Bu çalışmada, NINR (F32NR013611) finansal destek aldı. Ayrıca, kabul ve AnalyzeSkeleton(2D/3D) ve FracLac geliştiriciler teşekkür etmek istiyoruz (Arganda Carreras vd ve Karperien vd., sırasıyla) hangi burada açıklanan analiz mümkün olmazdı olmadan.

Tüm deneyler tarafından onaylanmış ve Arizona Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanmak Komitesi ve bakım ve Laboratuvar hayvanlarının kullanımı için NIH kurallar tarafından kurulan yönergelere uygun olarak gerçekleştirilen. Bakım hayvan ağrı ve rahatsızlık en aza indirmek için çekildi. Ötanazi yöntemleri için onaylanmış bir protokol according ve servikal işten çıkarma isoflurane anestezi altında oluşur.
1. doku hazırlık
Not: microglia morfoloji Analizi hücre morfolojisi korumak için sabit, cryoprotected doku örnekleri üzerinde yürütmek. Birini hazırlamak ve doğrudan sabit doku floresans IHC için dilim için standart bir protokoldür.
<ol><li>Fare ya da sıçan beyin euthanized bir hayvandan istenen deneme sonra ve bir Standart laboratuvar protokolüne göre kaldırın. 5 mL 24 h 4 ° C'de % 4 paraformaldehyde çözüm de içeren bir 10 mL flakon beyin yerleştirin Sonra durulama ve 5-10 mL % 30 sükroz fosfat yerine çözüm (PBS, 0.01 M) için 72 h 4 ° C'de arabelleğe alınmış Bir microtome ile kesit bütün beyin doku cryostat ile kesit kadar-80 ° C'de veya 4 ° C'de saklayabilirsiniz. Not: Bu protokol henüz parafin gömülü dokudan dilimlenmiş doku kullanarak test edilmemiştir.</li>
	<li>Bölüm beyin dokusu istenen bölüm kalınlığı ve bir cryoprotection çözüm (50 mM PBS, etilen glikol, gliserol) ya bir cryostat ya da microtome ve mağaza serbest yüzer bölümlerinde-20 ° C'de kullanarak Yönlendirme Not: Bu protokol başarıyla 50 µm için 200 µm arasında değişen kalınlıkta, koronal doku bölümlerinde yapılmıştır. Doku bölümleri daha az 50 µm microglia süreçler, kalın doku bölümlerde tam yayılımı yakalamak değil daha IHC boyama doku içine antikor penetrasyon nedeniyle kusurlu olabilir. Doku ya kesitli bir koronal veya sagittal yönlendirme olabilir ve bu seçim belirlenmesi için deneysel hedef ve beyin region(s) üzerinde bağlıdır.</li>
</ol>2. immünhistokimya
Not: Floresan veya 3, 3 '-diaminobenzidine (DAB) IHC iskelet ve Fraktal analiz yöntemleri uygulanabilir. Aşağıda bir standart floresan IHC protokolüdür ve gerektiği gibi yerine olabilir. Floresans IHC DAB IHC karşılaştırıldığında hücre süreçlerin üstün görselleştirme verir.
<ol><li>Doku bölümler 4 mL Cam şişe (ilâ 15 fare beyin bölümleri/flakon) yerleştirin ve 1 mL solüsyon kadar % 10 at serum, PBS (0.01 M), %0,5 Triton, 1 h için (23 ° C) Oda sıcaklığında %0,04 NaN3 içeren ile kuluçkaya.</li>
	<li>Üç kez, oda sıcaklığında PBS (0.01 M) ile 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>1 mL içeren PBS (0.01 M), %0,5 Triton, %0,04 NaN3ve (NaN3 etkinliğini korumak için) kaplı çözeltisi içinde 72 h için oda sıcaklığında birincil antikor (Iba1, 1:1, 000) ile kuluçkaya.</li>
	<li>Üç kez, oda sıcaklığında PBS (0.01 M) ile 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>4 h 1 mL içeren PBS (0.01 M), %0,5 Triton, %0,04 NaN3 çözeltisi içinde için oda sıcaklığında kapalı ikincil antikoru (Anti-tavşan 488, 1:250) ile kuluçkaya
</li>
	<li>Üç kez, oda sıcaklığında PBS (0.01 M) ile 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>Beyin dokusu bölümler (sayı ve tercihine göre yönlendirme) subbed slaytlara monte, bir yumuşak-set Montaj araç slayta uygulamak ve coverslip doku yerleştirin. 4 ° C'de slaytları depolama Not: 1,5 cam coverslip kalınlığı confocal görüntüleme için gereklidir. Yumuşak-set bir tercih edilen montaj orta yüksek viskozite doku sıkıştırmak değil ve en iyi zaman hard-set montaj medyaya göre morfolojisi korur çünkü.</li>
</ol>3. görüntüleme
<ol><li>Iba1 pozitif hücrelerinin beyin doku kısmındaki bir 20 X objektif veya daha büyük kullanarak bir z-yığın alma yeteneği vardır alan parlak veya confocal mikroskop kullanarak görüntü. Not: düşsel parametreleri ve yazılım kurulumu tüm photomicrograph toplama bir deneyde sabit olması gerekir. Mükemmel süreç detay bir 40 X veya 63 X objektif kullanarak elde edilir. Burada tüm bir photomicrograph veya bir çok hücreli yatırım getirisi daha büyük bir photomicrograph içinde açıklanan iskelet çözümleme protokolü uygulamak mümkündür.<ol>
<li>8-bit görüntüleri elde etmek belgili tanımlık mikroskop bilgisayar yazılımı için özel uygun yazılım ayarları kullanarak. Not: Dosyaları dönüştürme 8-bit sonrası satın alma için veri toplama bozabilir.</li>
		<li>En az bir 30 µm z-deste belgili tanımlık mikroskop bilgisayar yazılımı için özel uygun yazılım ayarları kullanarak görüntüleri 2 µm aralığını en fazla ile kazanmak. Not: Mikroskop ve yazılım bir X, Y ve Z eksenindeki resim alma için izin vermelisiniz. Bir z-yığın artırılabilir ve aralığı ek microglia ayrıntı sağlamak için azalabilir. Buna karşılık, saat görüntüleme artacaktır. Nyquist örnekleme floresan mikroskopi için mümkün olduğunda kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>TIF dosyaları olarak ya da belgili tanımlık mikroskop bilgisayar yazılımı tarafından gerekli tüm dosyaları kaydedin.</li>
	<li>Açık belgili tanımlık TIF eğe içinde ImageJ ve görüntü tıklayarak kanalları ayırmak için araç çubuğunu kullanın | Renk | Split kanallarıve görüntü tıklayarak görüntüleri yığını | Yığınlar | Proje x | Maksimum yoğunluk projeksiyon uygun olduğunda. .Tif dosyaları olarak kaydedin.</li>
</ol>4. iskelet Analizi
<ol><li>Download FIJI ya da ImageJ gelen < https://imagej.net/Fiji/Downloads>. Bireysel eklentileri AnalyzeSkeleton(2D/3D) üzerinden download < http://imagej.net/AnalyzeSkeleton>15 ve FracLac üzerinden download < https://imagej.nih.gov/ij/plugins/fraclac/fraclac.html>16. Not: bir photomicrograph ikili bir skeletonized görüntüye dönüştürme tüm süreç az 1 dk sürer.</li>
	<li>Floresan photomicrograph kullanıyorsanız, görüntü 8 bit olduğundan emin olun ve en iyi tüm olumlu boyama görselleştirmek için gri tonlamaya dönüştürmek. Araç çubuğunu kullanın ve görüntü tıklayın | Arama tabloları | Greys. Kullanarak bir DAB alan parlak fotoğraf, ilk kullanımda FFT bant eklenti filtre ( süreci tıklatarak araç çubuğunu kullanarak | FFT | Bant Filtre) ve daha sonra gri tonlamaya dönüştürme. Not: Bu protokol, ImageJ varsayılan ayarları bir FFT bant filtre için yeterli (filtre) 40, hiçbir şerit bastırma 3 piksele kadar amaçlıdır. Bir FFT bant filtre uygulayarak görüntünün genel olarak daha büyük yönlerini koruyarak gürültü (küçük Özellikler) kaldırır. Bu özellikle parlak alan görüntülerde kullanışlıdır nerede böler ve çatlaklar doku arka plan olarak görünür ve böylece iskelet analiz18zorlaştırıyor.</li>
	<li>Parlaklığı ayarlayın ve görüntü çok karanlık ise kontrast ve microglia işlem görüntülenir. Araç çubuğunu kullanın ve görüntü tıklayın | Ayarlamak | Parlaklık/kontrast. Minimum veya maksimum kaydırıcıları, histogram ama hayır daha fazla kenarlarına kadar gerektiği gibi ayarlayın. Not: ImageJ, parlaklık ve kontrast piksel değerlerini değiştirilmemiştir böylece resmin arama tablosu (LUT), güncelleştirme tarafından değiştirilir. Max ve min kaydırıcıları görüntü aralığı piksel değerleri 255 beyaz görünen yukarıda ve aşağıda görünen siyah180 piksel değerleri ile alt ve üst sınırları kontrol. En az kaydırıcıyı microglia lekeli DAB photomicrographs için kullanılacak ise floresan photomicrographs durumunda, maksimum kaydırıcıyı, kullanılmalıdır.</li>
	<li>Daha da işlemi tıklatarak araç çubuğunu kullanarak karşıtlığı artırmak için Keskinliği Azaltma Maskesi filtresi çalıştırmak | Filtreler | Keskinliği Azaltma Maskesi. Bu iletişim kuralı, ImageJ'ın varsayılan ayarları amacıyla (3 piksel yarıçapı ve maske 0,6 ağırlığını) kullanılır. Not: Keskinliği Azaltma Maskesi keskinleştirir ve orijinal görüntüden (Keskinliği Azaltma Maskesi) bulanık bir sürümünü çıkarılarak ve sonuçta elde edilen görüntü orijinal görüntünün yüksek karşıtlık sürümü birleştirme tarafından görüntünün kenar özelliklerini geliştirir. Bu nedenle, Keskinliği Azaltma Maskesi filtresi ayrıntılarını oluşturmaz ancak yerine bir resimde varolan ayrıntı açıklar. (Ve böylece ne kadar bulanıklık kaldırılacak) ayarlarında değişiklikler nasıl bulanık Keskinliği Azaltma Maskesi RADIUS olacağını ve maske ağırlık ayarlama değişiklikleri Keskinliği Azaltma Maskesi ile birleştirilmiş karşıtlık derecesini (ve böylece son resmin zıtlığını ayarlar).</li>
	<li>Keskinliği Azaltma Maskesi tarafından oluşturulan salt-and-pepper gürültü çıkarmak için bir despeckle adımı gerçekleştirin. Araç çubuğunu kullanın ve işlemi tıklatın | Gürültü | Gürültüyü Temizleme. Not: Lekeleri temizlemek her piksel, 3 × 3 mahallede medyan değeri değiştirerek salt-and-pepper gürültü kaldırır. Kenarları18netliği etkilemeden outliers yoğunluğu içinde medyan piksel tarafından değiştirilir etkisidir.</li>
	<li>Görüntü tıklayarak araç çubuğunu kullanarak ikili görüntü dönüştürmek | Ayarlamak | Eşik. Not: Eşik özellikleri arka plan karşı ilgi içine gri tonlamalı görüntüler stratifies ve görüntü ikili18dönüştürür.</li>
	<li>Despeckle, yakın-, uygulamak ve aykırı işlevler kaldırmak: kadar elde edilen ikili görüntüde tek piksel arka plan gürültü ve süreçler arasındaki boşluklar olabilir.<ol>
<li>İşlemi tıklatarak araç çubuğunu kullanarak despeckle işlevi uygular | Gürültü | Gürültüyü Temizleme. Not: Uygulama lekeleri temizlemek için ikili resim siler kalan tek piksellik gürültü yapmayın.</li>
		<li>İşlemi tıklatarak araç çubuğunu kullanarak yakın işlevi uygular | İkili | Yakın. Not: Bu eklenti ilâ 2 piksel ayrılırlarsa iki karanlık piksel bağlanır.</li>
		<li>İşlemi tıklatarak araç çubuğunu kullanarak kaldır outliers işlevi uygular | Gürültü | Outliers kaldırmak. Not: Bu protokol amacıyla, 2 piksel yarıçapı ve bir eşik 50 ile parlak outliers hedeflenir. Bu eklenti tarafından belirli bir değeri (eşik)18değerinden fazla sapma çevresindeki medyan piksel bir parlak ya da ölü aykırı piksel yerini alır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gelecekteki kullanımı ve/veya fractal analiz için ayrı bir dosya olarak kaydetmek ve işlemi tıklatarak araç çubuğunu kullanarak görüntü skeletonize | İkili | Skeletonize.</li>
	<li>Skeletonized görüntüyü seçin ve çalışma plugin eklentileri tıklatarak araç çubuğunu kullanarak AnalyzeSkeleton(2D/3D) | İskelet | İskelet analizve şube bilgileri kutusunun işaretlenmesi. Not: Görüntü işleme en iyi duruma getirme ile ekleme ya da silme yukarıda önerilen adımlardan gerektirecektir olasıdır. Bu süreçte skeletonized görüntüleri bir bindirme iskelet ve orijinal görüntü oluşturarak doğruluk için değerlendirilir. Somas merkezden yayılan işlemleri ile tek kökenli puan olmalıdır; dairesel somas verileri yıkmak ve protokol ayarı kaçınılmalıdır. Tek bir noktadan dairesel somas karşı örneği Şekil 1' de gösterilmiştir.</li>
</ol>Temsilcisi olmayan iskeletler kaynaklanan ve çözümler önerdi ortak sorunları:
<ul><li>Görüntü çok karanlık: gri tonlama için dönüştürmek, Parlaklık/kontrast kaydırıcıları ayarlayın ve/veya Keskinliği Azaltma Maskesi uygulama</li>
	<li>Çok fazla arka plan: Parlaklık/kontrast kaydırıcıları ayarlayın, Despeckle uygulamak ve/veya kaldırmak aykırı</li>
	<li>(Özellikle floresans görüntüler için) skeletonized görüntüdeki dairesel somas: FFT bant filtre ve/veya Keskinliği Azaltma Maskesi uygulamak</li>
	<li>Çatlaklar (özellikle alan parlak görüntüler için) bir doku: FFT bant filtre uygulamak ve/veya gürültüyü Temizleme</li>
</ul><ol start="10"><li>Tüm verileri sonuçlarından kopyalayın ve şube bilgi veriyor ve verileri bir Excel elektronik tabloya yapıştırabilirsiniz.</li>
	<li>Excel'de, IHC ve görüntü alma neden iskelet parçaları kaldırmak için veri kırpın.<ol>
<li>İskelet analiz ham veri çıktısı deney kitabıyla çoğaltmak ve dosya adına TRIM ekleyin. Tüm sonraki veri düzeltme gelecekteki kullanım ve referans için ham verileri korumak için çoğaltılmış çalışma kitabındaki gerçekleşmelidir.</li>
		<li>Hangi parçaları uzunluğu ImageJ içinde skeletonized görüntüyü açıp, çizgi aracını seçerek veri kümesinden kırpılacağı belirlemek. Çeşitli parçaları ortalama uzunluk, not alma, ölçmek ve kesme biçimi değerini üzerinde karar verin. Not: burada sunulan veri, istenmeyen parçaları için kesme uzunluğu 0.5 amaçlıdır. Bu değer bir veri kümesi tutarlı olmalıdır.</li>
		<li>Özel sıralama Excel elektronik tablo tıklayarak Sırala ve Filtre Uygula tarafından | Özel sıralama. "Son nokta voxels" büyükten küçüğe ve yeni bir düzeye, tarafından "Mx şube pt" Büyükten Küçüğe Sırala.</li>
		<li>Kesme biçimi değerini daha az en büyük şube uzunluğunda 2 bitiş noktaları içeren her satır kaldırmak (i.e., 0.5). Para bitiş noktaları toplam sayısını hesaplamak için bitiş noktası sütundaki verileri görüntüden toplamış.</li>
		<li>Şube bilgileri veri için tekrar ediyorum: 'şube boyla' en küçük gelen büyüğe sıralamak. Kaydırma üzerinden veri ve bir dal kesme biçimi değerini daha az uzunlukta her satırını kaldırmak(i.e., 0.5). Tüm dalları görüntüden toplanan toplam uzunluğunu hesaplamak için şube uzunluk sütunundaki değerlerin toplamı.</li>
		<li>Tüm veriler kesilmiş ve özetlenebilir kadar adımları 4.11.3-4.11.5 her görüntü/sayfası için yineleyin.</li>
		<li>(Uç noktalarının sayısını toplanır ve branş uzunluğu toplamı) her görüntü verilerinden microglia somas karşılık gelen görüntü sayısı bölün. Son verileri (bitiş noktaları/hücre & dal uzunluğu/hücre) istatistiksel yazılım girin. Not: Toplam şube uzunluğu/hücre veri uzunluğu, pixel dönüştürme mikron gerektirebilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. fractal analiz
Not: FracLac bir dizi değil kaplıdır farklı şekil analizleri bu protokol için çalıştırmak yapabiliyor. FracLac daha ayrıntılı bir açıklama çeşitli işlevler için FracLac el kitabı, bkz: < https://imagej.nih.gov/ij/plugins/fraclac/FLHelp/Introduction.htm> ve ilişkili başvurular 2,16,19. Fraktal Çözümleme Protokolü 4.1-4.7 yukarıda açıklanan adımları kullanır.
<ol><li>Tüm fractal analiz için kullanılan YG boyutunu belirler. ROI çizmek için Dikdörtgen aracını kullanın. Kutuyu hücrenin tamamını yakalamak için yeterli büyüklükte ve veri kümesi tutarlı kalır emin olun. Not: dikdörtgen seçimi yerine serbest seçim tüm ROIs aynı boy dikdörtgen, ve bu nedenle, hücreleri aynı ölçeğe sahip sağlamak için kullanın. Serbest seçim ImageJ çünkü otomatik ölçek farklı boy dikdörtgen windows farklı ölçeklerde hücrelerle sonuçlanan sığacak şekilde kare bir yatırım getirisi kullandıysanız bu durumda olmazdı. Fraktal şekiller ölçekli bağımsız olmakla birlikte, FracLac ImageJ için kullanarak fractal analiz süreci ölçek16tarihinde bağlıdır. Böylece, veri toplama boyunca sürekli olarak ölçekli bir yatırım getirisi için gerek yoktur.</li>
	<li>Rastgele microglia fractal analiz için her photomicrograph ve karşılık gelen ikili resim seçin. ROI Yöneticisi penceresinde ROI hücrenin konumunu kilitlemek için güncelleştirme seçin. CTRL + üst karakter + D alanı içinde yeni bir pencere olarak yatırım getirisi çoğaltmak için kullanın ve kırpılmış hücre kaydedin. (İskelet analizinden) karşılık gelen ikili görüntü üzerinde alan ROI Yöneticisi'ni kullanarak aynı hücre ile yinelenen. Hücreleri yeterli sayıda fractal analiz için rasgele seçilmiş ve tüm dosyalarını kaydetmek kadar yineleyin. Not: Bir rasgele sayı üreteci ve numaralandırılmış Kılavuzu rastgele hücreleri seçmek için kullanılabilir.</li>
	<li>İkili resim ile bireysel hücreyi aç. Boya Fırçası aracını çift tıklatın, siyah rengi ayarlamak ve fırça genişliği gerektiği gibi ayarlayın. Eşleşen photomicrograph referans olarak kullanarak, bitişik hücre süreçleri kaldırmak, parçalanmış işlemleri bağlamak ve hücre ilgi yalıtmak için boya fırçası kullanın. İkili hücre izole edildikten sonra ikili dosyayı kaydedin. Not: 'alt' basılı (siyah) ön plan renginden boya fırçası arka plan rengine (beyaz) geçiş yapar.</li>
	<li>Anahat araç yolu ile işlemi kullanarak ikili hücre dönüştürmek | İkili | Anahat. Not: FracLac görüntü j-ebilmek var olmak kullanılmış her iki katı şekillerdeki veya şekil özetliyor, ancak, Şu anki şekli kullanmak için16özetliyor kuralıdır.</li>
	<li>Araç çubuğunda, eklentileri tıklatarak araç çubuğunu kullanarak FracLac açın | Fractal analiz | FracLac ve BC (sayma kutusu)seçin. Kılavuz tasarım ayarlarında, Num G 4 olarak ayarlayın. Grafik seçenekleri'nin altında analiz dışbükey hull ve hücre sınırlayıcı daire için ölçümleri kutuyu işaretleyin. Bittiğinde, Tamam' ı seçin. Not: Num G sayısı kutusuna tarama sırasında kullanılan ızgara yönelimleri sayma ve Num G için önerilen Aralık 4-12. Num G ayarı ve önerilen Aralık iyice FracLac el ile16' kevgirden geçirilir. NUM G artan hesaplama kez önemli ölçüde yavaşlatabilir. FracLac ayarlarını yalnızca bir kez oturum başına ayarlamak gerekir. Ayarları girdikten sonra tarama düğmesi kullanılabilir hale gelir.</li>
	<li>Seçili resmin üzerine kutusunu sayma tarama çalıştırmayı tarama düğmesini seçin. Not: Tarama veri çıkışları olan üç windows oluşturur: gövde ve daire sonuçları, kutu sayısı Özeti dosya ve tarama türleri. Tarama türleri penceresinde kullanılan ayarları günlüğünü içerir, yanı sıra standart sapmalar kesin ölçer. Bu iletişim kuralının amacı gereği, tarama türleri penceresindeki kullanılmaz ve kapalı veya olabilir için gelecek bahsetme kurtarmak.</li>
	<li>Gövde ve Daire sonuçları penceresindeki istenen tüm veri kopyalamak (i.e., yoğunluk, yayılma oranı ve döngü) sonuçları. Kutu sayısı Özeti penceresindeki istenen verileri kopyalamak (i.e., Fraktal boyut ve lacunarity) sonuçları. Kopyalanan verileri bir Excel dosyası veya istatistiksel yazılım aktarın. Not: FracLac tam bir listesi çıktı veri sağlanan ve iyice FracLac ImageJ el ile16için açıklanmıştır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).</li><li>Karperien, A., Ahammer, H., Jelinek, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitating+the+subtleties+of+microglial+morphology+with+fractal+analysis.">Quantitating the subtleties of microglial morphology with fractal analysis.</a> Front Cell Neurosci. 7 (3), eCollection (2013).</li><li>Taylor, S. E., Morganti-Kossmann, C., Lifshitz, J., Ziebell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod+microglia:+a+morphological+definition.">Rod microglia: a morphological definition.</a> PLoS One. 9 (5), e97096 (2014).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo.">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Abiega, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Hyperactivity+Disturbs+ATP+Microgradients,+Impairs+Microglial+Motility,+and+Reduces+Phagocytic+Receptor+Expression+Triggering+Apoptosis/Microglial+Phagocytosis+Uncoupling.">Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling.</a> PLoS Biol. 14 (6), e1002466 (2016).</li><li>Wyatt-Johnson, S. K., Herr, S. A., Brewster, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Status+Epilepticus+Triggers+Time-Dependent+Alterations+in+Microglia+Abundance+and+Morphological+Phenotypes+in+the+Hippocampus.">Status Epilepticus Triggers Time-Dependent Alterations in Microglia Abundance and Morphological Phenotypes in the Hippocampus.</a> Front Neurol. 8 (700), eCollection (2017).</li><li>Morrison, H., Young, K., Qureshi, M., Rowe, R. K., Lifshitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microglia+analyses+reveal+diverse+morphologic+responses+in+the+rat+cortex+after+diffuse+brain+injury.">Quantitative microglia analyses reveal diverse morphologic responses in the rat cortex after diffuse brain injury.</a> Sci Rep. 7 (1), 13211 (2017).</li><li>Morrison, H. W., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+spatiotemporal+analysis+of+microglia+morphology+during+ischemic+stroke+and+reperfusion.">A quantitative spatiotemporal analysis of microglia morphology during ischemic stroke and reperfusion.</a> J Neuroinflammation. 10 (4), (2013).</li><li>Gyoneva, S., Traynelis, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norepinephrine+modulates+the+motility+of+resting+and+activated+microglia+via+different+adrenergic+receptors.">Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors.</a> J Biol Chem. 288 (21), 15291-15302 (2013).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+Enrichment+Potently+Prevents+Microglia-Mediated+Neuroinflammation+by+Human+Amyloid+beta-Protein+Oligomers.">Environmental Enrichment Potently Prevents Microglia-Mediated Neuroinflammation by Human Amyloid beta-Protein Oligomers.</a> J Neurosci. 36 (35), 9041-9056 (2016).</li><li>Rodriguez, J. J., Noristani, H. N., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+response+to+Alzheimer's+disease+is+differentially+modulated+by+voluntary+wheel+running+and+enriched+environments.">Microglial response to Alzheimer's disease is differentially modulated by voluntary wheel running and enriched environments.</a> Brain Struct Funct. 220 (2), 941-953 (2015).</li><li>Soltys, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+morphological+study+of+microglial+cells+in+the+ischemic+rat+brain+using+principal+component+analysis.">Quantitative morphological study of microglial cells in the ischemic rat brain using principal component analysis.</a> J Neurosci Methods. 146 (1), 50-60 (2005).</li><li>Orlowski, D., Soltys, Z., Janeczko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+development+of+microglia+in+the+postnatal+rat+brain.+A+quantitative+study.">Morphological development of microglia in the postnatal rat brain. A quantitative study.</a> Int J Dev Neurosci. 21 (8), 445-450 (2003).</li><li>Morrison, H. W., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+differences+in+astrocyte+and+microglia+responses+immediately+following+middle+cerebral+artery+occlusion+in+adult+mice.">Sex differences in astrocyte and microglia responses immediately following middle cerebral artery occlusion in adult mice.</a> Neuroscience. 339, (2016).</li><li>Arganda-Carreras, I., Fernandez-Gonzalez, R., Munoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+reconstruction+of+histological+sections:+Application+to+mammary+gland+tissue.">3D reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue.</a> Microsc Res Tech. 73 (11), 1019-1029 (2010).</li><li>Davis, B. M., Salinas-Navarro, M., Cordeiro, M. F., Moons, L., De Groef, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+microglia+activation:+a+spatial+statistics+approach+to+maximize+information+extraction.">Characterizing microglia activation: a spatial statistics approach to maximize information extraction.</a> Sci Rep. 7 (1), 1576 (2017).</li><li>. ImageJ User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/</a> (2014)</li><li>Karperien, A. L., Jelinek, H. F., , <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractal,+Multifractal,+and+Lacunarity+Analysis+of+Microglia+in+Tissue+Engineering.">Fractal, Multifractal, and Lacunarity Analysis of Microglia in Tissue Engineering.</a> Front Bioeng Biotechnol. 3 (51), eCollection (2015).</li><li>Martyanova, E. K., Tishkina, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+quantitative+analysis+of+microglial+morphology.">3D quantitative analysis of microglial morphology.</a> available as conference preceedings SkoltechOn. , (2015).</li><li>Fernandez-Arjona, M. D. M., Grondona, J. M., Granados-Duran, P., Fernandez-Llebrez, P., Lopez-Avalos, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Morphological+Categorization+in+a+Rat+Model+of+Neuroinflammation+by+Hierarchical+Cluster+and+Principal+Components+Analysis.">Microglia Morphological Categorization in a Rat Model of Neuroinflammation by Hierarchical Cluster and Principal Components Analysis.</a> Front Cell Neurosci. 11 (235), eCollection (2017).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Microglia hücreleri ince fizyolojisi ve patoloji mikro-etki alanları içinde ayarlanan ve türleri morfoloji2 çeşitli bir yelpazede ince7,14 ve brüt yaralanma8. ImageJ iletişim kurallarının kullanımını microglia morfoloji miktar platformu olarak tüm laboratuvarlar için erişilebilir yapar ve eklentileri bir açık kaynak görüntü işleme yazılımı vardır. Açıklanan protokol görüntü işleme ve analiz bu yazılımı kullanarak üzerinde odaklanmış iken, veri toplama, geçerlilik ve güvenilirlik tutarlılığını mükemmel IHC ve mikroskobu ile başlar. Bu iletişim kuralı ikili, iskelet ve tüm photomicrographs ve tek hücre anahat gösterimleri geliştirmek için kullanılır ama zavallı IHC boyama yer alamaz ve düşük kontrast içinde sonuç mikroskobu bulanık veya görüntü bozuk. Bir ek dikkate, değiştirilemez bir şekilde portaldan microglia morfoloji değiştiren beyin dokusu Muhafazası kesit, öncesinde sırasında değil düzleştirmek için özen göstermelidir. Son olarak, her deneme içinde aynı ölçek gibi aynı mikroskop kullanarak microglia yansıması gerekir. Araçları, amaçları ve yazılım benzer hedefleri rağmen farklı büyüklükteki photomicrographs neden ve detay yanı sıra her çerçeve içinde hücre sayısını değiştirmek mikroskoplar arasında değişir. Örneğin, iki kez sayı hücre ve edinimi Zeiss 880 kullanma daha ayrıntı daha az 40 X objektif bir Leica SPII kullanarak resim alma sonuçlanır. Bu veri örnekleme bir sorun olduğunda bu özellikle tek bir hücre yerine tüm çerçeve toplanan hücre yaklaşım veri için önemlidir.
Genel olarak, hangi tüm photomicrograph iskelet analiz tek hücre fractal analiz iki nedenden dolayı önce gelir. Belirleyici hücre yaklaşım bir photomicrograph tüm hücreleri tek hücre fractal analiz için karşılaştırıldığında ve saat bir faktör ise bir tarama aracı olarak düşünülebilir hızlı. Buna ek olarak, iskelet çözümleme sırasında elde edilen ikili görüntüleri fractal analiz için kullanılır. Yansıma sonra iskelet Çözümleme sonuçlarını etkilemek ve Kullanıcı-etkisi tanıtmak kritik adımlar vardır. Kullanıcılar arasında en değişken Protokolü adımlar adım 4.2 (artan görüntü parlaklığını) ve 4.5 (eşik belirleme) adım. Mümkün olduğu durumlarda, (max veya min kaydırıcısını 0-255 arasında) artırmak için en uygun bir numarası belirler ve tüm görüntüler ve kullanıcılar için sabit tutulan. Görüntü değişkenlik büyük olduğunda, Kullanıcı yerine görüntüler arasında değişir bir parlaklık seçebilirsiniz. Alternatif olarak, görüntüleri parlak ve kontrast yüksek ise, parlaklık artan atlanabilir ve eşik standardize özel eşik filtre kullanarak (Örn., Huang) daha değişken varsayılan yerine. Bir kez en iyi duruma getirilmiş, parametreler için ek Kullanıcı-etkisi en aza indirmek için yapıştırılır.
Bir örnek Kullanıcı değişkenlik Şekil 5' te gösterilmiştir. Veri değerleri Kullanıcı 1 Kullanıcı 2 karşı artmış ve eğer Kullanıcı 1 ve Kullanıcı 2 veri toplama için katkıda bu nedenle değişkenlik yükseltilmiştir. Kullanıcı 1 ve Kullanıcı 2 ikili ve skeletonized görüntüleri farklılıkları örneği olan vurgulanır renkli daireler (Şekil 5). Bu durumda, hem kullanıcılar hem de microglia sınırlı uzmanlık ile kısaca eğitimli lisans öğrencileri vardı. Normal gözetim ve bir microglia ile birlikte artan Protokolü eğitim2 uzman tarafından danışmanlık arası Kullanıcı değişkenliği azaltır. İkili hücreleri el ile ve tek tek izole microglia şekiller belirlemek için yalnızca eşik güvenmek yerine bir photomicrograph olduğundan burada değerlendirildi değil, fractal analiz arası Kullanıcı değişkenlik tabi daha az olsa da. Ancak, tüm yöntemler bazı değişkenlik kullanıcılar arasında bulunur. Bu nedenle, tek bir Kullanıcı (ideal olarak, microglia hücrelerde bazı uzmanlık eğitim) tüm veri kümesinin veri toplama tamamlamak.
Ek değişiklikler bu iletişim kuralı için kolayca yapılabilir ve görüntü kalitesi ve gürültüyü azaltmak ve işlem bağlantısını sağlamak için harcanan çabaları bağlı olacaktır. Örneğin, kontrast yeterli ise, o zaman Keskinliği Azaltma Maskesi gerekli değildir ve atlanabilir. En iyi duruma getirme ve görüntüler, deneysel çalışmaları ve bütün bir set veri toplama önce denetimleri, belirli bir kümesi için protokol sonlandırmak akıllıca olur. Son olarak, ek eklentileri diğerleri yerine açıklamak veya bu protokol için açıklanmayan görüntüleri netleştirmek için kullanılabilir dilate veya keskinleştirme gibi.
Bu iletişim kuralı avantajları onun evrensel kullanılabilirlik ve uyum vardır. Buna ek olarak, AnalyzeSkeleton kullanarak hücre yaklaşım değerlendirirken hızlı ve tüm photomicrograph için geçerli. Çok hücreli analiz yaklaşımı tek hücre yerine bir bütün bölge odaklanmak şeydir. Bu nedenle, hızlı bir şekilde, resmin içinde tüm microglia (bitiş noktaları ve işlem uzunluğu) açısından yaklaşım ortalama değerlendirmek mümkündür. İskelet çözümlemesi sağlayan birden çok hücre Analizi: veri örnekleme tarafından fractal analiz tek photomicrographs hücrelerden yalıtmak için gerekli zaman yatırım nedeniyle eşleştirilemeyen hücre sayıları açısından. Nerede bu en uygun olabilir bir örnek microglia türleri proximities fokal bir sakatlık içinde morfoloji eleme olurdu. IHC photomicrographs iskelet modeller oluşturmak için tüm alan görüntü işleme için daha zaman alıcı tek hücre yaklaşım karşılaştırıldığında kusurlu bir kısıtlamadır. Buna ek olarak, bir bölge analiz nerede microglia türleri morfoloji aynı alanda bulunan büyük ölçüde farklı koşullara uygun değil. Son olarak, bu analiz yöntemi hücre sayısı, deneysel koşullar arasında farklı olabilir bir parametre bağlıdır.
Fractal analiz tek bir hücre üzerinde yapılır ve bu nedenle iskelet çözümlemesinden ortalama hücre yaklaşım veri çıkışı tamamlar. Her ne kadar çok daha zaman alıcı, bu yatırım çok çeşitli xarakteristikaları veri verir. Örneğin, yoğunluk, yayılma oranı, hücre ve döngü veri boyutu, uzama ve hücre anahattının şeklini sırasıyla açıklanmaktadır. Fraktal boyut ve lacunarity hücre karmaşıklığı ve şekil heterojenite, anılan sıraya göre özetler. Her parametre nasıl hesaplanır ve nasıl veri yorumlanır daha ayrıntılı bir özetini içinde etkileşimli el ile16 sağlanır ve bu ayrıntı özel araştırma soru ile ilgili olarak düşünülmelidir. Hassas araçları fizyolojik ve patolojik koşullarda oluşabilir 2D microglia türleri morfoloji küçük değişiklikleri ölçmek için açıklanan protokol sonuçlarında. Sağlamlık, gönderilir ve form faktörü16,20 gibi ek xarakteristikaları analiz 3D şekiller oluşturmak mümkün olabilir.
İletişim kuralı geliştirme ve uyum sürekli ve Kullanıcı tarafından. Bu floresan8 ' den DAB/parlak-alan resim7 ama henüz katıştırılmış doku alkol için kapsayacak biçimde genişletilmiştir. Buna ek olarak, bu ek analiz için Imaris gibi özel mülk yazılım ile birlikte kullanılabilir. Bu iletişim kuralı Fizyoloji çeşitli için uygulanabilir ve microglia için sınırlı değildir ancak herhangi bir hücre veya doku belirli desen veya IHC yöntemlerle tespit şekilleri ile uygulanabilir. Son olarak, yeterli örnek boyutu ile birden fazla varyasyon veya küme analizi microglia göre morfolojisi12,21tabakalaşmak uygulanabilir; microglia morfoloji microglia işlevleri ve yanıt çevreleri için çok önemli bir göstergesi olarak bu anlamlı bilgi yok. Mikroglial morfolojik çeşitlilik için takdir genişleyen ve tam olarak sağlık ve hastalık sırasında nöron-glia-vasküler etkileşimleri anlamak önemlidir. Bu alanda büyüme ölçmek ve microglia morfoloji birden çok sürekli değişken kullanarak özetlemek için iyi gelişmiş, kullanımı kolay ve tekrarlanabilir protokolleri tarafından geliştirilmiştir.

Microglia beyin fizyolojisi1 olanakları bir süreklilik boyunca hiper yaklaşım ve son derece karmaşık türleri morfoloji arasında değişen de-ramified ve protozlar türleri morfoloji2 için değişiklikler için bir acil ve çeşitli morfolojik tepki var . Microglia3polarize ve çubuk şeklinde de olabilir. Microglia hücre yaklaşım yaygın olarak birden çok işlem sahip karmaşık bir şekil tanımlanır ve genellikle bitiş noktası başına hücre sayısı ve hücre süreçleri uzunluğu bildirilir. Microglia ince ayarlı beri nöronal ve gliyal işlevi ile sürekli hücre-hücre çapraz-hadis ve in vivo hareketliliği4,5, microglia türleri morfoloji farklı hücre işlevler ve işlev bozuklukları göstergeleri olarak hizmet verebilir beyinde. Yeterince tarif bu morfolojik değişiklikler çeşitliliği ve (epilepsi5,6 gibi ince fizyolojik rezonans meydana ramified hücreleri arasındaki farkları ayırt etmek için nicel bir yaklaşım gereklidir ve beyin sarsıntısı7) ek olarak (örneğin, kontur8) Brüt yaralanma. Morfoloji miktar7,8,9,10,11,12,13,14 kullanımının artmasıyla microglia türleri morfoloji tam çeşitliliği sağlık ve hastalık sırasında ortaya çıkaracaktır. ImageJ eklentileri microglia floresan veya floresan photomicrographs üzerinden microglia morfoloji özetlemek gerekli kademeli kullanımı sabit kemirgen dokusunda immünhistokimya (IHC) sonra elde mevcut çalışma ayrıntıları.
Burada açıklanan analiz teknikleri için 2010 yılında büyük meme yapıları, ölçmek için geliştirilmiş ImageJ eklentileri AnalyzeSkeleton (2D/3D)15ve ImageJ ve Fraktal analizi için entegre 2014 yılında geliştirilen FracLac16, Merkez bireysel microglia şekiller ölçmek. Bu eklentileri microglia yaklaşım tüm photomicrographs içinde hızlı bir analiz veya birden çok microglia bir photomicrograph içinde tanımlanmış bir yatırım getirisi sağlar. Bu analiz tek başına veya tamamlayıcı fraktal analizi ile kullanılabilir. Tek hücreli fractal analiz (FracLac) zaman bir yatırım gerektirir ama microglia karmaşıklığı, şekli ve boyutu ile ilgili birden çok morfoloji çıkış sağlar. Her iki araç kullanımı gereksiz değil, hücre yaklaşım hücre karmaşıklığı için tamamlayıcı ve birden çok parametre birleşimini farklı microglia türleri veri kümeleri12,17içinde morfoloji arasında ayırt etmek için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>primary antibody anti-IBA1</td><td>Wako&amp;nbsp;</td><td>019-19741</td><td>rabbit host</td></tr><tr><td>Vectashield soft mount</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Secondary antibody</td><td>Jackson ImmunorResearch</td><td>711-545-152</td><td>donkey host</td></tr><tr><td>4 mL glass vial</td><td>Wheaton</td><td>UX-08923-11</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide (NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>S-8032</td><td></td></tr><tr><td>glass coverslip</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>12-544-G</td><td></td></tr></tbody></table>

quantifying microglia morphology from photomicrographs of immunohistochemistry prepared tissue using imagej

Microglia beyin homeostazı katılmak ve sürekli çevreleri disfonksiyon, yaralanma ve hastalık için anket beyin fagositler vardır. İlk müdahale olarak microglia nöron ve glia fonksiyon bozukluğu azaltmak için önemli işlevleri vardır ve bu süreç içinde onlar çok çeşitli morfolojik değişiklikler tabi. Microglia türleri morfoloji açıklayıcı kategorize edilebilir veya alternatif olarak, hücre yaklaşım, karmaşıklık ve şekil gibi parametreleri için sürekli bir değişken olarak sayılabilir. Tek Kişilik hücrelere microglia miktarının yöntemleri uygulanırken, tüm bir photomicrograph içinde birden çok microglia birkaç teknikleri uygulamak. Bu yöntemin amacı çoklu ölçmek etmektir ve tek hücreler hazır ImageJ protokolleri kullanarak. Bu iletişim kuralı adımları bir özetidir ve floresan ve alan parlak photomicrographs temsilcisi ikili ve skeletonized görüntülere dönüştürmek için ve çözümlemek için önerilen ImageJ eklentileri kullanarak yazılım eklentileri AnalyzeSkeleton (2D/3D) ve FracLac Morfoloji veri toplamak için. Bu eklentiler çıkış işlemi bitiş noktaları, kavşaklar ve uzunluğu yanı sıra karmaşıklığı, hücre şekil ve boyut tanımlayıcıları açısından hücre morfolojisi özetler. Burada açıklanan iskelet Çözümleme Protokolü bir bütün photomicrograph veya bölge (ROI) ilgi içinde birden çok microglia bir bölgesel analizi için uygun ise FracLac bir tamamlayıcı tek hücre analizi sağlar. Kombine, protokol bir amaç, çeşitli microglia türleri morfoloji sağlıklı ve yaralı beyin mevcut arasında tabakalaşmak için kullanılan hassas ve kapsamlı değerlendirme aracı sağlar.

Burada açıklanan microglia morfoloji Analizi iletişim kuralları işleme floresan ve DAB photomicrographs xarakteristikaları analiz için yararlı adımları özetler. Aşağıdaki adımları görsel Şekil 2 ' de özetlenmiştir ve Şekil 3. Öyle ki birikmiş veri geçerli uygun şekilde orijinal photomicrograph modelleri bir temsilcisi ikili ve skeletonized görüntüsünü oluşturmada adımları hedefidir. İletişim kuralı uygulamadan sonra AnalyzeSkeleton eklenti sonuçları hangi etiketli bir iskelet görüntü bitiş noktaları ve şube sayısı (i.e., süreç) lengthcan elde edilen çıktı dosyalarından özetlenen. Bitiş noktaları ve işlem uzunluğu veri daha sonra microglia yaklaşım photomicrograph veya ROI ölçüde tahmin etmek için kullanılır. Şekil 4 ve iletişim kuralı uygulama olmadan toplanan elde edilen veriler (bitiş noktaları/hücre ve işlemi uzunluk/hücre) özetler. Benzer eğilimler var, rakam 4F içinde özetlenen veri daha az değişken daha fazla Şekil 4Eolan vardır. Buna ek olarak, bu veri iletişim kuralı uygulandığında gruplar arasındaki farklılıkları algılamak için artan duyarlılık göstermek. Son olarak, Uygulama Protokolü'nün arası Kullanıcı değişkenliği ile ilgili özen göstermelidir. Bu tür farklılıklar nerede aynı veri kümesi olarak yukarıda özetlenen özdeş bir protokol başvurusu iki bağımsız kullanıcılar tarafından analiz edildi Şekil 5 tarafından özetlenir.
Ek morfoloji veri iletişim kuralı uygulama sırasında oluşturulan ikili görüntülerden izole tek hücrelerden toplanır. Önce microglia Morfoloji ve FracLac eklenti Şekil 6' özetlenir kullanarak çözümlemek için protokol adımları. Biz her iki yaralı (Şekil 6A) bu analizde göstermek ve (Şekil 6B) doku yaralandı. İkili, anahatlı, dışbükey hull/daire ve kutusu sayım örnekleri iletişim kuralı uygulama Şekil 6C-F. içinde gösterilir ve her hücre ile analiz için Kapsüllenen temsilcisi görüntüleri Şekil 6Giçinde özetlenmiştir morfoloji veri farklılıkları kökenleri göstermek için bu görüntüler Yardım.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig1.jpg"> Şekil 1. Skeletonized microglia karşı (en iyi) bir tek kökenli soma ve karşılık gelen bindirme skeletonized hücre ile orijinal photomicrograph arasındaki bir dairesel soma (suboptimal) ile illüstrasyonlar. Ölçek çubuğu 10 µm. = <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig2.jpg"> Şekil 2. Protokol uygulamaya floresan photomicrographs. Ayrıntıları göstermek için illüstrasyonlar floresan photomicrograph tek bir hücre ile uygulanan iskelet Çözümleme Protokolü'nün kırpılmış. Ölçek çubuğu 10 µm. = <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig3.jpg"> Şekil 3. İletişim kuralı uygulamaya alan parlak DAB photomicrographs. Tek bir hücre ayrıntıları göstermek için kırpılmış alan parlak DAB photomicrograph uygulanan iskelet Çözümleme Protokolü'nün illüstrasyonlar. Ölçek çubuğu 10 µm. = <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig4.jpg"> Şekil 4. Veri analizi ve iletişim kuralı uygulama olmadan. (A) Floresan IHC ve kırpılmış hücre (B) sarı kutusuna karşılık gelen bir örnek photomicrograph. Örnek ikili ve skeletonized görüntüleri ile (C) ve (D) açıklandığı gibi uygulanan protokol olmadan. Microglia bitiş noktaları/hücre ve işlemi uzunluk/hücrenin özet verileri (beyaz) yaralanmamış ve (gri) (E) ile kortikal doku yaralandı ve protokol (F) uygulanır. İstatistiksel analiz kullanarak bir öğrenci t-testi ve n = 3, ** p < 0,01 gösterir. Ölçek çubuğu 10 µm. = <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig5.jpg"> Şekil 5. İletişim kuralı uygulama ile Kullanıcı farklılıkları. Kullanıcı 1 ve Kullanıcı 2 ikili ve iskelet görüntüleri orijinal bir görüntü ve protokol dönüştürme örneği. Renkli daireler eşleme ile iki resim arasındaki farklar vurgulanmıştır. Kullanıcı 1 ve Kullanıcı 2 yaralı ve yaralı beyin bölgelerinde microglia bitiş noktaları/hücre ve işlemi uzunluk/hücre veri Özet grafikleri. İstatistiksel analizi ANOVA ve örnek boyutudur n = 3; p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Ölçek çubuğu 10 µm. = <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig6.jpg"> Şekil 6. Fractal analiz ve iletişim kuralı uygulama olmadan. Microglia zarar görmemiş (A) ve karşılık gelen ikili (C) ve ile ve uygulanan protokol olmadan neden anahat (D) görüntüleri ile yaralı (B) korteks kırpılmış photomicrographs örneği. İlişkili dışbükey hull (mavi) ve karşılık gelen anahat şekilleri (E) için (pembe) Daire içine alarak şekil yoğunluğu hesaplamak, oranı ve döngü (G) için kullanılır. Sayım yöntemi kutusu (F) resimli ve Fraktal boyut (DB) ve (G) lacunarity (λ) hesaplamalar için kullanılır. Ölçek çubuğu 10 µm. = <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ at JoVE.com

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Microglia anket ve değişmiş beyin fizyolojisi kantitatif değerlendirilecek morfolojik değişiklikleri ile tepki beyin bağışıklık hücreleri vardır. Bu iletişim kuralı özetliyor bir ImageJ microglia morfoloji hücre yaklaşım, karmaşıklık ve şekli gibi ölçümleri göre sürekli veri olarak temsil etmek için analiz protokolüne dayalı.

ImageJ kullanarak doku hazırlanan immünhistokimya Photomicrographs üzerinden Microglia morfoloji miktarının

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

quantifying-microglia-morphology-from-photomicrographs

Research

JoVE Journal

Neuroscience

67.0K Görüntüleme.  University of Arizona. Microglia anket ve değişmiş beyin fizyolojisi kantitatif değerlendirilecek morfolojik değişiklikleri ile tepki beyin bağışıklık hücreleri vardır. Bu iletişim kuralı özetliyor bir ImageJ microglia morfoloji hücre yaklaşım, karmaşıklık ve şekli gibi ölçümleri göre sürekli veri olarak temsil etmek için analiz protokolüne dayalı.

Video: Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that include expression of novel surface antigens and production of mediators that build up and maintain the inflammatory response. Emerging evidence indicates that M/M are highly plastic cells that can assume classic pro-inflammatory (M1) or alternative anti-inflammatory (M2) activation after acute brain injury. However a complete characterization of M/M phenotype marker expression, their colocalization and temporal evolution in the injured brain is still missing.	
	Immunofluorescence protocols specifically staining relevant markers of M/M activation can be performed in the ischemic brain. Here we present immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis as a powerful approach to investigate the pattern of localization and co-expression of M/M phenotype markers such as CD11b, CD68, Ym1, in mouse model of focal ischemia induced by permanent occlusion of the middle cerebral artery (pMCAO). Two-dimensional analysis of the stained area reveals that each marker is associated to a defined M/M morphology and has a given localization in the ischemic lesion. Patterns of M/M phenotype marker co-expression can be assessed by three-dimensional confocal imaging in the ischemic area. Images can be acquired over a defined volume (10 &mu;m z-axis and a 0.23 &mu;m step size, corresponding to a 180 x 135 x 10 &mu;m volume) with a sequential scanning mode to minimize bleed-through effects and avoid wavelength overlapping. Images are then processed to obtain three-dimensional renderings by means of Imaris software. Solid view of three dimensional renderings allows the definition of marker expression in clusters of cells. We show that M/M have the ability to differentiate towards a multitude of phenotypes, depending on the location in the lesion site and time after injury.

A way to gain new insights into the complexity of the brain inflammatory response is presented. We describe immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis to investigate the pattern of co-expression of microglia/macrophage phenotype markers in a mouse model of focal ischemia.

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Nörobilim

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and simple protocol to detect protein expression during craniofacial morphogenesis/pathogenesis using mouse craniofacial tissues as examples. The protocol consists of preparation and cryosectioning of tissues, indirect immunofluorescence, image acquisition, and quantification. In addition, a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues for immunostaining is described, using craniofacial tissues and long bones as examples. Those methods are key to determine the protein expression and morphological/anatomical changes in various tissues during craniofacial morphogenesis/pathogenesis. They are also applicable to other tissues with appropriate modifications. Knowledge of the histology and high quality of sections are critical to draw scientific conclusions from experimental outcomes. Potential limitations of this methodology include but are not limited to specificity of antibodies and difficulties of quantification, which are also discussed here.

Here, we present a detailed protocol to detect and quantify protein levels during craniofacial morphogenesis/pathogenesis by immunostaining using mouse craniofacial tissues as examples. In addition, we describe a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues from young mice for immunostaining.

Fare Kraniyofacial dokularda ve Undecalcified kemik doku hazırlama ve Immünostasyon

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Gelişim Biyolojisi

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and subsequently digests this material, commonly through lysosomal degradation. Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) whose phagocytic function has been described in a broad range of conditions from neurodegenerative disease (e.g., beta-amyloid clearance in Alzheimer&#8217;s disease) to development of the healthy brain (e.g., synaptic pruning)1-6. The following protocol is an engulfment assay developed to visualize and quantify microglia-mediated engulfment of presynaptic inputs in the developing mouse retinogeniculate system7. While this assay was used to assess microglia function in this particular context, a similar approach may be used to assess other phagocytes throughout the brain (e.g., astrocytes) and the rest of the body (e.g., peripheral macrophages) as well as other contexts in which synaptic remodeling occurs (e.g. ,brain injury/disease).

Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) with a high capacity to phagocytose or engulf material in their extracellular environment. Here, a broadly applicable, reliable, and highly quantitative assay for visualizing and measuring microglia-mediated engulfment of synaptic components is described.

Bir yutulma Deneyi: CNS Fagositler ve nöronlar arasındaki etkileşimi değerlendirmek için bir protokol

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with distinct functions and gene expression profiles. The roles of microglial activation in health, injury and disease remain incompletely understood due to their dynamic and complex regulation in response to changes in their microenvironment. Thus, it is critical to non-invasively monitor and analyze changes in microglial activation over time in the intact organism. In vivo studies of microglial activation have been delayed by technical limitations to tracking microglial behavior without altering the CNS environment. This has been particularly challenging during chronic neurodegeneration, where long-term changes must be tracked. The retina, a CNS organ amenable to non-invasive live imaging, offers a powerful system to visualize and characterize the dynamics of microglia activation during chronic disorders.
This protocol outlines methods for long-term, in vivo imaging of retinal microglia, using confocal ophthalmoscopy (cSLO) and CX3CR1GFP/+ reporter mice, to visualize microglia with cellular resolution. Also, we describe methods to quantify monthly changes in cell activation and density in large cell subsets (200-300 cells per retina). We confirm the use of somal area as a useful metric for live tracking of microglial activation in the retina by applying automated threshold-based morphometric analysis of in vivo images. We use these live image acquisition and analyses strategies to monitor the dynamic changes in microglial activation and microgliosis during early stages of retinal neurodegeneration in a mouse model of chronic glaucoma. This approach should be useful to investigate the contributions of microglia to neuronal and axonal decline in chronic CNS disorders that affect the retina and optic nerve.

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Microglia activation and microgliosis are key responses to chronic neurodegeneration. Here, we present methods for in vivo, long-term visualization of retinal CX3CR1-GFP+ microglial cells by confocal ophthalmoscopy, and for threshold and morphometric analyses to identify and quantify their activation. We monitor microglial changes during early stages of age-related glaucoma.

Fare Glokomda Konfokal Oftalmoskopik Görüntüleme ve Hücre morfometrisi: Nörodejenerasyonda sırasında Retina Mikroglial Aktivasyonu Vivo Dynamics

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with ...

Tıp

Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections

With the growing interest in the tumor microenvironment, we set out to develop a method to specifically determine the microenvironment components within patient samples of glioblastoma, the deadliest and most invasive brain cancer. Not only are quantitative methods beneficial for accurately describing diseased tissues, they can also potentially contribute to more accurate prognosis, diagnosis, and the development of tissue-engineered systems and replacements. In glioblastoma, glial cells, such as microglia and astrocytes, have been independently correlated with poor prognosis based on pathologist grading. However, the state of these cells and other glial cell components has not been well-described quantitatively. This can be difficult due to the large processes that mark these glial cells. Furthermore, most histological analyses focus on the overall tissue sample or only within the bulk of the tumor, as opposed to delineating quantifications based on regions within the highly heterogeneous tissue. Here, we describe a method for identifying and quantitatively analyzing the populations of glial cells within the tumor bulk and adjacent regions of tumor resections from glioblastoma patients. We used chromogenic immunohistochemistry to identify the glial cell populations in patient tumor resections and ImageJ to analyze percent coverage of staining for each glial population. With these techniques we are able to better describe the glial cells throughout regions of the glioma tumor microenvironment.

This protocol was developed to quantitatively identify tumor microenvironment components in glioblastoma patient resections using chromogenic immunohistochemistry and ImageJ.

Hasta Glioblastoma Rezeksiyonlarında Hücresel Mikro Çevrenin Kantitatif İmmünohistokimyası

With the growing interest in the tumor microenvironment, we set out to develop a method to specifically determine the microenvironment components within ...

Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia selectively), when combined with IBA1 (which provides an exceptional visualization of their morphology), allows investigation of changes in density, distribution, and morphology. Quantifying these parameters is important in providing insights into the roles exerted by microglia, the resident macrophages of the brain. Under normal physiological conditions, microglia are regularly distributed in a mosaic-like pattern and present a small soma with ramified processes. Nevertheless, as a response to environmental factors (i.e., trauma, infection, disease, or injury), microglial density, distribution, and morphology are altered in various manners, depending on the insult. Additionally, the described double-staining method allows visualization of infiltrating macrophages in the brain based on their expression of IBA1 and without colocalization with TMEM119. This approach thus allows discrimination between microglia and infiltrating macrophages, which is required to provide functional insights into their distinct involvement in brain homeostasis across various contexts of health and disease. This protocol integrates the latest findings in neuroimmunology that pertain to the identification of selective markers. It also serves as a useful tool for both experienced neuroimmunologists and researchers seeking to integrate neuroimmunology into projects.

This protocol describes a step-by-step workflow for immunofluorescent costaining of IBA1 and TMEM119, in addition to analysis of microglial density, distribution, and morphology, as well as peripheral myeloid cell infiltration in mouse brain tissue.

Fare Beyninde Mikroglial Yoğunluk, Morfoloji ve Periferik Miyeloid Hücre Infiltrasyonu Analizi için IBA1 ve TMEM119 Kullanılarak İmmünofloresanS Boyama

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within cells. Neurochemical phenotyping of functionally identified neurons usually requires concurrent labelling with multiple antibodies (targeting protein) using immunohistochemistry (IHC) and optimization of in situ hybridization (targeting RNA), in tandem. A &#34;neurochemical signature&#34; to characterize particular neurons may be achieved however complicating factors include the need to verify FISH and IHC targets before combining the methods, and the limited number of RNAs and proteins that may be targeted simultaneously within the same tissue section.
Here we describe a protocol, using both fresh frozen and fixed mouse brain preparations, which detects multiple mRNAs and proteins in the same brain section using RNAscope FISH followed by fluorescence immunostaining, respectively. We use the combined method to describe the expression pattern of low abundance mRNAs (e.g., galanin receptor 1) and high abundance mRNAs (e.g., glycine transporter 2), in immunohistochemically identified brainstem nuclei.
Key considerations for protein labelling downstream of the FISH assay extend beyond tissue preparation and optimization of FISH probe labelling. For example, we found that antibody binding and labelling specificity can be detrimentally affected by the protease step within the FISH probe assay. Proteases catalyze hydrolytic cleavage of peptide bonds, facilitating FISH probe entry into cells, however they may also digest the protein targeted by the subsequent IHC assay, producing off target binding. The subcellular location of the targeted protein is another factor contributing to IHC success following FISH probe assay. We observed IHC specificity to be retained when the targeted protein is membrane bound, whereas IHC targeting cytoplasmic protein required extensive troubleshooting. Finally, we found handling of slide-mounted fixed frozen tissue more challenging than fresh frozen tissue, however IHC quality was overall better with fixed frozen tissue, when combined with RNAscope.

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

This protocol describes a method for combining fluorescence in situ hybridization (FISH) and fluorescence immunohistochemistry (IHC) in both fresh frozen and fixed mouse brain sections, with the goal of achieving multilabel FISH and fluorescence IHC signal. IHC targeted cytoplasmic and membrane attached proteins.

Multipleks Floresan In Situ Hibridizasyonun Floresan İmmünohistokimya ile Taze Dondurulmuş veya Sabit Fare Beyin Kesitlerinde Birleştirilmesi

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within ...

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple neurological diseases. Studying human microglia in health and disease represents a challenge due to the extremely limited supply of human cells. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from human individuals can be used to circumvent this barrier. Here, it is demonstrated how to differentiate human iPSCs into microglia-like cells (iMGs) for in vitro experimentation. These iMGs exhibit the expected and physiological properties of microglia, including microglia-like morphology, expression of proper markers, and active phagocytosis. Additionally, documentation for isolating and labeling synaptosome substrates derived from human iPSC-derived lower motor neurons (i3LMNs) is provided. A live-cell, longitudinal imaging assay is used to monitor engulfment of human synaptosomes labeled with a pH-sensitive dye, allowing for investigations of iMG's phagocytic capacity. The protocols described herein are broadly applicable to different fields that are investigating human microglia biology and the contribution of microglia to disease.

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

This protocol describes the differentiation process of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into microglia-like cells for in vitro experimentation. We also include a detailed procedure for generating human synaptosomes from iPSC-derived lower motor neurons that can be used as a substrate for in vitro phagocytosis assays using live-cell imaging systems.

İnsan Mikroglia Benzeri Hücreler: İnsan Sinaptozomları Kullanılarak İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden ve In Vitro Canlı Hücre Fagositoz Analizinden Farklılaşma

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...

Sinaptik Materyallerin Mikroglial Yutulması için Akış Sitometrisi Tabanlı Testler

Quantification of Microglial Engulfment of Synaptic Material Using Flow Cytometry

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this process; however, currently available methods for identifying microglial engulfment of synapses, such as immunohistochemistry (IHC) and imaging, are laborious and time-intensive. To address this challenge, herein we present in vitro and in vivo* assays that allow fast and high-throughput quantification of microglial engulfment of synapses using flow cytometry.
In the in vivo* approach, we performed intracellular vGLUT1 staining following fresh cell isolation from adult mouse brains to quantify engulfment of vGLUT1+ synapses by microglia. In the in vitro synaptosome engulfment assay, we used freshly isolated cells from the adult mouse brain to quantify the engulfment of pHrodo&#160;Red-labeled synaptosomes by microglia. These protocols together provide a time-efficient approach to quantifying microglial engulfment of synapses and represent promising alternatives to labor-intensive image analysis-based methods. By streamlining the analysis, these assays can contribute to a better understanding of the role of microglia in synaptic refinement in different disease models.

Yazar Spotlight: Psikonöroimmünolojide Teknolojik Yenilikler Yoluyla Anlayışı Geliştirme

Here we present two protocols to quantify microglial engulfment of vGLUT1-positive synapses and pHRodo&#160;Red-labeled crude synaptosomes using flow cytometry.

Akış Sitometrisi Kullanılarak Sinaptik Materyalin Mikroglial Yutulmasının Miktar Tayini

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this ...

ImageJ kullanarak doku hazırlanan immünhistokimya Photomicrographs üzerinden Microglia morfoloji miktarının

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

Fare Kraniyofacial dokularda ve Undecalcified kemik doku hazırlama ve Immünostasyon

Bir yutulma Deneyi: CNS Fagositler ve nöronlar arasındaki etkileşimi değerlendirmek için bir protokol

Fare Glokomda Konfokal Oftalmoskopik Görüntüleme ve Hücre morfometrisi: Nörodejenerasyonda sırasında Retina Mikroglial Aktivasyonu Vivo Dynamics

Hasta Glioblastoma Rezeksiyonlarında Hücresel Mikro Çevrenin Kantitatif İmmünohistokimyası

Fare Beyninde Mikroglial Yoğunluk, Morfoloji ve Periferik Miyeloid Hücre Infiltrasyonu Analizi için IBA1 ve TMEM119 Kullanılarak İmmünofloresanS Boyama

Multipleks Floresan In Situ Hibridizasyonun Floresan İmmünohistokimya ile Taze Dondurulmuş veya Sabit Fare Beyin Kesitlerinde Birleştirilmesi

İnsan Mikroglia Benzeri Hücreler: İnsan Sinaptozomları Kullanılarak İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden ve In Vitro Canlı Hücre Fagositoz Analizinden Farklılaşma

Akış Sitometrisi Kullanılarak Sinaptik Materyalin Mikroglial Yutulmasının Miktar Tayini

Akış Sitometrisi Kullanılarak Sinaptik Materyalin Mikroglial Yutulmasının Miktar Tayini