Questo lavoro è stato finanziato in parte dalla sovvenzione della National Science Foundation-160944 Mary E. Konkle e Michael A. Menze.

1. coltura cellulare
<ol><li>Mantenere cellule epatocellulari umane di carcinoma (HepG2) nel mezzo dell'Aquila per volta di Dulbecco (DMEM) contenente 10% siero bovino fetale (FBS) e ulteriori substrati (10 millimetri di glucosio, glutammina 2 mM e 1 mM piruvato) a 37 ° C in un'incubatrice di coltura delle cellule (5% CO2 , aria di 95%, 100% di umidità). Nota: Utilizzare la precedente formulazione di DMEM quando DMEM viene fatto riferimento nei passaggi successivi per manometrica e calorimetria.</li>
	<li>Piastra le cellule a 1 x 106 cellule per piastra di coltura di 100 mm e sottocultura loro ogni 7 giorni o prima di raggiungere confluency di 90% e rinnovare il mezzo ogni 3-4 giorni.</li>
	<li>Eseguire gli esperimenti quando le cellule sono 60-80% confluenti.</li>
</ol>2. preparazione del respirometro e calorimetro
<ol><li>Dispensare 2,2 mL di DMEM nell'alloggiamento respirometro, mettere il tappo completamente e regolare con lo strumento di tappo distanziale per consentire per diffusione ottimale dell'ossigeno dall'aria al mezzo.</li>
	<li>Mescolate continuamente a 37 ° C fino a quando la concentrazione di ossigeno (traccia blu) e il flusso di ossigeno (traccia rossa) sono stabili. Garantire che software di respirometro è programmato per contabilizzare la solubilità dell'ossigeno del medium usato nell'esperimento. Nota: Diversi media hanno coefficienti di solubilità di ossigeno differente (ad es., DMEM = 0,92).</li>
	<li>Dopo la stabilizzazione della concentrazione di ossigeno in DMEM con la camera aperta, selezionare una parte stabile della traccia di concentrazione di ossigeno e calibrare per saturazione dell'aria di 100%.</li>
	<li>Calibrare per 0% ossigeno selezionando una parte stabile della traccia di concentrazione di ossigeno quando l'ossigeno non è presente in aula. Eseguire questo passaggio dopo titolazione di µ l 20 di 230 mM Ditionito di sodio o dopo tutto l'ossigeno viene consumato da campione biologico alla fine di un esperimento.</li>
	<li>Dopo la calibrazione con 100% aria del respirometro, chiudere il tappo e assicurarsi che non ci sono bolle siano presenti in aula. Nota: un leggero aumento nel cambiamento continuo dell'ossigeno verrà rilevato in camera chiusa come il Sensore polarografico di ossigeno (POS) consuma ossigeno al fine di misurare la pressione parziale di ossigeno.</li>
	<li>Dopo ~ 10 min del tappo chiuso, confermare che il respirometro è pronto per cellule HepG2 osservando un flusso di ossigeno stabile. Nota: Il calorimetro usato qui utilizza Ampolle in acciaio inox e richiede una fiala da utilizzare come riferimento.</li>
	<li>Aggiungere 2,5 mL di H2O (dH2O) [volume uguale come i campioni (passaggio 4)] per la fiala di riferimento del calorimetro e serrare il tappo, con una pinza, se necessario. Pulire la fiala sigillata con flusso d'aria e abbassare lentamente la fiala alla posizione 1 nel canale di riferimento del calorimetro. Rimangono nella posizione 1 fino a quando il campione biologico viene preparato.</li>
</ol>3. preparazione delle cellule HepG2 Respirometry e Calorimetria
<ol><li>Confermare che il respirometro e calorimetro sono preparati e calibrati. Caldo DMEM e tripsina a 37 ° C in un bagno d'acqua.</li>
	<li>Aggiungere DMEM a un fresco 100 mm di spessore e posto nell'incubatrice per consentire l'equilibrazione del mezzo per CO2 e la temperatura. Nota: Questo mezzo verrà essere utilizzato per l'esperimento di calorimetria, così il volume appropriato dipende dal numero di fiale che verrà utilizzato.</li>
	<li>Confermare con un microscopio ottico invertito che le cellule sono al 60-80% confluenti, poi lavare il 100 mm piastra 2 x 10 ml di soluzione tampone fosfato (PBS) e temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere 3 mL della tripsina di 37 ° C per la piastra di 100 mm delle cellule e loro Incubare per 7-10 min a 37 ° C nell'incubatore di cultura cellulare. Neutralizzare la tripsina con 3 mL di 37 ° C DMEM e sospendere pipettando delicatamente e ~ 20 volte con una pipetta da 5 mL.</li>
	<li>Trasferire i 6 mL di sedimento cellule in DMEM e tripsina in una provetta conica sterile di 15 mL e si centrifuga per 5 min a 175 x g. rimuovere il liquido senza disturbare il pellet cellulare.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in ~ 5 mL di DMEM e dispensare accuratamente per garantire le cellule sono sufficientemente dissociato da altra.</li>
	<li>Rimuovere ~ 100 µ l del campione omogeneizzato ed eseguire un conteggio accurato delle cellule utilizzando 8 tutti i campi su un emocitometro per determinare il numero totale delle cellule. Quindi calcolare il volume per la risospensione delle cellule al fine di generare ~ 2 x 106 cellule per 50 µ l. Nota: Questo garantisce che 2 x 106 cellule vengono aggiunti a ciascuna camera del respirometro con minimo medio dislocamento.</li>
	<li>Centrifugare le cellule per 5 min a 175 x g. Risospendere il pellet nel volume calcolato di DMEM dal punto 3.7.</li>
	<li>Eseguire un conteggio delle cellule per determinare il volume necessario per iniettare 2 x 106 cellule per camera nel respirometro (questo dovrebbe essere ~ 50 µ l). Conservare le cellule per la misurazione respirometriche su ghiaccio fino al momento.</li>
	<li>Mentre il campione concentrato cellulare è sul ghiaccio, determinare la diluizione necessaria per produrre una concentrazione di 1 x 105 cellule/mL per la calorimetria.</li>
	<li>Mescolare bene il campione e preparare ~ 3 mL delle cellule a 1 x 105 cellule/mL in DMEM per ogni fiala. Nota: Il DMEM utilizzato per la diluizione del campione dovrebbe essere il mezzo equilibrato preparato al punto 3.3.</li>
</ol>4. calorimetria
<ol><li>Assicurarsi che il calorimetro è collegato al computer e il segnale calorimetrico in µW è osservabile e stabile.</li>
	<li>Aggiungere 2,5 mL delle cellule a 1 x 105 cellule/mL (~2.5 x 105 celle) per ogni fiala, garantire aria sufficiente è tra il coperchio della fiala ed il mezzo per consentire per la diffusione del gas.</li>
	<li>Immediatamente stringere il tappo, con una pinza, se necessario. Pulire la fiala sigillata, utilizzando il flusso d'aria per rimuovere eventuali detriti esterni e abbassare lentamente la fiala in posizione 1 del calorimetro. Registrare il tempo che la fiala è abbassata in posizione 1.</li>
	<li>Consentire la fiala per sedersi nella posizione 1 per 15 min. Nota: Durante questo periodo di 15 minuti, le cellule sono deve essere iniettato in respirometro (passo 5). Questo assicura che lo stesso intervallo di tempo viene utilizzato per la produzione di calore e consumo di ossigeno quando il rapporto di CR è determinato.</li>
	<li>Dopo 15 min in posizione 1, abbassare lentamente fiale del campione sia il riferimento alla posizione 2. Registrare il tempo che le fiale sono state abbassate e misura per almeno 30 min.</li>
</ol>5. respirometry
<ol><li>Durante l'intervallo di 15 minuti in cui la fiala è alla posizione 1 nel calorimetro, iniziano gli studi respirometrici.</li>
	<li>Mescolare bene il campione di cellule pipettando per garantire una soluzione omogenea e iniettare < 50 µ l di campione cellulare in ogni camera del respirometro per una concentrazione finale di ~ 2 x 106 cellule/camera. Registrare il tempo, che le cellule vengono iniettate il respirometro.</li>
	<li>Dopo l'iniezione, le cellule HepG2 sono continuamente agitate a 37 ° C. Attendere almeno 20-30 min per entrambi una stabilizzazione del flusso ossigeno ed una costante diminuzione della concentrazione di ossigeno.</li>
	<li>Selezionare la scheda flusso di2 O a V sulla destra dello schermo ed evidenziare una parte stabile del flusso di ossigeno. Selezionare indicatori, quindi le statistiche e dati del record per flusso2 O a V. Questa registrazione verrà utilizzata nel calcolo del rapporto CR. Nota: Passaggi 5.5 e 5.6 sono facoltativi. Perdita di respirazione e la respirazione disgiunto massima sarà rivelati di titolazioni di oligomycin e FCCP.</li>
	<li>Iniettare 1 µ l di oligomycin 4mg/mL in ogni camera e consentire ~ 10 min per la stabilizzazione del flusso di ossigeno. Tasso di respirazione di perdita stabile record eseguendo i passaggi eseguiti in 5.4 mettendo in evidenza una parte stabile della traccia del flusso di ossigeno dopo l'aggiunta di oligomycin.</li>
	<li>Titolare le iniezioni di 2-µ l di 0,2 mM FCCP in ogni camera, consentendo per la stabilizzazione di flusso di ossigeno dopo ogni iniezione. Continuano le titolazioni fino a quando il flusso massimo è raggiunto, come indicato da un lieve calo la successiva titolazione FCCP. Registrare il tasso di respirazione stabile durante il flusso massimo.</li>
</ol>6. calcolo del rapporto di Calorespirometric
<ol><li>Eseguire un conteggio finale delle cellule dei campioni preparati a ~ 1 x 105 cellule/mL utilizzando 8 tutti i campi di un emocitometro per determinare il numero totale di celle aggiunte alla fiala (2,5 mL).</li>
	<li>Determinare un tempo per i valori di misurazione dal calorimetro e respirometro in cui sono presenti a volte identici segnale stabile. Riferimento che il tempo registrato quando la fiala è stata abbassata a posizione 2 e il tempo di iniezione delle cellule nel respirometro.</li>
	<li>Registrare la produzione di calore posizionando il cursore sopra la traccia visualizzare l'output di calore per la fiala rispettata al momento determinato nel passaggio ed espressa come µW/milioni di cellule. Raccogliere dati sul consumo di ossigeno e garantire che si esprime come pmol O2 x s-1 1x milioni di cellule.</li>
	<li>Per calcolare il rapporto di CR, prima convertire µW in kJ/s e quindi dividere kJ/s per mol di O2/s per ottenere il rapporto CR espresso in kJ/mol O2. Nota: Il rapporto di CR è presentato in kJ/mol O2. (Vedi <a href="/files/ftp_upload/57724/JoVE_Supplemental_File.docx" target="_blank">1 FIle supplementari</a>)</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

L'obiettivo di calorespirometry è quello di valutare quantitativamente i contributi dei percorsi aerobici ed anaerobici di attività metabolica e ottenere una vista composta di flusso di energia cellulare. Ciò avviene mediante una misura simultanea di dissipazione del calore e flusso di ossigeno seguita da un confronto tra il rapporto CR calcolato con il teorico oxycaloric equivalente. Diversi passaggi critici devono essere considerate per dati riproducibili e affidabili. Il mantenimento di una cultura sterile cellula ...

Nei sistemi biologici, il rilascio di calore o entalpia cambiamento durante il metabolismo è in genere monitorati sia direttamente (tramite diretta calorimetria) o indirettamente tramite il consumo di O2 e/o produzione di CO2 (via manometrica). Sfortunatamente, quando queste tecniche sono utilizzate in isolamento, informazioni critiche vengono perse, come il contributo delle vie anaerobiche al metabolismo cellulare. Calorespirometry è una potente tecnica che si basa sulla misurazione simultanea di dissipazione di calore e di respirazione. Calorespirometric lavoro pionieristico studiato il metabolismo anaerobico in cellule di mammiferi completamente ossigenate e dimostrato contributi simultanei dei percorsi sia aerobici che anaerobici di omeostasi energetica nonostante le cellule trasformate in un ambiente completamente ossigenato1. Calorespirometry da allora è stato applicato a una vasta gamma di domande biologiche. Alcuni esempi includono lo studio dell'animale energetica a bassi livelli di ossigeno, gli effetti di erbicidi e di estrogeno sulle lamelle di molluschi bivalvi, il metabolismo degli organismi terrestri e la decomposizione microbica di materia organica del suolo2, 3 , 4 , 5 , 6. Inoltre, calorespirometry ha rivelato come metabolica precondizionamento prima del congelamento migliora la crioconservazione di mammiferi celle7. Ogni approccio, sia calorimetria e manometrica, indipendentemente ha aumentato la nostra conoscenza della bioenergetica cellulare e organismica. Tuttavia, fondamentali domande biologiche che possono essere risolte attraverso l'uso di calorespirometry rimangono relativamente inesplorate.
Leggi di Hess afferma che la variazione di entalpia totale di una reazione è indipendente del pathway tra gli stati iniziali e finali. Ad esempio, la variazione di entalpia totale per una via biochimica è la somma della variazione di entalpie di tutte le reazioni all'interno della via. Calorimetria offre un approccio in tempo reale per misurare la produzione di calore cellulare, che rileva indiscriminatamente vie sia aerobiche che anaerobiche. Questo si basa sul fondamento che nessuna energia viene scambiata nel sistema tranne attraverso le pareti della fiala sperimentale8. Un cambiamento nella dissipazione del calore è uguale al cambiamento di entalpia rilasciato da tutte le reazioni metaboliche in fiala. Così, un negativo entalpia correla ad una perdita di calore dal sistema. Ricerche approfondite negli ultimi quattro decenni ha caratterizzato il paesaggio termodinamico di anabolismo e catabolismo. Questo è rappresentato da un aumento costante nella ricerca articoli trovati sotto i termini di ricerca "biologici" e "calorimetria" come indicizzato dallo Stati Uniti National Library di medicina (NLM) presso il National Institutes of Health (PubMed). La ricerca rivela che prima del 1970, un totale di 27 pubblicazioni riferimento biologico calorimetria; nel frattempo, nel 2016 da solo, 546 pubblicazioni utilizzato la tecnica.
Metodi calorimetrici sono ben stabiliti per determinare la produzione di calore. Tuttavia, una maggiore flessibilità è concesso per la risoluzione il valore respirometriche. La misurazione respirometriche può consistere di O2, CO2, o O2 e CO2. Ulteriormente, la misura di O2 o CO2 può essere compiuta mediante varie tecniche, tra cui optrodes, Clark-tipo di elettrodi e diodo tunable laser assorbimento spettroscopia7,9,10 ,11. Mentre la produzione di CO2 è una metrica preziosa in molti studi respirometriche, il supporto per le cellule coltivate spesso utilizza un sistema di buffer di bicarbonic per controllo pH12,13. Per evitare complicazioni di CO2 misura nel sistema di bicarbonato, il seguente protocollo per la calorespirometry delle cellule nella cultura utilizza O2 come unico parametro respirometriche.
In concomitanza con cambiamento continuo dell'ossigeno di misurazione, alcuni respirometers (Vedi Tabella materiali) sono progettati per valutazioni dettagliate della funzione mitocondriale. Substrato-disaccoppiatore-inibitore-titolazioni (SUIT) protocolli sono ben stabiliti e sono compatibili con gli esperimenti progettati per misurare la membrana potenziale o reattive dell'ossigeno (ROS) specie formazione14. Il protocollo presentato per calorespirometry di cellule intatte è compatibile con l'introduzione della chimica uncouplers come Carbonil cianuro-p-trifluorometossifenil idrazone (FCCP) e l'inibitore oligomycin di F0F1-ATP sintasi. Attraverso l'aggiunta di FCCP, consumo di ossigeno può essere disgiunto dalla produzione di ATP, che è utile per valutare l'impatto di potenziali terapie su mitocondriale peformance15. Inoltre, l'aggiunta di oligomycin si illumina nella misura della respirazione di perdita. Così, le misure respirometriche eseguite durante calorespirometry sono compatibili con protocolli vasti progettati più ulteriormente per delucidare fisiologia mitocondriale.
La misura simultanea di dissipazione di calore e di cambiamento continuo dell'ossigeno consente il calcolo del rapporto calorespirometric (CR). Questo rapporto viene quindi confrontato con costante di Thornton o il oxycaloric teorico equivalente, che spazia tra -430 a-480 kJ mol-1 a seconda della varietà di cellula o tessuto di interesse e il carbonio completati substrati1, 16. quindi, un rapporto più negativo di CR rivela maggiori contributi da vie anaerobiche per complessivo activity. Ad esempio, il rapporto di CR per la respirazione dei tessuti muscolo routine senza l'attiva delle prestazioni di lavoro varia da-448 a-468 kJ mol-1 che è all'interno della gamma del oxycaloric teorico equivalente17,18. Nel frattempo, le cellule tumorali dei mammiferi coltivate in medium che è ad alto contenuto di glucosio visualizzare fermentazione acido lattico avanzata seguendo la glicolisi e relativamente basso coinvolgimento mitocondriale19. Questo risultati di fenotipo in rapporti di CR nell'intervallo di-490 a-800 kJ mol-1, dimostrando una maggiore partecipazione delle vie anaerobiche nel metabolismo cellulare come indicato da più negativa CR rapporti1,7, 16,20.
Distributori di cellule e tessuti sia commerciali che senza scopo di lucro attualmente offerta linee cellulari provenienti da oltre 150 specie, con quasi 4.000 linee cellulari derivano da esseri umani. Linee cellulari immortalizzate sono strumenti utili per valutare rapidamente la tossicità delle terapie potenziali, molte delle quali possono interferire direttamente o indirettamente con funzioni mitocondriali. Utilizzando cellule trasformate durante lo screening di stupefacenti può essere di limitato valore predittivo in parte a causa dell'effetto di Warburg, un segno distintivo di molti cancri. Spesso, i cancri generano ATP da fosforilazione del substrato-livello e mantengono l'equilibrio redox attraverso la produzione di lattato senza impegnarsi pienamente il mitocondrio sotto condizioni aerobiche19. Sviluppo farmaceutico è notoriamente costoso ed inefficiente, con circa 8 su 9 composti provati nei test clinici umani non riuscendo a ottenere l'approvazione del mercato21. Mentre terapeutica potenziale può passare uno screening iniziale a causa della bassa citotossicità nelle linee cellulari, è possibile che alcuni di questi composti sono mitotoxic. Senza un metodo adatto per rilevare come queste tossine possono alterare l'equilibrio di energia nelle cellule primarie che non vengono visualizzati l'effetto Warburg, informazione critica è spesso sovra-sembrava, strozzature sviluppo terapeutico nelle fasi iniziali.
Calorespirometry è un approccio pratico, non invadente per analizzare l'attività metabolica in una varietà di campioni biologici, compreso le cellule e tessuti. Il nucleo del protocollo presentato è compatibile con una gamma di applicazioni. Una complicazione, tuttavia, è stata identificata. Cellule immortalizzate sono spesso coltivate in un medium privo di glucosio, completato con galattosio per aumentare il contributo della fosforilazione ossidativa (OXPHOS) per la produzione di energia, al fine di sensibilizzare le cellule a potenziali mitotoxins22, 23. Questa riprogrammazione metabolico sembra oscurare analisi quando i campioni vengono inseriti nelle fiale di acciaio inossidabile utilizzate dal calorimetro15. Le cellule coltivate in un medium del glucosio continuano ad impegnarsi in alta attività metabolica per diverse ore. Nel frattempo, le cellule coltivate in medium galattosio diminuiscono la produzione di calore entro 30 min della loro collocazione in fiala, effettuare misure limitate ai punti di tempo sperimentale in anticipo. Questo comportamento, purtroppo, ostacola la possibilità di valutare la loro proliferazione cellulare. Nonostante questa limitazione specifica, la maggior parte delle applicazioni sono compatibili con l'analisi calorespirometric e dettagliate informazioni metaboliche possono essere ottenute attraverso questo approccio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="627">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HepG2 Cells</td>
			<td style="width:125px;">American Type Culture Collection</td>
			<td style="width:119px;">HB-8065</td>
			<td style="width:167px;">Cells used for calorespirometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">O2k-Respirometer</td>
			<td style="width:125px;">Oroboros Instruments</td>
			<td style="width:119px;">10022-02</td>
			<td>Respirometer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LKB 2277 thermal activity monitor (TAM)</td>
			<td style="width:125px;">Thermometric AB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Thermometric was purchased by TA Instruments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11360070</td>
			<td>100x solution added to DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum - Premiuim Select</td>
			<td style="width:125px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S11550</td>
			<td>Added to 10% in DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsn-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25200072</td>
			<td>Cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes</td>
			<td style="width:125px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">O4876</td>
			<td>Mitochondrial Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td style="width:125px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2920</td>
			<td>Mitochondrial Uncoupler</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td style="width:125px;">Corning Corporation</td>
			<td style="width:119px;">430167</td>
			<td>Tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glucose, powder</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15023021</td>
			<td>Glucose for DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Galactose, powder</td>
			<td style="width:125px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP656500</td>
			<td>Galactose for DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Glutamine for DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMEM, no glucose</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11966025</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

calorespirometry: a powerful, noninvasive approach to investigate cellular energy metabolism

Molte linee cellulari utilizzate nella ricerca biologica e biomedica di base mantengono l'omeostasi energetica attraverso una combinazione di respirazione sia aerobico che anaerobico. Tuttavia, nella misura in cui sia vie contribuiscono al paesaggio della produzione di energia cellulare è costantemente trascurata. Trasformato le cellule coltivate in saturando i livelli di glucosio spesso mostrano una dipendenza in diminuzione su fosforilazione ossidativa per la produzione di ATP, che viene compensata da un aumento nella fosforilazione del substrato-livello. Questo spostamento nell'equilibrio metabolico permette alle cellule di proliferare nonostante la presenza di tossine mitocondriali. Trascurando l'alterato equilibrio metabolico delle cellule trasformate, i risultati di uno screening farmaceutico potrebbero essere interpretata erroneamente dal potenzialmente effetti mitotoxic non possono essere rilevati utilizzando modello linee cellulari coltivate in presenza di elevati del glucosio concentrazioni. Questo protocollo descrive l'accoppiamento di due potenti tecniche, manometrica e Calorimetria, che consente la valutazione quantitativa e non invadente dei contributi sia aerobici ed anaerobici per la produzione di ATP cellulare. Respirazioni sia aerobici ed anaerobici generano calore, che può essere monitorato tramite calorimetria. Nel frattempo, la misurazione del tasso di consumo di ossigeno può valutare l'entità della respirazione aerobica. Quando sia la dissipazione di calore e consumo di ossigeno sono misurati simultaneamente, il rapporto di calorespirometric può essere determinato. Il valore ottenuto sperimentalmente può essere confrontato all'equivalente di oxycaloric teorico e nella misura della respirazione anaerobica può essere giudicata. Così, calorespirometry fornisce un metodo unico per analizzare una vasta gamma di domande biologiche, tra cui lo sviluppo di farmaci, la crescita microbica e bioenergetica fondamentale sia in normossia e in condizioni di ipossia.

La riproducibilità delle misurazioni calorespirometric dipende da una preparazione del campione corretto e coerente. Campioni preparati da coltura cellulare non devono essere utilizzati se le piastre sono invasi, come i conteggi delle cellule possono diventare imprecisi a causa di agglutinamento. Inoltre, flussi di calore ridotta a causa della diffusione di substrato limitato nelle cellule ragruppate possono verificarsi. Pertanto, quando si utilizza cellule aderenti, è fondamentale per selezionare un piatto con la conf...

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Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Calorespirometry: Un approccio potente, non invasivo per studiare il metabolismo energetico cellulare

Questo protocollo descrive calorespirometry, la misura diretta e simultanea di dissipazione di calore e di respirazione, che fornisce un approccio non invasivo per valutare il metabolismo energetico. Questa tecnica è utilizzata per valutare il contributo delle vie sia aerobiche e anaerobiche per l'utilizzazione di energia di monitoraggio del flusso totale di energia cellulare.

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

calorespirometry-powerful-noninvasive-approach-to-investigate

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.5K Views.  University of Louisville. Questo protocollo descrive calorespirometry, la misura diretta e simultanea di dissipazione di calore e di respirazione, che fornisce un approccio non invasivo per valutare il metabolismo energetico. Questa tecnica è utilizzata per valutare il contributo delle vie sia aerobiche e anaerobiche per l'utilizzazione di energia di monitoraggio del flusso totale di energia cellulare.

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The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

Tridimensionale pelle umana Ricostruire Modello: uno strumento per studiare la pelle normale e progressione Melanoma

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Ricerca

Bioingegneria

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Progettazione di un bioreattore per la pressione ciclica Ex Vivo Studio delle valvole cardiache aortica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do not have suitable autologous donor vessels due to disease progression or previous harvest. The aim of vascular tissue engineering is to develop a suitable alternative source for these bypass grafts. In addition, engineered vascular tissue may prove valuable as living vascular models to study cardiovascular diseases. Several promising approaches to engineering blood vessels have been explored, with many recent studies focusing on development and analysis of cell-based methods.2-5 Herein, we present a method to rapidly self-assemble cells into 3D tissue rings that can be used in vitro to model vascular tissues.
To do this, suspensions of smooth muscle cells are seeded into round-bottomed annular agarose wells. The non-adhesive properties of the agarose allow the cells to settle, aggregate and contract around a post at the center of the well to form a cohesive tissue ring.6,7 These rings can be cultured for several days prior to harvesting for mechanical, physiological, biochemical, or histological analysis. We have shown that these cell-derived tissue rings yield at 100-500 kPa ultimate tensile strength8 which exceeds the value reported for other tissue engineered vascular constructs cultured for similar durations (&lt;30 kPa).9,10 Our results demonstrate that robust cell-derived vascular tissue ring generation can be achieved within a short time period, and offers the opportunity for direct and quantitative assessment of the contributions of cells and cell-derived matrix (CDM) to vascular tissue structure and function.

This article outlines a versatile method to create cell-derived tissue rings by cellular self-assembly. Smooth muscle cells seeded into ring-shaped agarose wells aggregate and contract to form robust three-dimensional (3D) tissues within 7 days. Millimeter-scale tissue rings are conducive to mechanical testing and serve as building blocks for tissue assembly.

Diretto Cellular Self-Assembly di fabbricare Cell-Derived Anelli tessuto per l&#39;analisi biomeccanica e di ingegneria dei tessuti

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be validated for predictive purposes. Ideally such systems would be low volume, which precludes sampling and destructive analyses when time course data are to be obtained. What is needed is an in situ monitoring tool which can report the necessary information in real-time and noninvasively. An interesting option is the use of fluorescent, protein-based in vivo biological sensors as reporters of intracellular concentrations. One particular class of in vivo biosensors that has found applications in metabolite quantification is based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorescent proteins connected by a ligand binding domain. FRET integrated biological sensors (FIBS) are constitutively produced within the cell line, they have fast response times and their spectral characteristics change based on the concentration of metabolite within the cell. In this paper, the method for constructing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines that constitutively express a FIBS for glucose and glutamine and calibrating the FIBS in vivo in batch cell culture in order to enable future quantification of intracellular metabolite concentration is described. Data from fed-batch CHO cell cultures demonstrates that the FIBS was able in each case to detect the resulting change in the intracellular concentration. Using the fluorescent signal from the FIBS and the previously constructed calibration curve, the intracellular concentration was accurately determined as confirmed by an independent enzymatic assay.

A description of how to calibrate F&#246;rster Resonance Energy Transfer integrated biological sensors (FIBS) for in situ metabolic profiling is presented.&#160;The FIBS can be used to measure intracellular levels of metabolites noninvasively aiding in the development of metabolic models and high throughput screening of bioprocess conditions.

FIBS-enabled non invasiva Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data

Modern 3D electron microscopy approaches have recently allowed unprecedented insight into the 3D ultrastructural organization of cells and tissues, enabling the visualization of large macromolecular machines, such as adhesion complexes, as well as higher-order structures, such as the cytoskeleton and cellular organelles in their respective cell and tissue context. Given the inherent complexity of cellular volumes, it is essential to first extract the features of interest in order to allow visualization, quantification, and therefore comprehension of their 3D organization. Each data set is defined by distinct characteristics, e.g., signal-to-noise ratio, crispness (sharpness) of the data, heterogeneity of its features, crowdedness of features, presence or absence of characteristic shapes that allow for easy identification, and the percentage of the entire volume that a specific region of interest occupies. All these characteristics need to be considered when deciding on which approach to take for segmentation.
The six different 3D ultrastructural data sets presented were obtained by three different imaging approaches: resin embedded stained electron tomography, focused ion beam- and serial block face- scanning electron microscopy (FIB-SEM, SBF-SEM) of mildly stained and heavily stained samples, respectively. For these data sets, four different segmentation approaches have been applied: (1) fully manual model building followed solely by visualization of the model, (2) manual tracing segmentation of the data followed by surface rendering, (3) semi-automated approaches followed by surface rendering, or (4) automated custom-designed segmentation algorithms followed by surface rendering and quantitative analysis. Depending on the combination of data set characteristics, it was found that typically one of these four categorical approaches outperforms the others, but depending on the exact sequence of criteria, more than one approach may be successful. Based on these data, we propose a triage scheme that categorizes both objective data set characteristics and subjective personal criteria for the analysis of the different data sets.

The bottleneck for cellular 3D electron microscopy is feature extraction (segmentation) in highly complex 3D density maps. We have developed a set of criteria, which provides guidance regarding which segmentation approach (manual, semi-automated, or automated) is best suited for different data types, thus providing a starting point for effective segmentation.

Da Voxels alla Conoscenza: Una guida pratica per la segmentazione del Complesso microscopia elettronica 3D-Data

Modern 3D electron microscopy approaches have recently allowed unprecedented insight into the 3D ultrastructural organization of cells and tissues, ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar gradiente di diffusione del sistema per Indagare Chemiotassi in un 3D collagene Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular cartilage impairs its load-bearing function substantially as it experiences tremendous chemical degradation, i.e. proteoglycan loss and collagen fibril disruption. One promising way to investigate chemical damage mechanisms during OA is to expose the cartilage specimens to an external solute and monitor the diffusion of the molecules. The degree of cartilage damage (i.e. concentration and configuration of essential macromolecules) is associated with collisional energy loss of external solutes while moving across articular cartilage creates different diffusion characteristics compared to healthy cartilage. In this study, we introduce a protocol, which consists of several steps and is based on previously developed experimental micro-Computed Tomography (micro-CT) and finite element modeling. The transport of charged and uncharged iodinated molecules is first recorded using micro-CT, which is followed by applying biphasic-solute and multiphasic finite element models to obtain diffusion coefficients and fixed charge densities across cartilage zones.

We propose a protocol to investigate the transport of charged and uncharged molecules across articular cartilage with the aid of recently developed experimental and numerical methods.

Uno Sperimentale e Finite Element protocollo per indagare il trasporto di soluti neutri e carichi attraverso cartilagine articolare

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources

Studies in the field of microbiology rely on the implementation of a wide range of methodologies. In particular, the development of appropriate methods substantially contributes to providing extensive knowledge of the metabolism of microorganisms growing in chemically defined media containing unique nitrogen and carbon sources. In contrast, the management through metabolism of multiple nutrient sources, despite their broad presence in natural or industrial environments, remains virtually unexplored. This situation is mainly due to the lack of suitable methodologies, which hinders investigations.
We report an experimental strategy to quantitatively and comprehensively explore how metabolism operates when a nutrient is provided as a mixture of different molecules, i.e., a complex resource. Here, we describe its application for assessing the partitioning of multiple nitrogen sources through the yeast metabolic network. The workflow combines information obtained during stable isotope tracer experiments using selected 13C- or 15N-labeled substrates. It first consists of parallel and reproducible fermentations in the same medium, which includes a mixture of N-containing molecules; however,a selected nitrogen source is labeled each time. A combination of analytical procedures (HPLC, GC-MS) is implemented to assess the labeling patterns of targeted compounds and to quantify the consumption and recovery of substrates in other metabolites. An integrated analysis of the complete dataset provides an overview of the fate of consumed substrates within cells. This approach requires an accurate protocol for the collection of samples&#8211;facilitated by a robot-assisted system for online monitoring of fermentations&#8211;and the achievement of numerous time-consuming analyses. Despite these constraints, it allowed understanding, for the first time, the partitioning of multiple nitrogen sources throughout the yeast metabolic network. We elucidated the redistribution of nitrogen from more abundant sources toward other N-compounds and determined the metabolic origins of volatile molecules and proteinogenic amino acids.

This protocol describes an experimental procedure to quantitatively and comprehensively investigate the metabolism of multiple nutrient sources. This workflow, based on a combination of isotopic tracer experiments and an analytical procedure, allows the fate of consumed nutrients and the metabolic origin of molecules synthetized by microorganisms to be determined.

Flusso di lavoro basato sulla combinazione di tracciante isotopico esperimenti per studiare il metabolismo microbico di più fonti di nutrienti

Studies in the field of microbiology rely on the implementation of a wide range of methodologies. In particular, the development of appropriate methods ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

Fabbricazione di una matrice di multiplex artificiale microambiente cellulare

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and allostasis. Moreover, dysregulated protease activity drives pathogenesis and is a functional biomarker of diseases such as cancer; therefore, the ability to detect protease activity in vivo may provide clinically relevant information for biomedical diagnostics. The goal of this protocol is to create nanosensors that probe for protease activity in vivo by producing a quantifiable signal in urine. These protease nanosensors consist of two components: a nanoparticle and substrate. The nanoparticle functions to increase circulation half-life and substrate delivery to target disease sites. The substrate is a short peptide sequence (6-8 AA), which is designed to be specific to a target protease or group of proteases. The substrate is conjugated to the surface of the nanoparticle and is terminated by a reporter, such as a fluorescent marker, for detection. As dysregulated proteases cleave the peptide substrate, the reporter is filtered into urine for quantification as a biomarker of protease activity. Herein we describe construction of a nanosensor for matrix metalloproteinase 9 (MMP9), which is associated with tumor progression and metastasis, for detection of colorectal cancer in a mouse model.

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are tightly regulated enzymes involved in fundamental biological processes, and dysregulated protease activity drives progression of complex diseases such as cancer. This method&#39;s goal is to create nanosensors that measure protease activity in vivo by producing a cleavage signal that is detectable from host urine and discriminates disease.

Nanosensori per rilevare attività della proteasi In Vivo per la diagnostica non invasiva

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...