Bu eser (çalışma hibe CMM) Krembil Vakfı tarafından finanse edilmektedir. WX Carlton Marguerite Smith Öğrenci Ödülü alıcı oldu. NL bir Ontario lisansüstü öğrenim bursu aldım.

Bu iletişim kuralı Toronto Üniversitesi, hayvan bakımı Komitesi tarafından kabul edildi ve "Kılavuzu için bakım ve kullanım, deneysel hayvan uygun olarak" (2nd Edition, hayvan bakımı, Kanada Konseyi 2017).
1. en az omurilik yaralanma cerrahi
Not: ameliyat öncesi tüm cerrahi aletler ve malzemeler uygun yöntemlerle (Şekil 1A) sterilize emin olun.
<ol><li>Gazlı bez 4 – 5 karelerinin haddeleme ve onları birlikte gazlı bez sabit bir rulo elde etmek için ortada taping tarafından bir göğüs destek kemer oluşturmak.</li>
	<li>İndüksiyon odasında fareyi getirin ve anestezi ile %5 isoflurane işlemini başlatın. Devam etmeden önce yanı sıra prosedürü boyunca ayak çimdik refleks yokluğu onaylayın. Ameliyat-ebilmek almak 30 dk dan fazla tamamlamak için en az isoflurane maruz kalma (%5 5 dk) ve kalan zamanda da % 2-3 en iyi şekilde.</li>
	<li>% 2 – 3 isoflurane idame dozu, anestezik makineye bağlı bir burun konisi için fareyi aktarın. Saç kesme makineleri kürk deri ameliyat için geniş dikdörtgen bir alan ortaya çıkarmak için boyun/kulakları çok orta yedeklemek hayvandan patolojisi kaldırmak için kullanın.</li>
	<li>Fare burnu bağlı burun konisi yerleştirip kafatası kulak çubuklarla sabitleme stereotaksik bir araç olarak aktarın. Fare stereotaksik aygıtı güvenli bir kez isoflurane % 5 yerleşim kulak çubuklarının ve başa % 2 – 3 alt sırasında korumak.</li>
	<li>Ameliyat öncesi analjezik ilaçlar intraperitoneally yönetmek — Meloksikam (2.0 mg/kg). Cömertçe göz yağlama anestezi ne zaman altında kornea kuruma önlemek için açık fare gözleri üzerine uygulayın.</li>
	<li>Torasik destek kemer fare karın altında fare vücut ve omurga kuyruk temel alınarak hafifçe çekerek düzleştirme sırasında yerleştirin. Teyp etiketleme laboratuvar kuyruğu ve bir yıldız gibi pozisyon tüm genişletilmiş bacaklarda güvenliğini sağlamak için kullanın. Güvenli bir kez torasik destek kemer rostrally, üst toraks doğru fare karın üzerinden itmek — torasik omurga yukarı (Şekil 1B) desteklemek için.</li>
	<li>Steril Cerrahi alan povidone-iyot tarafından takip adım %1,3 70 etanol ile hazırlanan deri kürk Kırpılan alanı dezenfekte tarafından hazırlayın. İki kez tekrarlayın. Bir geniş steril tutmak bir steril cerrahi örtüsü uygulanır.</li>
	<li>#10 neşter bıçak kullanmadan, bir dikey kesi torasik omurga eğriliği için paralel hayvanın boyuna ekseni olarak her iki kürek kemikleri orta noktasından olun. Yumuşak doku ve omurga dağılımı (Şekil 1 c) duyurmak cilt geri çek.</li>
	<li>Supraskapular yağ yastığı (T4/5 vertebra düzeyi demarcates) alt kenarını tanımlamak. Aynı #10 bıçakla geri-kas tendon sütundan ayırmak için vertebra kemik T5-T8/9 her iki tarafında boyunca dikkatle ama bir güçle, kesin.</li>
	<li>Ekartör diş omurganın her iki tarafında kesi siteleri ekleyin. Yeterince omurga retrakte kas tabakaları (Şekil 1 d) üzerinde çok fazla yük koymadan yükseltmesine ekartör genişleterek pozlamayı ayarlayın.</li>
	<li>Cerrahi mikroskop altında kalan kas ve diğer yumuşak doku vertebra kemik (Şekil 1E) ortaya çıkarmak için omurga örten dikkatle temizleyin. Vertebra spinöz proses ile dişli forseps clasping ve biraz yukarı hareket ettirerek kaldırılacak ve aşağı omurga tanımlayın. Not: Bu kimlik intervertebral eklemlerin izin ve faiz vertebra altında küçük açıklıklar (intervertebral foramina) ortaya çıkarmak.</li>
	<li>Maruz intervertebral deliği, eksize için vertebra lamina için kaudal her iki tarafındaki eğri körelmenin makas bir kafa yerleştirin ve çift taraflı bağlantı intervertebral eklem kesti.</li>
	<li>Lamina yukarı kaldırın ve lamina yalıtmak ve kemiği kaldırmak için üst eki kesti. Not: Bu omurilik (Şekil 1F) içeren sağlam dural kese geçirecek. Aşırı olabilir hangi-ebilmek var olmak güdümlü yanında duvar ilanı kanama 1 cm x 1 cm tül üzerine etkilenen bölgelere precut ve/veya yıkama ile steril PBS.</li>
	<li>Bir dönüm noktası hizmet veren dorsal orta hat ven ile orta çizgi her iki tarafında dorsolateral spinal kord (yaklaşık 1 mm derin), yaklaşık 0,5 mm lateral yüzeyine 45 ° bükülmüş şaft (ile iğne eğim yukarı bakacak şekilde) 30 G iğne ucu yerleştirin.</li>
	<li>Kablosunu iğneyi eğimi tüm uzunluğu eklenir böylece ~ 2 mm iğne kaudal rostral (paralel) orta hat olarak taşıyın. İğne girişi (Şekil 1G) yolu ile retracing tarafından kaldırın. Not: Kanama olmalı ancak spinal dokusunun şişmesi bu adımda görülebilir.</li>
	<li>Yarayı kapatmak için Retraktörü kaldırmak ve yaralanma 6-0 absorbe dikiş kullanarak midline birlikte her iki tarafında sırt kasları dikiş. 4-0 steril ipek dikiş örten cilt daha sonra kapatmak için kullanın.</li>
	<li>Antibiyotikli bir krem ameliyat sonrası enfeksiyon bir pamuklu çubukla ucu kullanarak önlemek için yüzeysel dikilmiş deri uygulamak. Post-operatif analjezik 0.1 mg/kg buprenorfin subkutan sıvı (1 mL lactated zil'ın çözeltisi) birlikte yönetmek.</li>
	<li>İsoflurane Buharlaştırıcı ve oksijen kapatın. Stereotaksik aygıt ve yer yok yatak takımları ile temiz bir kafeste fareyi kaldırın.</li>
	<li>İçinde belgili tanımlık kafes yaklaşık 30 cm uzakta a ısı lamba Kurtarma uyanma takip anestezi ve monitör çalışma biçiminden için fareyi getirin. Fare 5-10 dk içinde uyanıyorum ve hind-ekstremite fonksiyonu ile mümkün taraflidir ve/veya kuyruk zayıflık uyanma üzerine.</li>
	<li>Önümüzdeki birkaç gün içinde fare davranışı izlemek ve uygun ameliyat sonrası bakım ve analjezikler (yani, püre, lactated zil'ın çözüm sıvı subkutan, 0.1 mg/kg buprenorfin 2 x 2 – 3 gün ve uygun ağırlık kontrolü için subkutan günlük ) uygun olarak yerel hayvan tesisi düzenlemeleri ve bireysel olarak kurtarma olarak değişebilir.</li>
</ol>2. Neurosphere tahlil diseksiyon
Not: uygun steril doku kültürü yordamları izleyin.
<ol><li>Enzimatik solüsyona hazırlık
	<ol>
<li>32 mL, Earle ün dengeli tuz çözüm (EBSS) albümin ovomucoid inhibitörü içeren cam şişe ve yavaşça eriyene kadar girdap ekleyin.</li>
		<li>EBSS 5 mL önceden alakart papain cam şişe ekleyin ve çözülmeye 37 ° C su banyosu içinde yer. Çözüm olacak (Çözüm 1) temizleyin.</li>
		<li>EBSS 500 µL alıp önceden alakart DNaz konsantrasyonu 1 mg/mL (Çözüm 2) elde etmek için şişe cam ekleyin. Şişeyi ileri geri eğerek hafifçe karıştırın ve bu karışımı 250 µL çözüm 1'e ekleyin. Not: tüm çözümleri (Çözüm 1 ve 2) yapılan doku iki adet işlenmesi için yeterlidir. Eğer daha fazla doku parçaları işleme, daha fazla çözüm hazırlık ile karşılamak.</li>
	</ol></li>
	<li>Doku hazırlık ve diseksiyonu
	<ol>
<li>Yer laboratuvar mendil isoflurane fare kafes içine batırılmış ve 2-3 dk buharlar tamamen fare anestezi için izin verir. Aşağıdaki nakavt, fare kafesinden çıkarmak ve bir ayak parmağı-çimdik refleks yokluğu onaylayın.</li>
		<li>Metal körelmiş (yani, metal kafes kartı) Hayvan ötenazi yapmak ile servikal çıkığı gerçekleştirin. Sprey cömertçe % 70 etanol ile orta arka için onun boynundan hayvan euthanized.</li>
		<li>Kafatası tabanında makas kafasını kesti ve bir biyo torbaya atmak için kullanın. İçinde belgili tanımlık deri kas ve vertebra kemik dağılımı (Şekil 2A) ortaya çıkarmak için geri tüm uzunluğu boyunca bir ensizyon olun.</li>
		<li>Her kürek kemiği medial yönünü kaldırın (i.e., kürek kemiği — yağ yastığı örten tarafından tanımlanan) ve uzak (arasında scapulae ve omurga) yumuşak doku kesmek için makas kullanın. Ayrı tamamen temel vertebral sütunun ortaya çıkarmak için.</li>
		<li>Omurga eğriliği, makas aynı çifti üst göğüs diyafram yerleştirin ve vertebral sütunun uzakta ekli kaburga, kas ve iç organlarda (Şekil 2B) keserek ayırmak.</li>
		<li>Makas kaudal vertebra deliği/ataşını ve lamina (dorsal yüzeyi) her iki tarafında intervertebral eklem kesti. Sağlam kablonun zarar vermemesi için belirli kendine iyi bak. İstenen seviyeye kadar bu işleme devam edin ve/veya kablonun uzunluğunu maruz kalmaktadır.</li>
		<li>Dikkatle yanal kordon spinal kord doku içine bir petri düzenli yapay serebrospinal sıvı ile aktarma önce uzanan spinal nerve(s) kesin. Örnek buz (Şekil 2C) üzerinde tutun.</li>
		<li>Diseksiyon mikroskop altında ~ 2 mm rostral ve kaudal yaralanma siteye eklemek omurilik doku kes. Forseps iki çift yavaşça kordon boyuna dorsal ve ventral çatlaklar boyunca 2 yarıya içine ayırmak için kullanın (Şekil 2C').</li>
		<li>Microscissors ile yaralı dorsolateral beyaz madde kesmek. 15 mL konik tüp içine yerleştirin.</li>
		<li>Bir tane tuttuğunu forseps ile omurilik yarısı alay ve beyaz madde istenen periventriküler bölge yalıtmak için spinal kord rostrocaudal ölçüde bir çift daha iyi forseps kullanarak kaldırın. Spinal kord diğer yarısı için yineleyin.</li>
		<li>Periventriküler doku parçaları ayrı 15 mL konik tüpler içine yerleştirin. Hafifçe konik tüpler duvara karşı doku kıyma ve microscissors kullanın. Not: Doku ayrılma değişiklikler Papain ayrılma sistemi Protokolü23 ve yukarıda açıklanan doku hazırlık işlemleri24vardır.</li>
		<li>Yeni çözüm 1 (adım 2.1.3) 2.5 mL için doku örneği ekleyin ve bir rock'çı 30 dk 37 ° C'de yerleştirin.</li>
		<li>Yavaşça 1.000 µL pipet ucu ile çözümde doku triturate. 300 x g RT., 5 min için de bulutlu hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi</li>
		<li>Earle ün dengeli tuz solüsyonu, ovomucoid inhibitörü çözüm (adım 2.1.1) 300 µL 2.7 mL ile çözüm 3 hazırlamak ve 150 µL DNaz, ben çözüm (adım 2.1.3).</li>
		<li>Süpernatant adım (adım 2.2.13) iptal et ve önceki adımdaki (adım 2.2.14) çözüm 3 1.5 ml resuspend.</li>
		<li>Bu yeni hücre süspansiyon (adım 2.2.15) 5 mL ovoimucoid inhibitörü çözeltisi (adım 2.1.1) kesintili yoğunluğu gradyan oluşturmak için yeni bir 15 mL tüp konik üst katman. Dik, 5 min için 300 x g , santrifüj</li>
		<li>Süpernatant atın ve 2 mL neurobasal medya resuspend. 3 dk RT. az için 300 x g , santrifüj</li>
		<li>Süpernatant atın ve 1 mL neurobasal medya resuspend. 4 mL 5 mL toplam hacmi için medyanın ardından 20 µm hücre süzgeç kullanarak süspansiyon filtre.</li>
	</ol></li>
	<li>Kaplama
	<ol>
<li>Neurobasal medya ile epidermal büyüme faktörü (20 ng/mL) ilave tarafından neurosphere büyüme için kültür ortamı hazırlamak / fibroblast büyüme faktörü (20 ng/mL) / heparin (2 µg/mL) [için kesin NSCs] veya [için ilkel NSCs] leukemina inhibitör faktörü (10 ng/mL). Her iki medya 10 mL 25 mL doku kültürü şişesi ekleyin.</li>
		<li>Bir hemasitometre ve Trypan mavi boya süspansiyon (adım 2.2.18)25hücrelerde sayısını hesaplamak için kullanın. Bir kez hesaplanır, doku kültürü şişeler (adım 2.3.1) hazırlanan hücreleri eklemek klonal yoğunluğunun eklenen hücreleri ile 10 hücre/µL ve yer doku kültürü şişesi içine kuluçka makinesi 24 h (37 ° C, % 95 nem oranı, % 5 CO2) için. Not: Sayım tekniği örneği aşağıdaki gibidir: Trypan mavi boya 10 µL ile hücre süspansiyon ve mix al 10 µL. Bu karışımdan 10 µL bir hemasitometre ekleyin. 10 X ışık mikroskobu altında canlı hücreleri sayı ve 4 / 4 x 4 çeyrek dairelerin içinde sayılan tüm hücreleri toplayın. Formülünü kullanın: 100.000/[(X cells/4) x 2 x 10 x 1.000] hücre süspansiyon her 25 mL doku kültürü şişeye klonal yoğunluğu (10 hücre/µL) sağlamak için kaplama hacmi vermek.</li>
		<li>24 h sonra yavaşça şişeye girdap ve içeriği 15 mL konik tüp içine dökün. Dik, 5 min için 300 x g , santrifüj</li>
		<li>Süpernatant atın ve 1-2 mL taze neurobasal medya hücrelerde yeniden askıya alma.</li>
		<li>2.3.2 500 µL her onların anılan sıraya göre mitojenle takıma medya (EFH kesin NSC büyüme için) ve ilkel NSC büyüme için LIF içeren bir 24-iyi doku kültürü plaka klonal yoğunluğu, süspansiyon ve plaka hücrelerde hücre sayısını saymak için adımları yineleyin. Not: x 2 x 10 x 1.000 adapte formülü (5000 / [hücre/4 X) kullanın) her şey 500 µL medya içeren kaplama için hücre süspansiyon hacmi hesaplamak için.</li>
		<li>7 gün boyunca da kuluçka (37 ° C, % 95 nem oranı, % 5 CO2) büyümeye hücreleri içeren tabak koyun.</li>
	</ol></li>
	<li>Sayma
	<ol>
<li>7 gün içinde kültür plakaları kaldırmak ve ışık mikroskop altında görüntüleyin. Neurospheres olan küresel kolonileri sayarak ölçmek > dNSCs kültürler için çapı 80 µm ve > 50 µm çapı pNSCs kültürler için. Not: arzu edilirse, neurospheres daha fazla pasajlı26 olabilir veya Ayrıştırılan. Hücreleri artık gerekiyorsa, orta renk sarı döner böylece hızlandırılmış hidrojen peroksit wells (yaklaşık 1 mL) 20 dk için ekleyerek atın. Sonra atın.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Johansson, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+neural+stem+cell+in+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system.</a> Cell. 96 (1), 25-34 (1999).</li>
<li>McKay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stem cells in the central nervous system.</a> Science. 276 (5309), 66-71 (1997).</li>
<li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287 (5457), 1433-1438 (2000).</li>
<li>Temple, S., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Stem cells in the adult mammalian central nervous system.</a> Current Opinion in Neurology. 9 (1), 135-141 (1999).</li>
<li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+neural+stem+cells+contribute+to+stroke-induced+neurogenesis+and+neuroblast+migration+toward+the+infarct+boundary+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Cerebral+Blood+Flow+And+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Activated neural stem cells contribute to stroke-induced neurogenesis and neuroblast migration toward the infarct boundary in adult rats.</a> Journal Of Cerebral Blood Flow And Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).</li>
<li>Komitova, M., Mattsson, B., Johansson, B. B., Eriksson, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enriched+environment+increases+neural+stem%2Fprogenitor+cell+proliferation+and+neurogenesis+in+the+subventricular+zone+of+stroke-lesioned+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Enriched environment increases neural stem/progenitor cell proliferation and neurogenesis in the subventricular zone of stroke-lesioned adult rats.</a> Stroke. 36 (6), 1278-1282 (2005).</li>
<li>Faiz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neural+stem+cells+from+the+subventricular+zone+give+rise+to+reactive+astrocytes+in+the+cortex+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult neural stem cells from the subventricular zone give rise to reactive astrocytes in the cortex after stroke.</a> Cell Stem Cell. 17 (5), 624-634 (2015).</li>
<li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ependymal+cell+contribution+to+scar+formation+after+spinal+cord+injury+is+minimal%2C+local+and+dependent+on+direct+ependymal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports+-+UK%22%5BJournal%5D)">Ependymal cell contribution to scar formation after spinal cord injury is minimal, local and dependent on direct ependymal injury.</a> Science Reports - UK. 7, (2017).</li>
<li>Mothe, A. J., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation%2C+migration%2C+and+differentiation+of+endogenous+ependymal+region+stem%2Fprogenitor+cells+following+minimal+spinal+cord+injury+in+the+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Proliferation, migration, and differentiation of endogenous ependymal region stem/progenitor cells following minimal spinal cord injury in the adult rat.</a> Neuroscience. 131 (1), 177-187 (2005).</li>
<li>Thuret, S., Moon, L. D., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+interventions+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Therapeutic interventions after spinal cord injury.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (8), 628-643 (2006).</li>
<li>Bethea, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemically+administered+interleukin-10+reduces+tumor+necrosis+factor-alpha+production+and+significantly+improves+functional+recovery+following+traumatic+spinal+cord+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Systemically administered interleukin-10 reduces tumor necrosis factor-alpha production and significantly improves functional recovery following traumatic spinal cord injury in rats.</a> Journal of Neurotrauma. 16 (10), 851-863 (1999).</li>
<li>Donnelly, D. J., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+its+role+in+neuroprotection%2C+axonal+regeneration+and+functional+recovery+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury.</a> Experimental Neurology. 209 (2), 378-388 (2008).</li>
<li>Cummings, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neural+stem+cells+differentiate+and+promote+locomotor+recovery+in+spinal+cord-injured+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Human neural stem cells differentiate and promote locomotor recovery in spinal cord-injured mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (39), 14069-14074 (2005).</li>
<li>Beattie, M. S., Hermann, G. E., Rogers, R. C., Bresnahan, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+in+models+of+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Cell death in models of spinal cord injury.</a> Progress in Brain Research. 137, 37-47 (2002).</li>
<li>Metz, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+the+weight-drop+contusion+model+in+rats%3A+a+comparative+study+of+human+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury.</a> Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).</li>
<li>Faulkner, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+astrocytes+protect+tissue+and+preserve+function+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury.</a> Journal of Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).</li>
<li>Cheriyan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+injury+models%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Spinal+Cord%22%5BJournal%5D)">Spinal cord injury models: a review.</a> Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).</li>
<li>Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+expansion%2C+and+differentiation+of+adult+Mammalian+neural+stem+and+progenitor+cells+using+the+neurosphere+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Cell+Transplantation%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay.</a> Neural Cell Transplantation: Methods and Protocols. , 91-101 (2009).</li>
<li>Singec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+actual+sensitivity+and+specificity+of+the+neurosphere+assay+in+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology.</a> Nature Methods. 3 (10), (2006).</li>
<li>Mignone, J. L., Kukekov, V., Chiang, A. S., Steindler, D., Enikolopov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+and+progenitor+cells+in+nestin-GFP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neural stem and progenitor cells in nestin-GFP transgenic mice.</a> The Journal of Comparative Neurology. 469 (3), 311-324 (2004).</li>
<li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+basic+protein+regulates+primitive+and+definitive+neural+stem+cell+proliferation+from+the+adult+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Myelin basic protein regulates primitive and definitive neural stem cell proliferation from the adult spinal cord.</a> Stem Cells. 35 (2), 485-496 (2017).</li>
<li>Sachewsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primitive+neural+stem+cells+in+the+adult+mammalian+brain+give+rise+to+GFAP-expressing+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Primitive neural stem cells in the adult mammalian brain give rise to GFAP-expressing neural stem cells.</a> Stem Cell Reports. 2 (6), 810-824 (2014).</li>
<li>Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.worthington-biochem.com/PDS/default.html">http://www.worthington-biochem.com/PDS/default.html</a> (2018).</li>
<li>Mothe, A., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neural+stem%2Fprogenitor+cells+from+the+periventricular+region+of+the+adult+rat+and+human+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).</li>
<li>Absher, M. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B978012427150050098X">Hemocytometer counting.</a> Tissue Culture. , 395-397 (1973).</li>
<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+the+adult+mouse+neural+stem+cells+using+the+neurosphere+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).</li>
<li>Xiong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preconditioning+with+isoflurane+produces+dose-dependent+neuroprotection+via+activation+of+adenosine+triphosphate-regulated+potassium+channels+after+focal+cerebral+ischemia+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesia+and+Analgesia%22%5BJournal%5D)">Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats.</a> Anesthesia and Analgesia. 96 (1), 233-237 (2003).</li>
<li>Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+testing+of+motor+function+in+spinal+cord+injured+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats.</a> Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).</li>
<li>Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CatWalk-assisted+gait+analysis+in+the+assessment+of+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury.</a> Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Cerrahi işlem sırasında nerede araştırmacı belirli en iyi sonuçları elde etmek ve hayvanlar arasında değişkenlik en aza indirmek için özen birkaç önemli adımlar vardır. Anestezi nöroprotektif etkileri uzun süre maruz27olduğu gösterildiği gibi (isoflurane) inhale anestezi ile ameliyat sırasında özen göstermelidir. Buna göre omurilik yaralanma takip yeniden üretim kapasitesini okurken kadar hızlı ve verimli karıştırıcı değişkenleri önlemek için mümkün olduğu...

Merkezi sinir sistemi kendi kendini yenileyerek, multipotent kök hücrelerin tüm farklı olgun sinir hücre türleri1,2,3,4' e çıkmasına kapasitesine sahip bir subpopulation içerir. Bu sinir kök hücreleri (NSCs) beyin ve omurilik özel niş yer alır ve çoğalırlar, göç ve olgun sinir hücrelerine ayırt etmek için yaralanma takip etkinleştirilebilir. NSCs ve onların Döl kortikal hasar modelleri5,6yaralanma sitedeki geçirilecek gösterilmiştir. Beyinde, NSCs nerede gliyal yara oluşumu7' ye katkıda astrocytes içine ayırt sitesine yaralanma lateral ventrikül geçirilecek gösterilmiştir. Omurilik, ancak, bu aynı endojen NSCs Medulla Spinalis Yaralanmalarında takip kurtarma tanıtmak için harnessed olabilir eğer sormak kaç çalışmalar yapılmıştır. Nitekim, şu anda bir tartışma olup doğrudan fiziksel zarar merkezi kanal8 astar periventriküler niş omurilik kök hücre havuzda aktivasyonu gerektirir veya spinal hasar (kök bırakarak parankimi kordon hücre niş olduğu gibi) endojen NSCs9etkinleştirmek yeterli olur.
Omurilik yaralanma (SCI) modeller bir dizi akut ve kronik yaralanması Patofizyoloji eğitim için kullanılmaktadır. Bu modeller de neuroprotection, immunomodulation ve gelişmekte olan hücre nakli/değiştirme stratejileri10,11,13SCI tedavisinde potansiyel tedaviler test etmek için kullanılmıştır. Geçerli modelleri büyük ölçekli fonksiyonel açıkları yanı sıra geniş lezyonlar ve kavite kordon14,15' te neden sıkıştırma ve/veya kontüzyonu yaralanmaları içerir. Sonuç gliyal izleri genişliği/çevresi omurilik16çoğunluğu ile birlikte birkaç spinal segmentler yayılabilir. Böylece, bu modeller klinik olmakla birlikte, endojen NSCs yaralanma aşağıdaki yanıt eğitimi için önemli sorunlar paraları. Daha hafif formların merkezi kanal17yedek yaralanma neden için uyarlanmış yaralanma kimyasal modellerdir. Ancak, bu tür yaralanma SCI ile ilişkili demiyelinizasyon odaklanmak ve travmatik bilimleri ile ilişkili fiziksel ve/veya mekanik hasar klinik modeli değildir
Geçerli yaralanma modellerin sınırlarını adrese, orijinal fare9, bir yetişkin fare modeli uygulama için gelişmiş bir iğne parça en az SCI modeli, adapte olması. Adapte yaralanma modelimiz tutarlı bir lezyon fare omurilik dorsolateral bölgesinin oluşturabilir ve merkezi canal yaralanma seviyelerine adlı yedek. Bu modelin avantajı bu NSC kinetik çalışma ruhsatı mı yaralanma ve onların potansiyel radyal geçiş yaralanma siteye aşağıdaki. Bir fare modeli kullanımı da soy izleme endojen NSCs ve yaralanma takip onların Döl izin transgenik fareler kullanımına izin verir. NSCs özelliklerini daha da bu protokol için tanıttı vitro neurosphere tahlil değiştirilmiş bir formu kullanarak tespit edilebilir.
Neurosphere tahlil NSCs yalıtım mitogens huzurunda izin veren bir vitro koloni oluşturan tahlil olduğunu. Klonal kaplama yoğunlukları bireysel NSCs NSCs küçük bir subpopulation ve ataları18,19büyük bir çoğunluğu oluşan hücre serbest yüzer küresel sömürgelerine çıkmasına çoğalırlar. Bizim iletişim kuralında, spinal kord periventriküler bölgesinden iki farklı ve lineally ilgili NSCs yalıtım göstermek — temel koşullar altında ve ardından en az SCI modelimiz. Kesin sinir kök hücreleri (dNSCs) hızlı testin ve gliyal fibrillary asidik protein (GFAP'nin) ve epidermal büyüme faktörü (EGF), fibroblast büyüme faktörü (FGF) ve heparin (birlikte olarak adlandırdığı EFH)20huzurunda yetiştirilmektedir. Bu dNSCs için çok az neurospheres vitrosebebiyet veren saf spinal kord nadirdir. Ancak, biz dNSCs en az SCI, periventriküler bölge21kimden izole neurospheres sayıda genişleyen takip etkinleştirilir gösterir. İlkel sinir kök hücreleri (pNSCs) ters yönde nöral kök hücre soy dNSCs. pNSCs pluripotency işaretçiyi Oct4 düşük düzeyde son derece nadir, hızlı ve lösemi inhibitör faktörü (LIF) duyarlı22. pNSCs ne zaman yetişkin fare spinal kord miyelin temel protein (MBP) birincil kültür varlığı nedeniyle gelen izole neurospheres oluşturmaz; Ancak, pNSC neurospheres MBP eksik fareler izole olabilir ve genişletilmiş aşağıdaki yaralanma onların sayılardır — dNSCs21benzer. Son olarak, biz dNSC elde edilen neurospheres erken kez en az bilm takip yaralanma siteden izole olabilir göstermek Bu bulgular bizim yaralanma modeli ve deneyleri periventriküler NSCs yeteneklerini çoğalırlar ve yaralanma yanıt olarak göç gibi etkinleştirme özellikleri değerlendirebilir göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>Agricola Retractor</td><td>Fine Science Tools</td><td>17005-04</td><td></td></tr><tr><td>Moria Vannas-Wolff Spring Scissors (Curved)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15370-50</td><td>Customize when ordering to get blunted tips</td></tr><tr><td>Graefe Forceps (Straight, 1 x 2 Teeth)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11053-10</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td>Or any other forceps for suturing</td></tr><tr><td>Hartman Hemostats (Straight)</td><td>Fine Science Tools</td><td>13002-10</td><td>Or any other appropriate for suturing</td></tr><tr><td>Scalpel Handle #3</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td>Or any other appropriate</td></tr><tr><td>Hair clippers</td><td>amazon.ca</td><td>https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA</td><td>or any other appropriate</td></tr><tr><td>Stereotaxic instrument</td><td>Stoeling</td><td>51500</td><td>or any other appropriate</td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td></td><td></td><td>or any appropirate sanctioned my animal care facility</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td></td><td></td><td>or any appropriate sanctioned by animal care facility</td></tr><tr><td>Tears Naturale P.M.</td><td>Alcon</td><td>https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE</td><td>or any other appropriate</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter International Inc</td><td>DIN 02225875</td><td>or any other appropriate for anesthesia</td></tr><tr><td>Q-tips Cottom Swabs</td><td>amazon.ca</td><td>https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&amp;amp;psc=1&amp;amp;refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Gauze</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-761-52</td><td></td></tr><tr><td>30 G Needles</td><td>Becton Dickinson</td><td>305106</td><td>For Injury</td></tr><tr><td>25 G Needles</td><td>Becton Dickinson</td><td>305122</td><td>For Drug injections</td></tr><tr><td>1 mL Syringes</td><td>Becton Dickinson</td><td>3090659</td><td>for drug injections</td></tr><tr><td>3 mL Syringes</td><td>Becton Dickinson</td><td>309657</td><td>for fluid injections</td></tr><tr><td>4-0 Suture</td><td>uoftmedstore.com</td><td>2297-VS881</td><td>for skin suturing</td></tr><tr><td>6-0 Suture</td><td>uoftmedstore.com</td><td>VS889</td><td>for muscle suturing</td></tr><tr><td>Polysporin ointment</td><td>amazon.ca</td><td>102051</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane Vaporizer</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tubes</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Any appropriate</td></tr><tr><td>Petri Dishes</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>any appropriate</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Any</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Any appropriate</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Any appropriate</td></tr><tr><td>Standard Dissection Tools</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Counting Microscope</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Neural Basal-A Medium</td><td>Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17404-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin- Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>L- Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>12100046</td><td></td></tr><tr><td>F12</td><td>Invitrogen</td><td>12700075</td><td></td></tr><tr><td>30% Glucose</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td>1 M, 9.01 g in 100 mL dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>1 M Glucose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7.5% NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>155 mM, 1.30 g in 100 mL dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>155 mM NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>23.83 g in 100 mL dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Apo-Transferrin</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>3188-AT</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P7505</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>Selenium</td><td>Sigma</td><td>S9133</td><td></td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma</td><td>P6149</td><td></td></tr><tr><td>Papain Dissociation System&amp;nbsp;</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>PDS</td><td>1 vial of papain can be used for 2 samples</td></tr><tr><td>Epidermal Growth Factor</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8041</td><td>Powder reconstituted with 1mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer</td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Factor</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0226</td><td>Powder reconstituted with 0.5 mL Hormone Mix and aliquoted into 20 &amp;mu;L vials to be stored in freezer</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor</td><td>In House</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 well Plates</td><td>NUNC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 M NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>11.69 g in 100 mL dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>1 M KCL</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>7.46 g in 100 mL dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>1 M MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td>20.33 g in 100 mL dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>108 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>C7902</td><td>1.59 g in 100 mL dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr></tbody></table>

a neurosphere assay to evaluate endogenous neural stem cell activation in a mouse model of minimal spinal cord injury

Sinir kök hücreleri (NSCs) Yetişkin memeli spinal kord nispeten mitotically sakin bir nüfus okudu vitro neurosphere tahlil kullanarak olabilir periventriküler hücre vardır. Bu koloni oluşturan tahlil NSCs cevaben bir tabak içinde eksojen faktörleri incelemek için güçlü bir araçtır; Ancak, bu aynı zamanda vivo içinde manipülasyonlar etkisi güçlü doğru anlayış ve tahlil sınırlamaları ile eğitim için kullanılabilir. Klinik ilgi bir manipülasyon yaralanma endojen NSC etkinleştirme üzerinde etkisi olduğunu. Medulla Spinalis Yaralanmalarında güncel modelleri ortak kontüzyonu, sıkıştırma ve transeksiyon modelleri şiddeti neden olarak kök hücre bulunduğu sitesinde yaralanma NSC niş imha bu çalışma için bir meydan okuma sağlar. Burada, Yetişkin fare omurilik alt torasik düzeyi (T7/8) Yüzeysel dorsolateral yüzeyde yerelleştirilmiş hasara neden olur en az yaralanma modeli açıklar. Bu yaralanma modeli yaralanma düzeyde merkezi kanal yedek ve yaralanma takip çeşitli zaman noktalarda lezyon düzeyinde bulunan NSCs analizine izin verir. İşte, nasıl neurosphere tahlil omurilik periventriküler bölge - ilkel ve kesin NSCs ikamet NSCs iki farklı ve lineally ilgili nüfus aktivasyonu çalışma için kullanılması gereken göstermektedir (pNSCs ve dNSCs, sırasıyla). Nasıl saptamak ve bu NSCs yaralanma ve beyaz madde yaralanma site düzeyinde periventriküler bölge kültür göstermektedir. Bizim ameliyat sonrası omurilik diseksiyonlarının artan sayıda pNSC ve dNSC elde edilen neurospheres periventriküler bölge yaralı iplerden denetimleri, onların harekete geçirmek yolu ile yaralanma konuşan göre göster. Ayrıca, yaralanma, dNSC elde edilen neurospheres yaralanma sitesinden ayrılmış olabilir — NSCs onların periventriküler niş yaralanma sitelere geçirme yeteneği gösteren.

Ameliyat, kuyruk ve olası hind-bacak taraflidir için en fazla 24 saat içeren en az motor açıkları fareler deneyim gerekir. Bu saatten sonra fareler hiçbir hind-felç ve/veya taraflidir ve minimal değişiklikler yürüyüş deneyim gerekir.
Şekil 3 5 gün en az Medulla Spinalis Yaralanmalarında temsilcisi neurosphere tahlil sonuçlarını gösterir. DNSC elde edilen neurospheres (EFH içind...

Watch this Scientific Journal Video about A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenous Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury at JoVE.com

A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenous Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury

Endojen nöral kök hücre etkinleştirme en az Medulla Spinalis Yaralanmalarında, fare modeli değerlendirmek için bir Neurosphere tahlil

Burada, biz orta kanal niş konut endojen sinir kök hücreleri (NSCs) yedek bir yetişkin fare en az omurilik yaralanma modelinde performansını göstermek. Neurosphere tahlil harekete geçirmek ve yaralanma takip kesin ve ilkel NSCs geçirilmesi ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Neural stem cells (NSCs) in the adult mammalian spinal cord are a relatively mitotically quiescent population of periventricular cells that can be studied ...

a-neurosphere-assay-to-evaluate-endogenous-neural-stem-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.9K Görüntüleme.  University of Toronto. Burada, biz orta kanal niş konut endojen sinir kök hücreleri (NSCs) yedek bir yetişkin fare en az omurilik yaralanma modelinde performansını göstermek. Neurosphere tahlil harekete geçirmek ve yaralanma takip kesin ve ilkel NSCs geçirilmesi ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Video: A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenous Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of multipotent, self-renewing, and expandable neural stem cells. In serum conditions, these multipotent NSPCs will differentiate, generating neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. The harvested tissue is enzymatically dissociated in a papain-EDTA solution and then mechanically dissociated and separated through a discontinuous density gradient to yield a single cell suspension which is plated in neurobasal medium supplemented with epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), and heparin. Adult rat spinal cord NSPCs are cultured as free-floating neurospheres and adult human spinal cord NSPCs are grown as adherent cultures. Under these conditions, adult spinal cord NSPCs proliferate, express markers of precursor cells, and can be continuously expanded upon passage. These cells can be studied in vitro in response to various stimuli, and exogenous factors may be used to promote lineage restriction to examine neural stem cell differentiation. Multipotent NSPCs or their progeny can also be transplanted into various animal models to assess regenerative repair.

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

Periventriküler Yetişkin Rat Bölgesinde ve İnsan Omurilik gelen Nöral Kök / Progenitör Hücreler izolasyonu

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Gelişim Biyolojisi

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

Neurosphere Testi Yetişkin Fare Nöral Kök Hücre İzolasyonu ve Genişleme

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Nörobilim

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Neurosphere Testi kullanarak Embriyonik Fare Nöral Kök Hücre Kültürü oluşturulması

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Promotion of Survival and Differentiation of Neural Stem Cells with Fibrin and Growth Factor Cocktails after Severe Spinal Cord Injury

Neural stem cells (NSCs) can self-renew and differentiate into neurons and glia. Transplanted NSCs can replace lost neurons and glia after spinal cord injury (SCI), and can form functional relays to re-connect spinal cord segments above and below a lesion. Previous studies grafting neural stem cells have been limited by incomplete graft survival within the spinal cord lesion cavity. Further, tracking of graft cell survival, differentiation, and process extension had not been optimized. Finally, in previous studies, cultured rat NSCs were typically reported to differentiate into glia when grafted to the injured spinal cord, rather than neurons, unless fate was driven to a specific cell type. To address these issues, we developed new methods to improve the survival, integration and differentiation of NSCs to sites of even severe SCI. NSCs were freshly isolated from embryonic day 14 spinal cord (E14) from a stable transgenic Fischer 344 rat line expressing green fluorescent protein (GFP) and were embedded into a fibrin matrix containing growth factors; this formulation aimed to retain grafted cells in the lesion cavity and support cell survival. NSCs in the fibrin/growth factor cocktail were implanted two weeks after thoracic level-3 (T3) complete spinal cord transections, thereby avoiding peak periods of inflammation. Resulting grafts completely filled the lesion cavity and differentiated into both neurons, which extended axons into the host spinal cord over remarkably long distances, and glia. Grafts of cultured human NSCs expressing GFP resulted in similar findings. Thus, methods are defined for improving neural stem cell grafting, survival and analysis of in vivo findings.

Fibrin matrices containing growth factors were used to retain grafted neural stem cells into sites of complete spinal cord transection. Grafted cells completely filled the lesion cavity and differentiated into multiple neural cell types, including neurons that extended axons into host spinal cord over long distances.

Şiddetli Spinal Kord Yaralanması sonra fibrin ve Büyüme Faktörü kokteyller ile Nöral Kök Hücre Survival ve Farklılaşma Tanıtım

Neural stem cells (NSCs) can self-renew and differentiate into neurons and glia. Transplanted NSCs can replace lost neurons and glia after spinal cord ...

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can be used both to investigate the biological responses to injury and to test potential therapies. Contusion or compression injury delivered to the surgically exposed spinal cord are the most widely used models of the pathology. In this report the experimental contusion is performed by using the Infinite Horizon (IH) Impactor device, which allows the creation of a reproducible injury animal model through definition of specific injury parameters. Stem cell transplantation is commonly considered a potentially useful strategy for curing this debilitating condition. Numerous studies have evaluated the effects of transplanting a variety of stem cells. Here we demonstrate an adapted method for spinal cord injury followed by tail vein injection of cells in CD1 mice. In short, we provide procedures for: i) cell labeling with a vital tracer, ii) pre-operative care of mice, iii) execution of a contusive spinal cord injury, and iv) intravenous administration of post mortem neural precursors. This contusion model can be utilized to evaluate the efficacy and safety of stem cell transplantation in a regenerative medicine approach.

Spinal cord injury is a traumatic condition that causes severe morbidity and high mortality. In this work we describe in detail a contusion model of spinal cord injury in mice followed by a transplantation of neural stem cells.

Omurilik Yaralanması Deneysel Kontuzif Modelinde Sinir Kök Hücre Nakli

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can ...

Tıp

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal cord. A major current area of research is focused on the mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous or induced functional recovery following SCI. Spontaneous functional recovery is reported to be greater early in life, raising interesting questions about how adaptive plasticity changes as the spinal cord develops. To facilitate investigation of this dynamic, we have developed a SCI model in the neonatal mouse. The model has relevance for pediatric SCI, which is too little studied. Because neural plasticity in the adult involves some of the same mechanisms as neural plasticity in early life1, this model may potentially have some relevance also for adult SCI. Here we describe the entire procedure for generating a reproducible spinal cord compression (SCC) injury in the neonatal mouse as early as postnatal (P) day 1. SCC is achieved by performing a laminectomy at a given spinal level (here described at thoracic levels 9-11) and then using a modified Yasargil aneurysm mini-clip to rapidly compress and decompress the spinal cord. As previously described, the injured neonatal mice can be tested for behavioral deficits or sacrificed for ex vivo physiological analysis of synaptic connectivity using electrophysiological and high-throughput optical recording techniques1. Earlier and ongoing studies using behavioral and physiological assessment have demonstrated a dramatic, acute impairment of hindlimb motility followed by a complete functional recovery within 2 weeks, and the first evidence of changes in functional circuitry at the level of identified descending synaptic connections1.

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

Bir Yenidoğan Fare Omurilik Sıkıştırma Yaralanması Modeli

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

Yalıtım ve kültür embriyonik fare nöral kök hücrelerin

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal (P1&#8722;3) Mouse Neurogenic Niches

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including proliferation, self-renewal and multipotency. In the postnatal and adult brain, NSPCs are mainly present in two neurogenic niches: the subventricular zone (SVZ) lining the lateral ventricles and the subgranular zone of the hippocampal dentate gyrus (DG). The isolation of the neurogenic niches from postnatal brain allows obtaining a higher amount of NSPCs in culture with a consequent advantage of higher yields. The close contact between cells within each neurosphere creates a microenvironment that may resemble neurogenic niches. Here, we describe, in detail, how to generate SVZ- and DG-derived neurosphere cultures from 1&#8722;3-day-old (P1&#8722;3) mice, as well as passaging, for neurosphere expansion. This is an advantageous approach since the neurosphere assay allows a fast generation of NSPC clones (6&#8722;12 days) and contributes to a significant reduction in the number of animal usage. By plating neurospheres in differentiative conditions, we can obtain a pseudomonolayer of cells composed of NSPCs and differentiated cells of different neural lineages (neurons, astrocytes and oligodendrocytes) allowing the study of the actions of intrinsic or extrinsic factors on NSPC proliferation, differentiation, cell survival and neuritogenesis.

In this article, we describe, in detail, a protocol for the generation of neurosphere cultures from postnatal mouse neural stem cells derived from the main mouse neurogenic niches. Neurospheres are used to identify neural stem cells from brain tissue allowing the estimation of precursor cell numbers. Moreover, these 3D structures can be plated in differentiative conditions, giving rise to neurons, oligodendrocytes and astrocytes, allowing the study of cell fate.

Postnatal (P1−3) Fare Nörojenik Nişlerden Nörosferlerin İzolasyon ve Genişlemesi

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Nöral Kök Hücrelerin Sıçan ve Fare Beynine İntra-Arteriyel Teslimatı: Serebral İskemiye Uygulama

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

NPC Neurosphere Assay: An In Vitro Assay to Assess the Migratory Response of Neural Precursor Cells from the Neurosphere

Source: Williams, M. et al. <a href="https://www.jove.com/v/56628/rapid-detection-neurodevelopmental-phenotypes-human-neural-precursor">Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs).</a>&#160;J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates the neural precursor cell neurosphere migration assay&#8212;an in vitro assay to study the migratory response of neural precursor cells from the neurosphere&#8212;via microscopic analysis.

NPC Nörosfer Testi: Nörosferden Nöral Öncü Hücrelerin Göç Tepkisini Değerlendirmek İçin Bir İn Vitro Test

Source: Williams, M. et al. Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs).&#160;J. Vis. Exp. (2018)
This video ...