Güvenilir hayvan modelleri temel araştırmanın önemli bileşenleridir. Bizim mürin yaklaşımımemelilerde akut akciğer hasarı gelişimi mekanistik ve kinetik immünolojik sorulara cevap sağlar. Minimal invazivlik, basit kullanım ve iyi tekrarlanabilirlik bu tekniğin başlıca avantajlarıdır.
Buna ek olarak, doz titrasyonu ile, biz klinik etkisi modüle edebilirsiniz. Bu teknik, ciddi akciğer hasarı olan hastaların klinik durumunu yansıtarak altta yatan mekanizmaların araştırılmasını sağlar. Lipopolisakkarit veya LPS'yi mililitrebaşına beş miligramlık bir konsantrasyonda eksi 20 santigrat derecede saklayın.
İntratrakeal aşılama için, steril fosfat tamponlu tuzlu da çözülmüş LPS'yi mililitrede 2,000 mikrogramlık son konsantrasyona seyreltin. 22-gauge venöz kateter20 milimetre uzunluğunda kesin. 37 santigrat derece lik bir vücut sıcaklığıkorumak için fareyi Sıcaklık kontrollü bir masaya yatkın konuma yerleştirin.
Metin protokolünde açıklandığı gibi anesteziyi takiben, anestezi altında korneaların kurumasını önlemek için steril oftalmik yağ layıcı uygulayın. Ön patiler masayla yakın temas halinde kalırken, masanın yaklaşık beş santimetre yukarısında konumlandırılmış yatay bir çubuktaki baş ve kanca kesici leri kaldırın. Boynu masaya göre 90 derecelik açıyla süper genişletin.
Ses tellerini görselleştirmeye ve trakeayı hedeflemeye yardımcı olmak için gırtlanın üzerindeki cilde soğuk bir ışık kaynağı yerleştirin. Daha kolay entübasyon koşulları için boğaz düzeltmek için forseps ile dil tutun. Gırtlanın doğru görüntülenmesi ve tanımlanması kateterin doğru intratrakeal yerleşimini sağlamak için önemlidir.
Harici bir soğuk ışık kaynağı bu adımda yardımcı olur. Kateteri yaklaşık 10 milimetretlik bir trakeaya yerleştirin. Bu sağ veya sol ana bronş içine sıvı tek taraflı aşılama neden olacağı gibi ekleme, çok derin olmadığından emin olun.
Gırtlağın direnci oluşursa, tekrar ilerlemeden önce kateteri birkaç milimetre geri çekin. Şimdi, lps seyreltilmiş MPBS bir pipet kullanarak enjekte edin. Enjekte edilen hacim farenin vücut ağırlığına bağlıdır.
Bir şırınga bağlayın ve tam sıvı hacmi akciğerlerde dağıtılan sağlamak için hava 50 mikrolitre bir bolus ekleyin. Kateteri yavaşça çıkarın. Trakeadan sıvı sızıntısını önlemek için farenin üst gövdesini 30 saniye boyunca dik bir pozisyonda tutun.
Bir operasyon masasında bant ile ötenazi fare düzeltmek ve kısa bir süre% 70 etanol ile karın üzerinde kürk dezenfekte. Karın boşluğunu makas ve cımbızla ortanca çizgide dikkatlice açın. Karın aort vertebral sütuna vena kava inferior sağ erişim elde etmek için bağırsak parçaları çıkarın.
Böbrek damarları bulmak ve vena kava inferior içine bir mililitreşşile bağlı bir bükülmüş, 23-gauge kanül eklemek, doğrudan damarların birleşimi altında. 250 mikrolitre kan aspirat ve 0,5 molar EDTA çözeltisi 20 mikrolitre ile dolu 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. EDTA karıştırma kolaylaştırmak ve buz üzerine tüp koymak için hafifçe çalkalayın.
Bronkoalveoler lavaj için, her biri 0,5 mililitre steril PBS ve 0,1 mililitre hava içeren üç adet mililitre şırınga hazırlayın. % 70 etanol ile boğaz kürk dezenfekte ve dikkatle makas ve cımbız ile trakea maruz. Nefes borusunu harekete geçirin ve etrafına bir dikiş sarın.
Trakeayı mikro makas kullanarak delin ve 20 milimetre uzunluğa kadar kesilmiş 22 kalibrelik venöz kateter takın. Kateteri bir dikişle düzeltin ve 0,5 mililitre steril PBS ve 0,1 mililitre hava aşıla. 60 saniye sonra sıvı aspire.
Ek iki şırınga ile prosedürü tekrarlayın ve buz üzerinde 15 mililitrelik bir tüp içinde tüm aspire toplamak. Dikkatle akciğerleri hasat makas ve cımbız ile göğüs açık. Costal marjı boyunca diyafram kesin ve iki lateral kesiler ile kaburga kesti.
Akciğerleri dikkatlice delmekten kaçının. Sternum kranially kaldırın ve düzeltmek veya çıkarın. Sıcak, 37 derece Santigrat PBS ile iki 10 mililitreşli şırınga hazırlayın.
Sol ventriküliçine küçük bir kesi yapın. 26-gauge kanül ile sağ ventrikül delinme. Sonra, önceden ısıtılmış bir PBS ile pulmoner dolaşımı floş.
İşlem sırasında akciğerlerin solukla döndüğünü unutmayın. Akciğerlerin sağ lobu çıkarın ve yarıya kesin. Snap sıvı nitrojen onları dondurma eksi 80 santigrat derece daha fazla gen ekspresyonu ve protein analizi için uzun vadeli depolama izledi.
Tüm sol akciğer çıkarın ve makas ve cımbız ile doku kıyma tarafından 48-iyi plaka içinde homojenize. Dokuyu 2 mililitre sindirim tamponuna 37 derecede 60 dakika kuluçkaya yatırın. Akciğer dokusu parçalarını dikkatlice yukarı ve aşağı boruile tutarak daha fazla homojenizasyon gerçekleştirin.
Kan örneklerini beş mililitrelik FACS tüpüne aktarın ve kanı iki mililitre kırmızı kan hücresi lisis tamponuyla hafifçe karıştırın. Tüpleri buza koyun ve iki mililitre buz gibi pbs ekleyerek iki dakika sonra reaksiyonu sonlandırın. Numuneyi 400 kez g'de beş dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı atın.
Daha önce açıklanan protokollere göre sonraki FACS boyama için 60 mikrolitre FACS tampon ve süreç ile hücre pelet resuspend. 400 kez g beş dakika santrifüj BAL sıvı. Supernatant aspire ve sıvı nitrojen daha fazla protein analizi için eksi 80 santigrat derece uzun süreli depolama ardından dondurmak.
Bal hücreli peleti iki mililitre soğuk FACS tamponuyla yeniden askıya aldıktan sonra, süspansiyonu kılları dizginlemek için 100 mikron örgü filtre kullanarak beş mililitrelik bir FACS tüpüne aktarın. Numuneyi tekrar santrifüj ettikten sonra, 60 mikrolitre FACS tamponu ile peleti yeniden askıya alın ve daha önce açıklanan protokollere göre sonraki FACS boyama işlemi için. Şimdi, sindirilmiş sol akciğer dokusunu kümeleri çıkarmak için 100 mikronluk bir örgü filtre kullanarak beş mililitrelik bir FACS tüpüne aktarın.
400 kez g beş dakika için örnek santrifüj önce buz gibi FACS tampon iki mililitre ekleyerek sindirim sürecini sonlandırın. Supernatant atın ve daha önce açıklanan protokollere göre sonraki FACS boyama için FACS tampon ve süreç 60 mikrolitre ile pelet resuspend. BIR FACS analizi için, beş mililitrelik bir tüpteki 60 mikrolitre hücreye 20 mikrolitre CD16/CD32 antikor engelleme çözeltisi ekleyin.
Fc reseptörlerine immünglobulin nonspesifik bağlanmasını engellemek için 15 dakika boyunca dört santigrat derecede hücreleri kuluçkaya yatırın. Bu arada, metin protokolünde açıklandığı gibi, FACS arabellek ve antikorlar ile bir ana karışımı hazırlamak. Bloke ettikten sonra hücreleri yıkamayın.
100 mikrolitrelik son hacmi elde etmek için numune başına 20 mikrolitre antikor ana karışımı ekleyin. Numuneleri karanlıkta 20 dakika boyunca 4 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Her numuneyi bir mililitre FACS tamponu ve santrifüjile yıkayın.
Supernatant atın ve FACS tampon ucs ölçümleri için uygun hücre konsantrasyonu ile pelet resuspend. Son olarak, mutlak hücre numaralarını belirlemek için her örneğe ticari olarak kullanılabilen florokrom çiftli kalibrasyon boncuklarının sabit numaralarını ekleyin. Kan, BAL ve doku hücreleri için metin protokolünde gösterilen gating stratejisini kullanarak akış sitometrisi yapın.
İntratrakeal instillasyondan sonra 24 ve 72 saat sonra, akciğer dokusunda TNF-alfa ekspresyonu önemli ölçüde upregulated edildi, kontrol hayvanlara göre sürekli ve 50 kat daha fazla artış ulaştı. Doku ve alveoler alana lökosit invazyonu akut akciğer hasarı gelişimi için bir özellik ve karakteristiktir. FACS analizi, 24 saat sonra kontrollere göre mutlak hücre sayısının neredeyse dokuz kat arttığı, nötrofil granülositlerin akciğer interstisyumuna önemli ölçüde infiltrasyon unu saptandı.
Mutlak nötrofil granülosit sayısı 72 saat sonra biraz azalmış, ancak kontrollere göre faktör artışı devam etti. Interstisyel nötrofil granülosit infiltrasyonu ile tutarlı olarak, tüm akciğer dokusunda MMP-9 ekspresyonu da toplam gözlem süresi boyunca anlamlı olarak artmıştır. Nötrofil granülositler sadece akciğer dokusunda değil, BAL sıvısında da artmıştır.
Kontrol hayvanlarına göre kat artışı akciğer dokusuna göre daha belirgindi. Alveolokapiller bariyerin ciddi bozulmasına bağlı akciğer ödemi akut akciğer hasarı gelişimi için patoognomoniktir. ELISA tarafından BAL sıvısındaki albumen içeriğinin analizi, LPS instillasyonundan 24 saat ve 72 saat sonra önemli bir bariyer fonksiyonu kaybı olduğunu ortaya koymuştur.
Uygun kateter yerleşimi LPS'nin ikili aşılanması için çok önemlidir. Genellikle, öksürük veya nefes alma gibi solunum alışkanlıklarındaki değişiklikler, sıvının doğru intratrakeal aşısını gösterir. Akut akciğer hasarının indüksiyonundan sonra, ilgili araştırma sorularını yanıtlamak için FACS analizi, PCR, protein tespiti gibi sonraki adımlar yapılabilir.
