Bu iş için hibe yoluyla Wellcome Trust tarafından finanse edildi APM [076566/Z/05/Z] JCK [074.318] İnsan Genetiği için Wellcome Trust Merkezi çekirdek bir ödülü [075491/Z/04].

1) Hücre Kültürü <ol><li> Ilgi gen eksprese eden hücre türlerini seçin. </li><li> DNA risk varyantları ve ilgi (Şekil 1) içinde gen transkripsiyonu kodlama polimorfizmi için heterozigot hücre hatları seçin. </li><li> Kültür tedarikçi özellikleri ise DNA ve RNA ekstraksiyonu için 2 x 10 cm Petri yemekler hazırlamak göre seçilen hücre hatları. </li><li> Hücrelerin% 80 izdiham aşağıda açıklanan prosedürü izleyerek ya da piyasada bulunan kitler kullanılarak hasat hücrelere prosedürünü başlatmak ve DNA ve RNA izole ulaştığınızda. </li></ol> 2) DNA Ekstraksiyon <ol><li> Çanak ortamları çıkarın, PBS ile yıkayın ve lizis solüsyonu (% 0.6 SDS, 100 mM NaCl, 50 mM Tris, 20 mM EDTA ve 50 mg / ml RNaz A) çanak 500 mcL ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 20 dakika süreyle hafifçe Rock plaka. </li><li> ° C 37 gecede bir mikrosantrifüj tüp ve inkübe hücre lizat Pençe. </li><li> Nihai konsantrasyonu 100 mg / ml proteinaz K ve 37 ° C gecede inkübe. </li><li> Fenol-kloroform pH 8, tekrar eşit hacmi ile DNA ayıklayın, sonra kloroform / izoamil alkol eşit hacmi ile ayıklayın. </li><li> 1 / 10 hacim 3 M NaCl ve 2,5 hacim% 100 etanol ile DNA çöktürün. </li><li> 30 dakika 13.000 rpm&#39;de dönmeye 4, sonra 5 dakika buz bekletin ve ° C </li><li> DNA% 70 etanol ile yıkayın, hava kuru ve TE 200 mcL tekrar süspansiyon izin verir. </li><li> 65 ° C&#39;de 10 dakika ve oda sıcaklığında 2 gün bekletin. </li><li> -20 ° C ya da uzun vadeli ° C 4 Mağaza </li></ol> 3) RNA Ekstraksiyon <ol><li> Çanak ortamları çıkarın, oda sıcaklığında 10 dakika inkübe TRIzol ve 1 mL PBS ile yıkayın. </li><li> Pençe hücreler, bir mikrosantrifüj tüp içinde bir kaç kez transfer, pipet ve 5 dakika inkübe edin. </li><li> 10.000 rpm&#39;de 10 dakika süreyle Spin 4 ° C </li><li> Taze bir tüp içinde süpernatant transferi ve kloroform 200 mcL ekleyin. </li><li> Shake ve 10.000 rpm&#39;de 10 dakika için spin 4 ° C </li><li> Taze bir tüp içinde sulu faz transfer ve% 70 etanol eşit hacmi ekleyin. </li><li> 1 veya 2 (hacmine bağlı olarak) 30 saniye süreyle maksimum hızda RNeasy sütun ve spin çözüm yükleyin. </li><li> Burada RNeasy kiti (Qiagen) talimatları takip edin. </li></ol> 4) Nükleik Asit Numune Hazırlama <ol><li> DNA ve RNA konsantrasyonu NanoDrop Spektrofotometre (Thermo Scientific) kullanarak sayısal olarak. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre rastgele decamers ve Üst Simge III Reverse Transcriptase (Invitrogen) kullanarak RNA 500-1000 ng cDNA hazırlayın. </li></ol> 5) PCR ve Primer Eklenti Testi <ol><li> Tasarım iki çift, her DNA markör için PCR primerleri, genomik DNA amplifikasyonu için bir çift ve cDNA için diğer çifti (Şekil 2 ). Ileri yerleştirin ve genomik kirlenmesini önlemek amacıyla farklı ekzonlarında cDNA astar ters. Tasarım aralığı 100-500 bp uzunluğunda bir PCR ürünü elde etmek için astar. </li><li> 0.5 U Taq Immolase (BioLine) 0.8 mM dNTP, 2 mM MgCl 2, 0.2 M her astar ve cDNA veya DNA ya da 20 ng dahil olmak üzere 10 mcL PCR reaksiyonu hazırlayın. Dört bağımsız reaksiyonlar her numune artırın. </li><li> PCR amplifikasyon doğrusal faz devir sayısı tutan her bir primer çifti için optimize edilmiş koşullar altında çalıştırın. </li><li> Eksonükleaz ile PCR ürününün kuluçka fazla PCR primer ve dNTP çıkarın I ve 37 Karides Alkalin Fosfataz (SAP) ° C de 20 dakika. </li><li> 384 plaka üzerine iki kez her bir PCR ürünü Spot, 8 ölçümleri, her bir örnek için uygun olacağını. </li><li> Testi Tasarım (Sequenom) yazılımı ile aynı astar genomik ve cDNA PCR ürünleri için kullanılan böylece uzatma astar tasarlayın. 3ddNTPs kombinasyonları (Şekil 2) de dahil olmak üzere 14-18 bp ve uzatma karışımı astar süresini belirtin. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre MassARRAY sistemi (Sequenom) kullanarak astar uzatma reaksiyonu ve MALDI-TOF/MS analiz yürütmek. </li><li> Tipik bir astar uzatma reaksiyonu bir başlangıç ​​adımı 94 ° C, 2 dakika süreyle, 5 s, 5 s için 52 ° C ve 72 ° C 94 ° C 40 döngüleri takip 5 s. </li><li> Astar uzatma ürünleri SpectroCLEAN reçine ile temizlenmeli ve SpectroPOINT nanolitre dağıtıcı tarafından mikroarray (chip) üzerine aktarılır. </li><li> Uzun oligonükleotidler SpectroREADER bir kütle spektrometresi kullanarak MALDI-TOF nicel. </li></ol> 6) İstatistiksel Analiz <ol><li> MALDI-TOF/MS sonuçları deney genel kalitesi için MassARRAY Typer yazılımı ile kontrol edin. </li><li> Pik alan verileri içeren Allelotyping raporu ayıklayın. </li><li> Her bir spektrum hesaplamak içinallel 1 ve allel 2 (pik alanına oranı) pik alanı arasındaki oran. </li><li> 8 ölçümleri arasında, Excel karşılık gelen fonksiyonunu kullanarak, her cDNA örnek için bir pik alan oranı ortalama ve standart sapma kaynaklanıyor. </li><li> 8 ölçümleri genomik DNA boyunca aynı ortalama pik alan oranı türet. </li><li> CDNA ortalama oranı, beklenen 1:1 oranında sapma değerlendirmek için genomik ortalama oranı ile bölün. </li></ol> 7) Deneysel Kontrolleri <ol><li> Deneysel eserler ekarte etmek için, deney en az üç kez tekrarlayın. </li><li> Ek DNA belirteçleri Mümkün olduğunda, tasarım deneyleri. </li><li> Hem ileri ve geri tellerine tavlama çoklu PCR primer çiftleri ve uzatma primerler tasarlayın. </li><li> Aldığınızda DNA işaretleyicileri için heterozigot ama fenotipi ile ilişkili DNA risk türevleri yapmamaktadırlar negatif kontroller hücre hatları mümkün testi (Şekil 1 ve 3) </li></ol> 8) Temsilcisi Sonuçlar Kütle spektrometresi izleri örnekler Şekil 3, allel spesifik ifade analizi bir örnek gösterilmiştir. Şekil 4 farklı şablonlar üzerinde yapılan 4 allel spesifik primer uzatma ürünleri analiz sonuçları göstermektedir. Üst grafikler transkripsiyonu kodlama polimorfizmi için heterozigot hem de iki farklı hücre hatları, genomik DNA analizinden elde edilen sonuçlar temsil eder. Ancak, sadece hücre hattı risk DNA varyantı (Şekil 1) için heterozigot. Düşük grafikler aynı hücre hatları elde edilen cDNA analizinden elde edilen sonuçlar temsil eder. Deneysel artifakı bir sonucu olarak ilk zirve, her zaman ikinci bir zirve bile genomik analiz daha yüksek. Bu nedenle, genomik analiz sonuçları cDNA veri normalleştirmek için kullanılır. Normalleştirme sonra, allel oranı anlamlı derecede farklı hücre hattı 1 A (ikinci zirve diğer spektrumları karşılaştırıldığında daha düşük göründüğü), veri bu hücre hattı öneririz B. 1 hücre hattı çok yakın iken A taşır DNA analiz altında gen ifadesi azaltır ikinci zirve ile ölçülen alleli ile faz varyant. Hücre B hattı çok uygun bir negatif kontrol sağlar. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. A ve B hücre hattı seçim stratejisi. Hücre dizileri ama sadece hücre hattı risk DNA varyantı (daire) için heterozigot bir transkripsiyonu kodlama işaretleyici (üçgen) heterozigot. Mavi risk varyant allel daha düşük bir seviyede transkripsiyon, (gerçek fonksiyonel varyant ile yakın bir ilişki içinde doğrudan bir etkisi olan ya da ya) ilişkilidir. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Allel özel astar assay uzantısı. Bu rakam cDNA (solda) ve genomik DNA (sağda) şablonları için yapılan deneysel işlemin iş akış göstermektedir. PCR primerleri (gri dikdörtgenler) heterozigot kodlama polimorfizmi (üçgen) yükseltmek için tasarlanmıştır. Genomik kirlenme PCR primerleri amplifikasyon cDNA şablon üzerinde yapılan farklı ekzon (açık mavi bar) yerleştirilir dizileri tavlama önlemek için. PCR ürünü daha sonra polimorfizmi yanında bir baz tavlama bir uzantısı astar ile yürütülen bir astar uzatma reaksiyonu için şablon olarak kullanılır ve üç dideoxynucleotide uygun karışımlar (ddNTPs) sonlandırıcılar (kare) ve bir deoksinükleotid (daire) genişletmek için sırasıyla bir ya da iki temeli astar. Ortaya çıkan astar uzatma ürünleri MALDI-TOF kütle spektrometresi ile ayırma ve miktar izin farklı kitleler var. DNA marker mavi allel karşılık gelen ürün miktarı kırmızı allel nispeten düşüktür. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Allel spesifik bir ifade testinin sonuçları. Rakam genomik DNA üzerinde yapılan analiz kütle spektrometresi sonuçları ve hücre hattı cDNA A ve B hücre hattı (Şekil 1) .

<ol>
	<li>Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+complex+disease+traits+with+global+gene+expression.">Mapping complex disease traits with global gene expression.</a> Nat Rev Genet. 10, 184-194 (2009).</li><li>Singer-Sam, J., LeBon, J. M., Dai, A., Riggs, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive,+quantitative+assay+for+measurement+of+allele-specific+transcripts+differing+by+a+single+nucleotide.">A sensitive, quantitative assay for measurement of allele-specific transcripts differing by a single nucleotide.</a> PCR Methods Appl. 1, 160-163 (1992).</li><li>Yan, H., Yuan, W., Velculescu, V. E., Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+variation+in+human+gene+expression.">Allelic variation in human gene expression.</a> Science. 297, 1143-11 (2002).</li><li>Ding, C., Cantor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+gene+expression+analysis+technique+using+competitive+PCR+and+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+MS.">A high-throughput gene expression analysis technique using competitive PCR and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 3059-3064 (2003).</li><li>Gabriel, S., Ziaugra, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNP+genotyping+using+Sequenom+MassARRAY+7K+platform.">SNP genotyping using Sequenom MassARRAY 7K platform.</a> Curr Protoc Hum Genet Chapter. Chapter 2 (Unit 2), 12-12 (2004).</li><li>Lo, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+variation+in+gene+expression+is+common+in+the+human+genome.">Allelic variation in gene expression is common in the human genome.</a> Genome Res. 13 (8), 1855-1862 (2003).</li><li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression-based+discovery+of+variation+in+the+human+glutathione+S-transferase+M3+promoter+and+functional+analysis+in+a+glioma+cell+line+using+allele-specific+chromatin+immunoprecipitation.">Expression-based discovery of variation in the human glutathione S-transferase M3 promoter and functional analysis in a glioma cell line using allele-specific chromatin immunoprecipitation.</a> Cancer Res. 65, 99-104 (2005).</li><li>Knight, J. C., Keating, B. J., Rockett, K. A., Kwiatkowski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+regulatory+polymorphisms+by+allele-specific+quantification+of+RNA+polymerase+loading.">In vivo characterization of regulatory polymorphisms by allele-specific quantification of RNA polymerase loading.</a> Nat Genet. 33 (4), 469-475 (2003).</li><li>Pastinen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+genetic+and+epigenetic+variation+affecting+human+gene+expression.">A survey of genetic and epigenetic variation affecting human gene expression.</a> Physiol Genomics. 16 (2), 184-193 (2004).</li><li>Francks, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+77-kilobase+region+of+chromosome+6p22.2+is+associated+with+dyslexia+in+families+from+the+United+Kingdom+and+from+the+United+States.">A 77-kilobase region of chromosome 6p22.2 is associated with dyslexia in families from the United Kingdom and from the United States.</a> Am J Hum Genet. 75 (6), 1046-1058 (2004).</li><li>Paracchini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromosome+6p22+haplotype+associated+with+dyslexia+reduces+the+expression+of+KIAA0319,+a+novel+gene+involved+in+neuronal+migration.">The chromosome 6p22 haplotype associated with dyslexia reduces the expression of KIAA0319, a novel gene involved in neuronal migration.</a> Hum Mol Genet. 15 (10), 1659-1666 (2006).</li></ol>

Bu yöntem, transkript düzeyinde in vivo allel belirli bir fark değerlendirerek gen ekspresyonu hastalığı ile ilişkili DNA varyantlarının etkinin değerlendirilmesini sağlar . Bu protokol göreli transkript bolluk MALDI-TOF ama TaqMan 6,7 gibi allel spesifik kantifikasyon sağlayan diğer teknolojileri ile ölçülür kullanılabilir. Bu yaklaşımın en önemli kısıtlılığı, transkripsiyonu kodlama belirteçlerin durumu. Ilkesine dayalı yöntemler burada açıklanan, ancak farklı sınıflar polimorfizmleri yararlanarak tarif edilmiştir. HaploChip testi 1 kb II 8 polimeraz RNA spesifik antikorlar ile izole kromatin immunoprecipitated malzeme olacak bir gen transkripsiyonel başlangıç ​​veya sonuna sitesi içinde yer belirleyicileri kullanarak allel spesifik ifade ölçer. Alternatif olarak, şablonu RNA 9 farkı çekirdekli zaman intronik SNP kullanılabilir. Belirli bir protokol haploChip testi ile birlikte, burada açıklanan disleksi için aday gen (ya da okuma engelli) tanımlamak için başarıyla kullanılmaktadır. Başlangıçta bir genetik ilişki çalışmasında, disleksi kapsayan ve üç gen 10 ile ilgili bir DNA dizisi belirledi. Allel spesifik gen ekspresyonu assay disleksi ile ilişkili DNA varyantları ifade varyasyonu varlığı sadece biri için üç gen gözlenen ancak diğer iki 11 olduğunu gösterdi.

<table border="1">
	<thead>
		<tr>
			<th>Material Name</th>
			<th>Type</th>
			<th>Company</th>
			<th>Catalogue Number</th>
			<th>Comment</th>
		</tr>
	</thead>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4417-100TAB</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0416</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27788.366</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308-500MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol: chloroform</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>77617</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100777C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32221-2.5L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immolase Taq</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21048</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DNTP100A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease 1</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0293S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shrimp Alkaline Phosphatase</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>E70092Z</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroCLEAN resin</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>10053</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassEXTEND ddNTP/dNTP mix </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Varies according to assay design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassEXTEND thermosequenase </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>10052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chilled microcentrifuge</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroPOINT nanolitre dispenser</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroREADER mass spectrometer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an allele-specific gene expression assay to test the functional basis of genetic associations

Ortak kompleks özellikleri ile önemli genetik derneklerin sayısı sürekli artmaktadır. Ancak, bu derneklerin çoğu moleküler düzeyde anlaşılmaktadır değil. Fenotipleri DNA varyantlarının etkisi aracılık mekanizmalardan biri, gen ekspresyonu, özellikle karmaşık özellikler için 1 ilgili olarak gösterilmiştir . Bu yöntem, bir hücresel bağlamda gen ekspresyonu üzerine spesifik DNA dizilerinin etkisi testleri. Ilke, bir genin iki allel kaynaklanan hastalığı (risk çeşitleri) 2,3 ile ilişkili DNA dizilerinin bir kopyasını taşıyan hücrelerin analizi, transkript göreceli bolluk ölçmek için . Bu nedenle, bu yöntem için kullanılan hücreler, iki temel genotipik gereksinimleri karşılaması gerekir: DNA risk varyantları ve kromozom kökenli (Şekil 1) dayalı transkript ayırt edebilirsiniz DNA işaretleri, genellikle kodlama polimorfizmleri, iki heterozigot olmak zorunda. DNA risk varyantları ve DNA belirteçlerinin aynı allel sıklığı gerekmez ancak genetik belirteçlerin faz (haplotypic) ilişkinin anlaşılması gerekir. Ilgi gen ifade hücre tipleri seçmek için de önemlidir. Bu protokol, özellikle nükleik asitlerin fibroblastlar ayıklamak için kabul prosedürü ifade eder, ancak yöntemin birincil hücreler de dahil olmak üzere diğer hücrelere türleri için de geçerlidir. DNA ve RNA hücre hatları elde ediliyor ve cDNA üretilir. DNA ve cDNA, kodlamayan DNA işaretleri 4 hedef için tasarlanmış bir astar uzantısı testi ile analiz edilir . Astar uzantısı tahlil üreticinin spesifikasyonlarına göre MassARRAY (Sequenom) 5 platformu kullanılarak yapılmaktadır. Primer uzatma ürünleri matriks yardımlı lazer desorpsiyon / iyonizasyon kütle spektrometresi (MALDI-TOF/MS) uçuş süresi ile analiz edilir. Seçilmiş belirteçlerinin heterozigot Çünkü iki tepe MS profilleri üretecektir. Her pik alanı transkript bolluk orantılıdır ve bir alel oranı (allel 1: 2 allel) oluşturmak için MassARRAY Typer yazılım bir fonksiyonu hesaplama ile ölçülebilir. CDNA elde allelik oranı genomik DNA, alel oranı 1:01 teknik eserler için doğru olması bekleniyor ölçülen kullanarak normalize. 1 önemli ölçüde farklı bir normalize allelik oranı ile belirteçleri fenotipi ile ilişkili DNA varyantları gen ekspresyonu üzerinde bir etkiye sahip olduğunu düşündüren, aynı hücrede iki kromozom elde edilen transkript miktarı farklı olduğunu göstermektedir. Deneysel kontrollerin sonuçları onaylamak için kullanılmalıdır.

Watch this Scientific Journal Video about An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations at JoVE.com

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

Genetik dernekler genellikle işlevsel bir düzeyde açıklanamayan kalır. Bu yöntem, analiz ederek transkripsiyonu SNP için heterozigot hücrelere gen ekspresyonu fenotipi ile ilişkili genetik belirteçlerin etkisini değerlendirmek amaçlamaktadır. Teknoloji allel spesifik astar uzatma ürünleri ölçmek için MALDI-TOF kütle spektrometresi doğru ölçüm sağlar.

Genetik Dernekleri Fonksiyonel Dayanak Test bir Allel özel Gen İfadesi Testi

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

an-allele-specific-gene-expression-assay-to-test-functional-basis

Research

JoVE Journal

Biology

22.7K Görüntüleme.  University of Oxford. Genetik dernekler genellikle işlevsel bir düzeyde açıklanamayan kalır. Bu yöntem, analiz ederek transkripsiyonu SNP için heterozigot hücrelere gen ekspresyonu fenotipi ile ilişkili genetik belirteçlerin etkisini değerlendirmek amaçlamaktadır. Teknoloji allel spesifik astar uzatma ürünleri ölçmek için MALDI-TOF kütle spektrometresi doğru ölçüm sağlar.

Video: An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

Light/dark Transition Test for Mice

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, however, can be used to delete or manipulate a specific gene in mice. The influence of a given gene on a specific behavior can then be determined by conducting behavioral analyses of the mutant mice. As a test for behavioral phenotyping of mutant mice, the light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. The test is based on the natural aversion of mice to brightly illuminated areas and on their spontaneous exploratory behavior in novel environments. The test is sensitive to anxiolytic drug treatment. The apparatus consists of a dark chamber and a brightly illuminated chamber. Mice are allowed to move freely between the two chambers. The number of entries into the bright chamber and the duration of time spent there are indices of bright-space anxiety in mice. To obtain phenotyping results of a strain of mutant mice that can be readily reproduced and compared with those of other mutants, the behavioral test methods should be as identical as possible between laboratories. The procedural differences that exist between laboratories, however, make it difficult to replicate or compare the results among laboratories. Here, we present our protocol for the light/dark transition test as a movie so that the details of the protocol can be demonstrated. In our laboratory, we have assessed more than 60 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. Those data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.

Visualization of the protocol will facilitate understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used across laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test.

The light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie that shows detailed procedures on how we conduct the test.

Fareler için açık / koyu Geçiş Testi

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Biyoloji

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Civciv Embriyo Sinir İndüksiyon için Testi

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Omurilik Elektrofizyoloji

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Gen İfadesi Çalışmaları basitleştirin Otomatik Hücre Sayıcı kullanma: Namalwa Hücreler IL-4 Bağımlı Gen İfadesi siRNA demonte

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

Embriyo sırasında Fonksiyonel Artıklık Test Ters Genetik Yaklaşım

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Kromatin Immunoprecipitation İnsan Hücrelerinde Aktif Gen İfadesi Testi Dinamik Histon Modifikasyon (ChIP)

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

Farmakolojik ve Fonksiyonel Genetik Tahliller Planarian Rejenerasyon işleyin<emJaponica> Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...