Bu çalışmada, NINR (F32NR013611) finansal destek aldı. Ayrıca, kabul ve AnalyzeSkeleton(2D/3D) ve FracLac geliştiriciler teşekkür etmek istiyoruz (Arganda Carreras vd ve Karperien vd., sırasıyla) hangi burada açıklanan analiz mümkün olmazdı olmadan.

Tüm deneyler tarafından onaylanmış ve Arizona Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanmak Komitesi ve bakım ve Laboratuvar hayvanlarının kullanımı için NIH kurallar tarafından kurulan yönergelere uygun olarak gerçekleştirilen. Bakım hayvan ağrı ve rahatsızlık en aza indirmek için çekildi. Ötanazi yöntemleri için onaylanmış bir protokol according ve servikal işten çıkarma isoflurane anestezi altında oluşur.
1. doku hazırlık
Not: microglia morfoloji Analizi hücre morfolojisi korumak için sabit, cryoprotected doku örnekleri üzerinde yürütmek. Birini hazırlamak ve doğrudan sabit doku floresans IHC için dilim için standart bir protokoldür.
<ol><li>Fare ya da sıçan beyin euthanized bir hayvandan istenen deneme sonra ve bir Standart laboratuvar protokolüne göre kaldırın. 5 mL 24 h 4 ° C'de % 4 paraformaldehyde çözüm de içeren bir 10 mL flakon beyin yerleştirin Sonra durulama ve 5-10 mL % 30 sükroz fosfat yerine çözüm (PBS, 0.01 M) için 72 h 4 ° C'de arabelleğe alınmış Bir microtome ile kesit bütün beyin doku cryostat ile kesit kadar-80 ° C'de veya 4 ° C'de saklayabilirsiniz. Not: Bu protokol henüz parafin gömülü dokudan dilimlenmiş doku kullanarak test edilmemiştir.</li>
	<li>Bölüm beyin dokusu istenen bölüm kalınlığı ve bir cryoprotection çözüm (50 mM PBS, etilen glikol, gliserol) ya bir cryostat ya da microtome ve mağaza serbest yüzer bölümlerinde-20 ° C'de kullanarak Yönlendirme Not: Bu protokol başarıyla 50 µm için 200 µm arasında değişen kalınlıkta, koronal doku bölümlerinde yapılmıştır. Doku bölümleri daha az 50 µm microglia süreçler, kalın doku bölümlerde tam yayılımı yakalamak değil daha IHC boyama doku içine antikor penetrasyon nedeniyle kusurlu olabilir. Doku ya kesitli bir koronal veya sagittal yönlendirme olabilir ve bu seçim belirlenmesi için deneysel hedef ve beyin region(s) üzerinde bağlıdır.</li>
</ol>2. immünhistokimya
Not: Floresan veya 3, 3 '-diaminobenzidine (DAB) IHC iskelet ve Fraktal analiz yöntemleri uygulanabilir. Aşağıda bir standart floresan IHC protokolüdür ve gerektiği gibi yerine olabilir. Floresans IHC DAB IHC karşılaştırıldığında hücre süreçlerin üstün görselleştirme verir.
<ol><li>Doku bölümler 4 mL Cam şişe (ilâ 15 fare beyin bölümleri/flakon) yerleştirin ve 1 mL solüsyon kadar % 10 at serum, PBS (0.01 M), %0,5 Triton, 1 h için (23 ° C) Oda sıcaklığında %0,04 NaN3 içeren ile kuluçkaya.</li>
	<li>Üç kez, oda sıcaklığında PBS (0.01 M) ile 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>1 mL içeren PBS (0.01 M), %0,5 Triton, %0,04 NaN3ve (NaN3 etkinliğini korumak için) kaplı çözeltisi içinde 72 h için oda sıcaklığında birincil antikor (Iba1, 1:1, 000) ile kuluçkaya.</li>
	<li>Üç kez, oda sıcaklığında PBS (0.01 M) ile 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>4 h 1 mL içeren PBS (0.01 M), %0,5 Triton, %0,04 NaN3 çözeltisi içinde için oda sıcaklığında kapalı ikincil antikoru (Anti-tavşan 488, 1:250) ile kuluçkaya
</li>
	<li>Üç kez, oda sıcaklığında PBS (0.01 M) ile 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>Beyin dokusu bölümler (sayı ve tercihine göre yönlendirme) subbed slaytlara monte, bir yumuşak-set Montaj araç slayta uygulamak ve coverslip doku yerleştirin. 4 ° C'de slaytları depolama Not: 1,5 cam coverslip kalınlığı confocal görüntüleme için gereklidir. Yumuşak-set bir tercih edilen montaj orta yüksek viskozite doku sıkıştırmak değil ve en iyi zaman hard-set montaj medyaya göre morfolojisi korur çünkü.</li>
</ol>3. görüntüleme
<ol><li>Iba1 pozitif hücrelerinin beyin doku kısmındaki bir 20 X objektif veya daha büyük kullanarak bir z-yığın alma yeteneği vardır alan parlak veya confocal mikroskop kullanarak görüntü. Not: düşsel parametreleri ve yazılım kurulumu tüm photomicrograph toplama bir deneyde sabit olması gerekir. Mükemmel süreç detay bir 40 X veya 63 X objektif kullanarak elde edilir. Burada tüm bir photomicrograph veya bir çok hücreli yatırım getirisi daha büyük bir photomicrograph içinde açıklanan iskelet çözümleme protokolü uygulamak mümkündür.<ol>
<li>8-bit görüntüleri elde etmek belgili tanımlık mikroskop bilgisayar yazılımı için özel uygun yazılım ayarları kullanarak. Not: Dosyaları dönüştürme 8-bit sonrası satın alma için veri toplama bozabilir.</li>
		<li>En az bir 30 µm z-deste belgili tanımlık mikroskop bilgisayar yazılımı için özel uygun yazılım ayarları kullanarak görüntüleri 2 µm aralığını en fazla ile kazanmak. Not: Mikroskop ve yazılım bir X, Y ve Z eksenindeki resim alma için izin vermelisiniz. Bir z-yığın artırılabilir ve aralığı ek microglia ayrıntı sağlamak için azalabilir. Buna karşılık, saat görüntüleme artacaktır. Nyquist örnekleme floresan mikroskopi için mümkün olduğunda kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>TIF dosyaları olarak ya da belgili tanımlık mikroskop bilgisayar yazılımı tarafından gerekli tüm dosyaları kaydedin.</li>
	<li>Açık belgili tanımlık TIF eğe içinde ImageJ ve görüntü tıklayarak kanalları ayırmak için araç çubuğunu kullanın | Renk | Split kanallarıve görüntü tıklayarak görüntüleri yığını | Yığınlar | Proje x | Maksimum yoğunluk projeksiyon uygun olduğunda. .Tif dosyaları olarak kaydedin.</li>
</ol>4. iskelet Analizi
<ol><li>Download FIJI ya da ImageJ gelen < https://imagej.net/Fiji/Downloads>. Bireysel eklentileri AnalyzeSkeleton(2D/3D) üzerinden download < http://imagej.net/AnalyzeSkeleton>15 ve FracLac üzerinden download < https://imagej.nih.gov/ij/plugins/fraclac/fraclac.html>16. Not: bir photomicrograph ikili bir skeletonized görüntüye dönüştürme tüm süreç az 1 dk sürer.</li>
	<li>Floresan photomicrograph kullanıyorsanız, görüntü 8 bit olduğundan emin olun ve en iyi tüm olumlu boyama görselleştirmek için gri tonlamaya dönüştürmek. Araç çubuğunu kullanın ve görüntü tıklayın | Arama tabloları | Greys. Kullanarak bir DAB alan parlak fotoğraf, ilk kullanımda FFT bant eklenti filtre ( süreci tıklatarak araç çubuğunu kullanarak | FFT | Bant Filtre) ve daha sonra gri tonlamaya dönüştürme. Not: Bu protokol, ImageJ varsayılan ayarları bir FFT bant filtre için yeterli (filtre) 40, hiçbir şerit bastırma 3 piksele kadar amaçlıdır. Bir FFT bant filtre uygulayarak görüntünün genel olarak daha büyük yönlerini koruyarak gürültü (küçük Özellikler) kaldırır. Bu özellikle parlak alan görüntülerde kullanışlıdır nerede böler ve çatlaklar doku arka plan olarak görünür ve böylece iskelet analiz18zorlaştırıyor.</li>
	<li>Parlaklığı ayarlayın ve görüntü çok karanlık ise kontrast ve microglia işlem görüntülenir. Araç çubuğunu kullanın ve görüntü tıklayın | Ayarlamak | Parlaklık/kontrast. Minimum veya maksimum kaydırıcıları, histogram ama hayır daha fazla kenarlarına kadar gerektiği gibi ayarlayın. Not: ImageJ, parlaklık ve kontrast piksel değerlerini değiştirilmemiştir böylece resmin arama tablosu (LUT), güncelleştirme tarafından değiştirilir. Max ve min kaydırıcıları görüntü aralığı piksel değerleri 255 beyaz görünen yukarıda ve aşağıda görünen siyah180 piksel değerleri ile alt ve üst sınırları kontrol. En az kaydırıcıyı microglia lekeli DAB photomicrographs için kullanılacak ise floresan photomicrographs durumunda, maksimum kaydırıcıyı, kullanılmalıdır.</li>
	<li>Daha da işlemi tıklatarak araç çubuğunu kullanarak karşıtlığı artırmak için Keskinliği Azaltma Maskesi filtresi çalıştırmak | Filtreler | Keskinliği Azaltma Maskesi. Bu iletişim kuralı, ImageJ'ın varsayılan ayarları amacıyla (3 piksel yarıçapı ve maske 0,6 ağırlığını) kullanılır. Not: Keskinliği Azaltma Maskesi keskinleştirir ve orijinal görüntüden (Keskinliği Azaltma Maskesi) bulanık bir sürümünü çıkarılarak ve sonuçta elde edilen görüntü orijinal görüntünün yüksek karşıtlık sürümü birleştirme tarafından görüntünün kenar özelliklerini geliştirir. Bu nedenle, Keskinliği Azaltma Maskesi filtresi ayrıntılarını oluşturmaz ancak yerine bir resimde varolan ayrıntı açıklar. (Ve böylece ne kadar bulanıklık kaldırılacak) ayarlarında değişiklikler nasıl bulanık Keskinliği Azaltma Maskesi RADIUS olacağını ve maske ağırlık ayarlama değişiklikleri Keskinliği Azaltma Maskesi ile birleştirilmiş karşıtlık derecesini (ve böylece son resmin zıtlığını ayarlar).</li>
	<li>Keskinliği Azaltma Maskesi tarafından oluşturulan salt-and-pepper gürültü çıkarmak için bir despeckle adımı gerçekleştirin. Araç çubuğunu kullanın ve işlemi tıklatın | Gürültü | Gürültüyü Temizleme. Not: Lekeleri temizlemek her piksel, 3 × 3 mahallede medyan değeri değiştirerek salt-and-pepper gürültü kaldırır. Kenarları18netliği etkilemeden outliers yoğunluğu içinde medyan piksel tarafından değiştirilir etkisidir.</li>
	<li>Görüntü tıklayarak araç çubuğunu kullanarak ikili görüntü dönüştürmek | Ayarlamak | Eşik. Not: Eşik özellikleri arka plan karşı ilgi içine gri tonlamalı görüntüler stratifies ve görüntü ikili18dönüştürür.</li>
	<li>Despeckle, yakın-, uygulamak ve aykırı işlevler kaldırmak: kadar elde edilen ikili görüntüde tek piksel arka plan gürültü ve süreçler arasındaki boşluklar olabilir.<ol>
<li>İşlemi tıklatarak araç çubuğunu kullanarak despeckle işlevi uygular | Gürültü | Gürültüyü Temizleme. Not: Uygulama lekeleri temizlemek için ikili resim siler kalan tek piksellik gürültü yapmayın.</li>
		<li>İşlemi tıklatarak araç çubuğunu kullanarak yakın işlevi uygular | İkili | Yakın. Not: Bu eklenti ilâ 2 piksel ayrılırlarsa iki karanlık piksel bağlanır.</li>
		<li>İşlemi tıklatarak araç çubuğunu kullanarak kaldır outliers işlevi uygular | Gürültü | Outliers kaldırmak. Not: Bu protokol amacıyla, 2 piksel yarıçapı ve bir eşik 50 ile parlak outliers hedeflenir. Bu eklenti tarafından belirli bir değeri (eşik)18değerinden fazla sapma çevresindeki medyan piksel bir parlak ya da ölü aykırı piksel yerini alır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gelecekteki kullanımı ve/veya fractal analiz için ayrı bir dosya olarak kaydetmek ve işlemi tıklatarak araç çubuğunu kullanarak görüntü skeletonize | İkili | Skeletonize.</li>
	<li>Skeletonized görüntüyü seçin ve çalışma plugin eklentileri tıklatarak araç çubuğunu kullanarak AnalyzeSkeleton(2D/3D) | İskelet | İskelet analizve şube bilgileri kutusunun işaretlenmesi. Not: Görüntü işleme en iyi duruma getirme ile ekleme ya da silme yukarıda önerilen adımlardan gerektirecektir olasıdır. Bu süreçte skeletonized görüntüleri bir bindirme iskelet ve orijinal görüntü oluşturarak doğruluk için değerlendirilir. Somas merkezden yayılan işlemleri ile tek kökenli puan olmalıdır; dairesel somas verileri yıkmak ve protokol ayarı kaçınılmalıdır. Tek bir noktadan dairesel somas karşı örneği Şekil 1' de gösterilmiştir.</li>
</ol>Temsilcisi olmayan iskeletler kaynaklanan ve çözümler önerdi ortak sorunları:
<ul><li>Görüntü çok karanlık: gri tonlama için dönüştürmek, Parlaklık/kontrast kaydırıcıları ayarlayın ve/veya Keskinliği Azaltma Maskesi uygulama</li>
	<li>Çok fazla arka plan: Parlaklık/kontrast kaydırıcıları ayarlayın, Despeckle uygulamak ve/veya kaldırmak aykırı</li>
	<li>(Özellikle floresans görüntüler için) skeletonized görüntüdeki dairesel somas: FFT bant filtre ve/veya Keskinliği Azaltma Maskesi uygulamak</li>
	<li>Çatlaklar (özellikle alan parlak görüntüler için) bir doku: FFT bant filtre uygulamak ve/veya gürültüyü Temizleme</li>
</ul><ol start="10"><li>Tüm verileri sonuçlarından kopyalayın ve şube bilgi veriyor ve verileri bir Excel elektronik tabloya yapıştırabilirsiniz.</li>
	<li>Excel'de, IHC ve görüntü alma neden iskelet parçaları kaldırmak için veri kırpın.<ol>
<li>İskelet analiz ham veri çıktısı deney kitabıyla çoğaltmak ve dosya adına TRIM ekleyin. Tüm sonraki veri düzeltme gelecekteki kullanım ve referans için ham verileri korumak için çoğaltılmış çalışma kitabındaki gerçekleşmelidir.</li>
		<li>Hangi parçaları uzunluğu ImageJ içinde skeletonized görüntüyü açıp, çizgi aracını seçerek veri kümesinden kırpılacağı belirlemek. Çeşitli parçaları ortalama uzunluk, not alma, ölçmek ve kesme biçimi değerini üzerinde karar verin. Not: burada sunulan veri, istenmeyen parçaları için kesme uzunluğu 0.5 amaçlıdır. Bu değer bir veri kümesi tutarlı olmalıdır.</li>
		<li>Özel sıralama Excel elektronik tablo tıklayarak Sırala ve Filtre Uygula tarafından | Özel sıralama. "Son nokta voxels" büyükten küçüğe ve yeni bir düzeye, tarafından "Mx şube pt" Büyükten Küçüğe Sırala.</li>
		<li>Kesme biçimi değerini daha az en büyük şube uzunluğunda 2 bitiş noktaları içeren her satır kaldırmak (i.e., 0.5). Para bitiş noktaları toplam sayısını hesaplamak için bitiş noktası sütundaki verileri görüntüden toplamış.</li>
		<li>Şube bilgileri veri için tekrar ediyorum: 'şube boyla' en küçük gelen büyüğe sıralamak. Kaydırma üzerinden veri ve bir dal kesme biçimi değerini daha az uzunlukta her satırını kaldırmak(i.e., 0.5). Tüm dalları görüntüden toplanan toplam uzunluğunu hesaplamak için şube uzunluk sütunundaki değerlerin toplamı.</li>
		<li>Tüm veriler kesilmiş ve özetlenebilir kadar adımları 4.11.3-4.11.5 her görüntü/sayfası için yineleyin.</li>
		<li>(Uç noktalarının sayısını toplanır ve branş uzunluğu toplamı) her görüntü verilerinden microglia somas karşılık gelen görüntü sayısı bölün. Son verileri (bitiş noktaları/hücre & dal uzunluğu/hücre) istatistiksel yazılım girin. Not: Toplam şube uzunluğu/hücre veri uzunluğu, pixel dönüştürme mikron gerektirebilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. fractal analiz
Not: FracLac bir dizi değil kaplıdır farklı şekil analizleri bu protokol için çalıştırmak yapabiliyor. FracLac daha ayrıntılı bir açıklama çeşitli işlevler için FracLac el kitabı, bkz: < https://imagej.nih.gov/ij/plugins/fraclac/FLHelp/Introduction.htm> ve ilişkili başvurular 2,16,19. Fraktal Çözümleme Protokolü 4.1-4.7 yukarıda açıklanan adımları kullanır.
<ol><li>Tüm fractal analiz için kullanılan YG boyutunu belirler. ROI çizmek için Dikdörtgen aracını kullanın. Kutuyu hücrenin tamamını yakalamak için yeterli büyüklükte ve veri kümesi tutarlı kalır emin olun. Not: dikdörtgen seçimi yerine serbest seçim tüm ROIs aynı boy dikdörtgen, ve bu nedenle, hücreleri aynı ölçeğe sahip sağlamak için kullanın. Serbest seçim ImageJ çünkü otomatik ölçek farklı boy dikdörtgen windows farklı ölçeklerde hücrelerle sonuçlanan sığacak şekilde kare bir yatırım getirisi kullandıysanız bu durumda olmazdı. Fraktal şekiller ölçekli bağımsız olmakla birlikte, FracLac ImageJ için kullanarak fractal analiz süreci ölçek16tarihinde bağlıdır. Böylece, veri toplama boyunca sürekli olarak ölçekli bir yatırım getirisi için gerek yoktur.</li>
	<li>Rastgele microglia fractal analiz için her photomicrograph ve karşılık gelen ikili resim seçin. ROI Yöneticisi penceresinde ROI hücrenin konumunu kilitlemek için güncelleştirme seçin. CTRL + üst karakter + D alanı içinde yeni bir pencere olarak yatırım getirisi çoğaltmak için kullanın ve kırpılmış hücre kaydedin. (İskelet analizinden) karşılık gelen ikili görüntü üzerinde alan ROI Yöneticisi'ni kullanarak aynı hücre ile yinelenen. Hücreleri yeterli sayıda fractal analiz için rasgele seçilmiş ve tüm dosyalarını kaydetmek kadar yineleyin. Not: Bir rasgele sayı üreteci ve numaralandırılmış Kılavuzu rastgele hücreleri seçmek için kullanılabilir.</li>
	<li>İkili resim ile bireysel hücreyi aç. Boya Fırçası aracını çift tıklatın, siyah rengi ayarlamak ve fırça genişliği gerektiği gibi ayarlayın. Eşleşen photomicrograph referans olarak kullanarak, bitişik hücre süreçleri kaldırmak, parçalanmış işlemleri bağlamak ve hücre ilgi yalıtmak için boya fırçası kullanın. İkili hücre izole edildikten sonra ikili dosyayı kaydedin. Not: 'alt' basılı (siyah) ön plan renginden boya fırçası arka plan rengine (beyaz) geçiş yapar.</li>
	<li>Anahat araç yolu ile işlemi kullanarak ikili hücre dönüştürmek | İkili | Anahat. Not: FracLac görüntü j-ebilmek var olmak kullanılmış her iki katı şekillerdeki veya şekil özetliyor, ancak, Şu anki şekli kullanmak için16özetliyor kuralıdır.</li>
	<li>Araç çubuğunda, eklentileri tıklatarak araç çubuğunu kullanarak FracLac açın | Fractal analiz | FracLac ve BC (sayma kutusu)seçin. Kılavuz tasarım ayarlarında, Num G 4 olarak ayarlayın. Grafik seçenekleri'nin altında analiz dışbükey hull ve hücre sınırlayıcı daire için ölçümleri kutuyu işaretleyin. Bittiğinde, Tamam' ı seçin. Not: Num G sayısı kutusuna tarama sırasında kullanılan ızgara yönelimleri sayma ve Num G için önerilen Aralık 4-12. Num G ayarı ve önerilen Aralık iyice FracLac el ile16' kevgirden geçirilir. NUM G artan hesaplama kez önemli ölçüde yavaşlatabilir. FracLac ayarlarını yalnızca bir kez oturum başına ayarlamak gerekir. Ayarları girdikten sonra tarama düğmesi kullanılabilir hale gelir.</li>
	<li>Seçili resmin üzerine kutusunu sayma tarama çalıştırmayı tarama düğmesini seçin. Not: Tarama veri çıkışları olan üç windows oluşturur: gövde ve daire sonuçları, kutu sayısı Özeti dosya ve tarama türleri. Tarama türleri penceresinde kullanılan ayarları günlüğünü içerir, yanı sıra standart sapmalar kesin ölçer. Bu iletişim kuralının amacı gereği, tarama türleri penceresindeki kullanılmaz ve kapalı veya olabilir için gelecek bahsetme kurtarmak.</li>
	<li>Gövde ve Daire sonuçları penceresindeki istenen tüm veri kopyalamak (i.e., yoğunluk, yayılma oranı ve döngü) sonuçları. Kutu sayısı Özeti penceresindeki istenen verileri kopyalamak (i.e., Fraktal boyut ve lacunarity) sonuçları. Kopyalanan verileri bir Excel dosyası veya istatistiksel yazılım aktarın. Not: FracLac tam bir listesi çıktı veri sağlanan ve iyice FracLac ImageJ el ile16için açıklanmıştır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).</li><li>Karperien, A., Ahammer, H., Jelinek, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitating+the+subtleties+of+microglial+morphology+with+fractal+analysis.">Quantitating the subtleties of microglial morphology with fractal analysis.</a> Front Cell Neurosci. 7 (3), eCollection (2013).</li><li>Taylor, S. E., Morganti-Kossmann, C., Lifshitz, J., Ziebell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod+microglia:+a+morphological+definition.">Rod microglia: a morphological definition.</a> PLoS One. 9 (5), e97096 (2014).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo.">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Abiega, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Hyperactivity+Disturbs+ATP+Microgradients,+Impairs+Microglial+Motility,+and+Reduces+Phagocytic+Receptor+Expression+Triggering+Apoptosis/Microglial+Phagocytosis+Uncoupling.">Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling.</a> PLoS Biol. 14 (6), e1002466 (2016).</li><li>Wyatt-Johnson, S. K., Herr, S. A., Brewster, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Status+Epilepticus+Triggers+Time-Dependent+Alterations+in+Microglia+Abundance+and+Morphological+Phenotypes+in+the+Hippocampus.">Status Epilepticus Triggers Time-Dependent Alterations in Microglia Abundance and Morphological Phenotypes in the Hippocampus.</a> Front Neurol. 8 (700), eCollection (2017).</li><li>Morrison, H., Young, K., Qureshi, M., Rowe, R. K., Lifshitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microglia+analyses+reveal+diverse+morphologic+responses+in+the+rat+cortex+after+diffuse+brain+injury.">Quantitative microglia analyses reveal diverse morphologic responses in the rat cortex after diffuse brain injury.</a> Sci Rep. 7 (1), 13211 (2017).</li><li>Morrison, H. W., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+spatiotemporal+analysis+of+microglia+morphology+during+ischemic+stroke+and+reperfusion.">A quantitative spatiotemporal analysis of microglia morphology during ischemic stroke and reperfusion.</a> J Neuroinflammation. 10 (4), (2013).</li><li>Gyoneva, S., Traynelis, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norepinephrine+modulates+the+motility+of+resting+and+activated+microglia+via+different+adrenergic+receptors.">Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors.</a> J Biol Chem. 288 (21), 15291-15302 (2013).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+Enrichment+Potently+Prevents+Microglia-Mediated+Neuroinflammation+by+Human+Amyloid+beta-Protein+Oligomers.">Environmental Enrichment Potently Prevents Microglia-Mediated Neuroinflammation by Human Amyloid beta-Protein Oligomers.</a> J Neurosci. 36 (35), 9041-9056 (2016).</li><li>Rodriguez, J. J., Noristani, H. N., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+response+to+Alzheimer's+disease+is+differentially+modulated+by+voluntary+wheel+running+and+enriched+environments.">Microglial response to Alzheimer's disease is differentially modulated by voluntary wheel running and enriched environments.</a> Brain Struct Funct. 220 (2), 941-953 (2015).</li><li>Soltys, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+morphological+study+of+microglial+cells+in+the+ischemic+rat+brain+using+principal+component+analysis.">Quantitative morphological study of microglial cells in the ischemic rat brain using principal component analysis.</a> J Neurosci Methods. 146 (1), 50-60 (2005).</li><li>Orlowski, D., Soltys, Z., Janeczko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+development+of+microglia+in+the+postnatal+rat+brain.+A+quantitative+study.">Morphological development of microglia in the postnatal rat brain. A quantitative study.</a> Int J Dev Neurosci. 21 (8), 445-450 (2003).</li><li>Morrison, H. W., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+differences+in+astrocyte+and+microglia+responses+immediately+following+middle+cerebral+artery+occlusion+in+adult+mice.">Sex differences in astrocyte and microglia responses immediately following middle cerebral artery occlusion in adult mice.</a> Neuroscience. 339, (2016).</li><li>Arganda-Carreras, I., Fernandez-Gonzalez, R., Munoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+reconstruction+of+histological+sections:+Application+to+mammary+gland+tissue.">3D reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue.</a> Microsc Res Tech. 73 (11), 1019-1029 (2010).</li><li>Davis, B. M., Salinas-Navarro, M., Cordeiro, M. F., Moons, L., De Groef, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+microglia+activation:+a+spatial+statistics+approach+to+maximize+information+extraction.">Characterizing microglia activation: a spatial statistics approach to maximize information extraction.</a> Sci Rep. 7 (1), 1576 (2017).</li><li>. ImageJ User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/</a> (2014)</li><li>Karperien, A. L., Jelinek, H. F., , <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractal,+Multifractal,+and+Lacunarity+Analysis+of+Microglia+in+Tissue+Engineering.">Fractal, Multifractal, and Lacunarity Analysis of Microglia in Tissue Engineering.</a> Front Bioeng Biotechnol. 3 (51), eCollection (2015).</li><li>Martyanova, E. K., Tishkina, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+quantitative+analysis+of+microglial+morphology.">3D quantitative analysis of microglial morphology.</a> available as conference preceedings SkoltechOn. , (2015).</li><li>Fernandez-Arjona, M. D. M., Grondona, J. M., Granados-Duran, P., Fernandez-Llebrez, P., Lopez-Avalos, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Morphological+Categorization+in+a+Rat+Model+of+Neuroinflammation+by+Hierarchical+Cluster+and+Principal+Components+Analysis.">Microglia Morphological Categorization in a Rat Model of Neuroinflammation by Hierarchical Cluster and Principal Components Analysis.</a> Front Cell Neurosci. 11 (235), eCollection (2017).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Microglia hücreleri ince fizyolojisi ve patoloji mikro-etki alanları içinde ayarlanan ve türleri morfoloji2 çeşitli bir yelpazede ince7,14 ve brüt yaralanma8. ImageJ iletişim kurallarının kullanımını microglia morfoloji miktar platformu olarak tüm laboratuvarlar için erişilebilir yapar ve eklentileri bir açık kaynak görüntü işleme yazılımı vardır. Açıklanan protokol görüntü işleme ve analiz bu yazılımı kullanarak üzerinde odaklanmış iken, veri toplama, geçerlilik ve güvenilirlik tutarlılığını mükemmel IHC ve mikroskobu ile başlar. Bu iletişim kuralı ikili, iskelet ve tüm photomicrographs ve tek hücre anahat gösterimleri geliştirmek için kullanılır ama zavallı IHC boyama yer alamaz ve düşük kontrast içinde sonuç mikroskobu bulanık veya görüntü bozuk. Bir ek dikkate, değiştirilemez bir şekilde portaldan microglia morfoloji değiştiren beyin dokusu Muhafazası kesit, öncesinde sırasında değil düzleştirmek için özen göstermelidir. Son olarak, her deneme içinde aynı ölçek gibi aynı mikroskop kullanarak microglia yansıması gerekir. Araçları, amaçları ve yazılım benzer hedefleri rağmen farklı büyüklükteki photomicrographs neden ve detay yanı sıra her çerçeve içinde hücre sayısını değiştirmek mikroskoplar arasında değişir. Örneğin, iki kez sayı hücre ve edinimi Zeiss 880 kullanma daha ayrıntı daha az 40 X objektif bir Leica SPII kullanarak resim alma sonuçlanır. Bu veri örnekleme bir sorun olduğunda bu özellikle tek bir hücre yerine tüm çerçeve toplanan hücre yaklaşım veri için önemlidir.
Genel olarak, hangi tüm photomicrograph iskelet analiz tek hücre fractal analiz iki nedenden dolayı önce gelir. Belirleyici hücre yaklaşım bir photomicrograph tüm hücreleri tek hücre fractal analiz için karşılaştırıldığında ve saat bir faktör ise bir tarama aracı olarak düşünülebilir hızlı. Buna ek olarak, iskelet çözümleme sırasında elde edilen ikili görüntüleri fractal analiz için kullanılır. Yansıma sonra iskelet Çözümleme sonuçlarını etkilemek ve Kullanıcı-etkisi tanıtmak kritik adımlar vardır. Kullanıcılar arasında en değişken Protokolü adımlar adım 4.2 (artan görüntü parlaklığını) ve 4.5 (eşik belirleme) adım. Mümkün olduğu durumlarda, (max veya min kaydırıcısını 0-255 arasında) artırmak için en uygun bir numarası belirler ve tüm görüntüler ve kullanıcılar için sabit tutulan. Görüntü değişkenlik büyük olduğunda, Kullanıcı yerine görüntüler arasında değişir bir parlaklık seçebilirsiniz. Alternatif olarak, görüntüleri parlak ve kontrast yüksek ise, parlaklık artan atlanabilir ve eşik standardize özel eşik filtre kullanarak (Örn., Huang) daha değişken varsayılan yerine. Bir kez en iyi duruma getirilmiş, parametreler için ek Kullanıcı-etkisi en aza indirmek için yapıştırılır.
Bir örnek Kullanıcı değişkenlik Şekil 5' te gösterilmiştir. Veri değerleri Kullanıcı 1 Kullanıcı 2 karşı artmış ve eğer Kullanıcı 1 ve Kullanıcı 2 veri toplama için katkıda bu nedenle değişkenlik yükseltilmiştir. Kullanıcı 1 ve Kullanıcı 2 ikili ve skeletonized görüntüleri farklılıkları örneği olan vurgulanır renkli daireler (Şekil 5). Bu durumda, hem kullanıcılar hem de microglia sınırlı uzmanlık ile kısaca eğitimli lisans öğrencileri vardı. Normal gözetim ve bir microglia ile birlikte artan Protokolü eğitim2 uzman tarafından danışmanlık arası Kullanıcı değişkenliği azaltır. İkili hücreleri el ile ve tek tek izole microglia şekiller belirlemek için yalnızca eşik güvenmek yerine bir photomicrograph olduğundan burada değerlendirildi değil, fractal analiz arası Kullanıcı değişkenlik tabi daha az olsa da. Ancak, tüm yöntemler bazı değişkenlik kullanıcılar arasında bulunur. Bu nedenle, tek bir Kullanıcı (ideal olarak, microglia hücrelerde bazı uzmanlık eğitim) tüm veri kümesinin veri toplama tamamlamak.
Ek değişiklikler bu iletişim kuralı için kolayca yapılabilir ve görüntü kalitesi ve gürültüyü azaltmak ve işlem bağlantısını sağlamak için harcanan çabaları bağlı olacaktır. Örneğin, kontrast yeterli ise, o zaman Keskinliği Azaltma Maskesi gerekli değildir ve atlanabilir. En iyi duruma getirme ve görüntüler, deneysel çalışmaları ve bütün bir set veri toplama önce denetimleri, belirli bir kümesi için protokol sonlandırmak akıllıca olur. Son olarak, ek eklentileri diğerleri yerine açıklamak veya bu protokol için açıklanmayan görüntüleri netleştirmek için kullanılabilir dilate veya keskinleştirme gibi.
Bu iletişim kuralı avantajları onun evrensel kullanılabilirlik ve uyum vardır. Buna ek olarak, AnalyzeSkeleton kullanarak hücre yaklaşım değerlendirirken hızlı ve tüm photomicrograph için geçerli. Çok hücreli analiz yaklaşımı tek hücre yerine bir bütün bölge odaklanmak şeydir. Bu nedenle, hızlı bir şekilde, resmin içinde tüm microglia (bitiş noktaları ve işlem uzunluğu) açısından yaklaşım ortalama değerlendirmek mümkündür. İskelet çözümlemesi sağlayan birden çok hücre Analizi: veri örnekleme tarafından fractal analiz tek photomicrographs hücrelerden yalıtmak için gerekli zaman yatırım nedeniyle eşleştirilemeyen hücre sayıları açısından. Nerede bu en uygun olabilir bir örnek microglia türleri proximities fokal bir sakatlık içinde morfoloji eleme olurdu. IHC photomicrographs iskelet modeller oluşturmak için tüm alan görüntü işleme için daha zaman alıcı tek hücre yaklaşım karşılaştırıldığında kusurlu bir kısıtlamadır. Buna ek olarak, bir bölge analiz nerede microglia türleri morfoloji aynı alanda bulunan büyük ölçüde farklı koşullara uygun değil. Son olarak, bu analiz yöntemi hücre sayısı, deneysel koşullar arasında farklı olabilir bir parametre bağlıdır.
Fractal analiz tek bir hücre üzerinde yapılır ve bu nedenle iskelet çözümlemesinden ortalama hücre yaklaşım veri çıkışı tamamlar. Her ne kadar çok daha zaman alıcı, bu yatırım çok çeşitli xarakteristikaları veri verir. Örneğin, yoğunluk, yayılma oranı, hücre ve döngü veri boyutu, uzama ve hücre anahattının şeklini sırasıyla açıklanmaktadır. Fraktal boyut ve lacunarity hücre karmaşıklığı ve şekil heterojenite, anılan sıraya göre özetler. Her parametre nasıl hesaplanır ve nasıl veri yorumlanır daha ayrıntılı bir özetini içinde etkileşimli el ile16 sağlanır ve bu ayrıntı özel araştırma soru ile ilgili olarak düşünülmelidir. Hassas araçları fizyolojik ve patolojik koşullarda oluşabilir 2D microglia türleri morfoloji küçük değişiklikleri ölçmek için açıklanan protokol sonuçlarında. Sağlamlık, gönderilir ve form faktörü16,20 gibi ek xarakteristikaları analiz 3D şekiller oluşturmak mümkün olabilir.
İletişim kuralı geliştirme ve uyum sürekli ve Kullanıcı tarafından. Bu floresan8 ' den DAB/parlak-alan resim7 ama henüz katıştırılmış doku alkol için kapsayacak biçimde genişletilmiştir. Buna ek olarak, bu ek analiz için Imaris gibi özel mülk yazılım ile birlikte kullanılabilir. Bu iletişim kuralı Fizyoloji çeşitli için uygulanabilir ve microglia için sınırlı değildir ancak herhangi bir hücre veya doku belirli desen veya IHC yöntemlerle tespit şekilleri ile uygulanabilir. Son olarak, yeterli örnek boyutu ile birden fazla varyasyon veya küme analizi microglia göre morfolojisi12,21tabakalaşmak uygulanabilir; microglia morfoloji microglia işlevleri ve yanıt çevreleri için çok önemli bir göstergesi olarak bu anlamlı bilgi yok. Mikroglial morfolojik çeşitlilik için takdir genişleyen ve tam olarak sağlık ve hastalık sırasında nöron-glia-vasküler etkileşimleri anlamak önemlidir. Bu alanda büyüme ölçmek ve microglia morfoloji birden çok sürekli değişken kullanarak özetlemek için iyi gelişmiş, kullanımı kolay ve tekrarlanabilir protokolleri tarafından geliştirilmiştir.

Microglia beyin fizyolojisi1 olanakları bir süreklilik boyunca hiper yaklaşım ve son derece karmaşık türleri morfoloji arasında değişen de-ramified ve protozlar türleri morfoloji2 için değişiklikler için bir acil ve çeşitli morfolojik tepki var . Microglia3polarize ve çubuk şeklinde de olabilir. Microglia hücre yaklaşım yaygın olarak birden çok işlem sahip karmaşık bir şekil tanımlanır ve genellikle bitiş noktası başına hücre sayısı ve hücre süreçleri uzunluğu bildirilir. Microglia ince ayarlı beri nöronal ve gliyal işlevi ile sürekli hücre-hücre çapraz-hadis ve in vivo hareketliliği4,5, microglia türleri morfoloji farklı hücre işlevler ve işlev bozuklukları göstergeleri olarak hizmet verebilir beyinde. Yeterince tarif bu morfolojik değişiklikler çeşitliliği ve (epilepsi5,6 gibi ince fizyolojik rezonans meydana ramified hücreleri arasındaki farkları ayırt etmek için nicel bir yaklaşım gereklidir ve beyin sarsıntısı7) ek olarak (örneğin, kontur8) Brüt yaralanma. Morfoloji miktar7,8,9,10,11,12,13,14 kullanımının artmasıyla microglia türleri morfoloji tam çeşitliliği sağlık ve hastalık sırasında ortaya çıkaracaktır. ImageJ eklentileri microglia floresan veya floresan photomicrographs üzerinden microglia morfoloji özetlemek gerekli kademeli kullanımı sabit kemirgen dokusunda immünhistokimya (IHC) sonra elde mevcut çalışma ayrıntıları.
Burada açıklanan analiz teknikleri için 2010 yılında büyük meme yapıları, ölçmek için geliştirilmiş ImageJ eklentileri AnalyzeSkeleton (2D/3D)15ve ImageJ ve Fraktal analizi için entegre 2014 yılında geliştirilen FracLac16, Merkez bireysel microglia şekiller ölçmek. Bu eklentileri microglia yaklaşım tüm photomicrographs içinde hızlı bir analiz veya birden çok microglia bir photomicrograph içinde tanımlanmış bir yatırım getirisi sağlar. Bu analiz tek başına veya tamamlayıcı fraktal analizi ile kullanılabilir. Tek hücreli fractal analiz (FracLac) zaman bir yatırım gerektirir ama microglia karmaşıklığı, şekli ve boyutu ile ilgili birden çok morfoloji çıkış sağlar. Her iki araç kullanımı gereksiz değil, hücre yaklaşım hücre karmaşıklığı için tamamlayıcı ve birden çok parametre birleşimini farklı microglia türleri veri kümeleri12,17içinde morfoloji arasında ayırt etmek için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>primary antibody anti-IBA1</td><td>Wako&amp;nbsp;</td><td>019-19741</td><td>rabbit host</td></tr><tr><td>Vectashield soft mount</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Secondary antibody</td><td>Jackson ImmunorResearch</td><td>711-545-152</td><td>donkey host</td></tr><tr><td>4 mL glass vial</td><td>Wheaton</td><td>UX-08923-11</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide (NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>S-8032</td><td></td></tr><tr><td>glass coverslip</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>12-544-G</td><td></td></tr></tbody></table>

quantifying microglia morphology from photomicrographs of immunohistochemistry prepared tissue using imagej

Microglia beyin homeostazı katılmak ve sürekli çevreleri disfonksiyon, yaralanma ve hastalık için anket beyin fagositler vardır. İlk müdahale olarak microglia nöron ve glia fonksiyon bozukluğu azaltmak için önemli işlevleri vardır ve bu süreç içinde onlar çok çeşitli morfolojik değişiklikler tabi. Microglia türleri morfoloji açıklayıcı kategorize edilebilir veya alternatif olarak, hücre yaklaşım, karmaşıklık ve şekil gibi parametreleri için sürekli bir değişken olarak sayılabilir. Tek Kişilik hücrelere microglia miktarının yöntemleri uygulanırken, tüm bir photomicrograph içinde birden çok microglia birkaç teknikleri uygulamak. Bu yöntemin amacı çoklu ölçmek etmektir ve tek hücreler hazır ImageJ protokolleri kullanarak. Bu iletişim kuralı adımları bir özetidir ve floresan ve alan parlak photomicrographs temsilcisi ikili ve skeletonized görüntülere dönüştürmek için ve çözümlemek için önerilen ImageJ eklentileri kullanarak yazılım eklentileri AnalyzeSkeleton (2D/3D) ve FracLac Morfoloji veri toplamak için. Bu eklentiler çıkış işlemi bitiş noktaları, kavşaklar ve uzunluğu yanı sıra karmaşıklığı, hücre şekil ve boyut tanımlayıcıları açısından hücre morfolojisi özetler. Burada açıklanan iskelet Çözümleme Protokolü bir bütün photomicrograph veya bölge (ROI) ilgi içinde birden çok microglia bir bölgesel analizi için uygun ise FracLac bir tamamlayıcı tek hücre analizi sağlar. Kombine, protokol bir amaç, çeşitli microglia türleri morfoloji sağlıklı ve yaralı beyin mevcut arasında tabakalaşmak için kullanılan hassas ve kapsamlı değerlendirme aracı sağlar.

Burada açıklanan microglia morfoloji Analizi iletişim kuralları işleme floresan ve DAB photomicrographs xarakteristikaları analiz için yararlı adımları özetler. Aşağıdaki adımları görsel Şekil 2 ' de özetlenmiştir ve Şekil 3. Öyle ki birikmiş veri geçerli uygun şekilde orijinal photomicrograph modelleri bir temsilcisi ikili ve skeletonized görüntüsünü oluşturmada adımları hedefidir. İletişim kuralı uygulamadan sonra AnalyzeSkeleton eklenti sonuçları hangi etiketli bir iskelet görüntü bitiş noktaları ve şube sayısı (i.e., süreç) lengthcan elde edilen çıktı dosyalarından özetlenen. Bitiş noktaları ve işlem uzunluğu veri daha sonra microglia yaklaşım photomicrograph veya ROI ölçüde tahmin etmek için kullanılır. Şekil 4 ve iletişim kuralı uygulama olmadan toplanan elde edilen veriler (bitiş noktaları/hücre ve işlemi uzunluk/hücre) özetler. Benzer eğilimler var, rakam 4F içinde özetlenen veri daha az değişken daha fazla Şekil 4Eolan vardır. Buna ek olarak, bu veri iletişim kuralı uygulandığında gruplar arasındaki farklılıkları algılamak için artan duyarlılık göstermek. Son olarak, Uygulama Protokolü'nün arası Kullanıcı değişkenliği ile ilgili özen göstermelidir. Bu tür farklılıklar nerede aynı veri kümesi olarak yukarıda özetlenen özdeş bir protokol başvurusu iki bağımsız kullanıcılar tarafından analiz edildi Şekil 5 tarafından özetlenir.
Ek morfoloji veri iletişim kuralı uygulama sırasında oluşturulan ikili görüntülerden izole tek hücrelerden toplanır. Önce microglia Morfoloji ve FracLac eklenti Şekil 6' özetlenir kullanarak çözümlemek için protokol adımları. Biz her iki yaralı (Şekil 6A) bu analizde göstermek ve (Şekil 6B) doku yaralandı. İkili, anahatlı, dışbükey hull/daire ve kutusu sayım örnekleri iletişim kuralı uygulama Şekil 6C-F. içinde gösterilir ve her hücre ile analiz için Kapsüllenen temsilcisi görüntüleri Şekil 6Giçinde özetlenmiştir morfoloji veri farklılıkları kökenleri göstermek için bu görüntüler Yardım.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig1.jpg"> Şekil 1. Skeletonized microglia karşı (en iyi) bir tek kökenli soma ve karşılık gelen bindirme skeletonized hücre ile orijinal photomicrograph arasındaki bir dairesel soma (suboptimal) ile illüstrasyonlar. Ölçek çubuğu 10 µm. = <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig2.jpg"> Şekil 2. Protokol uygulamaya floresan photomicrographs. Ayrıntıları göstermek için illüstrasyonlar floresan photomicrograph tek bir hücre ile uygulanan iskelet Çözümleme Protokolü'nün kırpılmış. Ölçek çubuğu 10 µm. = <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig3.jpg"> Şekil 3. İletişim kuralı uygulamaya alan parlak DAB photomicrographs. Tek bir hücre ayrıntıları göstermek için kırpılmış alan parlak DAB photomicrograph uygulanan iskelet Çözümleme Protokolü'nün illüstrasyonlar. Ölçek çubuğu 10 µm. = <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig4.jpg"> Şekil 4. Veri analizi ve iletişim kuralı uygulama olmadan. (A) Floresan IHC ve kırpılmış hücre (B) sarı kutusuna karşılık gelen bir örnek photomicrograph. Örnek ikili ve skeletonized görüntüleri ile (C) ve (D) açıklandığı gibi uygulanan protokol olmadan. Microglia bitiş noktaları/hücre ve işlemi uzunluk/hücrenin özet verileri (beyaz) yaralanmamış ve (gri) (E) ile kortikal doku yaralandı ve protokol (F) uygulanır. İstatistiksel analiz kullanarak bir öğrenci t-testi ve n = 3, ** p < 0,01 gösterir. Ölçek çubuğu 10 µm. = <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig5.jpg"> Şekil 5. İletişim kuralı uygulama ile Kullanıcı farklılıkları. Kullanıcı 1 ve Kullanıcı 2 ikili ve iskelet görüntüleri orijinal bir görüntü ve protokol dönüştürme örneği. Renkli daireler eşleme ile iki resim arasındaki farklar vurgulanmıştır. Kullanıcı 1 ve Kullanıcı 2 yaralı ve yaralı beyin bölgelerinde microglia bitiş noktaları/hücre ve işlemi uzunluk/hücre veri Özet grafikleri. İstatistiksel analizi ANOVA ve örnek boyutudur n = 3; p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Ölçek çubuğu 10 µm. = <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig6.jpg"> Şekil 6. Fractal analiz ve iletişim kuralı uygulama olmadan. Microglia zarar görmemiş (A) ve karşılık gelen ikili (C) ve ile ve uygulanan protokol olmadan neden anahat (D) görüntüleri ile yaralı (B) korteks kırpılmış photomicrographs örneği. İlişkili dışbükey hull (mavi) ve karşılık gelen anahat şekilleri (E) için (pembe) Daire içine alarak şekil yoğunluğu hesaplamak, oranı ve döngü (G) için kullanılır. Sayım yöntemi kutusu (F) resimli ve Fraktal boyut (DB) ve (G) lacunarity (λ) hesaplamalar için kullanılır. Ölçek çubuğu 10 µm. = <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ at JoVE.com

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Microglia anket ve değişmiş beyin fizyolojisi kantitatif değerlendirilecek morfolojik değişiklikleri ile tepki beyin bağışıklık hücreleri vardır. Bu iletişim kuralı özetliyor bir ImageJ microglia morfoloji hücre yaklaşım, karmaşıklık ve şekli gibi ölçümleri göre sürekli veri olarak temsil etmek için analiz protokolüne dayalı.

ImageJ kullanarak doku hazırlanan immünhistokimya Photomicrographs üzerinden Microglia morfoloji miktarının

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

quantifying-microglia-morphology-from-photomicrographs

Research

JoVE Journal

Neuroscience

66.3K Görüntüleme.  University of Arizona. Microglia anket ve değişmiş beyin fizyolojisi kantitatif değerlendirilecek morfolojik değişiklikleri ile tepki beyin bağışıklık hücreleri vardır. Bu iletişim kuralı özetliyor bir ImageJ microglia morfoloji hücre yaklaşım, karmaşıklık ve şekli gibi ölçümleri göre sürekli veri olarak temsil etmek için analiz protokolüne dayalı.

Video: Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated micro-plates. Under these conditions, cells spread and divide in all directions resulting in an inherent variability in cell shape, morphology and behavior. The high cell-to-cell variance of the overall population impedes the success of HCA, especially for drug development. The ability of micropatterns to normalize the shape and internal polarity of every individual cell provides a tremendous opportunity for solving this critical bottleneck 1-2.
To facilitate access and use of the micropatterning technology, CYTOO has developed a range of ready to use micropatterns, available in coverslip and microwell formats. In this video article, we provide detailed protocols of all the procedures from cell seeding on CYTOOchip micropatterns, drug treatment, fixation and staining to automated acquisition, automated image processing and final data analysis. With this example, we illustrate how micropatterns can facilitate cell-based assays. Alterations of the cell cytoskeleton are difficult to quantify in cells cultured on homogenous substrates, but culturing cells on micropatterns results in a reproducible organization of the actin meshwork due to systematic positioning of the cell adhesion contacts in every cell. Such normalization of the intracellular architecture allows quantification of even small effects on the actin cytoskeleton as demonstrated in these set of protocols using blebbistatin, an inhibitor of the actin-myosin interaction.

Adhesive micropatterns that normalize cellular architecture can be used to increase sensitivity in the detection of drug effects, improve reproducibility and simplify automated image acquisition and analysis. Such technology will benefit drug/siRNA screening assays, performed on conventional cell culture supports and consequently suffering from excessive cell-to-cell variability.

İlaç Etkisi Micropatterned Hücreler Geliştirilmiş Görselleştirme ve Kantitatif Analiz

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

Biyomühendislik

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and subsequently digests this material, commonly through lysosomal degradation. Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) whose phagocytic function has been described in a broad range of conditions from neurodegenerative disease (e.g., beta-amyloid clearance in Alzheimer&#8217;s disease) to development of the healthy brain (e.g., synaptic pruning)1-6. The following protocol is an engulfment assay developed to visualize and quantify microglia-mediated engulfment of presynaptic inputs in the developing mouse retinogeniculate system7. While this assay was used to assess microglia function in this particular context, a similar approach may be used to assess other phagocytes throughout the brain (e.g., astrocytes) and the rest of the body (e.g., peripheral macrophages) as well as other contexts in which synaptic remodeling occurs (e.g. ,brain injury/disease).

Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) with a high capacity to phagocytose or engulf material in their extracellular environment. Here, a broadly applicable, reliable, and highly quantitative assay for visualizing and measuring microglia-mediated engulfment of synaptic components is described.

Bir yutulma Deneyi: CNS Fagositler ve nöronlar arasındaki etkileşimi değerlendirmek için bir protokol

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Nörobilim

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with distinct functions and gene expression profiles. The roles of microglial activation in health, injury and disease remain incompletely understood due to their dynamic and complex regulation in response to changes in their microenvironment. Thus, it is critical to non-invasively monitor and analyze changes in microglial activation over time in the intact organism. In vivo studies of microglial activation have been delayed by technical limitations to tracking microglial behavior without altering the CNS environment. This has been particularly challenging during chronic neurodegeneration, where long-term changes must be tracked. The retina, a CNS organ amenable to non-invasive live imaging, offers a powerful system to visualize and characterize the dynamics of microglia activation during chronic disorders.
This protocol outlines methods for long-term, in vivo imaging of retinal microglia, using confocal ophthalmoscopy (cSLO) and CX3CR1GFP/+ reporter mice, to visualize microglia with cellular resolution. Also, we describe methods to quantify monthly changes in cell activation and density in large cell subsets (200-300 cells per retina). We confirm the use of somal area as a useful metric for live tracking of microglial activation in the retina by applying automated threshold-based morphometric analysis of in vivo images. We use these live image acquisition and analyses strategies to monitor the dynamic changes in microglial activation and microgliosis during early stages of retinal neurodegeneration in a mouse model of chronic glaucoma. This approach should be useful to investigate the contributions of microglia to neuronal and axonal decline in chronic CNS disorders that affect the retina and optic nerve.

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Microglia activation and microgliosis are key responses to chronic neurodegeneration. Here, we present methods for in vivo, long-term visualization of retinal CX3CR1-GFP+ microglial cells by confocal ophthalmoscopy, and for threshold and morphometric analyses to identify and quantify their activation. We monitor microglial changes during early stages of age-related glaucoma.

Fare Glokomda Konfokal Oftalmoskopik Görüntüleme ve Hücre morfometrisi: Nörodejenerasyonda sırasında Retina Mikroglial Aktivasyonu Vivo Dynamics

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with ...

Tıp

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ), a well-established model for glutamatergic synapses, has been extensively studied for decades. Identification of mutations causing NMJ morphological defects revealed a repertoire of genes that regulate synapse development and function. Many of these were identified in large-scale studies that focused on qualitative approaches to detect morphological abnormalities of the Drosophila NMJ. A drawback of qualitative analyses is that many subtle players contributing to NMJ morphology likely remain unnoticed. Whereas quantitative analyses are required to detect the subtler morphological differences, such analyses are not yet commonly performed because they are laborious. This protocol describes in detail two image analysis algorithms "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics", available as Fiji-compatible macros, for quantitative, accurate and objective morphometric analysis of the Drosophila NMJ. This methodology is developed to analyze NMJ terminals immunolabeled with the commonly used markers Dlg-1 and Brp. Additionally, its wider application to other markers such as Hrp, Csp and Syt is presented in this protocol. The macros are able to assess nine morphological NMJ features: NMJ area, NMJ perimeter, number of boutons, NMJ length, NMJ longest branch length, number of islands, number of branches, number of branching points and number of active zones in the NMJ terminal.

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two image analysis algorithms, "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" were created, to automatically quantify nine morphological features of the Drosophila neuromuscular junction (NMJ).

Yüksek throughput ve Çok parametrik Nicelik için iki Algoritmalar<em&gt; Drosophila</em&gt; Nöromusküler Junction Morfoloji

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

Area-based Image Analysis Algorithm for Quantification of Macrophage-fibroblast Cocultures

Quantification of cells is necessary for a wide range of biological and biochemical studies. Conventional image analysis of cells typically employs either fluorescence detection approaches, such as immunofluorescent staining or transfection with fluorescent proteins or edge detection techniques, which are often error-prone due to noise and other non-idealities in the image background. 
We designed a new algorithm that could accurately count and distinguish macrophages and fibroblasts, cells of different phenotypes that often colocalize during tissue regeneration. MATLAB was used to implement the algorithm, which differentiated distinct cell types based on differences in height from the background. A primary algorithm was developed using an area-based method to account for variations in cell size/structure and high-density seeding conditions. 
Non-idealities in cell structures were accounted for with a secondary, iterative algorithm utilizing internal parameters such as cell coverage computed using experimental data for a given cell type. Finally, an analysis of coculture environments was carried out using an isolation algorithm in which various cell types were selectively excluded based on the evaluation of relative height differences within the image. This approach was found to accurately count cells within a 5% error margin for monocultured cells and within a 10% error margin for cocultured cells.

We present a method, which utilizes a generalizable area-based image analysis approach to identify cell counts. Analysis of different cell populations exploited the significant cell height and structure differences between distinct cell types within an adaptive algorithm.

Makrofaj-fibroblast Kokültürlerinin Nicelleştirilmesi için Alan Tabanlı Görüntü Analiz Algoritması

Quantification of cells is necessary for a wide range of biological and biochemical studies. Conventional image analysis of cells typically employs either ...

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network level. Astrocytes are strongly connected to each other through gap junctions and coupling through these junctions is dynamic and highly regulated. An emerging concept is that astrocytic functions are specialized and adapted to the functions of the neuronal circuit with which they are associated. Therefore, methods to measure various parameters of astrocytic networks are needed to better describe the rules governing their communication and coupling and to further understand their functions.
Here, using the image analysis software (e.g., ImageJFIJI), we describe a method to analyze confocal images of astrocytic networks revealed by dye-coupling. These methods allow for 1) an automated and unbiased detection of labeled cells, 2) calculation of the size of the network, 3) computation of the preferential orientation of dye spread within the network, and 4) repositioning of the network within the area of interest.
This analysis can be used to characterize astrocytic networks of a particular area, compare networks of different areas associated to different functions, or compare networks obtained under different conditions that have different effects on coupling. These observations may lead to important functional considerations. For instance, we analyze the astrocytic networks of a trigeminal nucleus, where we have previously shown that astrocytic coupling is essential for the ability of neurons to switch their firing patterns from tonic to rhythmic bursting1. By measuring the size, confinement, and preferential orientation of astrocytic networks in this nucleus, we can build hypotheses about functional domains that they circumscribe. Several studies suggest that several other brain areas, including the barrel cortex, lateral superior olive, olfactory glomeruli, and sensory nuclei in the thalamus and visual cortex, to name a few, may benefit from a similar analysis.

Here we present a protocol to assess the organization of astrocytic networks. The described method minimizes bias to provide descriptive measures of these networks such as cell count, size, area, and position within a nucleus. Anisotropy is assessed with a vectorial analysis.

Boyut, şekil ve yön ağlar yönetim eşleşmiş Astrocytes analiz

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia selectively), when combined with IBA1 (which provides an exceptional visualization of their morphology), allows investigation of changes in density, distribution, and morphology. Quantifying these parameters is important in providing insights into the roles exerted by microglia, the resident macrophages of the brain. Under normal physiological conditions, microglia are regularly distributed in a mosaic-like pattern and present a small soma with ramified processes. Nevertheless, as a response to environmental factors (i.e., trauma, infection, disease, or injury), microglial density, distribution, and morphology are altered in various manners, depending on the insult. Additionally, the described double-staining method allows visualization of infiltrating macrophages in the brain based on their expression of IBA1 and without colocalization with TMEM119. This approach thus allows discrimination between microglia and infiltrating macrophages, which is required to provide functional insights into their distinct involvement in brain homeostasis across various contexts of health and disease. This protocol integrates the latest findings in neuroimmunology that pertain to the identification of selective markers. It also serves as a useful tool for both experienced neuroimmunologists and researchers seeking to integrate neuroimmunology into projects.

This protocol describes a step-by-step workflow for immunofluorescent costaining of IBA1 and TMEM119, in addition to analysis of microglial density, distribution, and morphology, as well as peripheral myeloid cell infiltration in mouse brain tissue.

Fare Beyninde Mikroglial Yoğunluk, Morfoloji ve Periferik Miyeloid Hücre Infiltrasyonu Analizi için IBA1 ve TMEM119 Kullanılarak İmmünofloresanS Boyama

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple neurological diseases. Studying human microglia in health and disease represents a challenge due to the extremely limited supply of human cells. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from human individuals can be used to circumvent this barrier. Here, it is demonstrated how to differentiate human iPSCs into microglia-like cells (iMGs) for in vitro experimentation. These iMGs exhibit the expected and physiological properties of microglia, including microglia-like morphology, expression of proper markers, and active phagocytosis. Additionally, documentation for isolating and labeling synaptosome substrates derived from human iPSC-derived lower motor neurons (i3LMNs) is provided. A live-cell, longitudinal imaging assay is used to monitor engulfment of human synaptosomes labeled with a pH-sensitive dye, allowing for investigations of iMG's phagocytic capacity. The protocols described herein are broadly applicable to different fields that are investigating human microglia biology and the contribution of microglia to disease.

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

This protocol describes the differentiation process of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into microglia-like cells for in vitro experimentation. We also include a detailed procedure for generating human synaptosomes from iPSC-derived lower motor neurons that can be used as a substrate for in vitro phagocytosis assays using live-cell imaging systems.

İnsan Mikroglia Benzeri Hücreler: İnsan Sinaptozomları Kullanılarak İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden ve In Vitro Canlı Hücre Fagositoz Analizinden Farklılaşma

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...

Sinaptik Materyallerin Mikroglial Yutulması için Akış Sitometrisi Tabanlı Testler

Quantification of Microglial Engulfment of Synaptic Material Using Flow Cytometry

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this process; however, currently available methods for identifying microglial engulfment of synapses, such as immunohistochemistry (IHC) and imaging, are laborious and time-intensive. To address this challenge, herein we present in vitro and in vivo* assays that allow fast and high-throughput quantification of microglial engulfment of synapses using flow cytometry.
In the in vivo* approach, we performed intracellular vGLUT1 staining following fresh cell isolation from adult mouse brains to quantify engulfment of vGLUT1+ synapses by microglia. In the in vitro synaptosome engulfment assay, we used freshly isolated cells from the adult mouse brain to quantify the engulfment of pHrodo&#160;Red-labeled synaptosomes by microglia. These protocols together provide a time-efficient approach to quantifying microglial engulfment of synapses and represent promising alternatives to labor-intensive image analysis-based methods. By streamlining the analysis, these assays can contribute to a better understanding of the role of microglia in synaptic refinement in different disease models.

Yazar Spotlight: Psikonöroimmünolojide Teknolojik Yenilikler Yoluyla Anlayışı Geliştirme

Here we present two protocols to quantify microglial engulfment of vGLUT1-positive synapses and pHRodo&#160;Red-labeled crude synaptosomes using flow cytometry.

Akış Sitometrisi Kullanılarak Sinaptik Materyalin Mikroglial Yutulmasının Miktar Tayini

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this ...

ImageJ kullanarak doku hazırlanan immünhistokimya Photomicrographs üzerinden Microglia morfoloji miktarının

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

İlaç Etkisi Micropatterned Hücreler Geliştirilmiş Görselleştirme ve Kantitatif Analiz

Bir yutulma Deneyi: CNS Fagositler ve nöronlar arasındaki etkileşimi değerlendirmek için bir protokol

Fare Glokomda Konfokal Oftalmoskopik Görüntüleme ve Hücre morfometrisi: Nörodejenerasyonda sırasında Retina Mikroglial Aktivasyonu Vivo Dynamics

Yüksek throughput ve Çok parametrik Nicelik için iki Algoritmalar

Makrofaj-fibroblast Kokültürlerinin Nicelleştirilmesi için Alan Tabanlı Görüntü Analiz Algoritması

Boyut, şekil ve yön ağlar yönetim eşleşmiş Astrocytes analiz

Fare Beyninde Mikroglial Yoğunluk, Morfoloji ve Periferik Miyeloid Hücre Infiltrasyonu Analizi için IBA1 ve TMEM119 Kullanılarak İmmünofloresanS Boyama

İnsan Mikroglia Benzeri Hücreler: İnsan Sinaptozomları Kullanılarak İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden ve In Vitro Canlı Hücre Fagositoz Analizinden Farklılaşma

Akış Sitometrisi Kullanılarak Sinaptik Materyalin Mikroglial Yutulmasının Miktar Tayini

Akış Sitometrisi Kullanılarak Sinaptik Materyalin Mikroglial Yutulmasının Miktar Tayini