarak elde edilebilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Ölçüm bir kütle spektrometresi platformda.<ol>
<li>3200 x g reçine uygulama kitle spectra çip önlemek 5 min için plaka santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Plaka düzeni örneklerinin sistemin yazılım arayüzü koşmak önce yükleyin. Not: Adım 2.6.3 yalnızca eğitimli personel tarafından gerçekleştirilmelidir.</li>
		<li>Genotipleme analit karışımı plaka Genotipleme çip ile bir dağıtım sistemi uygulanır. Ardından, çip kitle spectra sonra platformu yazılım arabirimi yardımıyla yorumlanabilir analit karışım oluşturmak için MALDI-TOF sisteminize yükleyin. Not: Sistem kitle spectra 'kitle spectra çipin Genotipleme plaka tek bir şey için karşılık gelen her pad,', UV ışığı kısa darbeleri yönlendirerek oluşturur. Bu darbe desorpsiyon ve analit iyonlaşma ile sonuçlanır. Bunlar DNA iyonize moleküller o zaman tahrikli vakum tüplü tepesine daha hızlı seyahat ve dedektör, ilk olarak, ağır iyonları ulaşmak daha hafif iyonları, dışarı ayıran bir yüksek gerilim elektrostatik alana göre. "Zaman uçuş" Bu analitler hangi kitle her DNA parçasının belirlenebilir ve böylece nükleotid baz SNP mevcut anlaşılmaktadır olabilir sistem tarafından kaydedilir.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Genotipleme veri
Not: kalite kontrol ve veri yorumu Bu metodoloji kağıt odak değildir. Ancak, aşağıda kısaca kitle spectra yorumu kapsar.
<ol><li>El ile denetim ve kalite kontrol kitle spectra ürününün. Not: Ham yığın spectra sistemi tarafından oluşturulan ve Malzemeleri tablodalistelendiği gibi yazılım ile analiz. Bir Gauss karışım Yöntem kümeleme probabilistic Genotipleme arama yapmak için bu çıkış için uygulanır.<ol>
<li>Analiz yazılımı açın. Typer Analyzerseçin. Dosya menüsünden Dosya açık kuyulardan seçin ve 2.6.3 adımda oluşturulan spektrum verileri içeren xml dosyası seçin. Yonga adı Çalıştır görünür olmalıdır için seçin ve 384-şey plaka "trafik ışığı" bölme-ecek var olmak göstermek SNPs seçili bir listesini de. Buradan, scatterplot veri noktalarının her SNP için görüntülemek için Ara arsalar küme seçin. Not: Bu bir 'arama' sonuç düşük yoğunluklu SNPs uygulanması tavsiye edilir. Temsil edici sonuçlar için kullanılan yazılım, varsayılandan daha yüksek olan bir küme büyüklüğü cut-off 5, sıkı kalite kontrol için önerilmektedir. Bu ayar parametreleri altındaki büyüklüğü kesim alanı Posta işleme kümeleri bölmesinde ayarlanabilir. Autocluster bir küme Analizi çalıştırmak için Araçlar sekmesinden seçin.</li>
		<li>Kartezyen arsalar sonrası işleme bölmesinde inceleyerek genotip aramaların manuel olarak kontrol edin. Tahlil bölmesinde SNP faiz ve Post-Processing kümeleri sekmesini tıklatın seçin, bir küme komplo kümeleme genotip ile örnek kimlikleri ve karşılık gelen genotip SNP için görünür olacak.</li>
		<li>Genotip çağrı kümeleri incelemek ve değerlendirmek ne kadar iyi bireysel her çağrı ile diğer aramalar için SNP kümeleri. Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı için her genotip rehberlik için arsa üzerinde bazı sınır çizgileri sağlar; bir IL13 SNP (Şekil 1) gelen bir genotip çağrıları küme Arsa örnek bakın. Çağrı sıkıca diğer aramalar ile küme değil ve açıkça bir küme dışında oturur veya çok düşük yoğunluklu varsa, doğru tıkırtı datapoint ve el ile Hayır aramakayarlamak için Değişiklik ara seçin.</li>
		<li>Aşağı akım analiz için kullanılan yüksek kaliteli Genotipleme veri sağlamak için SNPs ve arama ücretleri bir QC eşiğin, Örneğin % 90 olan kişiler hariç. Arama veri için uygun ayarlamalar yapıldıktan sonra istatistik uygulamaları için veri verin. ( Tablo reçetesilistelenen) temsilcisi sonuçlar üretmek için kullanılan yazılım bu görünüm menüsünü ve Kaydet'iseçerek Plaka veri seçimden ile elde edilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Aronson, S. J., Rehm, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+foundation+for+genomics+in+precision+medicine.">Building the foundation for genomics in precision medicine.</a> Nature. 526 (7573), 336-342 (2015).</li><li>Ball, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+a+GWAS:+power,+sample+size,+and+data+structure.">Designing a GWAS: power, sample size, and data structure.</a> Genome-Wide Association Studies and Genomic Prediction. , 37-98 (2013).</li><li>Kwon, J. M., Goate, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+candidate+gene+approach.">The candidate gene approach.</a> Alcohol research and health. 24 (3), 164-168 (2000).</li><li>Oeth, P., Mistro, G. D., Marnellos, G., Shi, T., van den Boom, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+genotyping+using+single+base+primer+extension+coupled+with+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+(MassARRAY).">Qualitative and quantitative genotyping using single base primer extension coupled with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MassARRAY).</a> Single Nucleotide Polymorphisms: Methods and Protocols. , 307-343 (2009).</li><li>Pusch, W., Kostrzewa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+screening+and+diagnostic+research.">Application of MALDI-TOF mass spectrometry in screening and diagnostic research.</a> Current pharmaceutical design. 11 (20), 2577-2591 (2005).</li><li>Su, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreatment+epidermal+growth+factor+receptor+(EGFR)+T790M+mutation+predicts+shorter+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitor+response+duration+in+patients+with+non-small-cell+lung+cancer.">Pretreatment epidermal growth factor receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer.</a> Journal of clinical oncology. 30 (4), 433-440 (2012).</li><li>Singhal, N., Kumar, M., Kanaujia, P. K., Virdi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-TOF+mass+spectrometry:+an+emerging+technology+for+microbial+identification+and+diagnosis.">MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis.</a> Frontiers in microbiology. 6, 791 (2015).</li><li>Cricca, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+genotyping+of+high-risk+Human+Papillomavirus+by+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry-based+method.">High-throughput genotyping of high-risk Human Papillomavirus by MALDI-TOF Mass Spectrometry-based method.</a> New Microbiologica. 38 (2), 211-223 (2015).</li><li>Ashley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Variation+at+the+Th2+Immune+Gene+IL13+is+Associated+with+IgE-mediated+Paediatric+Food+Allergy.">Genetic Variation at the Th2 Immune Gene IL13 is Associated with IgE-mediated Paediatric Food Allergy.</a> Clinical &amp; Experimental Allergy. 47 (8), 1032-1037 (2017).</li><li>Bousman, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+NRG1+and+DAOA+genetic+variation+on+transition+to+psychosis+in+individuals+at+ultra-high+risk+for+psychosis.">Effects of NRG1 and DAOA genetic variation on transition to psychosis in individuals at ultra-high risk for psychosis.</a> Translational psychiatry. 3 (4), e251 (2013).</li><li>Moffatt, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale,+consortium-based+genomewide+association+study+of+asthma.">A large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma.</a> New England Journal of Medicine. 363 (13), 1211-1221 (2010).</li><li>Granada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+association+study+of+plasma+total+IgE+concentrations+in+the+Framingham+Heart+Study.">A genome-wide association study of plasma total IgE concentrations in the Framingham Heart Study.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3), 840-845 (2012).</li><li>Oeth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPLEX+assay:+Increased+plexing+efficiency+and+flexibility+for+MassARRAY+system+through+single+base+primer+extension+with+mass-modified+terminators.">iPLEX assay: Increased plexing efficiency and flexibility for MassARRAY system through single base primer extension with mass-modified terminators.</a> Sequenom application note. 27, (2005).</li><li>Ellis, J. A., Ong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MassARRAY+System+for+Targeted+SNP+Genotyping.">The MassARRAY System for Targeted SNP Genotyping.</a> Genotyping: Methods and Protocols. , 77-94 (2017).</li><li>Johnson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAP:+A+web-based+tool+for+identification+and+annotation+of+proxy+SNPs+using+HapMap.">SNAP: A web-based tool for identification and annotation of proxy SNPs using HapMap.</a> Bioinformatics. 24 (24), 2938-2939 (2008).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada, kütle spektrometresi kullanılarak çoğaltılmış Genotipleme yöntemi göstermektedir. Temsilcisi sonuçları PCR MALDI-TOF Kütle spektrometresi4 tahlil kimya ile Malzemeler tablo13' te listelenen ile eşleştirilmiş kullanarak oluşturulan. Bu platformla Laboratuarı ' 1,255 bireyler için 40 h içinde 9 SNPs üzerinde 11,295 genotip toplam oluşturulan.
Biz genetik hipotezler üretme ve bir keşif klinik kohort ph...

İnsan karmaşık hastalığında genetik varyantların hastalığı duyarlılık katkıda bulunmak ve bu çeşitleri miktarının yüksek riskli hasta grupları ve tedavi cevaplama tanımlama anlayış Escherichia türleri için yararlı olabilir. Gerçekten de, Allah'ın hassas tıp hasta alt gruplar1tanımlamak için genomik bilgi kullanan üzerine bağlıdır. Ne yazık ki, nereye hastalığı fenotipleri önemli genetik heterojenite, düşük alellerle ve değişken expressivity tarafından desteklenen, karmaşık hastalık biyoloji alanlarında kohort boyutu roman tanımlamak genom çapında yaklaşımlar için gereksinimleri adayların çoğu kez aşırı derecede büyük2. Alternatif olarak, bir hedef aday gen yaklaşım belirli genler/yolları hastalığı nedenleri3hakkında bir priori bir hipotez ile başlar. Yolu analiz araçları keşfedilmeyi çok sayıda aday yolları üreten bir tanımlanan hedef loci Patofizyoloji araştırmak için yaygın olarak kullanılır. Biz burada onlarca yüzlerce insan kohort çalışmaları4' e uygun bir tahlil ile SNPs incelenmesi için izin veren bir çoğaltılmış Genotipleme yaklaşım göstermektedir. Bu nispeten yüksek aracılığıyla-yüzlerce Roman keşif çalışmaları için genotyped olmak için DNA örnekleri binlerce ve belirli yolları incelenmesi için izin yerine, yaklaşımdır. Burada özetlenen yöntemleri nispeten hızlı ve ucuz bir şekilde tanımlayıcı risk alelleri ve klinik özellikleri ile dernekler için yararlıdır. Bu platform mikrobiyal enfeksiyon7 ve insan papilloma virüsü8için eleme ve tanılama amacıyla5,6ve son zamanlarda, daha fazlası için çok avantajlı oldu.
Bu iletişim kuralı için soruşturma, yanigen kümesi yelpazesi ile başlar., genellikle edebiyat arama veya bir priori hipotezler hastalık süreci; katılımı için belirlenen hedef bölgeleri ya da belki de bir keşif genom çapında Derneği (GWA) çalışmanın önde gelen dernek olarak çoğaltma için seçilmiş. Gen kümesinden araştırmacı etiketi SNPs rafine bir listesini seçer. Diğer bir deyişle, bağlantı dengesizliği (LD) veya türevleri bölge arasında korelasyon SNPs yüksek LD, bir haplogrubundan bilinen bir grup için bir temsilci 'Etiket SNP' tanımlamak için kullanılır. Bölgenin yüksek LD Genotipleme bir SNP haplogrubundan tüm SNPs, varyasyon temsil etmek yeterli olacak SNPs kez birlikte devralınacağı anlamına gelir. Alternatif olarak, Eğer çok sayıda bölgelerden, e.gSNPs kesin listesini takip., çoğaltma bir GWA çalışma için bu işlemi gereksiz olabilir. Çoğaltılmış Genotipleme için bir tahlil sonra bu hedefler öyle ki kitle bu uzantısı astar için farklı amplifikasyon astar vardır ve yorumlanabilir üretmek için ürünler spectra kitle tasarlanması gerekir. Bu parametreler bir çoğaltılmış Genotipleme tahlil tasarım aracı tarafından kolayca uygulanabilir. Bu tasarım ileriye ve geriye doğru astar faiz işaretleri hedef ve SNP içeren sıra yükseltmek için kullanılır. Uzantısı astar doğrudan SNPs proksimal iliştirin ve SNP için tamamlayıcı bir tek, kitle-modified, 'Terminatör' tabanı eklenir. Sonlandırıcı Bankası daha fazla DNA'ın uzantısı engeller. Kütle spektrometresi tarafından algılanması için tek bir Bankası tarafından farklı parçaları Bankası kütle değişimini sağlar. Genotipleme Kimya içeren plaka sonra bir çip bir kütle spektrometresi platformda ölçüm için uygulanır. Uygun kalite kontrol sistem tarafından algılanan ham Genotipleme aramaları uygulandıktan sonra veri ihraç ve hastalık fenotipleri ile ilişkisi için sınamak için istatistiksel analiz için kullanılan.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="695">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Genomic DNA&#160;</td>
			<td style="width:127px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:235px;">1 &#956;L at a concentration of 5-10 ng/&#956;L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Primers: forward and reverse amplification and extension</td>
			<td style="width:127px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:235px;">see manuscript section 1.2.1 on design of primers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deionized water&#160;</td>
			<td style="width:127px;">E.g. Milli-Q water&#160;</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>deionized with 18.2 M&#937;.cm resistivity</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Genotyping reagent kit. iPLEX Gold Chemistry reagent set&#160;</td>
			<td>Agena Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">#10148-2</td>
			<td style="width:235px;">includes all reagents for reactions in 2.2.1, 2.3.1 and 2.4.2 , chip and resin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PCR plates (384-well)</td>
			<td style="width:127px;">Abgene</td>
			<td style="width:119px;">#ABGAB-1384</td>
			<td style="width:235px;">For the MassARRAY system plates by Abgene are compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipettes</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>single and 8-channel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>compatible with 384-well plates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:235px;">compatible with PCR programs as detailed in 2.2.4, 2.3.2 and 2.4.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimple resin plate&#160;</td>
			<td>Agena Bioscience</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>6mg, 384-well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate rotator&#160;</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">MassARRAY Analyzer 4 System</td>
			<td style="width:127px;">Agena Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:235px;">MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization &#8211; time of flight) Mass Spectrometer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RS1000 Nanodispenser</td>
			<td style="width:127px;">Agena Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Assay Design Suite</td>
			<td style="width:127px;">Agena Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Tool used to design the multiplex genotyping assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hot Start Taq</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA polymerase enzyme&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Resin&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Agena Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Supplied with iPLEX kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

candidate gene testing in clinical cohort studies with multiplexed genotyping and mass spectrometry

Karmaşık hastalıklar genellikle hastalığı duyarlılık katkıda birden çok ortak genetik varyantların tarafından desteklenen. Burada, gen yolu kurum içinde klinik tabur araştırmak için kütle spektrometresi ile çoğaltılmış Genotipleme tahlil kullanarak bir düşük maliyetli etiket tek nükleotit polimorfizmi (SNP) yaklaşım tarif. Örnek olarak gıda Anti aday locus Interleukin13 (IL13) araştırıyoruz. Bu yöntem etkili bir şekilde kapsama bir bölge içinde paylaşılan bağlantı dengesizliği (LD) yararlanarak en üst düzeye çıkarır. Seçili LD SNPs sonra çoğaltılmış bir tahlil içine aynı anda, çözümlenmesi 40 farklı SNPs etkinleştirme maliyet-etkililik artırılması tasarlanmıştır. Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) Tek nükleotid uzantısı tarafından takip hedef loci yükseltmek için kullanılır ve amplicons sonra matris yardımlı Lazer Desorpsiyon/iyonlaşma-saati flight(MALDI-TOF) kütle spektrometresi kullanılarak ölçülür. Ham çıktı kalite kontrol mekanizması uygulamaktayız tanımları ve kesintileri, kullanarak yazılım, arama genotip ile analiz edilir ve yüksek olasılık genotip tespit ve veri analizi için çıkış.

Yukarıda açıklanan protokol ile biz genotyped bir kohort gıda alerji durumları ve denetimleri9Th2 bağışıklık gen IL13 genelinde SNPs etiketleyin. Biz logistic regresyon analizi, ilgi bölgedeki genetik varyantların gıda alerji riski artmış olup olmadığını sınamak soy ve diğer potansiyel covariates için uygulanır. Tablo 10 9 bir varyant rs1295686 meydan kanıtlanmış yiyecek alerji ile ilişkil...

Watch this Scientific Journal Video about Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry at JoVE.com

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Klinik kohort çalışmaları çoğaltılmış Genotipleme ve kütle spektrometresi ile test aday gen

Genetik varyantların karmaşık insan hastalığa katkıda kimliği roman mekanizmalar belirlemek için bize izin verir. Burada, biz aday genler veya kapsamı düşük maliyetle en üst düzeye çıkarır ve kohort-esaslı çalışmalar için mükellef gen yolu çözümlemesi için bir multiplex Genotipleme yaklaşım göstermektedir.

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

candidate-gene-testing-clinical-cohort-studies-with-multiplexed

Research

JoVE Journal

Genetics

10.0K Görüntüleme.  Max-Delbrück Center for Molecular Medicine. Genetik varyantların karmaşık insan hastalığa katkıda kimliği roman mekanizmalar belirlemek için bize izin verir. Burada, biz aday genler veya kapsamı düşük maliyetle en üst düzeye çıkarır ve kohort-esaslı çalışmalar için mükellef gen yolu çözümlemesi için bir multiplex Genotipleme yaklaşım göstermektedir.

Video: Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend diseases related to pregnancy. In this protocol, human primary villous cytotrophoblasts freshly isolated from placentas through a standard DNase/trypsin protocol are microporated with small interfering RNA (siRNA). This approach provided greater efficiency for siRNA transfection when compared to a lipofection-based method. Transfected cells can subsequently be analyzed by standard Western blot within a time frame of 3-4 days post-transfection. In addition, using cultured primary villous cytotrophoblasts, Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) analysis was optimized and performed on extracts from days 1 to 4. The use of these cultured primary cells and the protocol described allow for an evaluation of the implication of specific genes and transcription factors in the process of villous cytotrophoblast differentiation into a syncytiotrophoblast-like cell layer. However, the limited time span allowable in culture precludes the use of methods requiring more time, such as generation of a stable cell population. Therefore testing of this cell population requires highly optimized gene transfer protocols.

This protocol describes a method for efficiently transfecting siRNA in freshly isolated human villous cytotrophoblasts using microporation and identifying DNA-protein complexes in these cells. Transfected cells can be monitored by Western blot and EMSA analyses during the 4-day culture time.

Taze izole edilmiş insan Villöz sitotrofoblastlar ilgili siRNA transfeksiyonu ve EMSA analizi

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Genetik

Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP)

MALDI-TOF MS offers the possibility to differentiate some bacteria not only at the species and subspecies level but even below, at the strain level. Allelic isoforms of the detectable biomarker ions result in isolate-specific mass shifts. Mass spectrometry-based phyloproteomics (MSPP) is a novel technique that combines the mass spectrometric detectable biomarker masses in a scheme that allows deduction of phyloproteomic relations from isolate specific mass shifts compared to a genome sequenced reference strain. The deduced amino acid sequences are then used to calculate MSPP-based dendrograms.
Here we describe the workflow of MSPP by typing a Campylobacter jejuni ssp. doylei isolate collection of seven strains. All seven strains were of human origin and multilocus sequence typing (MLST) demonstrated their genetic diversity. MSPP-typing resulted in seven different MSPP sequence types, sufficiently reflecting their phylogenetic relations.
The C. jejuni ssp. doylei MSPP scheme includes 14 different biomarker ions, mostly ribosomal proteins in the mass range of 2 to 11 kDa. MSPP can in principle, be adapted to other mass spectrometric platforms with an extended mass range. Therefore, this technique has the potential to become a useful tool for strain level microbial typing.

Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics MSPP

Mass spectrometry-based phyloproteomics (MSPP) was used to type a collection of Campylobacter jejuni ssp. doylei isolates at the strain level in comparison to multilocus sequence typing (MLST).

alt türlerinin<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Ssp.<em&gt; doylei</em&gt; Kütle Spektrometre tabanlı PhyloProteomics kullanma izolatlar (MSPP)

MALDI-TOF MS offers the possibility to differentiate some bacteria not only at the species and subspecies level but even below, at the strain level. ...

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry (LC/ESI-MS) is described. DNA extraction is carried out using a silica membrane-based DNA extraction kit. After the PCR amplification using a detergent-free PCR buffer, restriction enzymes are added to the solution without purifying the reaction solution. A reverse-phase silica monolith column and a Fourier transform high resolution mass spectrometer having a modified Kingdon trap analyzer are employed for separation and detection, respectively. The mobile phase, consisting of 400 mM 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol, 15 mM triethylamine (pH 7.9) and methanol, is delivered at a flow rate of 0.4 ml/min. The cycle time for LC/ESI-MS analysis is 8 min including equilibration of the column. Deconvolution software having an isotope distribution model of the oligonucleotide is used to calculate the corresponding monoisotopic mass from the mass spectrum. For analysis of oligonucleotides (range 26-79 nucleotides), mass accuracy was 0.62 &#177; 0.74 ppm (n = 280) and excellent accuracy and precision were sustained for 180 hr without use of a lock mass standard.

An improved polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method for genotyping pufferfish species by liquid chromatography/mass spectrometry is described. A reverse-phase silica monolith column is employed for separating digested amplicons. This method can elucidate the monoisotopic masses of oligonucleotides, which is useful for identifying base composition.

Sıvı Kromatografi / Kütle Spektrometresi zehirlidir pufferfish Geliştirilmiş Polimeraz Zincir Reaksiyonu-kısıtlama Parça Uzunluk Polimorfizmi Genotiplemesi

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

İnsan Primer Hücre Kültürleri içinde Sirkadyen Saat Gen İfade ve Hormon salgısını Paralel Ölçümü

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in a single reaction. The miRNA assay counts transcripts by directly imaging and digitally counting miRNA molecules that are labeled with color-coded fluorescent barcoded probe sets (a reporter probe and a capture probe). Barcodes are hybridized directly to mature miRNAs that have been elongated by ligating a unique oligonucleotide tag (miRtag) to the 3&#39; end. Reverse transcription and amplification of the transcripts are not required. Reporter probes contain a sequence of six color positions populated using a combination of four fluorescent colors. The four colors over six positions are used to construct a gene-specific color barcode sequence. Post-hybridization processing is automated on a robotic prep station. After hybridization, the excess probes are washed away, and the tripartite structures (capture probe-miRNA-reporter probe) are fixed to a streptavidin-coated slide via the biotin-labeled capture probe. Imaging and barcode counting is done using a digital analyzer. The immobilized barcoded miRNAs are visualized and imaged using a microscope and camera, and the unique barcodes are decoded and counted. Data quality control (QC), normalization, and analysis are facilitated by a custom-designed data processing and analysis software that accompanies the assay software. The assay demonstrates high linearity over a broad range of expression, as well as high sensitivity. Sample and assay preparation does not involve enzymatic reactions, reverse transcription, or amplification; has few steps; and is largely automated, reducing investigator effects and resulting in high consistency and technical reproducibility. Here, we describe the application of this technology to identifying circulating miRNA perturbations in irritable bowel syndrome.

We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.

İrritabl Bağırsak Sendromu içinde miRNA&#39;lar Sirkülasyon tedirginlikler bir Çoklanmış Yüksek verim Gen İfadesi Platformu Kullanma Algılanan

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.

We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.

İç Standartları FACS ve qPCR kullanma Tek hücreli Gen İfadesi Profil

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer's Disease Gene Susceptibility Assessment

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but especially on red blood cells (RBCs). As a receptor for the complement components C3b and C4b, CR1 regulates the activation of the complement cascade and promotes the phagocytosis of immune complexes and cellular debris, as well as the amyloid-beta (A&#946;) peptide in Alzheimer's disease (AD). Several studies have confirmed AD-associated single nucleotide polymorphisms (SNPs), as well as a copy-number variation (CNV) in the CR1 gene. Here, we describe an innovative method for determining the length polymorphism of the CR1 receptor. The receptor includes three domains, called long homologous repeats (LHR)-LHR-A, LHR-C, and LHR-D-and an n domain, LHR-B, where n is an integer between 0 and 3. Using a single pair of specific primers, the genetic material is used to amplify a first fragment of the LHR-B domain (the variant amplicon B) and a second fragment of the LHR-C domain (the invariant amplicon). The variant amplicon B and the invariant amplicon display differences at five nucleotides outside of the hybridization areas of said primers. The numbers of variant amplicons B and of invariant amplicons is deduced using a quantitative tool (high-resolution melting (HRM) curves), and the ratio of the variant amplicon B to the invariant amplicon differs according to the CR1 length polymorphism. This method provides several advantages over the canonical phenotype method, as it does not require fresh material and is cheaper, faster, and therefore applicable to larger populations. Thus, the use of this method should be helpful to better understand the role of CR1 isoforms in the pathogenesis of diseases such as AD.

Here, we describe an innovative method to determine complement receptor 1 (CR1) length polymorphisms for use in several applications, particularly the assessment of susceptibility to diseases such as Alzheimer&#39;s disease (AD). This method could be useful to better understand the role of CR1 isoforms in the pathogenesis of AD.

Complement Reseptör 1 Boyunca Polimorfizm Genotiplendirme için Yüksek Çözünürlükte Melting PCR: Alzheimer Hastalığı Gen Duyarlılık Değerlendirmesi için Yenilikçi Bir Araç

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in which the gene of interest has been disrupted. A gene-disruption DNA construct containing a suitable antibiotic resistance marker gene is useful for the generation of gene-disrupted strains in bacteria. However, conventional construction methods, which require gene cloning steps, involve complex and time-consuming protocols. Here, a relatively facile, rapid, and cost-effective method for targeted gene disruption in Streptococcus mutans is described. The method utilizes a 2-step fusion polymerase chain reaction (PCR) to generate the disruption construct and electroporation for genetic transformation. This method does not require an enzymatic reaction, other than PCR, and additionally offers greater flexibility in terms of the design of the disruption construct. Employment of electroporation facilitates the preparation of competent cells and improves the transformation efficiency. The present method may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

We describe a facile, rapid, and relatively inexpensive method for the generation of gene-disrupted Streptococcus mutans strains; this technique may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Nesil bir gen kesintiye Streptococcus mutans çoğunlukla zorlanma olmadan Gen Klonlama

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for germination or early seedling development are activated by gibberellin (GA), while genes associated with stress responses are activated by abscisic acid (ABA). The mechanisms of GA and ABA signaling can be interrogated by introducing reporter gene constructs into aleurone cells via particle bombardment, with the resulting transient expression measured using enzyme assays. An improved protocol is reported that partially automates and streamlines the grain homogenization step and the enzyme assays, allowing significantly more throughput than existing methods. Homogenization of the grain samples is carried out using an automated tissue homogenizer, and GUS (&#946;-glucuronidase) assays are carried out using a 96-well plate system. Representative results using the protocol suggest that phospholipase D activity may play an important role in the activation of HVA1 gene expression by ABA, through the transcription factor TaABF1.

An improved protocol is presented for the measurement of transient gene expression from reporter constructs in barley aleurone cells after particle bombardment. The combination of automated grain grinding with 96-well plate enzyme assays provides high throughput for the procedure.

Gen ifadesinin artan işlem hacmi ile alı arpa Aleurone katmanlarında ölçme

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...