The authors would like to acknowledge support from Spinal Cord Injury Ontario, the Ontario-China Research and Innovation Fund, the Toronto General and Western Hospital Foundation, and Physicians&#8217; Services Incorporated Foundation. The authors thank Dr. Tasneem Zahir for expert advice in human spinal cord NSPC culture, and Drs. Cindi Morshead and Iris Kulbatski for their expert advice in rat spinal cord NSPC isolation.

Bütün hayvan prosedürleri Hayvan Bakımı Kanada Konseyi tarafından hazırlanan Deney Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Kılavuzu kurulan politikalarına uygun olarak, ON Canada Hayvan Bakım Üniversitesi Sağlık Ağı Komitesi, Toronto tarafından onaylanmıştır. İnsan omurilik dokusu hasat için onay Üniversitesi Sağlık Ağı Araştırma Etik Kurulu ve Ontario, Kanada&#39;da organ bağışı denetleyen Hayat Vakfı Trillium-Hediyelik elde edilmiştir. Diseksiyon Tamponlar ve Kültür Medya 1. Hazırlık <ol><li> Sıçan omur iliği izolasyonu için, 100 mi diseksiyon tamponu (1 x PBS +% 0.6 glikoz + 2,% penisilin-streptomisin) ile buzdolabında hazırlar. Insan omurilik için 100 mi diseksiyon tamponu (1 x HBSS +% 0.6 glikoz + 2,% penisilin-streptomisin) ile buzdolabında hazırlar. </li><li> 37 ° C&#39;de 100 mi, serum-içermeyen ortam (SFM) ve sıcak hazırlayın. SFM hazırlamak için, 2 mM L-glutamin ilave, 100 ug / mNeurobasal-A ortama l streptomisin penisilin,% 2 B27, ve% 10 hormonu karışımı. Hormon karışımı hazırlamak için, 1 olmak:% 0.6 glikoz ihtiva eden 1 DMEM / F12 ortamı, 3 mM NaHCO 3, 5 mM HEPES, 25 ng / ml insülin, 100 ug / ml apo-transferin, 10 uM putresin, 30 nM selenyum, ve 20 nM progesteron. </li><li> EFH büyüme faktörü bakımından zenginleştirilmiş kaplama ortamı hazırlanması 37 ° C de ve sıcak (SFM 20 ng / ml, EGF, 20 ng / ml bFGF, 2 ug / ml heparin ekleme). İnsan EFH insan rekombinant büyüme faktörleri (Malzeme Tabloya bakınız) içerdiğinden emin olun. </li></ol> 2. Hasat ve Yetişkin Rat Periventriküler Omurilik Doku diseksiyonu <ol><li> Etanol diseksiyon aletleri sterilize ve önceden steril tuzlu su veya otoklav aletleri durulayın. Sıçan ver - Kişinin kuruma göre (6 8 haftalık) sodyum pentobarbital (65 mg / ml 1 cc) ya da anestezi (yani,% 4 isofluorane) doz aşımı ölümcül enjeksiyon hayvan protokolü onayladı. D% 70 etanol ile sıçan arka OUSE ve geniş diseksiyon makas ile dorsal yüzeyinde deri kaldırmak. </li><li> Dorsal yüzeyine dik makas Holding, enine arka ayaklarında üstünde vertebra sütun kesti. Uzunlamasına spinöz süreçleri ortaya çıkarmak için bir Rostral yönde vertebra sütun örten dorsal kas kesmek için küçük makas kullanın. </li><li> Maruz kuyruk ucunda başlayarak, omurilik ve omurga arasındaki boşlukta spinal kanal lateral içine ekstradural rongeurs ya da küçük bir künt kemik kesme aleti takın. Lamina içine küçük kesikler (sol kemik kemerler ve omurları her tarafında spinöz proses hakkı) yapın ve dikkatlice omuriliği (Şekil 1A-D) maruz lamina uzakta soyun. Kanatlarının açısı sığ olduğundan emin olun ve altta yatan omurilik hasarlı olup böylece kordon paralel. </li><li> Tanitima rostralinde yönde laminektomi Devamtorakal ve servikal omurilik e. </li><li> Yavaşça dikkatle kabloyu serbest bırakmak için kökleri koparmaya künt doku forseps ve kullanım microscissors omurga gelen omurilik tüketim. (1,1 yukarıda tarif edilen), 4 ° C, steril sıçan diseksiyon tampon içeren bir Petri kabındaki eksize omurilik yerleştirin. Taze hazırlanmış, 4 ° C kesme tamponu içerisinde doku durulayın kullanarak makas 1 cm uzunluğundaki parçalara (Şekil 1E) içine enine omurilik kesti. </li><li> Doku her segment için, ince forseps ile doku tutmak için bir elinizi kullanın. Diğer elinizle, özenle diseksiyon kapsamı yardımıyla örten meninksler, beyaz cevher ve gri maddenin en kaldırmak için Microscissors kullanın. Alternatif olarak, ependima ve gri madde (Şekil 1F-H) çevreleyen küçük bir miktar içeren omurilik sadece periventriküler bölgeyi terk, beyaz ve gri maddenin en uzak soymak ince forseps (4 Dumont #) kullanın.</li><li> Soğuk sıçan diseksiyonu tampon içeren bir 10 cm steril Petri kabı içine disseke periventriküler doku Havuz. </li></ol> 3. Hasat ve Yetişkin İnsan Periventriküler Omurilik Doku diseksiyonu Not: diğer organlar organ nakli için kaldırılmıştır sonra İnsan omurilik dokusu yetişkin organ nakli vericilerden hasat edilir (donörler yaş 2 ile 60 yaşları arasında değişiyordu). Hayat Programı Trillium-Hediyelik hastanın ailesi araştırma amaçlı dokusunun çıkarılması için onay alır ve biz aortik kros-klemp 2 saat içinde halatlar hasat mümkün olmuştur, öyle ki zamanında bizim hasat ekibi bildirir. Erkek ve kadın yetişkin serolojisi negatif olan donörler ve hiçbir enfeksiyon kabul edilir. <ol><li> Aynı anterior poz kullanarak anterior yaklaşımla ameliyathanede steril bir şekilde Hasat doku zaten Organ Şeffaf tarafından organ için dissekelant hasat ekibi. </li><li> Büyük kaburga serpme ve büyük kan damarları dahil geri kalan doku ve organların büyük kürek Retraktörler ile geri çekilmesi yoluyla ön omuriliğe Açığa. </li><li> Rezeke edilecek omurganın istenilen uzunlukta rostral ve kaudal ucunda intervertebral diskler yoluyla kesmek için uzun bir bıçak ile monte edilmiş bir sternum testeresi kullanın. Açı testere yaklaşık 45 ° medial spinal kanal sadece kısa durdurma omurların yan kısmından üçgen çukur kesmek için. </li><li> En blok dura ile kesme önlemek için özen kavisli keskisi ve çekiç yardımı ile istenen kesimlerin vertebralarda medial yönlerini çıkarın. Sonra yavaşça dişli forseps ile dura kaplı omurilik kaldırın ve keskin kordon rostral ve kaudal uçları insizyon. Bilateral bireysel kökleri transect uzun makas ve forseps kullanın. </li><li> 4 ° spinal kord eksize segmenti yerleştirinC, steril tampon maddesi (1x HBSS +% 0.6 glikoz + 2,% penisilin-streptomisin) doku kültürü oda taşınması için büyük bir test tüpü içinde. </li> <li> Not: Genellikle, 3 - Üst torasik spinal kord 6 cm kısmın ve / veya orta-düşük torasik seviyesi mümkün olduğu kadar çabuk dolaşımda kesilmesinden sonra steril koşullar altında ameliyathanede çıkarıldı ve soğuk steril tampon yerleştirilir . dolaşımın kesilmesi ve omurilik çıkarılması arasında geçen süre bağışı için hedeflenen organlarını toplamak için gereken zamanla değişir ve 45 dakika ile 2 saat arasında değişmektedir. Kalp ve akciğerler de kaldırıldı varsa, diseksiyon yanı sıra alt servikal kord bir kısmını hasat için çok rostrally alınabilir. </li><li> 3 saat içinde genellikle hasattan sonra en kısa sürede insan omurilik dokusu parçalara ayır. Forseps ile dura ve diğer meninksler çıkarın. Taze yapılmış 4 ° C diseksiyon tamponunda omurilik dokusu durulayın ve1 cm&#39;lik bölümler halinde enine kesilmiş. </li><li> Diseksiyon kapsamı yardımıyla, her doku kesimi için doku forseps, ince forseps ve microscissors kullanarak gri maddenin en örten meninksler, beyaz cevher tüketim ve. Soğuk insan diseksiyon tampon içeren 10 cm&#39;lik bir steril Petri kabı içine ependima ve çevresindeki gri madde küçük bir miktar içerir parçalara periventriküler doku, havuz. </li></ol> 4. İzolasyon ve Kültürleme Yetişkin Rat ve İnsan Omurilik NSPCs arasında <ol><li> Laminer akış kaputu aseptik aşağıdaki adımları uygulayın. <ol><li> Microscissors 1 mm 3 parçaya disseke sıçan ya da insan periventriküler doku kıyma. </li><li> Enzimatik malzemeler / reaktiflerin tabloda gösterildiği gibi papain ayrışma kiti kullanılarak proteolitik enzimlerle kıyılmış doku ayırmak. Not: Reaktif bileşenler 4 flakon içerir; Flakon 1: Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS) Flakon 2: Papain containing L-sistein ve EDTA, Flakon 3: Deoksiribonükleaz I (DNase) Flakon 4: Sığır serum albümini (BSA) ile ovomukoid proteaz inhibitörü. Not: Not: Papain protein yüzeyler için geniş özgüllüğe sahip bir sülfhidril proteazdır. papain Burada Carica papaya bitkisinden elde edilen lateks ve çok protein alt tabakaları daha kapsamlı daha pankreas proteazlar parçalayan bir. Ayrışma işlemi sırasında viskozitesini arttırır ve zor bir pipetleme yapacak ayrışma ortamı içinde serbest bazı hücre hasarının neden DNA bulunmaktadır. Bu nedenle, DNaz sağlam hücrelere zarar vermeden DNA sindirimi hücre izolasyon prosedürü dahil edilir. Ovomukaidler ayrışma aşamasından sonra papain aktivitesini inhibe etmek için kullanılan proteaz inhibitörleri glikoprotein edilir. </li></ol></li><li> İlk kullanımda, EBSS&#39;ye (şişe 1) 32 ml &#39;si ile, albümin ovomukoid inhibitörü karışımı (şişe 4) tekrar oluşturmak ve daha sonra 4 ° C de saklamak ve daha sonra izolasyonların için kullanımı.Not: Bu ovomukoid inhibitörü 10 mg, ml başına albümin 10 mg etkin bir konsantrasyonda bir çözelti elde edilir. </li><li> 0.5 mM EDTA, 1 mM L-sistein papain / ml 20 birim bir çözelti elde edildi, Papain şişe (şişe 2) ila EBSS&#39;ye (şişe 1) 5 ml ilave edilir. Papain tam enzimin tam aktivite sağlamak için eritilir gelinceye kadar on dakika için 37 ° C su banyosu içinde şişe yerleştirin tamamen çözündüğünde papain çözelti berrak görünen kontrol edin. </li><li> (3 şişe), bir DNase flakon EBSS&#39;ye (flakon 1) 500 ul ekleyin ve DNaz denatürasyonunu kesme duyarlı olarak hafifçe karıştırın. Yaklaşık 20 birim / ml papain ve% 0.005 DNase bir nihai konsantrasyonu elde papain ihtiva eden şişeye DNaz çözeltisi 250 ul ekle. Daha sonra kullanmak üzere DNaz flakonun dengesini kaydedin. </li><li> Yukarıda adım 4.4 gibi hazırlanan papain çözeltisi içinde kıyılmış sıçan veya insan dokusu yerleştirin. Insan dokusu izolasyonu için, ikisi arasında eşit olarak kıyılmış doku bölmekpapain küçük şişeler (yaklaşık 0.2 g / şişe). </li><li> Aktif papain çözeltisi içinde doku ayırmak ve bir rocker platformunda sabit bir ajitasyon ile 37 ° C&#39;de inkübe edilir. 0.4 gr, sırasıyla - yaklaşık 0.2 kıyılmış doku miktarına bağlı olarak 1-2 st için 45 1 saat dakikadır ve insan doku için, sıçan dokusu inkübe edin. </li><li> Bulanık bir hücre süspansiyonu elde etmek üzere geri kalan doku parçaları ayırmak için 10 ml&#39;lik bir pipet ile karışım toz haline getirin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de bir steril 15 ml konik tüp ve santrifüj içine hücre süspansiyonu (çözünmemiş dokusunun herhangi parçaları dahil değildir) aktarın. </li><li> Orta içeren ovomukoid bir papain inhibitörü pelet hücreleri tekrar süspansiyon. <ol><li> 15 ml konik bir tüp içinde yeniden albümin ovomukoid inhibitör çözeltisi (şişe 4) 300 | il 2.7 mi EBSS (şişe 1) karıştırılarak ovomukoid çözeltisi hazırlayın. Yukarıdaki adım 4.4 olarak kaydedildi (3 şişe) DNaz çözeltisi 150 ul ekleyin. </li><li> Süpernatant atıntanelenmiş hücreler hemen seyreltildi DNaz albümin inhibitör karışımı içinde hücre pelletini. </li></ol></li><li> Tek bir adım kesintili yoğunluk gradyan boyunca santrifüj hücre zarlarından ayrı sağlam hücreler. <ol><li> En yavaşça, 15 ml bir tüp (4 şişe), albümin-inhibitör çözeltisi 5 ml eklenmesi ve 5 ml&#39;lik bir pipet kullanılarak, aralıklı yoğunluk gradyan hazırlamak ve yavaş hücre süspansiyonu tabaka (adım 4.8 olarak yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanmıştır), albümin inhibitör çözeltisi. </li><li> Oda sıcaklığında 6 dakika için 70 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Not: Bu sınır en az bir karıştırma sonucu etkilemeyecektir gradyanın iki tabaka arasındaki ara yüz, açıkça görülmelidir. Membran fragmanları, ara yüzeyde kalır ve ayrışmış hücrelerinin, tüpün alt pelet. </li></ol></li><li> Fare hücreleri için, süpernatan atılır ve sıçan EFH ortamı, 1 ml hücre pelletini (37 ° C&#39;de önceden ısıtılmış).Bir haemositometre ile canlı hücre yoğunluğunu sayın ve EFH bölgesindeki / ul 10 hücre yoğunluğunda bir T25 kültür şişesi içine hücreleri plaka. Sıçan dokudan hücrelerin tipik verim / ml den az 10 hücre yoğunluğunda arzu edilir yaklaşık% 80 viability.If klonal kültürleri, tohum hücreleri ile yaklaşık 2 x 10 6 hücre olup. % 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de şişeler inkübe ve 1 hafta kürelerin bir araya toplanmasının engellenmesi için kültürler rahatsız büyümeye izin verir. </li><li> İnsan hücreleri için, süpernatan atılır ve insan EFH ortamı 10 ml hücre pelletini (37 ° C&#39;de önceden ısıtılmış). 40 mikron naylon hücre süzgecinden hücre süspansiyonu filtre miyelin ve hücre zarı parçalarını almak için EFH 30 ml izledi. 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ve EFH ortamı, 1 ml hücre pelletini. </li><li> Bir haemositometre ile canlı hücre yoğunluğunu sayın ve toplam hacim içinde / oyuk 10 5 hücre yoğunluğunda 6 oyuklu kültür plakaları, insan hücreleri plaka5 ml EFH / oyuk. İnsan dokusundan gelen hücrelerin tipik bir verimi, yaklaşık% 70 canlılık ile yaklaşık 1 x 10 6 hücre olup. Böyle Matrigel gibi yapışık alt tabaka ile Ön-ceket kuyuları (aşağıya Not bakınız). 1 mi SFM: 40 ul Matrigel bir oranda seyreltilir. </li><li> Not: Alternatif olarak, poli-D-lisin / laminin, fibronektin ya da kollajen gibi diğer yapışık alt tabakalar kullanılabilir. </li><li> % 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de inkübe edin ve kültürler 1 hafta için rahatsız büyümeye izin verir. </li></ol> Yetişkin sıçan ve insan omurilik NSPCs 5. Pasajlanması <ol><li> Sıçan NSPCs küçük neurospheres ilk tohumlama 1 hafta içinde çapı yaklaşık 70 mikron oluşturacaktır; , hücre süspansiyonu toplamak 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de santrifüj ve mekanik neurospheres ayırmak için hücre pelet öğütülerek haftalık geçiş sıçan NSPCs. </li><li> Taze sıçan EFH ortamı içeren T25 şişeler içine ayrışmış hücreleri Tohum. Seçenek olarak ise,Pasajlanması% 50 şartına sıçan orta kullanın. Pasajlanması de sıçan NSPCs tipik verim geçişi numarası ile katlanarak artar yaklaşık 5 x 10 6 hücre olduğunu. </li><li> İnsan kültürler, bir hafta sonra ilk kaplama, hücreler, alt-tabakaya yapışma sağlamak için haftada iki kez, taze EFH kültür ortamının yarısı değiştirin. Genel olarak, 1-2 hafta sonra hücreler, alt-tabakaya bağlanmış olan, bir kez taze EFH ile haftada iki kez kültür ortamının tüm hacmi değiştirin. </li><li> - 8 hafta 4 ila izdiham ulaşmadan Alt kültür hücreleri. <ol><li> De 37 ° C &#39;de yaklaşık olarak 10 dakika süre ile inkübe başına enzimatik substrat hücreleri ayırarak Alt kültür hücreleri, enzim 2 ml (Malzeme Tablo). 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de hücre süspansiyonu, santrifüj toplamak ve yavaşça taze yapılmış EFH ortamı, 1 ml hücre pelletini. </li><li> Bir haemositometre ile canlı hücre sayımı ve 6 oyuklu kültür plakaları içine hücreleri plaka (ön-koYukarıdaki adım 4.12), 10 5 hücre yoğunluğunda / kuyuda / oyuk 5 mi EFH bir toplam hacimde konsantre edilir. Pasajlanması insan NSPCs tipik verim yaklaşık 2 x 10 6 hücre ve genellikle bu pasajda ile iki katına çıkacak. Pasajlanması arasında haftada 3 kez - Genellikle% 50 şartına EFH orta 2 kültürleri korumak. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+neural+stem+cells.">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287, 1433-1438 (2000).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Gritti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotential+stem+cells+from+the+adult+mouse+brain+proliferate+and+self-renew+in+response+to+basic+fibroblast+growth+factor.">Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor.</a> J Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).</li><li>Morshead, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+in+the+adult+mammalian+forebrain:+a+relatively+quiescent+subpopulation+of+subependymal+cells.">Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells.</a> Neuron. 13, 1071-1082 (1994).</li><li>Weiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+CNS+stem+cells+are+present+in+the+adult+mammalian+spinal+cord+and+ventricular+neuroaxis.">Multipotent CNS stem cells are present in the adult mammalian spinal cord and ventricular neuroaxis.</a> J Neurosci. 16, 7599-7609 (1996).</li><li>Martens, D. J., Seaberg, R. M., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+infusions+of+exogenous+growth+factors+into+the+fourth+ventricle+of+the+adult+mouse+brain+increase+the+proliferation+of+neural+progenitors+around+the+fourth+ventricle+and+the+central+canal+of+the+spinal+cord.">In vivo infusions of exogenous growth factors into the fourth ventricle of the adult mouse brain increase the proliferation of neural progenitors around the fourth ventricle and the central canal of the spinal cord.</a> Eur J Neurosci. 16, 1045-1057 (2002).</li><li>Kulbatski, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocytes+and+radial+glia+derived+from+adult+rat+spinal+cord+progenitors:+morphological+and+immunocytochemical+characterization.">Oligodendrocytes and radial glia derived from adult rat spinal cord progenitors: morphological and immunocytochemical characterization.</a> J Histochem Cytochem. 55, 209-222 (2007).</li><li>Akesson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+and+neuronal+survival+after+intraspinal+transplantation+of+human+spinal+cord-derived+neurospheres.">Long-term culture and neuronal survival after intraspinal transplantation of human spinal cord-derived neurospheres.</a> Physiol Behav. 92, 60-66 (2007).</li><li>Dromard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+human+spinal+cord+harbors+neural+precursor+cells+that+generate+neurons+and+glial+cells+in+vitro.">Adult human spinal cord harbors neural precursor cells that generate neurons and glial cells in vitro.</a> J Neurosci Res. 86, 1916-1926 (2008).</li><li>Mothe, A. J., Zahir, T., Santaguida, C., Cook, D., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem/progenitor+cells+from+the+adult+human+spinal+cord+are+multipotent+and+self-renewing+and+differentiate+after+transplantation.">Neural stem/progenitor cells from the adult human spinal cord are multipotent and self-renewing and differentiate after transplantation.</a> PLoS One. 6, e27079 (2011).</li><li>Huettner, J. E., Baughman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+identified+neurons+from+the+visual+cortex+of+postnatal+rats.">Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats.</a> J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).</li><li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+the+adult+mouse+neural+stem+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat Methods. 2, 333-336 (2005).</li><li>Singec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+actual+sensitivity+and+specificity+of+the+neurosphere+assay+in+stem+cell+biology.">Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology.</a> Nat Methods. 3, 801-806 (2006).</li><li>Louis, S. A., Azari, H., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural-colony+forming+cell+assay:+an+assay+to+discriminate+bona+fide+neural+stem+cells+from+neural+progenitor+cells.">Neural-colony forming cell assay: an assay to discriminate bona fide neural stem cells from neural progenitor cells.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Louis, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+neural+stem+and+progenitor+cells+in+the+neural+colony-forming+cell+assay.">Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay.</a> Stem Cells. 26, 988-996 (2008).</li><li>Conti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-independent+symmetrical+self-renewal+of+a+mammalian+tissue+stem+cell.">Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell.</a> PLoS Biol. 3, e10 (2005).</li><li>Pollard, S. M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherent+neural+stem+(NS)+cells+from+fetal+and+adult+forebrain.">Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain.</a> Cereb Cortex. 16, i112-i120 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Sıçan omurilik dokusu bakım diseksiyonu sırasında laminektomi yaparken omurilik zarar vermemek için dikkat edilmelidir. Bu omurilik segmentleri sağlam olduğunda periventriküler doku izole etmek daha kolaydır. Doku parçaları tam olarak tahlil tamponuna daldırılmalıdır ve örten zarları ve beyaz madde microscissors boyuna şeritler gibi kesilebilir. Alternatif olarak, ince doku forseps uzakta beyaz cevher soymak için kullanılabilir. NSPCs için izolasyon prosedürü için, s...

NSPCs kendini yenilemek ve kolayca in vitro genişletebilirsiniz sinir soyu taahhüt multipotent hücrelerdir. Onlar kendini sürekli yenileyen multipotent kök hücreleri ve daha kısıtlı atalarıdır özelliklerini görüntülemek beri nöral kök / progenitör hücrelerin karışık bir nüfus olarak bu hücrelerin bakın. NSPCs fetus ve erişkin beyin ve omurilik 1,2 hem de bulunabilir. Yetişkin olarak, NSPCs normalde sakin ve yan ventriküller 2-4 astar subventriküler bölge ve spinal kord 5,6 merkez kanal çevreleyen periventriküler bölge de dahil olmak üzere belirli niş içinde bulunur. Tipik haliyle, NSPCs EGF ve bFGF ile takviye edilmiş serumsuz ortam içinde serbest yüzen neurospheres ya da yapışık mono tabakaları, kök / progenitör hücre popülasyonları için seçin Mitojenler gibi kültürlenmiştir. Başlangıçta Reynolds ve Weiss 2 tarafından geliştirilen neurosphere deneyi, en yaygın olarak kültürlemek için kullanılan vesinir kök hücreleri genişletin. Bunlar büyüme faktörü içermeyen ortam serum içeren kaplama olduğunda NSPCs nöronlar, astrositler ve oligodendrosit ayırma yöntemi, multipotency göstermektedir. Kültürlü doku, merkezi kanal 6,7 bölgeleri içerdiğinde Multipotent, kendini yenileyen NSPCs yetişkin kemirgenden omurilik izole edilmiş ve kültürlenmiş edilebilir. Diğer bölgelerden gelen hücrelerin üretilmesi aksine yetişkin omurilikten kaynaklanan NSPCs kullanarak potansiyel avantajı, bu dokuya spesifik hücrelerin en yakın yaralanma ya da hastalık şu kayıp ya da hasarlı olan omurilik hücreleri benzer olmasıdır. Önceki çalışma yetişkin insan omurilik türetilmiş neurospheres uzun vadeli yayılır veya hücre 8,9 yeterli sayıda üretmek için geçişli olamazdı gösterdi. Ancak, kültür koşullarında değişikliklerle, biz göstererek, yetişkin insan omurilik kökenli NSPCs genişletilmesi ve nakli bildirdi kendini sürekli yenileyenve multipotent NSPCs, organ nakli donörlerinin 10 yetişkin insan omurilik izole edilebilir. Öncelikle, büyüme faktörü açısından zenginleştirilmiş bir ortam içinde bir alt-tabaka üzerine yapışık diseksiyon ve bu hücrelerin kültür içinde beyaz bir maddenin en çıkarılması, yetişkin insan omurilik NSPCs çoğalan için seçildi. Bu protokolde, yetişkin sıçan ve insan organ nakli donör, periventriküler doku diseksiyonu ve NSPCs izolasyonu, kültür ve genişlemesi omurilik hasat açıklar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#10010023</td>
			<td>Dissection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#14175095</td>
			<td>Dissection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># G-6152</td>
			<td>Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#15140-148</td>
			<td>Dissection buffer and culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal-A&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#10888-022</td>
			<td>Culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine, 200mM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#25030-081</td>
			<td>Culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#12587010</td>
			<td>Culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#11885084</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#21700-075</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># S-5761</td>
			<td>Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#H9136</td>
			<td>Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#I-5500</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#T-2252</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># P7505</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#S-9133</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P-6149</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF, mouse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#E4127</td>
			<td>Prepare 100 &#956;g/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF, human recombinant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#E9644</td>
			<td>Prepare 100 &#956;g/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF, human recombinant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#F0291</td>
			<td>Prepare 100 &#956;g/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin, 10000U</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#H3149</td>
			<td>Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain dissociation kit</td>
			<td>Worthington Biochemicals</td>
			<td>#LK003150</td>
			<td>Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pentobarbital</td>
			<td>Bimeda &#8211; MTC Animal Health Inc</td>
			<td>DIN 00141704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps: Addisons</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#11006-12&#160;</td>
			<td>Serrated standard tip; micro-tip also available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps: Dumont #4</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#11241-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#15024-10</td>
			<td>Round-handled Vannas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeurs</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>N1430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mm Petri dishes&#160;</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Culture flasks</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA21008-949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>CA73520-906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, growth factor reduced (100X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 &#956;l Matrigel: 1 ml SFM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord

Yetişkin sıçan ve büyüme faktörü bakımından zenginleştirilmiş bir ortam içinde kültürlenmiş insan omurilik sinir kök / progenitör hücreleri (NSPCs) kendini yenileyen ve genişletilebilir nöral kök hücre multipotent çoğalması için izin verir. Serum koşullarda, bu multipotent NSPCs nöronlar, astrositler ve oligodendrositleri üreten, ayırt edecektir. Hasat doku bFGF (enzimatik olarak papain EDTA çözeltisi içinde çözülmüş ve daha sonra mekanik olarak, epidermal büyüme faktörü (EGF) ile desteklenmiş Neurobasal orta, temel fibroblast büyüme faktörü olduğu için kaplama, tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için ayrılmış ve kesintili bir yoğunluk gradyanı ile ayrıştırılır ) ve heparin. Yetişkin sıçan omurilik NSPCs yapışkan kültürler olarak büyütülür serbest yüzen neurospheres ve yetişkin insan omurilik NSPCs olarak kültürlenir. Bu koşullar altında, yetişkin omurilik NSPCs ön-madde hücreleri ifade belirteçleri, çoğalırlar ve sürekli geçmesi üzerine genişletilebilir. Bu hücreler olabilir bE, çeşitli uyaranlara karşı yanıt olarak, in vitro incelenmiştir ve dış faktörlerin nöral kök hücre farklılaşması incelemek için soy kısıtlama teşvik etmek için kullanılabilir. Multipotent NSPCs veya onların soyu rejeneratif onarım değerlendirmek için çeşitli hayvan modellerinde transplante edilebilir.

EFH ortam içinde süspansiyon kültürü içinde çoğaltıldığında Yetişkin sıçan omurilik hücreleri ilk kaplama 1 hafta içinde, küçük neurospheres (farklılaşmamış hücrelerin koloni) oluşturacaktır. Birincil kültürde kaplama, hücrelerin en ölür ve büyüme faktöre cevap veren bir kök hücreleri çoğalır ve EFH ortamında seçilir. Geçit 3 ile, bir çok serbest yüzen neurospheres yaklaşık 100 mikron çapında (Şekil 2A) &#39;de olacaktır. Neurospheres yuvarlak ve faz pa...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord at JoVE.com

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

Periventriküler Yetişkin Rat Bölgesinde ve İnsan Omurilik gelen Nöral Kök / Progenitör Hücreler izolasyonu

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

isolation-neural-stemprogenitor-cells-from-periventricular-region

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.1K Görüntüleme.  Toronto Western Research Institute and Krembil Neuroscience Center. The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors. 

Video: Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

İnsan Plasenta Doku türetilen İzolasyon ve mezenkimal kök Genişleme / Stromal hücreler

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Gelişim Biyolojisi

Isolation and Expansion of Adult Canine Hippocampal Neural Precursors

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural intermediacy between the rodent and human hippocampi, is therefore a valuable model in which to study adult neurogenesis. In vitro culture assays are an essential component of characterizing neurogenesis and adult neural precursor cells, allowing for precise control over the cellular environment. To date however, culture protocols for canine cells remain under-represented in the literature. Detailed here are systematic protocols for the isolation and culture of hippocampal neural precursor cells from the adult canine brain. We demonstrate the expansion of canine neural precursor cells as floating neurospheres and as an adherent monolayer culture, producing stable cell lines that are able to differentiation into mature neural cell types in vitro. Adult canine neural precursors are an underused resource that may provide a more faithful analogue for the study of human neural precursors and the cellular mechanisms of adult neurogenesis.

The canine brain is a valuable model in which to study adult neurogenesis. Presented here are protocols for isolating and expanding adult canine hippocampal neural precursor cells from primary brain tissue.

İzolasyon ve Yetişkin Köpek Hipokampal Sinir Öncüleri genişletilmesi

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

İnsan göbek bağı ve fetal plasentadan Mezenkimal Stromal Hücre İzolasyonu ve Vasıflandırılması

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. Currently, efforts are being made to regenerate damaged cartilage with ex vivo expanded chondrocytes or bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs). However, the restricted viability and instability of these cells limit their application in cartilage reconstruction. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have received scientific attention as a new alternative for regenerative applications. With unlimited self-renewal ability and multipotency, hiPSCs have been highlighted as a new replacement cell source for cartilage repair. However, obtaining a high quantity of high-quality chondrogenic pellets is a major challenge to their clinical application. In this study, we used embryoid body (EB)-derived outgrowth cells for chondrogenic differentiation. Successful chondrogenesis was confirmed by PCR and staining with alcian blue, toluidine blue, and antibodies against collagen types I and II (COL1A1 and COL2A1, respectively). We provide a detailed method for the differentiation of cord blood mononuclear cell-derived iPSCs (CBMC-hiPSCs) into chondrogenic pellets.

Here, we propose a protocol for chondrogenic differentiation from cord blood mononuclear cell-derived human induced pluripotent stem cells.

Kordon Kanından Oluşan İndüklü Pluripotent Kök Hücrelerden Kondrojenik Pellet Oluşumu

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and colleagues1. Later, others documented the existence of similar types of EPCs originating from bone marrow2,3. More recently, Yoder and Ingram showed that EPCs derived from umbilical cord blood had a higher proliferative potential compared to ones isolated from adult peripheral blood4,5,6. Apart from being involved in postnatal vasculogenesis, EPCs have also shown promise as a cell source for creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs7,8. Various isolation protocols exist, some of which involve the cell sorting of mononuclear cells (MNCs) derived from the sources mentioned earlier with the help of endothelial and hematopoietic markers, or culturing these MNCs with specialized endothelial growth medium, or a combination of these techniques9. Here, we present a protocol for the isolation and culture of EPCs using specialized endothelial medium supplemented with growth factors, without the use of immunosorting, followed by the characterization of the isolated cells using Western blotting and immunostaining.

The goal of this protocol is to isolate endothelial progenitor cells from umbilical cord blood. Some of the applications include using these cells as a biomarker for identifying patients with cardiovascular risk, treating ischemic diseases, and creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs.

Yalıtım endotelyal Progenitor Hücre insan göbek kordon kanı

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and neurite outgrowth; and later stages characterized by axon/dendrite outgrowth and synapse formation. In neurodevelopmental disorders, often one or more of these processes are disrupted, leading to abnormalities in brain formation and function. With the advent of human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology, researchers now have an abundant supply of human cells that can be differentiated into virtually any cell type, including neurons. These cells can be used to study both normal brain development and disease pathogenesis. A number of protocols using hiPSCs to model neuropsychiatric disease use terminally differentiated neurons or use 3D culture systems termed organoids. While these methods have proven invaluable in studying human disease pathogenesis, there are some drawbacks. Differentiation of hiPSCs into neurons and generation of organoids are lengthy and costly processes that can impact the number of experiments and variables that can be assessed. In addition, while post-mitotic neurons and organoids allow the study of disease-related processes, including dendrite outgrowth and synaptogenesis, they preclude the study of earlier processes like proliferation and migration. In neurodevelopmental disorders, such as autism, abundant genetic and post-mortem evidence indicates defects in early developmental processes. Neural precursor cells (NPCs), a highly proliferative cell population, may be a suitable model in which to ask questions about ontogenetic processes and disease initiation. We now extend methodologies learned from studying development in mouse and rat cortical cultures to human NPCs. The use of NPCs allows us to investigate disease-related phenotypes and define how different variables (e.g., growth factors, drugs) impact developmental processes including proliferation, migration, and differentiation in only a few days. Ultimately, this toolset can be used in a reproducible and high-throughput manner to identify disease-specific mechanisms and phenotypes in neurodevelopmental disorders.

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs

Neurodevelopmental processes such as proliferation, migration, and neurite outgrowth are often perturbed in neuropsychiatric diseases. Thus, we present protocols to rapidly and reproducibly assess these neurodevelopmental processes in human iPSC-derived NPCs. These protocols also allow the assessment of the effects of relevant growth factors and therapeutics on NPC development.

Hızlı algılama nörogelişimsel fenotipleri insan sinir habercisi hücrelerdeki (NPCs)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

Yalıtım ve kültür insan yetişkin ve Fetal kalp örnekler elde edilen birincil Epicardial hücre

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally isolated and characterized from bone marrow (BM), then acquired from tissues including adipose tissue, synovium, skin, dental pulp, and fetal appendages such as placenta, umbilical cord blood (UCB), and umbilical cord (UC). MSCs are a heterogeneous cell population with the capacity for (1) adherence to plastic in standard culture conditions, (2) surface marker expression of CD73+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19-/HLA-DR- phenotypes, and (3) trilineage differentiation into adipocytes, osteocytes, and chondrocytes, as currently defined by the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Although BM is the most widely used source of MSCs, the invasive nature of BM aspiration ethically limits its accessibility. Proliferation and differentiation capacity of MSCs obtained from BM generally decline with the age of the donor. In contrast, fetal MSCs obtained from UC have advantages such as vigorous proliferation and differentiation capacity. There is no ethical concern for UC sampling, as it is typically regarded as medical waste. Human UC starts to develop with continuing growth of the amniotic cavity at 4-8 weeks of gestation and keeps growing until reaching 50-60 cm in length, and it can be isolated during the whole newborn delivery period. To gain insight into the pathophysiology of intractable diseases, we have used UC-derived MSCs (UC-MSCs) from infants delivered at various gestational ages. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-MSCs from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

Human umbilical cord (UC) can be obtained during the perinatal period as a result of preterm, term, and postterm delivery. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-derived mesenchymal stem cells (UC-MSCs) from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

Yalıtım ve insan göbek kordonu kaynaklı mezenkimal kök hücre erken Doğum ve terim bebekler karakterizasyonu

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

3B cilt Organoid kablosu kan kaynaklı nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a differentiation state to sustain demands of the blood formation. However, it has been difficult to analyze the metabolic status (mitochondrial respiration and glycolysis) of HSPCs due to their limited numbers and lack of optimized protocols for non-adherent, fragile HSPCs. Here, we provide a set of clear, step-by-step instructions to measure metabolic respiration (oxygen consumption rate; OCR) and glycolysis (extracellular acidification rate; ECAR) of murine bone marrow-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs. This protocol provides a higher amount of LSK HSPCs from murine bone marrow, improves the viability of HSPCs during incubation, facilitates extracellular flux analyses of non-adherent HSPCs, and provides optimized injection protocols (concentration and time) for drugs targeting oxidative phosphorylation and glycolytic pathways. This method enables the prediction of the metabolic status and the health of HSPCs during blood development and diseases.

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) transition from a quiescent state to a differentiation state due to their metabolic plasticity during blood formation. Here, we present an optimized method for measuring mitochondrial respiration and glycolysis of HSPCs.