Burada, kesitli malzemelerdeki proteinler üzerinde immünoresans tespiti için basit protokolümüzü sıyoruz. Bu yöntem antijen alma gerektirmez. Fare kafaları kullanacağız, dekalsif edilmemiş sert dokular da dahil.
Bu tekniğin en büyük avantajı sert dokuların antijen alımı ve kireçlenme sini atlamaktır. Bunlar iyi bir immünboyama sonuçları nın kalitesine yol açar. Bu yöntem aynı zamanda hem zaman hem de emek tasarrufu sağlar.
Bu yöntem, uygun modifikasyonları olan diğer dokular için de geçerlidir. Dekalsified dokulardan güzel bölümler yapmak için, daha fazla çevreleyen dokuları kırpma küçülme hedef doku incelemek ve gerekirse kriyokoruma önce iki gün boyunca dört derece santigrat% 10 EDTA ile örnekleri tedavi. Görsel gösteri, bu yöntemin prosedürünün ayrıntılı ve net bir açıklamasını sağlar.
Başlamak için, her hamile fare için her kuyuda PBS'de %4 PFA'dan oluşan 10 santimetrelik ve PBS içeren birkaç adet 3,5 santimetrelik tabak hazırlayın ve hepsini buza koyun. Hamile farelerden embriyoları incelemek için, forceps ile ötenazi bir farenin göbek merkezinin altındaki deri kapmak, sadece deri ile kesilmiş, ve sonra yavaşça altta yatan karın kas duvarından ayırmak için deri çekin. Deri kesi aynı satırı takip, karın boşluğu içine kesilmiş.
Bir dizi embriyo içeren rahmi çıkarın. Sonra, yavaşça yumurta kesesi ve amnion gibi ekstraembriyonik dokuları kaldıracaktır rahim duvarı, keserek embriyoları çıkarın. Her embriyodan başı kesin ve izole edin ve forcep'ler ile her kafa %4 PFA içeren 12 kuyulu bir plakanın ayrı bir kuyusuna aktarın.
Dört saat boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yat. PBS'deki kafaları dört santigrat derecede 12 saat boyunca hafifçe sallayarak durula. Kafaları kriyokorumak için, pbs%30 sakaroz iki mililitre içeren yeni bir 12-well plaka içine forceps kullanarak aktarın.
Başları çanak altına batana kadar dört derece santigrat nazik ajitasyon ile kuluçka. Kriyokorunmuş kafaları yerleştirmek için, bunları Optimal Kesme Sıcaklık Bileşiği içeren bir kalıba aktarın ve birkaç dakika boyunca dengeleyin. Forceps kullanarak, numunelerin yerini ve yönünü, numunelerin kesilmiş tarafının gömme kalıbının altına dönük olacak şekilde ayarlayın.
Daha sonra, donmak için kuru buz üzerine kalıp yerleştirin ve kriyosectioning için hazır olana kadar eksi 80 santigrat derece bir plastik torbada saklayın. Doğum sonrası doku için, bir ötenazi deri ve yağ dokuları çıkardıktan sonra, üç hafta üç aylık fare, kesilmiş ve baş izole ve mandibula kaldırmak. Sonra, düzeltmek ve embriyo kafaları ile yapılan baş kriyoprotect.
EKIM embriyo başkanları gibi benzer bir şekilde% 8 jelatin gömmek ve kriyosectioning kadar eksi 80 santigrat derece bir plastik torbada Cryomolds tutun. Uygun kriyostat sıcaklığını ayarlayın. Kriyostat sıcaklığına denk gelmek için numuneleri yaklaşık 30 dakika kriyostat odasına yerleştirin.
Cryomold'dan numuneyle birlikte bloğu çıkarın ve numunenin kesilmiş tarafını chuck'tan en uzakta ve operatöre bakacak şekilde tutup, numunenin kesilmiş tarafını tutmak için bir OCT damlası ile numunenin üzerine monte edin ve dondurun. Bloyostat nesne tutucuüzerine blok monte chuck yükleyin. Bıçak tutucuyu, bıçak açısının örneğe göre 3-5 derece olacak şekilde ayarlayın.
Kaplamalı mikroskop slaytlar üzerine 10 mikrometre bölümleri toplayın. Bölümleri tamamen kuruyana kadar oda sıcaklığında bırakın ve eksi 80 derecede saklayın. Boyama ile başlamak için, eksi 80 santigrat derece slaytlar çıkarmak ve bölümleri hava-kurutmak için bir saat oda sıcaklığında tutun.
Oct'yi yıkamak ve bölümleri permeabilize etmek için slaytları her biri beş dakika boyunca üç kez %0,1 PBST'de durulayın. Her slayta 200 mikrolitre bloklama çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatın. Ardından, slaydı durulamadan engelleme çözümlerini kaldırın.
Her slayt için engelleme çözeltisi seyreltilmiş birincil antikor 100 mikrolitre ekleyin ve dört santigrat derece gecede kuluçka. Slaytları oda sıcaklığında 10 dakika boyunca pbs ile üç kez durulayın. Bloklama çözeltisinde seyreltilmiş 100 mikrolitre ikincil antikor ekleyin ve ışıktan korunan oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın.
PBS'de her biri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca üç kez durulayın, hala ışıktan korunun. Slaytları monte etmek için, her slayta DAPI ile iki damla solmaya karşı orta ekleyin, kapak kapağını bir kapak la kaplayın ve görüntüye hazır olana kadar dört derece santigrat derecede saklayın. Kontrol embriyolarının frontal kemikleri pSmad1/5/9, downstream BMP sinyal faktörleri ve hücre proliferasyonu belirteci Ki67 pozitifti.
Nöral krest spesifik, konstitutively aktive BMPR1A mutant embriyolar, ancak, ki67 düzeyleri azalmış iken pSmad1/5/9 düzeyleri artırıldı. Ayrıca mutant embriyoların ön kemiklerinde kontrol embriyolarına göre daha fazla apoptotik hücre gözlenmiştir. Jelatin gömülü kafaların koronal kriyokesitleri, burun kemiği ve burun dokularında bulunan bir tdTomato kasetinden gfp sinyali ve RFP sinyalini açıkça göstererek jelatinin floresan sinyalleri etkilemediğini gösterir.
Bu kesitler SOX9 veya Osterix ve E11/Podoplanin için immünosüllere büründüğünde, üç haftalık sert dokuların çoğundan kaliteli kesitler elde edildi. Öte yandan, üç aylık örneklerle, femur, burun dokuları ve kafatasının trabeküler bölmesi de dahil olmak üzere sert dokuların sadece bazılarında nazal-premaxilla sütür ve başın çevresindeki kemikler de dahil olmak üzere kaliteli bölümler elde edilebildi. SOX9-pozitif hücreler özellikle büyüme plakası kondrositlerinde ve femur ve nazal septumdan eklemde saptandı.
Üç haftalık kesici dişlerde mezenkimal hücrelerde SOX9 saptırıldı. Osterix ve E11 çift boyama sonuçları Osteoblastlarda Osterix saptandığını, E11'in ise femur ve baş kemik osteositlerinde saptandığını göstermektedir. Üç haftalık kesici dişlerde Osterix odontoblastlarda pozitif, folikül mezenkimal hücrelerinde E11 pozitifti.
Lütfen %4 PFA ile numuneleri aşırı düzeltmeyin. Jelatinde çözülmemiş sert dokuların kesiti için en iyi sıcaklık eksi 25 santigrat derece ve daha düşüktür. Bu prosedürü takiben, floresan düzeyleri protokolümüzde açıklandığı gibi ölçülebilir.
Bu ölçümler, farklı gruplar arasındaki protein ingöreceli düzeyinin farkını göstermek için bilgilendirici veriler sağlayacaktır. Bu teknik, geliştirildikten sonra farklı proteinlerin ortak ifade kalıplarını elde etmek için çift veya üçlü boyamanın önünü açmıştır. %4 PFA tehlikelidir.
Bu cilt alerjileri neden olabilir, ciddi göz hasarı, organ hasarları, veya kanser. Lütfen kişisel koruyucu ekipmanlar kullanın ve kullanımdan sonra cildi iyice yıkayın.
