Bu eser kısmen Mary E. Konkle ve Michael A. Menze Ulusal Bilim Vakfı Hibe CHE-160944 tarafından finanse edildi.

1. hücre kültürü
<ol><li>İnsan hepatosellüler karsinom (HepG2) Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) bir hücre kültür kuluçka 37 ° C'de % 10 fetal Sığır serum (FBS) ve ek yüzeylerde (10 mM glikoz, 2 mM glutamin ve 1 mM pyruvate) içeren hücrelerde korumak (%5 CO2 , % 95 hava, nem oranı %100). Not: Yukarıdaki DMEM formülasyonu DMEM basınçlırespirometri ve diferansiyel için sonraki adımda başvurulduğunda kullanın.</li>
	<li>1 x 106 hücre plaka başına 100 mm Kültür plaka ve alt kültür onları her 7 gün % 90 confluency ulaşan önce hücreleri ve orta her 3-4 gün yenilemek.</li>
	<li>Hücreleri % 60-80 birleşmesi olduğunuzda deneyler gerçekleştirin.</li>
</ol>2. Respirometer ve Kalorimetresi hazırlanması
<ol><li>Damlalıklı DMEM 2,2 mL respirometer odasına tıpa tam olarak yerleştirin ve optimum oksijen difüzyon--dan soluduğumuz hava orta için izin vermek için tıpa spacer aracıyla ayarlayın.</li>
	<li>Oksijen konsantrasyonu (mavi İzle) ve oksijen akı (kırmızı izle) stabildir kadar sürekli olarak 37 ° C'de karıştırın. Respirometer'ın yazılım ortamının deneyde kullanılan oksijen çözünürlük için hesap için programlanmıştır olun. Not: Farklı oksijen çözünürlük katsayıları farklı ortama sahip (Örneğin, DMEM 0,92 =).</li>
	<li>Stabilizasyon odası açık DMEM içinde oksijen konsantrasyonunun sonra oksijen konsantrasyonu izleme istikrarlı bir bölümünü seçmek ve % 100 hava doygunluk için kalibre.</li>
	<li>%0 oksijen oksijensiz odasında olmadığı durumlarda oksijen konsantrasyonu izleme istikrarlı bir bölümünü seçmek için kalibre edin. 20 µL titrasyon 230 mM sodyum dithionite veya tüm oksijen bir deney sonunda biyolojik örnek tarafından tüketilen sonra sonra bu adımı gerçekleştirin.</li>
	<li>Respirometer % 100 hava kalibrasyonu sonra tıpa kapatın ve hava kabarcığı yok odasında mevcut olduğundan emin olun. Not: oksijen akı hafif bir artış kapalı odasında polarographic oksijen sensörü (POS) oksijen kısmi basıncı ölçmek için oksijen tüketir tespit edilecektir.</li>
	<li>~ 10 dk sonra kapalı olmak tıpa, istikrarlı oksijen akı gözlemleyerek respirometer HepG2 hücreler için hazır olduğundan emin olun. Not: burada kullanılan Kalorimetresi paslanmaz çelik ampul kullanır ve bir referans olarak kullanmak üzere bir ampul gerektirir.</li>
	<li>2,5 mL H2O (dH2O) [eşit birim örnekleri (adım 4) olarak] Kalorimetresi başvuru ampul ekleyin ve pense kullanarak kap sıkın. Bir hava akımı ile mühürlü ampul temiz ve yavaşça Kalorimetresi referans kanal 1 konumuna ampul indirin. Biyolojik örnek hazırlanan kadar 1 konumunda kalır.</li>
</ol>3. HepG2 hücre basınçlırespirometri ve hazırlık Kalorimetre
<ol><li>Respirometer ve Kalorimetresi hazırlanan ve kalibre onaylayın. Sıcak DMEM ve tripsin 37 ° c su banyosu içinde.</li>
	<li>Bir taze 100-mm plaka ve yer orta CO2 ve sıcaklık için denge sağlamak için kuluçka DMEM ekleyin. Not: uygun birim kullanılacak ampul sayısına bağlıdır Bu orta Kalorimetre deneme için kullanılacaktır.</li>
	<li>Bir ters ışık mikroskobu ile onaylamak hücreleri 60-%80 birleşmesi, 100 mm plaka 2 x 10 mL ile Oda sıcaklığında fosfat tamponlu tuz (PBS) sonra yıkayın.</li>
	<li>37 ° C tripsin 3 mL hücreleri 100-mm plakasına eklemek ve onları 7-10 dk 37 ° c hücre kültür kuluçka için kuluçkaya. Tripsin 37 ° C DMEM 3 mL ile etkisiz hale getirin ve yavaşça o ~ 20 kez 5 mL damlalıklı ile pipetting tarafından askıya alma.</li>
	<li>Resuspended hücre DMEM ve tripsin 6 mL steril 15 mL konik tüp içine aktarmak ve hücre Pelet bozmadan sıvı 5 dk 175 x g. az kaldırmak için santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Hücre Pelet ~ 5 ml damlalıklı hücreler iyice emin olmak için-yeterince ayrışmış birbirinden ve DMEM resuspend.</li>
	<li>~ 100 µL iyi karışık örnek kaldırmak ve hücrelerin toplam sayısını belirlemek için bir hemasitometre tüm 8 alanları kullanan bir kapsamlı hücre sayısı gerçekleştirin. Sonra hücrelerin resuspension için ses ~ 2 x 50 µL başına 106 hücre oluşturmak için hesaplamak. Not: Bu 2 x 106 hücre respirometer ile en az orta yerinden her odası eklenir garanti eder.</li>
	<li>175 x g. Resuspend, 5 min için hücreleri hesaplanan hacmine DMEM adım 3.7 Pelet santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Hacimli (Bu ~ 50 µL olmalıdır) respirometer odasında başına 2 x 106 hücre enjekte etmek için gerekli belirlemek için bir hücre sayısı gerçekleştirin. Respirometric ölçüm için hücreleri buza hazır kadar saklayın.</li>
	<li>Konsantre hücre örneği buza olmakla birlikte, 1 x 105 hücre/mL Kalorimetre için bir konsantrasyon üretmek için gerekli seyreltme belirlemek.</li>
	<li>Örnek karıştırın ve ~ 3 mL 1 x 105 hücre/mL DMEM, hücrelerin her ampul için hazırlanın. Not: numune dilüsyonu için kullanılan DMEM 3.3 adımda hazırlanan dengelenmiş orta olmalıdır.</li>
</ol>4. Kalorimetre
<ol><li>Kalorimetresi bilgisayara doğru bağlandığından ve µW calorimetric sinyal gözlemlenebilir ve kararlı olduğundan emin olun.</li>
	<li>Ampul kapağı ve orta gaz difüzyon için izin vermek için 1 x 105 hücre/mL (~2.5 x 105 hücreleri) her ampul yeterli hava sağlamak için hücrelerin 2.5 mL arasındadır ekleyin.</li>
	<li>Hemen pense kullanarak kap sıkın. Dış herhangi bir enkaz kaldırmak için hava akımı kullanarak kapalı ampul temiz ve yavaşça Kalorimetresi 1 konumlandırmak için ampul indirin. Yazmak zaman ampul 1 konumuna indirilir.</li>
	<li>Ampul pozisyonu 1 15 dakika oturup izin. Not: Bu 15 dk süresince, respirometer (5. adım) enjekte edilir hücrelerdir. Bu CR oranı belirlendiğinde zaman aynı aralığı ısı üretimi ve oksijen tüketimi için kullanılmasını sağlar.</li>
	<li>1 konumundaki 15 dk sonra yavaşça başvuru ve örnek ampul pozisyonu 2 için indirin. Zaman ampul indirdi ve ölçmek için en az 30 dakika kayıt.</li>
</ol>5. basınçlırespirometri
<ol><li>Ampul Kalorimetresi 1 konumunda olduğu 15 dk aralığında respirometric çalışmaları başlar.</li>
	<li>Hücre örnek homojen bir çözüm sağlamak ve enjekte pipetting tarafından mix iyice < 50 µL ~ 2 x 106 hücreler/odası son bir konsantrasyon için respirometer her odası içine hücre örneği. Hücreleri respirometer enjekte edilir zaman kaydetmek.</li>
	<li>Enjeksiyon sonra HepG2 hücreler sürekli olarak 37 ° C'de kıpırdandı Oksijen akışı ve oksijen konsantrasyonu sürekli bir düşüş her iki sabitleme için en az 20-30 dakika bekleyin.</li>
	<li>Ekranın sağ O2 akı V başına sekmesinde seçin ve oksijen akı istikrarlı bir bölümünü vurgulayın. İşaretleri, sonra istatistikler ve O2 akı V başına kayıt verilerini seçin. Bu kayıt CR oranı hesaplanmasında kullanılır. Not: 5.5 ve 5.6 isteğe bağlı adımlardır. Sızıntı solunum ve maksimal edilişi solunum oligomycin ve FCCP titrations tarafından açıklanacak.</li>
	<li>4 mg/mL oligomycin 1 µL her odanın içine enjekte etmek ve izin ~ oksijen akı sabitleme 10 dakikadır. Oligomycin eklenmesinden sonra oksijen akı izleme istikrarlı bir kısmını vurgulayarak 5,4 içinde gerçekleştirilen numaralı adımları izleyerek kayıt istikrarlı sızıntı Solunum oranı.</li>
	<li>2-µL enjeksiyonları 0.2 bırakmak için oksijen akı sabitleme sonra her enjeksiyon mm FCCP her odasına titre. Maksimal akı ulaşılıncaya kadar titrations sonraki FCCP titrasyon hafif bir düşüş tarafından belirtildiği şekilde devam edin. Kayıt sırasında maksimum akı istikrarlı Solunum oranı.</li>
</ol>6. Calorespirometric oranı hesaplanması
<ol><li>Son hücre sayısı itibariyle hazırlanan numunelerin gerçekleştirmek ~ 1 x 105 hücre/mL ampul (2.5 mL) eklendi hücreleri toplam sayısını belirlemek için bir hemasitometre tüm 8 alanları kullanan.</li>
	<li>Bir süre için kayıt ölçümleri Kalorimetresi ve en istikrarlı sinyalleri aynı zamanlarda mevcut respirometer belirlemek. Ampul 2 ve respirometer içine hücre enjeksiyon zaman konumuna düşürdü kaydedilen saat başvuru.</li>
	<li>Isı üretim adım ve hızlı µW/milyon hücre olarak belirlenen zamanda saygın ampul için ısı çıktısını görüntüleme izleme üzerinde imleci yerleştirerek kaydedin. Oksijen tüketimi veri toplamak ve sağlamak pmol O2 s-1 milyon hücre x x olarak ifade edilir.</li>
	<li>CR oranı hesaplamak için önce µW kJ/s için dönüştürmek ve sonra O2/s kJ/mol O2ifade edilen CR oranı elde etmek için mol üzerinde kJ/s bölebilirsiniz. Not: CR oranı kJ/mol O2içinde sunulur. (bkz. <a href="/files/ftp_upload/57724/JoVE_Supplemental_File.docx" target="_blank">ek dosya 1</a>)</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gnaiger, E., Kemp, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaerobic+metabolism+in+aerobic+mammalian+cells:+information+from+the+ratio+of+calorimetric+heat+flux+and+respirometric+oxygen+flux.">Anaerobic metabolism in aerobic mammalian cells: information from the ratio of calorimetric heat flux and respirometric oxygen flux.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1016, 328-332 (1990).</li><li>Barros, N., Gallego, M., Feijoo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+the+specific+rate+of+catabolic+activity+(Ac)+from+the+heat+flow+rate+of+soil+microbial+reactions+measured+by+calorimetry:+significance+and+applications.">Calculation of the specific rate of catabolic activity (Ac) from the heat flow rate of soil microbial reactions measured by calorimetry: significance and applications.</a> Chemistry &amp; Biodiversity. 1, 1560-1568 (2004).</li><li>Cheney, M. A., Fiorillo, R., Criddle, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbicide+and+estrogen+effects+on+the+metabolic+activity+of+Elliptio+complanata+measured+by+calorespirometry.">Herbicide and estrogen effects on the metabolic activity of Elliptio complanata measured by calorespirometry.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 118, 159-164 (1997).</li><li>Wadso, L., Hansen, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calorespirometry+of+terrestrial+organisms+and+ecosystems.">Calorespirometry of terrestrial organisms and ecosystems.</a> Methods. 76, 11-19 (2015).</li><li>Gnaiger, E., Woakes, A. J., Grieshaber, M. K., Bridges, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+energetics+at+very+low+oxygen:+information+from+calorimetry+and+respirometry.">Animal energetics at very low oxygen: information from calorimetry and respirometry.</a> Strategies for Gas Exchange and Metabolism. , 149-171 (1991).</li><li>Barros, N., Hansen, L. D., Pineiro, V., Perez-Cruzado, C., Villanueva, M., Proupin, J., Rodriguez-Anon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+calorespirometric+ratios+of+soil+microbial+metabolism.">Factors influencing the calorespirometric ratios of soil microbial metabolism.</a> Soil Biology and Biochemistry. 92, 221-229 (2016).</li><li>Menze, M. A., Chakraborty, N., Clavenna, M., Banerjee, M., Liu, X. H., Toner, M., Hand, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+preconditioning+of+cells+with+AICAR-riboside:+improved+cryopreservation+and+cell-type+specific+impacts+on+energetics+and+proliferation.">Metabolic preconditioning of cells with AICAR-riboside: improved cryopreservation and cell-type specific impacts on energetics and proliferation.</a> Cryobiology. 61, 79-88 (2010).</li><li>Webb, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Calorimetry. , (1985).</li><li>Neven, L. G., Lehrman, N. J., Hansen, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+and+modified+atmospheres+on+diapausing+5th+instar+codling+moth+metabolism.">Effects of temperature and modified atmospheres on diapausing 5th instar codling moth metabolism.</a> Journal of Thermal Biology. 42, 9-14 (2014).</li><li>Brueckner, D., Solokhina, A., Krahenbuhl, S., Braissant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+application+of+tunable+diode+laser+absorption+spectroscopy+and+isothermal+micro-calorimetry+for+calorespirometric+analysis.">A combined application of tunable diode laser absorption spectroscopy and isothermal micro-calorimetry for calorespirometric analysis.</a> Journal of Microbiological Methods. 139, 210-214 (2017).</li><li>Hasan, S. M. K., Manzocco, L., Morozova, K., Nicoli, M. C., Scampicchio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ascorbic+acid+and+light+on+reactions+in+fresh-cut+apples+by+microcalorimetry.">Effects of ascorbic acid and light on reactions in fresh-cut apples by microcalorimetry.</a> Thermochimica Acta. 649, 63-68 (2017).</li><li>Criddle, R. S., Fontana, A. J., Rank, D. R., Paige, D., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+metabolic+heat+rate,+CO2+production,+and+O2+consumption+by+microcalorimetry.">Simultaneous measurement of metabolic heat rate, CO2 production, and O2 consumption by microcalorimetry.</a> Analytical Biochemistry. 194, 413-417 (1991).</li><li>Criddle, R. S., Breidenbach, R. W., Rank, D. R., Hopkin, M. S., Hansen, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+calorimetric+and+respirometric+measurements+on+plant-tissues.">Simultaneous calorimetric and respirometric measurements on plant-tissues.</a> Thermochimica Acta. 172, 213-221 (1990).</li><li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+respirometry:+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle.">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).</li><li>Grimm, D., Altamirano, L., Paudel, S., Welker, L., Konkle, M. E., Chakraborty, N., Menze, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+cellular+energetics+by+galactose+and+pioglitazone.">Modulation of cellular energetics by galactose and pioglitazone.</a> Cell and Tissue Research. , (2017).</li><li>Hansen, L. D., Macfarlane, C., McKinnon, N., Smith, B. N., Criddle, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+calorespirometric+ratios,+heat+per+CO2+and+heat+per+O2,+to+quantify+metabolic+paths+and+energetics+of+growing+cells.">Use of calorespirometric ratios, heat per CO2 and heat per O2, to quantify metabolic paths and energetics of growing cells.</a> Thermochimica Acta. 422, 55-61 (2004).</li><li>Chinet, A., Clausen, T., Girardier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcalorimetric+determination+of+energy+expenditure+due+to+active+sodium-potassium+transport+in+the+soleus+muscle+and+brown+adipose+tissue+of+the+rat.">Microcalorimetric determination of energy expenditure due to active sodium-potassium transport in the soleus muscle and brown adipose tissue of the rat.</a> The Journal of Physiology. 265, 43-61 (1977).</li><li>Paul, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+biochemical+energy+balance+during+an+isometric+tetanus+and+steady+state+recovery+in+frog+sartorius+at+0+degree+C.">Physical and biochemical energy balance during an isometric tetanus and steady state recovery in frog sartorius at 0 degree C.</a> Journal of General Physiology. 81, 337-354 (1983).</li><li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+cells.">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li><li>Kemp, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+calorimetric-respirometric+ratio+in+studying+intermediary+metabolism+of+cultured+mammalian+cells.">Importance of the calorimetric-respirometric ratio in studying intermediary metabolism of cultured mammalian cells.</a> Thermochimica Acta. 172, 61-73 (1990).</li><li>Kola, I., Landis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+pharmaceutical+industry+reduce+attrition+rates?.">Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates?.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-715 (2004).</li><li>Kamalian, L., Chadwick, A. E., Bayliss, M., French, N. S., Monshouwer, M., Snoeys, J., Park, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utility+of+HepG2+cells+to+identify+direct+mitochondrial+dysfunction+in+the+absence+of+cell+death.">The utility of HepG2 cells to identify direct mitochondrial dysfunction in the absence of cell death.</a> Toxicology in Vitro. 29, 732-740 (2015).</li><li>Rossignol, R., Gilkerson, R., Aggeler, R., Yamagata, K., Remington, S. J., Capaldi, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+substrate+modulates+mitochondrial+structure+and+oxidative+capacity+in+cancer+cells.">Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells.</a> Cancer Research. 64, 985-993 (2004).</li><li>Fontana, A. J., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W., Criddle, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcalorimetric+measurement+of+aerobic+cell-metabolism+in+unstirred+cell-cultures.">Microcalorimetric measurement of aerobic cell-metabolism in unstirred cell-cultures.</a> Thermochimica Acta. 172, 105-113 (1990).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Kantitatif metabolik aktivite aerobik ve anaerobik yolları katkıları değerlendirmek ve hücresel enerji akı bileşik bir görünümünü elde etmek için calorespirometry hedefidir. Bu ısı dağılımı ve oksijen akı hesaplanan CR oranı eşdeğer teorik oxycaloric ile karşılaştırılması ardından eşzamanlı bir ölçü tarafından gerçekleştirilir. Birkaç önemli adımlar için tekrarlanabilir ve güvenilir verileri dikkate alınmalıdır. Steril, sağlıklı hücre kültürü bakımından önemlidir. K...

Biyolojik sistemlerde, ısı-yayın veya entalpisi metabolizma sırasında genellikle değişimdir ya doğrudan izlenir (üzerinden doğrudan Kalorimetre) ya da dolaylı olarak O2 tüketimi ve/veya CO2 üretim (via basınçlırespirometri) aracılığıyla. Bu teknikler yalıtım modunda kullanıldığında, ne yazık ki, önemli bilgileri, hücre metabolizması anaerobik yolları katkısını gibi kaybolur. Calorespirometry ısı dağılımı ve solunum eş zamanlı ölçüm dayanır güçlü bir tekniktir. Calorespirometric iş öncü tam oksijenli memeli hücrelerinde anaerobik metabolizma incelenmiş ve eş zamanlı enerji homeostazı olmak dönüştürülmüş hücrelerin rağmen aerobik ve anaerobik yolları katkılarıyla gösterdi bir tam olarak oksijenli ortamı1. Calorespirometry beri çok çeşitli biyolojik sorular uygulanmıştır. Bazı örnekler, düşük oksijen düzeyde hayvan enerji bilimi çalışma, solungaçları bivalvia, karasal organizmaların metabolizma ve organik toprak madde2, mikrobiyal ayrışma herbisit ve östrojen etkileri 3 , 4 , 5 , 6. Ayrıca calorespirometry sahip hücreleri7donma önce ortaya nasıl metabolik Önkoşullanma memeli dondurma geliştirir. Her yaklaşım, diferansiyel ve basınçlırespirometri, hücresel ve organizma bioenergetics ile ilgili bilgilerimizi bağımsız olarak artmıştır. Ancak, calorespirometry kullanılarak yanıtlanabilir temel biyolojik soru nispeten keşfedilmemiş kalır.
Hess'ın hukuk bir reaksiyon toplam entalpi değişimine ilk ve son durumlar arasındaki yolun bağımsız olduğunu belirtir. Örneğin, toplam entalpi değişimi biyokimyasal bir yol için yol içinde bütün tepkiler enthalpies değişikliği toplamı olduğunu. Kalorimetre gelişigüzel aerobik ve anaerobik yolları algılar hücresel ısı üretim ölçmek için gerçek zamanlı bir yaklaşım sunmaktadır. Bu hiçbir enerji sistem dışında deneysel ampul8duvarları üzerinden değiştirilir temel üzerine dayanır. Isı dağılımı bir değişiklik değişiklik tüm metabolik reaksiyonlar ampul içinde serbest entalpi eşittir. Böylece, negatif bir entalpi ısı kaybına yol sistemden karşılıklı olarak ilişkilendirir. Son dört yılda ayrıntılı araştırma katabolizma ve Anabolizma termodinamik peyzaj karakterize. Bu araştırma makaleleri arama terimleri "biyolojik" ve "tarafından Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Kütüphane, tıp (NLM) Ulusal Sağlık Enstitüleri (PubMed) adlı dizine gibi Kalorimetre" altında bulunan sürekli bir artış ile temsil edilir. Arama bundan önce 1970, toplam 27 yayınlar başvuru biyolojik Kalorimetre ortaya koymaktadır; Bu arada, 2016 yılında 546 yayınlar tekniği kullanılmıştır.
Isı üretim belirlemek için kurulan calorimetric yöntemlerdir. Ancak, daha fazla esneklik respirometric değer çözmek için verilir. Respirometric ölçüm O2, CO2, ya da hem O2 ve CO2bileşiminden oluşabilir. Ayrıca, O2 veya CO2 ölçüm optrodes, Clark-tip elektrotlar ve akort diyot lazer soğurma spektroskopisi7,9,10 dahil olmak üzere çeşitli teknikler tarafından gerçekleştirilebilir ,11. CO2 üretim birçok respirometric çalışma içinde değerli bir ölçü olsa da, kültürlü hücreler için orta bikarbonik tampon sistemi pH kontrolü12,13kez kullanır. Bikarbonat sisteminde CO2 ölçü komplikasyonları önlemek için tek respirometric parametre olarak O2 hücre kültüründe calorespirometry için aşağıdaki iletişim kuralı kullanır.
Oksijen akı ölçme ile eşzamanlı, belirli respirometers ( Tablo malzemelerigörmek) mitokondriyal işlev detaylı değerlendirmeler için tasarlanmıştır. Substrat-uncoupler-inhibitörü-titrations (SUIT) protokolleri iyi kurulmuş ve membran potansiyeli veya reaktif oksijen türleri (ROS) oluşumu14ölçmek için tasarlanmış deneyler ile uyumlu değildir. Calorespirometry sağlam hücre için sunulan Protokolü karbonil siyanür-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) ve F0F1-ATP sentaz inhibitörü oligomycin gibi kimyasal uncouplers getirilmesi ile uyumludur. FCCP ek, oksijen tüketimi mitokondrial performans15potansiyel tedavi etkisini değerlendirmek yararlı olan ATP üretimden edilişi olabilir. Ayrıca, oligomycin eklenmesi sızıntı solunum ölçüde aydınlatır. Böylece, calorespirometry sırasında gerçekleştirilen respirometric ölçümleri mitokondrial fizyolojisi daha fazla aydınlatmak için tasarlanmış kapsamlı iletişim kuralları ile uyumludur.
Isı dağılımı ve oksijen akışı eş zamanlı ölçüm calorespirometric (CR) oranı hesaplanması için sağlar. Bu oran, daha sonra Thornton's sabit veya-430 bağlı olarak hücre satır veya doku ilgi-480 kJ mol-1 için ve desteklenmiştir karbon yüzeyler1, arasında değişmektedir teorik oxycaloric eşdeğer, karşılaştırılır 16. böylece daha olumsuz bir CR oranı artan anaerobik yolları genel olarak metabolik aktivite katkıları ortaya koymaktadır. Örneğin, rutin kas doku solunum çalışmalarının etkin performans olmadan CR oranı-448-468 kJ mol-1'e hangi teorik oxycaloric eşdeğer17,18aralıkta arasında değişmektedir. Bu arada, memeli kanser hücreleri glikoz yüksek orta kültürlü glikoliz aşağıdaki gelişmiş laktik asit fermantasyonu görüntülemek ve nispeten düşük mitokondrial nişan19. Bu fenotip anaerobik yolları daha olumsuz CR oranları1,7tarafından belirtildiği gibi hücresel metabolizma artan katılımı gösteren-800 kJ mol-1,-490 sonuçlarını CR oranları aralığı içinde 16,20.
Ticari ve kar amacı gütmeyen hücre ve doku distribütörler Şu anda insanların yaklaşık 4.000 hücre hatları ile 150 türler'den fazla teklif hücre hatları türetilmiş. Ölümsüzleştirdi hücre satırlarını hızlı bir şekilde birçoğu mitokondrial fonksiyonları ile doğrudan veya dolaylı olarak engel olabilecek potansiyel therapeutics toksisitesi değerlendirmek için uygun araçlardır. Dönüştürülmüş hücrelerin uyuşturucu tarama sırasında kullanarak sınırlı değeri kısmen Warburg etkisi nedeniyle, birçok kanser damgasını olabilir. Çoğu zaman, kanser ATP substrat düzeyinde fosforilasyon oluşturmak ve tam aerobik koşullar19altında mitokondri çekici olmadan laktat üretim ile redoks dengesini korumak. İlaç geliştirme Rootkitler pahalı ve verimsiz, yaklaşık 8 9 bileşikler için başaramadığı Pazar onay21insan klinik çalışmalarda test dışarı ile. Potansiyel tedavi nedeniyle düşük sitotoksisite başlangıç tarama hücre hatlarında geçebilir, bu bazı bu bileşiklerin mitotoxic vardır mümkündür. Nasıl bu toksinler Warburg etkisi görüntülenmez primer hücre enerji dengede zarar olabilir algılamak için uygun yöntemi kritik bilgi kez, tedavi edici gelişme erken aşamalarında darboğaz aşırı baktı.
Calorespirometry biyolojik örnekleri, hücre ve dokulara da dahil olmak üzere çeşitli metabolik etkinliğini çözümlemeye pratik, invaziv olmayan bir yaklaşımdır. Sunulan Protokolü özünü bir uygulama yelpazesi ile uyumludur. Bir sorun, ancak, tespit edilmiştir. Ölümsüzleştirdi hücreleri genellikle potansiyel mitotoxins22hücrelere duyarlı için Oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) enerji üretiminde katkısını artırmak için galaktoz ile takıma glikoz-Alerjik ortamda kültürlü, 23. Bu metabolik yeniden programlama örnekleri Kalorimetresi15tarafından kullanılan paslanmaz çelik ampul yerleştirildiğinde analiz belirsiz görünüyor. Birkaç saat için yüksek metabolik faaliyete girişme hücreleri glikoz ortamda kültürlü devam. Bu arada, galaktoz ortamda kültürlü hücreleri ısı üretim yerleri erken deneysel zaman puan için sınırlı ölçümler yaparak ampul içinde 30 dk içinde azaltın. Bu davranış, ne yazık ki, onların hücresel proliferasyonu değerlendirme imkanı engeller. Belirli bu sınırlamaya rağmen çoğu uygulama calorespirometric analizi ile uyumludur ve bu yaklaşımla ayrıntılı metabolik bilgi elde edilebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="627">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HepG2 Cells</td>
			<td style="width:125px;">American Type Culture Collection</td>
			<td style="width:119px;">HB-8065</td>
			<td style="width:167px;">Cells used for calorespirometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">O2k-Respirometer</td>
			<td style="width:125px;">Oroboros Instruments</td>
			<td style="width:119px;">10022-02</td>
			<td>Respirometer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LKB 2277 thermal activity monitor (TAM)</td>
			<td style="width:125px;">Thermometric AB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Thermometric was purchased by TA Instruments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11360070</td>
			<td>100x solution added to DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum - Premiuim Select</td>
			<td style="width:125px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S11550</td>
			<td>Added to 10% in DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsn-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25200072</td>
			<td>Cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes</td>
			<td style="width:125px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">O4876</td>
			<td>Mitochondrial Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td style="width:125px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2920</td>
			<td>Mitochondrial Uncoupler</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td style="width:125px;">Corning Corporation</td>
			<td style="width:119px;">430167</td>
			<td>Tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glucose, powder</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15023021</td>
			<td>Glucose for DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Galactose, powder</td>
			<td style="width:125px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP656500</td>
			<td>Galactose for DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Glutamine for DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMEM, no glucose</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11966025</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

calorespirometry: a powerful, noninvasive approach to investigate cellular energy metabolism

Temel biyolojik ve Biyomedikal araştırmalarda kullanılan birçok hücre çizgiler aerobik ve anaerobik solunum bir birleşimi yoluyla enerji homeostazı korumak. Ancak, hangi hücresel enerji üretim yatay olarak her iki yolları katkıda ölçüde sürekli olarak gözden olduğunu. Dönüştürülmüş hücrelerin glikoz düzeyleri genellikle doyurarak kültürlü azalmış bir bağımlılık Oksidatif fosforilasyon artış substrat düzeyinde fosforilasyon tarafından telafi olduğu ATP üretimi için göster. Metabolik dengeyi bu vardiyada mitokondrial toksinlerin varlığı rağmen çoğalırlar hücreleri sağlar. Değiştirilmiş metabolik dengeyi dönüştürülmüş hücrelerin ihmal, bir ilaç tarama sonuçlarından beri misinterpreted potansiyel olarak mitotoxic etkileri modeli hücre satırları huzurunda yüksek glikoz kültürlü kullanarak algılanmayabilir konsantrasyonları. Bu protokol iki güçlü teknikleri, basınçlırespirometri ve hücresel ATP üretimi aerobik ve anaerobik katkılar nicel ve noninvaziv değerlendirilmesi için sağlayan Kalorimetre, eşleştirme açıklar. Aerobik ve anaerobik solunum Kalorimetre izlenen yolu ile olabilir ısı üretir. Bu arada, oksijen tüketim hızı ölçüm aerobik solunum ölçüde değerlendirebilirsiniz. Isı dağılımı ve oksijen tüketimi aynı anda ölçülen zaman calorespirometric oranı belirlenebilir. Deneysel olarak elde edilen değer o zaman teorik oxycaloric eşdeğer karşılaştırılabilir ve anaerobik solunum ölçüde değerlendirilecektir. Böylece, calorespirometry biyolojik sorular, ilaç geliştirme, mikrobiyal büyüme ve normoxic ve hipoksik koşullar altında temel bioenergetics de dahil olmak üzere geniş bir analiz etmek için benzersiz bir yöntem sağlar.

Calorespirometric ölçümler tekrarlanabilirlik doğru ve tutarlı numune hazırlama üzerinde bağlıdır. Tabakları büyümüş, hücre sayımları topaklanma nedeniyle yanlış olabilir gibi hücre kültürü hazırlanan örnekleri kullanılmamalıdır. Ayrıca, düşük ısı akışı sınırlı substrat difüzyon olmalı hücrelerdeki nedeniyle oluşabilir. Bu nedenle, yapışık hücreleri kullanırken, % 60-80 arasında confluency ile bir kalıbı seçin ve orta deneme önce 24 saat değiştirmek için çok öne...

Watch this Scientific Journal Video about Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism at JoVE.com

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Calorespirometry: Hücresel enerji metabolizması araştırmak için bir güçlü, invaziv olmayan bir yaklaşım

Bu iletişim kuralı calorespirometry, ısı dağılımı ve enerji metabolizmasını değerlendirmek için invaziv olmayan bir yaklaşım sağlar solunum yolu tarif etmek ve aynı anda ölçümü anlatılmaktadır. Bu teknik enerji kullanımı aerobik ve anaerobik yolları katkısı toplam hücresel enerji akışı izleyerek değerlendirmek için kullanılır.

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

calorespirometry-powerful-noninvasive-approach-to-investigate

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.5K Görüntüleme.  University of Louisville. Bu iletişim kuralı calorespirometry, ısı dağılımı ve enerji metabolizmasını değerlendirmek için invaziv olmayan bir yaklaşım sağlar solunum yolu tarif etmek ve aynı anda ölçümü anlatılmaktadır. Bu teknik enerji kullanımı aerobik ve anaerobik yolları katkısı toplam hücresel enerji akışı izleyerek değerlendirmek için kullanılır.

Video: Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

Üç Boyutlu İnsan Cilt Model Yeniden İnşa: Aracı Normal Cilt ve Melanom İlerleme Eğitim

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Biyomühendislik

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Devirli Basınç Biyoreaktör Tasarım Ex vivo</emAort Kalp Vanalar> Eğitim

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do not have suitable autologous donor vessels due to disease progression or previous harvest. The aim of vascular tissue engineering is to develop a suitable alternative source for these bypass grafts. In addition, engineered vascular tissue may prove valuable as living vascular models to study cardiovascular diseases. Several promising approaches to engineering blood vessels have been explored, with many recent studies focusing on development and analysis of cell-based methods.2-5 Herein, we present a method to rapidly self-assemble cells into 3D tissue rings that can be used in vitro to model vascular tissues.
To do this, suspensions of smooth muscle cells are seeded into round-bottomed annular agarose wells. The non-adhesive properties of the agarose allow the cells to settle, aggregate and contract around a post at the center of the well to form a cohesive tissue ring.6,7 These rings can be cultured for several days prior to harvesting for mechanical, physiological, biochemical, or histological analysis. We have shown that these cell-derived tissue rings yield at 100-500 kPa ultimate tensile strength8 which exceeds the value reported for other tissue engineered vascular constructs cultured for similar durations (&lt;30 kPa).9,10 Our results demonstrate that robust cell-derived vascular tissue ring generation can be achieved within a short time period, and offers the opportunity for direct and quantitative assessment of the contributions of cells and cell-derived matrix (CDM) to vascular tissue structure and function.

This article outlines a versatile method to create cell-derived tissue rings by cellular self-assembly. Smooth muscle cells seeded into ring-shaped agarose wells aggregate and contract to form robust three-dimensional (3D) tissues within 7 days. Millimeter-scale tissue rings are conducive to mechanical testing and serve as building blocks for tissue assembly.

Hücresel Self-Meclis Biyomekanik Analizi ve Doku Mühendisliği, Hücre-Türetilmiş Doku Yüzüklerin Üretiyor yönelik

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be validated for predictive purposes. Ideally such systems would be low volume, which precludes sampling and destructive analyses when time course data are to be obtained. What is needed is an in situ monitoring tool which can report the necessary information in real-time and noninvasively. An interesting option is the use of fluorescent, protein-based in vivo biological sensors as reporters of intracellular concentrations. One particular class of in vivo biosensors that has found applications in metabolite quantification is based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorescent proteins connected by a ligand binding domain. FRET integrated biological sensors (FIBS) are constitutively produced within the cell line, they have fast response times and their spectral characteristics change based on the concentration of metabolite within the cell. In this paper, the method for constructing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines that constitutively express a FIBS for glucose and glutamine and calibrating the FIBS in vivo in batch cell culture in order to enable future quantification of intracellular metabolite concentration is described. Data from fed-batch CHO cell cultures demonstrates that the FIBS was able in each case to detect the resulting change in the intracellular concentration. Using the fluorescent signal from the FIBS and the previously constructed calibration curve, the intracellular concentration was accurately determined as confirmed by an independent enzymatic assay.

A description of how to calibrate F&#246;rster Resonance Energy Transfer integrated biological sensors (FIBS) for in situ metabolic profiling is presented.&#160;The FIBS can be used to measure intracellular levels of metabolites noninvasively aiding in the development of metabolic models and high throughput screening of bioprocess conditions.

Noninvaziv metabolik profil FIBS etkin

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data

Modern 3D electron microscopy approaches have recently allowed unprecedented insight into the 3D ultrastructural organization of cells and tissues, enabling the visualization of large macromolecular machines, such as adhesion complexes, as well as higher-order structures, such as the cytoskeleton and cellular organelles in their respective cell and tissue context. Given the inherent complexity of cellular volumes, it is essential to first extract the features of interest in order to allow visualization, quantification, and therefore comprehension of their 3D organization. Each data set is defined by distinct characteristics, e.g., signal-to-noise ratio, crispness (sharpness) of the data, heterogeneity of its features, crowdedness of features, presence or absence of characteristic shapes that allow for easy identification, and the percentage of the entire volume that a specific region of interest occupies. All these characteristics need to be considered when deciding on which approach to take for segmentation.
The six different 3D ultrastructural data sets presented were obtained by three different imaging approaches: resin embedded stained electron tomography, focused ion beam- and serial block face- scanning electron microscopy (FIB-SEM, SBF-SEM) of mildly stained and heavily stained samples, respectively. For these data sets, four different segmentation approaches have been applied: (1) fully manual model building followed solely by visualization of the model, (2) manual tracing segmentation of the data followed by surface rendering, (3) semi-automated approaches followed by surface rendering, or (4) automated custom-designed segmentation algorithms followed by surface rendering and quantitative analysis. Depending on the combination of data set characteristics, it was found that typically one of these four categorical approaches outperforms the others, but depending on the exact sequence of criteria, more than one approach may be successful. Based on these data, we propose a triage scheme that categorizes both objective data set characteristics and subjective personal criteria for the analysis of the different data sets.

The bottleneck for cellular 3D electron microscopy is feature extraction (segmentation) in highly complex 3D density maps. We have developed a set of criteria, which provides guidance regarding which segmentation approach (manual, semi-automated, or automated) is best suited for different data types, thus providing a starting point for effective segmentation.

Voksellerden Gönderen Bilgi için: Kompleks Elektron Mikroskopi 3D-Data Bölümlere Göre Pratik Rehber

Modern 3D electron microscopy approaches have recently allowed unprecedented insight into the 3D ultrastructural organization of cells and tissues, ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar Gradient Difüzyon Sistemi 3D Kollajen Matrix Kemotaksis Araştırma

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular cartilage impairs its load-bearing function substantially as it experiences tremendous chemical degradation, i.e. proteoglycan loss and collagen fibril disruption. One promising way to investigate chemical damage mechanisms during OA is to expose the cartilage specimens to an external solute and monitor the diffusion of the molecules. The degree of cartilage damage (i.e. concentration and configuration of essential macromolecules) is associated with collisional energy loss of external solutes while moving across articular cartilage creates different diffusion characteristics compared to healthy cartilage. In this study, we introduce a protocol, which consists of several steps and is based on previously developed experimental micro-Computed Tomography (micro-CT) and finite element modeling. The transport of charged and uncharged iodinated molecules is first recorded using micro-CT, which is followed by applying biphasic-solute and multiphasic finite element models to obtain diffusion coefficients and fixed charge densities across cartilage zones.

We propose a protocol to investigate the transport of charged and uncharged molecules across articular cartilage with the aid of recently developed experimental and numerical methods.

Deneysel ve Sonlu Eleman Protokolü Eklem Kıkırdak genelinde Nötr ve Yüklü Çözünenlerin Ulaştırma Araştırma

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources

Studies in the field of microbiology rely on the implementation of a wide range of methodologies. In particular, the development of appropriate methods substantially contributes to providing extensive knowledge of the metabolism of microorganisms growing in chemically defined media containing unique nitrogen and carbon sources. In contrast, the management through metabolism of multiple nutrient sources, despite their broad presence in natural or industrial environments, remains virtually unexplored. This situation is mainly due to the lack of suitable methodologies, which hinders investigations.
We report an experimental strategy to quantitatively and comprehensively explore how metabolism operates when a nutrient is provided as a mixture of different molecules, i.e., a complex resource. Here, we describe its application for assessing the partitioning of multiple nitrogen sources through the yeast metabolic network. The workflow combines information obtained during stable isotope tracer experiments using selected 13C- or 15N-labeled substrates. It first consists of parallel and reproducible fermentations in the same medium, which includes a mixture of N-containing molecules; however,a selected nitrogen source is labeled each time. A combination of analytical procedures (HPLC, GC-MS) is implemented to assess the labeling patterns of targeted compounds and to quantify the consumption and recovery of substrates in other metabolites. An integrated analysis of the complete dataset provides an overview of the fate of consumed substrates within cells. This approach requires an accurate protocol for the collection of samples&#8211;facilitated by a robot-assisted system for online monitoring of fermentations&#8211;and the achievement of numerous time-consuming analyses. Despite these constraints, it allowed understanding, for the first time, the partitioning of multiple nitrogen sources throughout the yeast metabolic network. We elucidated the redistribution of nitrogen from more abundant sources toward other N-compounds and determined the metabolic origins of volatile molecules and proteinogenic amino acids.

This protocol describes an experimental procedure to quantitatively and comprehensively investigate the metabolism of multiple nutrient sources. This workflow, based on a combination of isotopic tracer experiments and an analytical procedure, allows the fate of consumed nutrients and the metabolic origin of molecules synthetized by microorganisms to be determined.

Birden çok besin kaynaklarının mikrobiyal metabolizma araştırmaya izotopik izleyici deneyler kombinasyonuna göre iş akışı

Studies in the field of microbiology rely on the implementation of a wide range of methodologies. In particular, the development of appropriate methods ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

Çoğaltılmış yapay hücresel MicroEnvironment dizi imalatı

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and allostasis. Moreover, dysregulated protease activity drives pathogenesis and is a functional biomarker of diseases such as cancer; therefore, the ability to detect protease activity in vivo may provide clinically relevant information for biomedical diagnostics. The goal of this protocol is to create nanosensors that probe for protease activity in vivo by producing a quantifiable signal in urine. These protease nanosensors consist of two components: a nanoparticle and substrate. The nanoparticle functions to increase circulation half-life and substrate delivery to target disease sites. The substrate is a short peptide sequence (6-8 AA), which is designed to be specific to a target protease or group of proteases. The substrate is conjugated to the surface of the nanoparticle and is terminated by a reporter, such as a fluorescent marker, for detection. As dysregulated proteases cleave the peptide substrate, the reporter is filtered into urine for quantification as a biomarker of protease activity. Herein we describe construction of a nanosensor for matrix metalloproteinase 9 (MMP9), which is associated with tumor progression and metastasis, for detection of colorectal cancer in a mouse model.

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are tightly regulated enzymes involved in fundamental biological processes, and dysregulated protease activity drives progression of complex diseases such as cancer. This method&#39;s goal is to create nanosensors that measure protease activity in vivo by producing a cleavage signal that is detectable from host urine and discriminates disease.

Nanosensors için noninvaziv tanı koyma proteaz aktivitesi Vivo tespit

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...