Este trabalho foi financiado em parte pela concessão do National Science Foundation-160944 para Mary E. Konkle e Michael A. Menze.

1. cultura de pilha
<ol><li>Manter as células de carcinoma (HepG2) hepatocelular humano médio modificado águia de Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e substratos adicionais (10 mM glicose, glutamina 2 mM e piruvato de 1 mM) a 37 ° C numa incubadora de cultura celular (5% CO2 , ar de 95%, 100% de umidade). Nota: Use a formulação DMEM acima quando DMEM é referenciado em etapas posteriores para respirometria e calorimetria.</li>
	<li>Placa as células em 1 x 106 células por placa de cultura de 100mm e subcultura-las cada 7 dias ou antes de chegar a 90% de confluência e renovar o médio a cada 3-4 dias.</li>
	<li>Realize os experimentos que, quando as células são de 60-80% de Confluencia.</li>
</ol>2. preparação de Respirometer e calorímetro
<ol><li>Pipetar 2,2 mL de DMEM na câmara respirometer, tapar totalmente e ajustá-lo com a ferramenta de espaçador de rolha para permitir a difusão do ideal de oxigênio do ar para médio.</li>
	<li>Mexa continuamente a 37 ° C até que a concentração de oxigênio (traço azul) e o fluxo de oxigênio (traço vermelho) são estáveis. Certifique-se de que software a respirometer é programado para dar conta da solubilidade de oxigênio do meio utilizado no experimento. Nota: Diferentes meios de comunicação têm coeficientes de solubilidade de oxigênio diferentes (por exemplo, DMEM = 0,92).</li>
	<li>Após a estabilização da concentração de oxigênio em DMEM com a câmara aberta, selecione uma parte estável do rastreamento de concentração de oxigênio e calibrá-lo para a saturação do ar de 100%.</li>
	<li>Calibre para oxigênio de 0%, selecionando uma parte estável do rastreamento de concentração de oxigênio quando o oxigênio não está presente na câmara. Execute esta etapa após 20 titulação µ l de 230 mM ditionito de sódio ou após todo o oxigênio é consumido pela amostra biológica no final do experimento.</li>
	<li>Após a calibração de ar de 100% do respirometer, feche o bujão e certifique-se de que não há bolhas estão presentes na câmara. Nota: um ligeiro aumento no fluxo de oxigênio será detectado na câmara fechada como o sensor de oxigênio polarographic (POS) consome oxigênio para medir a pressão parcial de oxigênio.</li>
	<li>Depois de ~ 10 min da rolha sendo fechada, confirme que o respirometer está pronto para células HepG2, observando um fluxo estável de oxigênio. Nota: O calorímetro usado aqui utiliza ampola de aço inoxidável e requer uma ampola para ser usado como uma referência.</li>
	<li>Adicionar 2,5 mL de H2O (dH2O) [volume igual como as amostras (etapa 4)] para a ampola de referência do calorímetro e aperte a tampa, usando um alicate, se necessário. Limpe a ampola selada com fluxo de ar e abaixe lentamente a ampola na posição 1 no canal de referência do calorímetro. Permanecem na posição 1 até amostra biológica é preparada.</li>
</ol>3. preparação de células HepG2 para respirometria e calorimetria
<ol><li>Confirme que o respirometer e o calorímetro são preparados e calibrados. Quente DMEM e tripsina a 37 ° C em banho-maria.</li>
	<li>Adicione DMEM para uma placa de 100mm fresca e lugar na incubadora para permitir o equilíbrio do meio para CO2 e temperatura. Nota: Este meio será usado para o experimento de calorimetria, então o volume apropriado depende do número de ampolas que será usado.</li>
	<li>Confirme com um microscópio invertido que as células estão em 60-80% de confluencia, depois lave a 100mm-placa 2 x com 10 mL de temperatura fosfato salino (PBS).</li>
	<li>Adicionar 3 mL de tripsina de C a 37 ° a 100mm placa de células e incube-os por 7-10 min a 37 ° C, a incubadora de cultura de células. Neutralizar a tripsina com 3 mL de 37 ° C DMEM e suspender pipetando suavemente-~ 20 vezes com uma pipeta de 5 mL.</li>
	<li>Transferir a 6 mL de células ressuspensa em DMEM e tripsina em um tubo cônico de 15 mL estéril e centrifugue por 5 min à 175 g. x remover o líquido sem perturbar o centrifugado.</li>
	<li>Resuspenda o pellet de células em ~ 5 mL de DMEM e pipetar cuidadosamente para garantir que as células são suficientemente dissociado um do outro.</li>
	<li>Remova ~ 100 µ l da amostra bem misturada e realizar uma contagem completa de células utilizando todos os 8 campos em um hemocytometer para determinar o número total de células. Em seguida, calcule o volume para ressuspensão das células para gerar ~ 2 x 106 células por 50 µ l. Nota: Isto irá garantir que a 2 x 106 células são adicionadas a cada câmara do respirometer com deslocamento médio mínimo.</li>
	<li>Centrifugar as células durante 5 min à 175 x g. Ressuspender o sedimento do volume calculado de DMEM da etapa 3.7.</li>
	<li>Realize uma contagem de células, para determinar o volume necessário para injetar 2 x 106 células por câmara no respirometer (isto deve ser ~ 50 µ l). Armazene as células para a medição de respirometric no gelo até que esteja pronto.</li>
	<li>Enquanto a amostra concentrada de células está no gelo, determine a diluição necessária para produzir uma concentração de 1 x 105 células/mL para a calorimetria.</li>
	<li>Misturar a amostra bem e prepare-se para cada ampola ~ 3 mL de células a 1 x 105 células/mL em DMEM. Nota: O DMEM usado para a diluição da amostra deve ser o meio equilibrado, preparado na etapa 3.3.</li>
</ol>4. calorimetria
<ol><li>Garantir que o calorímetro é conectado ao computador e o sinal calorimétricos em µW é observável e estável.</li>
	<li>Adicionar 2,5 mL de células a 1 x 105 células/mL (5 células de ~2.5 x 10) para cada ampola, garantir o suficiente de ar entre a tampa da ampola e o meio para permitir a difusão do gás.</li>
	<li>Imediatamente aperte a tampa, usando um alicate, se necessário. Limpe a ampola selada, usando o fluxo de ar para remover quaisquer resíduos externos e abaixe lentamente a ampola na posição 1 do calorímetro. Registre o tempo que a ampola é abaixada na posição 1.</li>
	<li>Permitir que a ampola sentar-se na posição 1 por 15 min. Nota: Durante este período de 15 min, as células são para ser injetado o respirometer (passo 5). Isso garante que o mesmo intervalo de tempo é usado para produção de calor e consumo de oxigênio, quando a relação de CR é determinada.</li>
	<li>Após 15 minutos na posição 1, abaixe lentamente a referência e a amostra ampolas para a posição 2. Registra o tempo que as ampolas estavam abaixadas e medida pelo menos 30 min.</li>
</ol>5. respirometria
<ol><li>Durante o intervalo de 15 min em que a ampola está na posição 1 no calorímetro, começa os estudos respirometric.</li>
	<li>Misture bem a amostra de células pipetando para garantir uma solução homogénea e injetar < 50 µ l da amostra em cada câmara do respirometer para uma concentração final de ~ 2 x 106 células/câmara celular. Registre o tempo em que as células são injetadas no respirometer.</li>
	<li>Após a injeção, as células HepG2 são continuamente agitou a 37 ° C. Espere pelo menos 20-30 min para ambos uma estabilização do fluxo de oxigênio e uma diminuição constante da concentração de oxigênio.</li>
	<li>Selecione a guia de fluxo de2 O por V à direita da tela e realçar uma porção estável do fluxo de oxigênio. Selecione marcas, então as estatísticas e dados do registro para o fluxo de O2 por V. Esta gravação será usada no cálculo do rácio da CR. Nota: As etapas 5.5 e 5.6 são opcionais. Vazamento de respiração e respiração desacoplada máxima serão revelados por titulações de oligomicina e Compararia.</li>
	<li>Injetar 1 µ l de oligomicina 4mg/mL em cada câmara e permitir ~ 10 min para a estabilização do fluxo de oxigênio. Taxa de respiração vazamento estável registro seguindo as etapas executadas em 5.4 destacando uma parte estável do rastreamento de fluxo de oxigênio após adição de oligomicina.</li>
	<li>Titula-se injeções de 2 µ l de 0,2 mM Compararia em cada câmara, permitindo a estabilização de fluxo de oxigênio após cada injeção. Continue as titulações até o fluxo máximo é atingido, como indicado por um ligeiro decréscimo na titulação Compararia subsequente. A taxa de respiração estável durante o fluxo máximo de registro.</li>
</ol>6. cálculo do rácio de Calorespirometric
<ol><li>Realizar uma contagem de célula final das amostras preparadas em ~ 1 x 105 células/mL, utilizando todos os 8 campos de um hemocytometer para determinar o número total de células adicionado à ampola (2,5 mL).</li>
	<li>Determine um tempo para gravar medições do calorímetro e respirometer no qual estáveis sinais estão presentes em momentos idênticos. Referência que o tempo registrado quando a ampola foi reduzida para a posição 2 e o tempo de injeção de células para o respirometer.</li>
	<li>Grave a produção de calor, colocando o cursor sobre o rastreamento exibir a saída de calor para a ampola respeitada no momento determinado na etapa e expressa como µW/milhões de células. Coletar dados de consumo de oxigênio e certifique-se de que ele é expresso como pmol O2 x s-1 x milhões de células.</li>
	<li>Para calcular a taxa de CR, primeiro converta µW em kJ/s e depois dividir kJ/s por mol de O2/s para obter a relação de CR, expressada em kJ/mol O2. Nota: A relação do CR é apresentada em kJ/mol O2. (ver <a href="/files/ftp_upload/57724/JoVE_Supplemental_File.docx" target="_blank">arquivo complementar 1</a>)</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gnaiger, E., Kemp, R. 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Os autores não têm nada para divulgar.

O objetivo do calorespirometry é avaliar quantitativamente as contribuições das vias aeróbias e anaeróbias, a atividade metabólica e obter uma visão composta de fluxo de energia celular. Isso é realizado por uma medida simultânea de dissipação de calor e fluxo de oxigênio, seguido por uma comparação do rácio CR calculado com o equivalente de oxycaloric teórica. Vários passos críticos devem ser considerados para dados reprodutíveis e confiáveis. A manutenção de uma cultura de pilha de estéril, saud?...

Em sistemas biológicos, a libertação de calor ou entalpia de mudança durante o metabolismo normalmente é monitorado ou diretamente (via directa calorimetria) ou indiretamente através do consumo de O2 e/ou produção de CO2 (através de respirometria). Infelizmente, quando estas técnicas são utilizadas em isolamento, informação crítica é perdida, tais como a contribuição das vias anaeróbias para o metabolismo celular. Calorespirometry é uma técnica poderosa que se baseia na medição simultânea de dissipação de calor e a respiração. Calorespirometric trabalho pioneiro investigou o metabolismo anaeróbico em células de mamíferos totalmente oxigenados e demonstrado contribuições simultâneas das vias aeróbias e anaeróbias, a homeostase de energia, apesar das células transformadas em uma ambiente totalmente oxigenado1. Calorespirometry desde que foi aplicado a uma grande variedade de questões biológicas. Alguns exemplos incluem o estudo da energética animal em baixos níveis de oxigênio, os efeitos do herbicida e do estrogênio sobre as brânquias de moluscos bivalves, o metabolismo de organismos terrestres e a decomposição microbiana do solo orgânico matéria2, 3 , 4 , 5 , 6. Além disso, calorespirometry tem revelado como metabólica pré-condicionamento antes da congelação melhora a criopreservação de mamíferos células7. Cada abordagem, tanto calorimetria e respirometria, independente aumentou nosso conhecimento do celular e a Bioenergética. No entanto, questões biológicas fundamentais que podem ser respondidas através da utilização de calorespirometry permanecem relativamente inexploradas.
Lei de Hess afirma que a mudança de entalpia total de uma reação é independente do percurso entre os Estados iniciais e finais. Por exemplo, a mudança de entalpia total para uma via metabólica é o somatório da variação enthalpies de todas as reações dentro da via. Calorimetria oferece uma abordagem em tempo real para medir a produção de calor celular, que detecta indiscriminadamente vias aeróbias e anaeróbias. Isto é baseado na Fundação que nenhuma energia é trocada no sistema exceto pelas paredes da ampola experimental8. Uma mudança na dissipação de calor é igual à mudança na entalpia liberada de todas as reações metabólicas em ampola. Assim, uma entalpia negativa se correlaciona com a perda de calor do sistema. Exaustiva pesquisa nas últimas quatro décadas tem caracterizado a paisagem termodinâmica de catabolismo e o anabolismo. Isso é representado por um aumento constante nos artigos de pesquisa encontrado sob os termos de busca "biológicos" e "calorimetria" como indexados pelos Estados Unidos nacional biblioteca da medicina (NLM) no National Institutes of Health (PubMed). A pesquisa revela que antes de 1970, um total de 27 publicações calorimetria biológicos de referência; Enquanto isso, no ano de 2016, 546 publicações utilizaram a técnica.
Os métodos calorimétricos são bem estabelecidos para determinar a produção de calor. No entanto, mais flexibilidade é concedida para resolver o valor respirometric. A medição de respirometric pode consistir de O2, CO2, ou tanto O2 e CO2. Além disso, a medição de O2 e CO2 pode ser realizada por várias técnicas, incluindo optrodes, eletrodos tipo Clark e diodo ajustável do laser absorção espectroscopia7,9,10 ,11. Enquanto a produção de CO2 é uma métrica valiosa em muitos estudos respirometric, o meio para pilhas cultivadas frequentemente utiliza um sistema de reserva de bicarbonic para controle de pH12,13. Para evitar complicações da medição de CO2 no sistema de bicarbonato, o seguinte protocolo para o calorespirometry das células em cultura utiliza O2 como o único parâmetro de respirometric.
Simultâneas com medição de fluxo de oxigênio, certas respirometers (ver Tabela de materiais) são projetados para avaliações detalhadas da função mitocondrial. Substrato-desacoplador-inibidor-titulações (SUIT) protocolos são bem estabelecidos e são compatíveis com os experimentos para medir a membrana potencial ou reativas de oxigênio (ROS) de espécies formação14. O protocolo apresentado por calorespirometry de células intactas é compatível com a introdução de produtos químicos uncouplers como carbonila cianeto-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) e a F0F1-ATP sintase inibidor oligomicina. Através da adição de FCCP, consumo de oxigênio pode ser desacoplado da produção de ATP, que é útil para avaliar o impacto da terapêutica potencial mitocondrial peformance15. Além disso, a adição de oligomicina acende-se a extensão da respiração de vazamento. Assim, as respirometric medições realizadas calorespirometry são compatíveis com protocolos extensivos projetados para elucidar ainda mais a fisiologia mitocondrial.
A medição simultânea de dissipação de calor e de fluxo de oxigênio permite o cálculo da relação de calorespirometric (CR). Esta relação é então comparada com a constante do Thornton ou a oxycaloric teórico equivalente, que varia entre-430 ao-480 kJ mol-1 , dependendo da linhagem de células ou tecidos de interesse e o de substratos de carbono completados1, 16. assim, uma relação de CR mais negativa revela aumentada contribuições de vias anaeróbias a atividade metabólica geral. Por exemplo, a proporção de CR para a respiração do tecido muscular rotina sem o desempenho ativo de trabalho varia de-448 a-468 kJ mol-1, que está dentro do intervalo dos teóricos oxycaloric equivalente17,18. Enquanto isso, células de câncer mamíferos cultivadas em meio que é rico em glicose exibir reforçada ácido lático fermentação glicólise a seguir e relativamente baixo envolvimento mitocondrial19. Este resultados de fenótipo em rácios de CR no intervalo de-490 a-800 kJ mol-1, demonstrando um maior envolvimento das vias anaeróbias no metabolismo celular como indicado pelo negativo mais CR rácios1,7, 16,20.
Distribuidores comerciais e sem fins lucrativos de célula e tecido atualmente oferta de linhas de celulares de mais de 150 espécies, com quase 4.000 linhas de células derivadas de seres humanos. Linha celular imortalizado é ferramentas convenientes para avaliar rapidamente a toxicidade da terapêutica potencial, muitos dos quais direta ou indiretamente interferem com funções mitocondriais. Usar células transformadas durante o rastreio de drogas pode ser de valor preditivo limitado em parte por causa do efeito Warburg, uma marca registrada de muitos cancros. Muitas vezes, cancros geram ATP de fosforilação do substrato-nível e mantêm equilíbrio redox através da produção de lactato sem engajar-se totalmente a mitocôndria sob condições aeróbias19. Desenvolvimento farmacêutico é notoriamente caro e ineficiente, com aproximadamente 8 em 9 compostos testados em ensaios clínicos humanos não atingirem o mercado aprovação21. Enquanto terapêutica potencial pode passar triagem inicial devido à baixa citotoxicidade em linhas celulares, é possível que alguns destes compostos são mitotoxic. Sem um método adequado para detectar como estas toxinas podem prejudicar o equilíbrio de energia em células primárias que não exibem o efeito Warburg, informação crítica é muitas vezes excessivamente olhou, descongestionamento desenvolvimento terapêutico em estágios iniciais.
Calorespirometry é uma abordagem prática e não-invasiva para analisar a atividade metabólica em uma variedade de amostras biológicas, incluindo células e tecidos. O núcleo do protocolo apresentado é compatível com uma variedade de aplicações. Uma complicação, no entanto, foi identificada. Células imortalizadas geralmente são cultivadas em um meio isento de glicose suplementado com galactose para aumentar a contribuição da fosforilação oxidativa (OXPHOS) para a produção de energia, a fim de sensibilizar as células com potencial mitotoxins22, 23. Esta reprogramação metabólica parece obscurecer a análise quando amostras são colocadas nas ampolas de aço inoxidável usadas pelo calorímetro15. As células cultivadas em meio de glicose continuam a se envolver em alta atividade metabólica durante várias horas. Enquanto isso, células cultivadas em meio de galactose diminuem a produção de calor dentro de 30 min de sua colocação em ampola, fazer medições restritas aos pontos de início tempo experimental. Este comportamento, infelizmente, dificulta a oportunidade de avaliar sua proliferação celular. Apesar desta limitação específica, a maioria dos aplicativos são compatíveis com análise de calorespirometric e metabólicas obter informações detalhadas podem ser obtidas através desta abordagem.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="627">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HepG2 Cells</td>
			<td style="width:125px;">American Type Culture Collection</td>
			<td style="width:119px;">HB-8065</td>
			<td style="width:167px;">Cells used for calorespirometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">O2k-Respirometer</td>
			<td style="width:125px;">Oroboros Instruments</td>
			<td style="width:119px;">10022-02</td>
			<td>Respirometer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LKB 2277 thermal activity monitor (TAM)</td>
			<td style="width:125px;">Thermometric AB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Thermometric was purchased by TA Instruments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11360070</td>
			<td>100x solution added to DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum - Premiuim Select</td>
			<td style="width:125px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S11550</td>
			<td>Added to 10% in DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsn-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25200072</td>
			<td>Cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes</td>
			<td style="width:125px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">O4876</td>
			<td>Mitochondrial Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td style="width:125px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2920</td>
			<td>Mitochondrial Uncoupler</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td style="width:125px;">Corning Corporation</td>
			<td style="width:119px;">430167</td>
			<td>Tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glucose, powder</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15023021</td>
			<td>Glucose for DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Galactose, powder</td>
			<td style="width:125px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP656500</td>
			<td>Galactose for DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Glutamine for DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMEM, no glucose</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11966025</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

calorespirometry: a powerful, noninvasive approach to investigate cellular energy metabolism

Muitas linhas de celulares usadas em pesquisa biológica e biomédica básica mantenham a homeostase de energia através de uma combinação da respiração aeróbia e anaeróbia. No entanto, na medida em que ambos os caminhos contribuem para a paisagem da produção de energia celular é consistentemente ignorada. Células transformadas cultivadas em saturando os níveis de glicose frequentemente mostram uma diminuição da dependência na fosforilação oxidativa para a produção de ATP, que é compensada por um aumento no nível de substrato fosforilação. Essa mudança no equilíbrio metabólico permite que as células a proliferar apesar da presença de toxinas mitocondriais. Em negligenciar a poise metabólica alterada de células transformadas, resultados de um rastreio farmacêutico podem ser mal interpretados desde o potencialmente mitotoxic efeitos podem não ser detectados usando linhas de célula modelo cultivadas na presença de glicose alta concentrações. Este protocolo descreve o emparelhamento de duas técnicas poderosas, respirometria e calorimetria, que permite a avaliação quantitativa e não-invasiva de contribuições aeróbias e anaeróbias para produção de ATP celular. Respiração aeróbia e anaeróbia gera calor, que pode ser monitorado através de calorimetria. Enquanto isso, a medição da taxa de consumo de oxigênio pode avaliar o grau de respiração aeróbia. Quando tanto a dissipação de calor e consumo de oxigênio são medidos simultaneamente, a relação de calorespirometric pode ser determinada. O valor obtido experimentalmente em seguida pode ser comparado com a oxycaloric teórico equivalente e a extensão da respiração anaeróbica pode ser julgada. Assim, o calorespirometry fornece um método exclusivo para analisar uma ampla gama de questões biológicas, incluindo o desenvolvimento de drogas, crescimento microbiano e bioenergética fundamental sob condições de hipóxicos e normoxic.

A reprodutibilidade das medições calorespirometric depende de uma preparação de amostra adequada e consistente. Amostras preparadas a partir de cultura de células não devem ser usadas se as placas são abandonadas, como contagem de células pode se tornar imprecisa devido à aglutinação. Além disso, os fluxos de calor reduzida devido à difusão do substrato limitada nas células agrupadas podem ocorrer. Portanto, quando usando células aderentes, é crítico para selecionar uma placa com a confluência entre 60...

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Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Calorespirometry: Uma abordagem poderosa, não-invasiva para investigar o metabolismo energético celular

Este protocolo descreve calorespirometry, a medição direta e simultânea de dissipação de calor e de respiração, que fornece uma abordagem não-invasiva para avaliar o metabolismo energético. Esta técnica é usada para avaliar a contribuição das vias aeróbias e anaeróbias para utilização de energia, monitorando o fluxo de energia celular total.

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

calorespirometry-powerful-noninvasive-approach-to-investigate

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.5K visualizações.  University of Louisville. Este protocolo descreve calorespirometry, a medição direta e simultânea de dissipação de calor e de respiração, que fornece uma abordagem não-invasiva para avaliar o metabolismo energético. Esta técnica é usada para avaliar a contribuição das vias aeróbias e anaeróbias para utilização de energia, monitorando o fluxo de energia celular total.

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The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

A Pele Tridimensional Humanos Reconstruir Modelo: uma Ferramenta para o Estudo da Pele Normal e Progressão Melanoma

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Bioengenharia

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Projeto de um biorreator de pressão cíclica para o Ex Vivo Estudo de válvulas cardíacas Aórtica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do not have suitable autologous donor vessels due to disease progression or previous harvest. The aim of vascular tissue engineering is to develop a suitable alternative source for these bypass grafts. In addition, engineered vascular tissue may prove valuable as living vascular models to study cardiovascular diseases. Several promising approaches to engineering blood vessels have been explored, with many recent studies focusing on development and analysis of cell-based methods.2-5 Herein, we present a method to rapidly self-assemble cells into 3D tissue rings that can be used in vitro to model vascular tissues.
To do this, suspensions of smooth muscle cells are seeded into round-bottomed annular agarose wells. The non-adhesive properties of the agarose allow the cells to settle, aggregate and contract around a post at the center of the well to form a cohesive tissue ring.6,7 These rings can be cultured for several days prior to harvesting for mechanical, physiological, biochemical, or histological analysis. We have shown that these cell-derived tissue rings yield at 100-500 kPa ultimate tensile strength8 which exceeds the value reported for other tissue engineered vascular constructs cultured for similar durations (&lt;30 kPa).9,10 Our results demonstrate that robust cell-derived vascular tissue ring generation can be achieved within a short time period, and offers the opportunity for direct and quantitative assessment of the contributions of cells and cell-derived matrix (CDM) to vascular tissue structure and function.

This article outlines a versatile method to create cell-derived tissue rings by cellular self-assembly. Smooth muscle cells seeded into ring-shaped agarose wells aggregate and contract to form robust three-dimensional (3D) tissues within 7 days. Millimeter-scale tissue rings are conducive to mechanical testing and serve as building blocks for tissue assembly.

Dirigido Cellular Automontagem para Fabricar Anéis Cell-Derived Tecido para Análise Biomecânica e Engenharia de Tecidos

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be validated for predictive purposes. Ideally such systems would be low volume, which precludes sampling and destructive analyses when time course data are to be obtained. What is needed is an in situ monitoring tool which can report the necessary information in real-time and noninvasively. An interesting option is the use of fluorescent, protein-based in vivo biological sensors as reporters of intracellular concentrations. One particular class of in vivo biosensors that has found applications in metabolite quantification is based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorescent proteins connected by a ligand binding domain. FRET integrated biological sensors (FIBS) are constitutively produced within the cell line, they have fast response times and their spectral characteristics change based on the concentration of metabolite within the cell. In this paper, the method for constructing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines that constitutively express a FIBS for glucose and glutamine and calibrating the FIBS in vivo in batch cell culture in order to enable future quantification of intracellular metabolite concentration is described. Data from fed-batch CHO cell cultures demonstrates that the FIBS was able in each case to detect the resulting change in the intracellular concentration. Using the fluorescent signal from the FIBS and the previously constructed calibration curve, the intracellular concentration was accurately determined as confirmed by an independent enzymatic assay.

A description of how to calibrate F&#246;rster Resonance Energy Transfer integrated biological sensors (FIBS) for in situ metabolic profiling is presented.&#160;The FIBS can be used to measure intracellular levels of metabolites noninvasively aiding in the development of metabolic models and high throughput screening of bioprocess conditions.

FIBS habilitado Noninvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data

Modern 3D electron microscopy approaches have recently allowed unprecedented insight into the 3D ultrastructural organization of cells and tissues, enabling the visualization of large macromolecular machines, such as adhesion complexes, as well as higher-order structures, such as the cytoskeleton and cellular organelles in their respective cell and tissue context. Given the inherent complexity of cellular volumes, it is essential to first extract the features of interest in order to allow visualization, quantification, and therefore comprehension of their 3D organization. Each data set is defined by distinct characteristics, e.g., signal-to-noise ratio, crispness (sharpness) of the data, heterogeneity of its features, crowdedness of features, presence or absence of characteristic shapes that allow for easy identification, and the percentage of the entire volume that a specific region of interest occupies. All these characteristics need to be considered when deciding on which approach to take for segmentation.
The six different 3D ultrastructural data sets presented were obtained by three different imaging approaches: resin embedded stained electron tomography, focused ion beam- and serial block face- scanning electron microscopy (FIB-SEM, SBF-SEM) of mildly stained and heavily stained samples, respectively. For these data sets, four different segmentation approaches have been applied: (1) fully manual model building followed solely by visualization of the model, (2) manual tracing segmentation of the data followed by surface rendering, (3) semi-automated approaches followed by surface rendering, or (4) automated custom-designed segmentation algorithms followed by surface rendering and quantitative analysis. Depending on the combination of data set characteristics, it was found that typically one of these four categorical approaches outperforms the others, but depending on the exact sequence of criteria, more than one approach may be successful. Based on these data, we propose a triage scheme that categorizes both objective data set characteristics and subjective personal criteria for the analysis of the different data sets.

The bottleneck for cellular 3D electron microscopy is feature extraction (segmentation) in highly complex 3D density maps. We have developed a set of criteria, which provides guidance regarding which segmentation approach (manual, semi-automated, or automated) is best suited for different data types, thus providing a starting point for effective segmentation.

De Voxels ao Conhecimento: Um Guia Prático para a segmentação do Complexo Microscopia Eletrônica 3D-Data

Modern 3D electron microscopy approaches have recently allowed unprecedented insight into the 3D ultrastructural organization of cells and tissues, ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Gradiente planar do sistema de difusão para investigar Quimiotaxia numa Matriz de Colagénio 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular cartilage impairs its load-bearing function substantially as it experiences tremendous chemical degradation, i.e. proteoglycan loss and collagen fibril disruption. One promising way to investigate chemical damage mechanisms during OA is to expose the cartilage specimens to an external solute and monitor the diffusion of the molecules. The degree of cartilage damage (i.e. concentration and configuration of essential macromolecules) is associated with collisional energy loss of external solutes while moving across articular cartilage creates different diffusion characteristics compared to healthy cartilage. In this study, we introduce a protocol, which consists of several steps and is based on previously developed experimental micro-Computed Tomography (micro-CT) and finite element modeling. The transport of charged and uncharged iodinated molecules is first recorded using micro-CT, which is followed by applying biphasic-solute and multiphasic finite element models to obtain diffusion coefficients and fixed charge densities across cartilage zones.

We propose a protocol to investigate the transport of charged and uncharged molecules across articular cartilage with the aid of recently developed experimental and numerical methods.

Um Experimental e Finite Element protocolo para investigar o transporte de solutos neutras e carregadas em toda a cartilagem articular

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources

Studies in the field of microbiology rely on the implementation of a wide range of methodologies. In particular, the development of appropriate methods substantially contributes to providing extensive knowledge of the metabolism of microorganisms growing in chemically defined media containing unique nitrogen and carbon sources. In contrast, the management through metabolism of multiple nutrient sources, despite their broad presence in natural or industrial environments, remains virtually unexplored. This situation is mainly due to the lack of suitable methodologies, which hinders investigations.
We report an experimental strategy to quantitatively and comprehensively explore how metabolism operates when a nutrient is provided as a mixture of different molecules, i.e., a complex resource. Here, we describe its application for assessing the partitioning of multiple nitrogen sources through the yeast metabolic network. The workflow combines information obtained during stable isotope tracer experiments using selected 13C- or 15N-labeled substrates. It first consists of parallel and reproducible fermentations in the same medium, which includes a mixture of N-containing molecules; however,a selected nitrogen source is labeled each time. A combination of analytical procedures (HPLC, GC-MS) is implemented to assess the labeling patterns of targeted compounds and to quantify the consumption and recovery of substrates in other metabolites. An integrated analysis of the complete dataset provides an overview of the fate of consumed substrates within cells. This approach requires an accurate protocol for the collection of samples&#8211;facilitated by a robot-assisted system for online monitoring of fermentations&#8211;and the achievement of numerous time-consuming analyses. Despite these constraints, it allowed understanding, for the first time, the partitioning of multiple nitrogen sources throughout the yeast metabolic network. We elucidated the redistribution of nitrogen from more abundant sources toward other N-compounds and determined the metabolic origins of volatile molecules and proteinogenic amino acids.

This protocol describes an experimental procedure to quantitatively and comprehensively investigate the metabolism of multiple nutrient sources. This workflow, based on a combination of isotopic tracer experiments and an analytical procedure, allows the fate of consumed nutrients and the metabolic origin of molecules synthetized by microorganisms to be determined.

Fluxo de trabalho baseado na combinação de traçador isotópico experimentos para investigar o metabolismo microbiano de múltiplas fontes de nutrientes

Studies in the field of microbiology rely on the implementation of a wide range of methodologies. In particular, the development of appropriate methods ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

Fabricação de uma matriz de microambiente celular Artificial multiplexado

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and allostasis. Moreover, dysregulated protease activity drives pathogenesis and is a functional biomarker of diseases such as cancer; therefore, the ability to detect protease activity in vivo may provide clinically relevant information for biomedical diagnostics. The goal of this protocol is to create nanosensors that probe for protease activity in vivo by producing a quantifiable signal in urine. These protease nanosensors consist of two components: a nanoparticle and substrate. The nanoparticle functions to increase circulation half-life and substrate delivery to target disease sites. The substrate is a short peptide sequence (6-8 AA), which is designed to be specific to a target protease or group of proteases. The substrate is conjugated to the surface of the nanoparticle and is terminated by a reporter, such as a fluorescent marker, for detection. As dysregulated proteases cleave the peptide substrate, the reporter is filtered into urine for quantification as a biomarker of protease activity. Herein we describe construction of a nanosensor for matrix metalloproteinase 9 (MMP9), which is associated with tumor progression and metastasis, for detection of colorectal cancer in a mouse model.

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are tightly regulated enzymes involved in fundamental biological processes, and dysregulated protease activity drives progression of complex diseases such as cancer. This method&#39;s goal is to create nanosensors that measure protease activity in vivo by producing a cleavage signal that is detectable from host urine and discriminates disease.

Nanosensors para detectar Protease atividade In Vivo para diagnóstico não-invasivo

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...