この仕事の一部メアリー é. Konkle とマイケル ・ a. Menze に国立科学財団助成金チェ 160944 によって資金を供給されました。

1. 細胞培養
<ol><li>ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 細胞文化のインキュベーターで 37 ° C で 10% 牛胎児血清 (FBS)、追加基板 (10 mM グルコース、グルタミン、2 mM と 1 mM ピルビン酸) を含む人間の肝細胞癌 (hepg2 細胞) 細胞を維持 (5 %co2、95% の空気、湿度 100%)。 注: は、DMEM が呼吸と熱量測定の後の手順で参照される上記 DMEM の定式化を使用します。</li>
	<li>1 x 106細胞をプレートあたりセル 100 mm の板を文化とサブカルチャーそれらすべて 7 日または 90% の confluency に達する前に、媒体ごとに 3-4 日を更新します。</li>
	<li>セルが 60-80% 合流実験を実行します。</li>
</ol>2. 呼吸度計、熱量計の準備
<ol><li>呼吸室に DMEM の 2.2 mL ピペットで移しなさい完全にストッパーを挿入、中に空気から最適な酸素の拡散を実現するストッパー スペーサー ツールで調整。</li>
	<li>(ブルー トレース) の酸素濃度、酸素流量 (赤のトレース) が安定するまで、37 ° C で継続的にかき混ぜます。実験で使用中の酸素溶解度を考慮して呼吸のソフトウェアをプログラムを確認します。 注: 別のメディアがある別の酸素溶解度係数 (例えば、DMEM 0.92 を =)。</li>
	<li>商工会議所を開き DMEM で酸素濃度の安定化は後、酸素濃度トレースの安定した部分を選択し、100% の空気飽和のためにそれを校正します。</li>
	<li>0% 酸素室で酸素がないとき酸素濃度トレースの安定した部分を選択するために校正します。20 μ L の滴定実験の終わりに生物学的サンプルですべての酸素が消費された後の 230 mM 亜ジチオン酸ナトリウムの後、この手順を実行します。</li>
	<li>100% の空気の呼吸度計のキャリブレーション後ストッパーを閉じ泡が商工会議所に存在しないことを確認します。 注: 酸素流量のわずかな増加として検出される密閉チャンバーのポーラロ グラフ法による酸素センサー (POS) の酸素分圧を測定するために酸素を消費します。</li>
	<li>閉じられているストッパーの ~ 10 分後安定した酸素流量を観察することによって呼吸度計を HepG2 細胞の準備ができているを確認します。 注: ここで使用される熱量計ステンレス アンプルを利用し、1 アンプルの参照として使用することが必要です。</li>
	<li>カロリメータの参照アンプルに 2.5 mL H2O (dH2O) の [サンプル (ステップ 4) と等しいボリューム] を追加し、必要に応じて、ペンチを使用してキャップを締めます。気流のある密封されたアンプルをきれいにし、熱量計の参照チャネルの 1 の位置にアンプルをゆっくりと下ろします。位置 1 まで生物的サンプルを用意しています。</li>
</ol>3. HepG2 細胞の呼吸と熱量測定のための準備
<ol><li>計、熱量計の準備し、校正を確認します。暖かい DMEM そして 37 の ° C の水浴中にトリプシン。</li>
	<li>新鮮な 100 mm プレートと CO2と温度の両方のための媒体の平衡を許可するインキュベーターで場所に DMEM を追加します。 注: 適切なボリュームに使用するアンプル数によって異なりますので、この媒体は熱量測定実験のため使用されます。</li>
	<li>セルは、60-80% 合流、その後洗って 100 mm プレート室温リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 10 mL を 2 倍を倒立顕微鏡で確認します。</li>
	<li>細胞の 100 mm プレートを 37 ° C トリプシンの 3 mL を加えるし、細胞文化のインキュベーターで 37 ° C で 7-10 分間インキュベートします。37 ° C DMEM の 3 mL のトリプシンを中和し、5 mL のピペットを使い、優しく 〜 20 回ピペッティング システムそれによって中断します。</li>
	<li>滅菌 15 mL の円錐管に DMEM およびトリプシンの再懸濁細胞の 6 mL を転送し、175 x g に 5 分は細胞ペレットを乱すことがなく液体を削除、それを遠心分離します。</li>
	<li>〜 5 mL DMEM とセルを万全にそれが十分に互いから分離したピペットで細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>十分に混合されたサンプルの ~ 100 μ L を削除し、セルの合計数を決定するための診断のすべての 8 のフィールドを利用した徹底的な細胞数を実行します。〜 50 μ L あたり 10 の6セル × 2 を生成するために、細胞の再懸濁のボリュームを計算します。 注: これは 2 × 106セルが最小限の中変位計の各商工会議所に追加されている保証されます。</li>
	<li>細胞を再懸濁します 175 x g. で 5 分間遠心分離機の DMEM ステップ 3.7 から計算される量のペレット。</li>
	<li>(これは 〜 50 μ L をする必要があります) 呼吸の商工会議所あたり 2 × 106細胞を注入するために必要なボリュームを決定するセル数を実行します。氷の準備ができるまで進入します。 測定用セルを格納します。</li>
	<li>濃縮細胞サンプルは、氷の上は、熱量測定の 1 x 10 の5セル/mL の濃度を生成するために必要な希釈を決定します。</li>
	<li>サンプルをよく混ぜ、それぞれアンプルの DMEM で 1 x 10 の5セル/mL で細胞の 〜 3 mL を準備します。 注: サンプル希釈用 DMEM は 3.3 の手順で調製した平衡の培地をする必要があります。</li>
</ol>4. 熱量測定
<ol><li>熱量計は、コンピューターに接続されている μ で熱量の信号が観察可能な安定したことを確認します。</li>
	<li>各アンプルに 1 x 105セル/ml (~2.5 x 105細胞) 細胞の 2.5 mL を追加、アンプルの蓋とガスの拡散を許可する媒体の間は十分な空気を確保します。</li>
	<li>すぐに必要に応じて、ペンチを使用して、キャップを締めます。密封されたアンプルは、空気の流れを使用して任意の外部の破片を削除するをきれいにし、熱量計の 1 の位置にアンプルをゆっくりと下ろします。アンプルは 1 の位置に下がる時間を記録します。</li>
	<li>15 分の 1 の位置に座っているアンプルを許可します。 注: この 15 分間は、細胞呼吸 (手順 5) に注入されるべきです。これにより、CR の比率が決定するときに、熱発生量と酸素消費量の時間の同じ間隔を使用します。</li>
	<li>位置 1 で 15 分後のリファレンスとサンプルの両方のアンプル 2 の位置までゆっくりと下ろします。時間、アンプルが引き下げられると、少なくとも 30 分のための測定を記録します。</li>
</ol>5. 呼吸
<ol><li>アンプルがカロリメータの位置 1 は 15 分間隔、中に進入します研究を開始します。</li>
	<li>同種のソリューションを確認し注入ピペッティングにより細胞サンプルを徹底的にミックス < ~ 106セル/室 × 2 の最終濃度計の各チャンバーに細胞サンプルを 50 μ l 添加します。呼吸度計に細胞を注入時間を記録します。</li>
	<li>HepG2 細胞を継続的に 37 ° C で攪拌注入後酸素流量と酸素濃度の安定した減少の両方安定化のため、少なくとも 20 〜 30 分を待ちます。</li>
	<li>画面の右上あたり V O2フラックスタブを選択し、酸素流量の安定した部分を強調表示。マーク、統計、および V 当たり O2フラックスのレコード データを選択します。この記録は、CR 率の計算に使用されます。 注: 5.5、5.6 の手順はオプションです。漏れの呼吸と最大の共役呼吸オリゴマイシンおよび FCCP の滴定によって明らかにされます。</li>
	<li>各チャンバーに 4 mg/mL オリゴマイシンの 1 μ L を注入でき 〜 酸素のフラックスの安定化のため 10 分。以下の手順でレコードの安定したリーク呼吸オリゴマイシン添加後酸素フラックス トレースの安定した部分を強調することによって 5.4 で実行されます。</li>
	<li>0.2 mM の FCCP 各商工会議所に各投与後酸素フラックス安定化を可能にする 2 μ L 注入を滴定しなさい。最大磁束に到達するまで、後続 FCCP 滴定のわずかな低下によって示されるように、滴定を続けます。最大磁束中安定した呼吸を記録します。</li>
</ol>6. Calorespirometric 比の計算
<ol><li>作製したサンプルの最後のセルの数を数えるため 〜 1 x 10 の5セル/mL アンプル (2.5 mL) に追加されるセルの合計数を決定するための診断のすべての 8 のフィールドを活用しました。</li>
	<li>熱量計法と安定した信号が同じ時間に存在する計から測定を記録する時間を決定します。アンプルは位置 2 と呼吸度計にセルの注入の時間に低下したときに記録された時間を参照します。</li>
	<li>ステップと μ/100万セルとして急行を決められた時点で尊敬のアンプルの熱出力を表示するトレースの上にカーソルを置くと、熱生産を記録します。酸素消費量データを収集し、pmol O2倍の 100万個 x s-1として表現されることを確認します。</li>
	<li>CR の比率を計算するために μ を kJ/秒に変換し、kJ/mol O2として表される CR 比を取得する O2/s の mol 以上 kJ/s を分割します。注: CR 率は kJ/mol O2で提示されます。 (<a href="/files/ftp_upload/57724/JoVE_Supplemental_File.docx" target="_blank">補足のファイル 1</a>を参照してください)</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gnaiger, E., Kemp, R. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcalorimetric+measurement+of+aerobic+cell-metabolism+in+unstirred+cell-cultures.">Microcalorimetric measurement of aerobic cell-metabolism in unstirred cell-cultures.</a> Thermochimica Acta. 172, 105-113 (1990).</li></ol>

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Calorespirometry の目的は、好気性と嫌気性代謝経路の貢献を定量的に評価し、細胞のエネルギー流束の複合ビューを取得することです。これは、熱放散と同等理論 oxycaloric の計算の CR 率の比較に続いて酸素流量の同時測定で。いくつかの重要なステップは、再現性のある信頼性の高いデータの考慮されなければなりません。滅菌、健康な細胞培養のメンテナンスが重要です。細菌や真菌による?...

生物学的システム、代謝時に熱リリースまたはエンタルピーの変更は通常直接どちらかを監視 (を介して直接熱量測定) または間接的 O2消費量や CO2の生産 (呼吸) を経由。残念ながら、単独でこれらのテクニックを使用すると、重要な情報が失われます、嫌気性細胞の代謝経路の貢献など。Calorespirometry は、放熱と呼吸の両方の同時測定に依存する強力な手法です。完全に酸素の哺乳類細胞の嫌気性代謝を検討した calorespirometric 仕事を開拓し、にもかかわらず中トランス ホーム細胞のエネルギー恒常性する好気性と嫌気性経路の同時の貢献を実証します。完全に酸素環境1。Calorespirometry は、さまざまな生物学的質問にから適用されています。いくつかの例は、低酸素レベルで動物のエネルギー論の研究、二枚貝、地上の生物の代謝と有機質土壌物質2,の微生物分解のえらに及ぼす除草剤とエストロゲンの両方3,4,5,6。 さらに、calorespirometry は7細胞の哺乳類の凍結凍結する前に明らかにしたどのように代謝前処理向上。それぞれのアプローチは、熱量測定および呼吸、細胞と個体の生体エネルギーの私達の知識は個別に増加しました。ただし、calorespirometry を使用して答えることができる基本的な生物学的質問比較的未踏のままです。
ヘスの法則の反作用の合計エンタルピー変化は初期と最終状態の間の経路に依存しません。たとえば、生化学的経路の合計エンタルピー変更は、経路内のすべての反作用のエンタルピーの変更の合計です。熱量測定は、無差別に好気性と嫌気性の両方の経路を検出する細胞熱生産を測定するためのリアルタイムのアプローチを提供しています。これは実験アンプル8の壁を通ってを除く、システムでエネルギーは交換されません基盤に基づいています。放熱の変更は、アンプルのすべての代謝反応からリリース エンタルピーの変更と同じです。したがって、負のエンタルピーは、システムからの熱の損失に関連します。過去 4 年間の徹底的な研究は、異化と同化の熱力学的景観を特徴としています。これは、検索用語「生物」と「熱量」インデックスによってアメリカ合衆国国立図書館の医学 (NLM) 健康の国民の協会 (PubMed) で研究の記事の安定した上昇によって表されます。検索は合計 27 の文書参照の生物学的熱量測定; 1970 年前にことを明らかに一方、単独で 2016 年 546 出版物利用技術です。
熱量測定法は、熱生産を決定する確立されています。ただし、進入します。 値を解決するためより多くの柔軟性が与えられます。進入します。 測定は、O2CO2、または O2と CO2の両方で構成できます。さらに、O2 ・ CO2測定は optrodes、クラーク型電極、波長可変半導体レーザー吸収分光法7,9,10 など、様々 な手法で行うことができます。、11。CO2の生産は多くの進入します研究に貴重な指標が、培養細胞用培地はしばしば pH コントロール12,13炭酸水バッファー システムを利用しています。重炭酸塩システムの CO2測定の合併症を避けるためには、培養細胞の calorespirometry の次のプロトコルは、唯一の進入しますパラメーターとして O2を利用しています。
酸素のフラックスの測定と並行して、特定の respirometers (材料の表を参照してください) は、ミトコンドリア機能の詳細な評価のため設計されています。基板-ランプ-阻害剤-滴定 (スーツ) プロトコルは、よく確立されるおよび膜の潜在的な反応酸素種 (ROS) の形成14を測定するために設計された実験と互換性が。そのままなセルの calorespirometry の提案するプロトコルは、化学的脱共役カルボニル シアン化物-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) と F0F1-ATP 合成酵素阻害剤オリゴマイシンなどの導入と互換性が。FCCP 添加して酸素消費量が、ミトコンドリアの性能15の潜在的な治療の影響を評価するために有用である ATP を生産から結合することができます。さらに、オリゴマイシン添加漏れ呼吸の程度が点灯します。したがって、calorespirometry の中に実行される進入します。 測定がさらにミトコンドリアの生理機能を解明するために広範なプロトコルと互換性があります。
放熱の酸素流量同時測定 calorespirometric (CR) 比の計算が可能です。この比率は、ソーントンの定数または細胞または興味の組織によって-480 kJ mol-1 -430 と補われた炭素基板1,間の範囲と同等理論 oxycaloric と比較して16. したがってより否定的な CR の比率は、全体的な代謝活動に嫌気代謝経路から増加した貢献を明らかにします。たとえば、仕事の積極的なパフォーマンスなしルーチン筋肉組織呼吸の CR 率は-448 から-468 の理論 oxycaloric 等価17,18の範囲内にある kJ mol-1 範囲します。一方、哺乳類の癌細胞は高いブドウ糖の培地で培養した解糖系に続く強化の乳酸発酵を表示、ミトコンドリア婚約19が比較的低い。-800 kJ mol-1、嫌気性より否定的な CR 比1,7、によって示されると細胞の代謝経路の高まりの関与を示す-490 の CR 率の範囲内でこの表現型の結果 16,20。
両方の商業および非営利の細胞・組織の代理店現在ほぼ 4,000 細胞 150 種以上提供細胞は、人間から派生しました。不死化細胞株は、すぐに多くの直接または間接的を妨げるミトコンドリア機能の潜在的な治療の毒性を評価するための便利なツールです。薬剤のスクリーニング中に変換されたセルを使用して可能性があります限られた予測値の一部に Warburg 効果、多くの癌の特徴のため。多くの場合、癌は基質レベルのリン酸化から ATP を生成し、完全好気性条件19の下でミトコンドリアを雇わないで乳酸の産生を介して酸化還元バランスを維持します。医薬品開発は、悪名高い高価、非能率的で 9 化合物市場承認21を達成するために失敗した人間の臨床試験で検証中約 8 です。潜在的な治療は、細胞株の低毒性のための最初のスクリーニングを渡すことも、これらの化合物のいくつかが mitotoxic であることは可能です。これらの毒素が Warburg 効果を表示しない一次電池のエネルギー ・ バランスを損なうことができる方法を検出するための適切なメソッドがない重要な情報は過剰に見て、初期の段階で治療開発のボトルネックします。
Calorespirometry は、さまざまな細胞や組織を含む生体試料などの代謝活動を分析する実用的な非侵襲的アプローチです。提案するプロトコルのコアは、アプリケーションの範囲との互換性です。ただし、1 つの合併症が確認されています。不死化細胞は、潜在的な mitotoxins22、細胞を感作するために酸化的リン酸化 (OXPHOS) エネルギー生産のための貢献度を高めてガラクトースと補われるブドウ糖自由の培地中で培養頻繁 23。この代謝リプログラミングが熱量計15で使用されるステンレス製アンプルに配置するサンプル分析を不明瞭に表示されます。グルコース培地で培養された細胞は、いくつかの時間の高い代謝活性に従事し続けてください。一方、ガラクトース培地で培養された細胞は、測定実験早くポイントに制限を行う、アンプル内の配置の 30 分以内熱生産を減少させます。この現象は、残念ながら、彼らの細胞増殖を評価する機会を妨げています。この特定の制限にもかかわらず calorespirometric 解析と互換性のあるほとんどのアプリケーション、これにより代謝の詳細情報を取得できます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="627">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HepG2 Cells</td>
			<td style="width:125px;">American Type Culture Collection</td>
			<td style="width:119px;">HB-8065</td>
			<td style="width:167px;">Cells used for calorespirometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">O2k-Respirometer</td>
			<td style="width:125px;">Oroboros Instruments</td>
			<td style="width:119px;">10022-02</td>
			<td>Respirometer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LKB 2277 thermal activity monitor (TAM)</td>
			<td style="width:125px;">Thermometric AB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Thermometric was purchased by TA Instruments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11360070</td>
			<td>100x solution added to DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum - Premiuim Select</td>
			<td style="width:125px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S11550</td>
			<td>Added to 10% in DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsn-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25200072</td>
			<td>Cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes</td>
			<td style="width:125px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">O4876</td>
			<td>Mitochondrial Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td style="width:125px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2920</td>
			<td>Mitochondrial Uncoupler</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td style="width:125px;">Corning Corporation</td>
			<td style="width:119px;">430167</td>
			<td>Tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glucose, powder</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15023021</td>
			<td>Glucose for DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Galactose, powder</td>
			<td style="width:125px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP656500</td>
			<td>Galactose for DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Glutamine for DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMEM, no glucose</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11966025</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

calorespirometry: a powerful, noninvasive approach to investigate cellular energy metabolism

基本的な生物学的および生物医学研究で使用される多くの細胞は、好気性と嫌気性の呼吸の組み合わせによりエネルギー恒常性を維持します。ただし、両方の経路が細胞のエネルギー生産の景観に貢献する範囲は一貫して見落とさ。変換で培養された細胞のブドウ糖のレベルをしばしば飽和は、酸化的リン酸化基質レベルのリン酸化の増加によって償われる ATP の生産のために減少の依存関係を表示します。代謝の身のこなし、このシフトでは、細胞はミトコンドリア毒素の存在にもかかわらず増殖することができます。以来トランス ホーム細胞の変えられた代謝身のこなしを無視して、医薬品のスクリーニングの結果が誤って、潜在的 mitotoxic の効果が検出されないモデル高グルコースの存在下で培養のセルラインを使用して濃度。このプロトコルでは、呼吸と熱量測定、細胞 ATP を生産する好気性と嫌気性の貢献の量的で、非侵襲的評価を可能にする 2 つの強力な手法の組み合わせについて説明します。好気性と嫌気性の呼吸熱監視を介して熱量測定をすることができますを生成します。一方、酸素消費率を測定は、好気呼吸の程度を評価できます。放熱と酸素消費量の両方を同時に測定、calorespirometric 比が決定できます。理論 oxycaloric 相当に得られた実測値を比較し、ことができ、嫌気性の呼吸の程度を判断できます。したがって、calorespirometry は、医薬品開発、微生物の増殖、平地と低酸素の条件の下で基本的な生体エネルギーなど生物の質問の広い範囲を分析するユニークな方法を提供します。

Calorespirometric 測定値の再現性は、適切かつ一貫性のある試料に依存します。培養細胞から調製したサンプル使用しないでくださいプレートが大きくなり過ぎた場合細胞数は凝集のため不正確になることができます。さらに、限られた基板周辺固定支持の細胞の拡散による熱フローが発生する可能性があります。したがって、付着性のセルを使用する場合は、60-80% の confluency にプレートを選択...

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Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Calorespirometry: 細胞のエネルギー代謝を調査する強力な非侵襲的アプローチ

このプロトコルでは、calorespirometry、放熱の呼吸、エネルギー代謝を評価するために非侵襲的アプローチを提供する直接・同時測定をについて説明します。この手法は、総細胞エネルギーの流れを監視することによって好気性と嫌気性経路エネルギー利用への貢献を評価するために使用されます。

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

calorespirometry-powerful-noninvasive-approach-to-investigate

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.5K ビュー.  University of Louisville. このプロトコルでは、calorespirometry、放熱の呼吸、エネルギー代謝を評価するために非侵襲的アプローチを提供する直接・同時測定をについて説明します。この手法は、総細胞エネルギーの流れを監視することによって好気性と嫌気性経路エネルギー利用への貢献を評価するために使用されます。

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The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

三次元ヒト皮膚は、モデルを再構築：ノーマルスキンとメラノーマ進行を勉強するツールを

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

生物工学

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

のための周期的圧力のバイオリアクターの設計生体外で</em大動脈心臓弁の>研究

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do not have suitable autologous donor vessels due to disease progression or previous harvest. The aim of vascular tissue engineering is to develop a suitable alternative source for these bypass grafts. In addition, engineered vascular tissue may prove valuable as living vascular models to study cardiovascular diseases. Several promising approaches to engineering blood vessels have been explored, with many recent studies focusing on development and analysis of cell-based methods.2-5 Herein, we present a method to rapidly self-assemble cells into 3D tissue rings that can be used in vitro to model vascular tissues.
To do this, suspensions of smooth muscle cells are seeded into round-bottomed annular agarose wells. The non-adhesive properties of the agarose allow the cells to settle, aggregate and contract around a post at the center of the well to form a cohesive tissue ring.6,7 These rings can be cultured for several days prior to harvesting for mechanical, physiological, biochemical, or histological analysis. We have shown that these cell-derived tissue rings yield at 100-500 kPa ultimate tensile strength8 which exceeds the value reported for other tissue engineered vascular constructs cultured for similar durations (&lt;30 kPa).9,10 Our results demonstrate that robust cell-derived vascular tissue ring generation can be achieved within a short time period, and offers the opportunity for direct and quantitative assessment of the contributions of cells and cell-derived matrix (CDM) to vascular tissue structure and function.

This article outlines a versatile method to create cell-derived tissue rings by cellular self-assembly. Smooth muscle cells seeded into ring-shaped agarose wells aggregate and contract to form robust three-dimensional (3D) tissues within 7 days. Millimeter-scale tissue rings are conducive to mechanical testing and serve as building blocks for tissue assembly.

生体力学的解析と組織工学のための細胞由来の組織のリングを製作する監督セルラーセルフアセンブリ

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be validated for predictive purposes. Ideally such systems would be low volume, which precludes sampling and destructive analyses when time course data are to be obtained. What is needed is an in situ monitoring tool which can report the necessary information in real-time and noninvasively. An interesting option is the use of fluorescent, protein-based in vivo biological sensors as reporters of intracellular concentrations. One particular class of in vivo biosensors that has found applications in metabolite quantification is based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorescent proteins connected by a ligand binding domain. FRET integrated biological sensors (FIBS) are constitutively produced within the cell line, they have fast response times and their spectral characteristics change based on the concentration of metabolite within the cell. In this paper, the method for constructing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines that constitutively express a FIBS for glucose and glutamine and calibrating the FIBS in vivo in batch cell culture in order to enable future quantification of intracellular metabolite concentration is described. Data from fed-batch CHO cell cultures demonstrates that the FIBS was able in each case to detect the resulting change in the intracellular concentration. Using the fluorescent signal from the FIBS and the previously constructed calibration curve, the intracellular concentration was accurately determined as confirmed by an independent enzymatic assay.

A description of how to calibrate F&#246;rster Resonance Energy Transfer integrated biological sensors (FIBS) for in situ metabolic profiling is presented.&#160;The FIBS can be used to measure intracellular levels of metabolites noninvasively aiding in the development of metabolic models and high throughput screening of bioprocess conditions.

FIBS対応の非侵襲メタボリック·プロファイリング

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data

Modern 3D electron microscopy approaches have recently allowed unprecedented insight into the 3D ultrastructural organization of cells and tissues, enabling the visualization of large macromolecular machines, such as adhesion complexes, as well as higher-order structures, such as the cytoskeleton and cellular organelles in their respective cell and tissue context. Given the inherent complexity of cellular volumes, it is essential to first extract the features of interest in order to allow visualization, quantification, and therefore comprehension of their 3D organization. Each data set is defined by distinct characteristics, e.g., signal-to-noise ratio, crispness (sharpness) of the data, heterogeneity of its features, crowdedness of features, presence or absence of characteristic shapes that allow for easy identification, and the percentage of the entire volume that a specific region of interest occupies. All these characteristics need to be considered when deciding on which approach to take for segmentation.
The six different 3D ultrastructural data sets presented were obtained by three different imaging approaches: resin embedded stained electron tomography, focused ion beam- and serial block face- scanning electron microscopy (FIB-SEM, SBF-SEM) of mildly stained and heavily stained samples, respectively. For these data sets, four different segmentation approaches have been applied: (1) fully manual model building followed solely by visualization of the model, (2) manual tracing segmentation of the data followed by surface rendering, (3) semi-automated approaches followed by surface rendering, or (4) automated custom-designed segmentation algorithms followed by surface rendering and quantitative analysis. Depending on the combination of data set characteristics, it was found that typically one of these four categorical approaches outperforms the others, but depending on the exact sequence of criteria, more than one approach may be successful. Based on these data, we propose a triage scheme that categorizes both objective data set characteristics and subjective personal criteria for the analysis of the different data sets.

The bottleneck for cellular 3D electron microscopy is feature extraction (segmentation) in highly complex 3D density maps. We have developed a set of criteria, which provides guidance regarding which segmentation approach (manual, semi-automated, or automated) is best suited for different data types, thus providing a starting point for effective segmentation.

ボクセルからの知識へ：複雑な電子顕微鏡3D-データのセグメンテーションの実用ガイド

Modern 3D electron microscopy approaches have recently allowed unprecedented insight into the 3D ultrastructural organization of cells and tissues, ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

3Dコラーゲンマトリックス中の走化性を調査するために、平面グラデーション拡散システム

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular cartilage impairs its load-bearing function substantially as it experiences tremendous chemical degradation, i.e. proteoglycan loss and collagen fibril disruption. One promising way to investigate chemical damage mechanisms during OA is to expose the cartilage specimens to an external solute and monitor the diffusion of the molecules. The degree of cartilage damage (i.e. concentration and configuration of essential macromolecules) is associated with collisional energy loss of external solutes while moving across articular cartilage creates different diffusion characteristics compared to healthy cartilage. In this study, we introduce a protocol, which consists of several steps and is based on previously developed experimental micro-Computed Tomography (micro-CT) and finite element modeling. The transport of charged and uncharged iodinated molecules is first recorded using micro-CT, which is followed by applying biphasic-solute and multiphasic finite element models to obtain diffusion coefficients and fixed charge densities across cartilage zones.

We propose a protocol to investigate the transport of charged and uncharged molecules across articular cartilage with the aid of recently developed experimental and numerical methods.

実験および有限要素議定書は、関節軟骨全体で中性および荷電溶質の輸送を調査します

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources

Studies in the field of microbiology rely on the implementation of a wide range of methodologies. In particular, the development of appropriate methods substantially contributes to providing extensive knowledge of the metabolism of microorganisms growing in chemically defined media containing unique nitrogen and carbon sources. In contrast, the management through metabolism of multiple nutrient sources, despite their broad presence in natural or industrial environments, remains virtually unexplored. This situation is mainly due to the lack of suitable methodologies, which hinders investigations.
We report an experimental strategy to quantitatively and comprehensively explore how metabolism operates when a nutrient is provided as a mixture of different molecules, i.e., a complex resource. Here, we describe its application for assessing the partitioning of multiple nitrogen sources through the yeast metabolic network. The workflow combines information obtained during stable isotope tracer experiments using selected 13C- or 15N-labeled substrates. It first consists of parallel and reproducible fermentations in the same medium, which includes a mixture of N-containing molecules; however,a selected nitrogen source is labeled each time. A combination of analytical procedures (HPLC, GC-MS) is implemented to assess the labeling patterns of targeted compounds and to quantify the consumption and recovery of substrates in other metabolites. An integrated analysis of the complete dataset provides an overview of the fate of consumed substrates within cells. This approach requires an accurate protocol for the collection of samples&#8211;facilitated by a robot-assisted system for online monitoring of fermentations&#8211;and the achievement of numerous time-consuming analyses. Despite these constraints, it allowed understanding, for the first time, the partitioning of multiple nitrogen sources throughout the yeast metabolic network. We elucidated the redistribution of nitrogen from more abundant sources toward other N-compounds and determined the metabolic origins of volatile molecules and proteinogenic amino acids.

This protocol describes an experimental procedure to quantitatively and comprehensively investigate the metabolism of multiple nutrient sources. This workflow, based on a combination of isotopic tracer experiments and an analytical procedure, allows the fate of consumed nutrients and the metabolic origin of molecules synthetized by microorganisms to be determined.

複数の栄養源の微生物代謝を調査するため同位体トレーサー実験の組み合わせに基づいてワークフロー

Studies in the field of microbiology rely on the implementation of a wide range of methodologies. In particular, the development of appropriate methods ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

多重の人工細胞の微小環境配列の作製

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and allostasis. Moreover, dysregulated protease activity drives pathogenesis and is a functional biomarker of diseases such as cancer; therefore, the ability to detect protease activity in vivo may provide clinically relevant information for biomedical diagnostics. The goal of this protocol is to create nanosensors that probe for protease activity in vivo by producing a quantifiable signal in urine. These protease nanosensors consist of two components: a nanoparticle and substrate. The nanoparticle functions to increase circulation half-life and substrate delivery to target disease sites. The substrate is a short peptide sequence (6-8 AA), which is designed to be specific to a target protease or group of proteases. The substrate is conjugated to the surface of the nanoparticle and is terminated by a reporter, such as a fluorescent marker, for detection. As dysregulated proteases cleave the peptide substrate, the reporter is filtered into urine for quantification as a biomarker of protease activity. Herein we describe construction of a nanosensor for matrix metalloproteinase 9 (MMP9), which is associated with tumor progression and metastasis, for detection of colorectal cancer in a mouse model.

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are tightly regulated enzymes involved in fundamental biological processes, and dysregulated protease activity drives progression of complex diseases such as cancer. This method&#39;s goal is to create nanosensors that measure protease activity in vivo by producing a cleavage signal that is detectable from host urine and discriminates disease.

非侵襲的診断のプロテアーゼ活動In Vivo検出するナノセンサー

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...