Name: healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish
Uploaded: 2018-08-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish at JoVE.com

Biz Bayan LourdesCarreon G Tan medaka tesisin bakımı ona yardım için ve Anthony Peltier açıklayıcı rakamları için teşekkür ederim. Bu eser NMBU ve Araştırma Konseyi Norveç, grant numaraları 244461 (su ürünleri programı) ve 248828 (Digital hayat Norveç programı) tarafından finanse edildi.

Tüm hayvan işleme göre bakım ve Norveççe Üniversitesi'nde araştırma hayvan refahı için öneriler yaşam bilimleri ve yetkili müfettişler gözetimi altında gerçekleştirildi.
1. hazırlanması aletleri ve çözümleri
Not: Tüm çözümler steril olmalıdır. Dikkat pH ve dikkatle okudu tür hücre dışı ortama adapte edilmelidir tüm çözümler osmolalite (osmol/kg su) verilmesi gerekir. pH ve osmolalite pH metre ve donma noktası osmometer gibi hassas elektronik ekipman ile anılan sıraya göre ayarlanmalıdır.
<ol><li>
500 mL olmadan Ca2 + ekstra hücresel çözeltisi yapmak (Ca2 + EC ücretsiz): 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.3 mM MgCl2, 4 mM glikoz, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>4,38 gram NaCl, 186.37 mg KCl, MgCl2, 360.32 mg glikoz ve HEPES 1.19 g ultrasaf 450 ml 61.89 mg dağıtılması (0,055 uS / cm 25 ° c, 18,2 MOhm direnci) H2O manyetik karıştırıcı kullanarak bir cam ölçek.</li>
		<li>PH 7,75 NaOH ile için ayarlayın.</li>
		<li>Çözüm 500 mL volumetric flask aktarın. Volumetric flask ultrasaf H2ile O kadar 500 mL doldurun.</li>
		<li>Çözüm de osmolalite ölçme önce karıştırın. 290-300 mOsm mannitol ile için ayarlayın. Filtre su vakum sistemi ve 0.2 µm filtresi kullanarak çözüm sterilize.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ekstra hücresel çözüm (EC) 500 mL olun: 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1.3 mM MgCl2, 4 mM glikoz, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>NaCl 4,38 g, KCl 186.37 mg, CaCl2147.01 mg, MgCl261.89 mg, glikoz 360.32 mg ve HEPES 1.19 g ultrasaf H2O manyetik karıştırıcı kullanarak bir cam kabı içinde 450 ml geçiyoruz.</li>
		<li>PH 7,75 NaOH ile için ayarlayın.</li>
		<li>Çözüm 500 mL volumetric flask aktarın. Volumetric flask ultrasaf H2ile O kadar 500 mL doldurun.</li>
		<li>Çözüm de osmolalite ölçme önce karıştırın. 290-300 mOsm mannitol ile için ayarlayın. Filtre su vakum sistemi ve 0.2 µm filtresi kullanarak çözüm sterilize.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
500 mL %0,1 sığır serum albumin (EC BSA ile) ile ekstra hücresel çözeltisi olun: 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1.3 mM MgCl2, 4 mM glikoz, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>NaCl 4,38 g, KCl 186.37 mg, CaCl2147.01 mg, MgCl261.89 mg, glikoz 360.32 mg ve HEPES 1.19 g ultrasaf H2O manyetik karıştırıcı kullanarak bir cam kabı içinde 450 ml geçiyoruz.</li>
		<li>PH 7,75 NaOH ile için ayarlayın.</li>
		<li>Çözüm 500 mL volumetric flask aktarın. Volumetric flask ultrasaf H2ile O kadar 500 mL doldurun.</li>
		<li>Çözüm de osmolalite ölçme önce karıştırın. 290-300 mOsm mannitol ile için ayarlayın. Filtre su vakum sistemi ve 0.2 µm filtresi kullanarak çözüm sterilize. 50 mg BSA ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
İntraselüler çözeltinin (IC) 250 mL olun: 110 mM KOH, 20 mM KCl, 10 mM Hepes, 20 mM sükroz.
	<ol>
<li>1,54 g KOH, KCl 327.75 mg, HEPES 595.75 mg ve ultrasaf H2O manyetik karıştırıcı kullanarak bir cam kabı içinde 450 ml sukroz 1,712 g geçiyoruz.</li>
		<li>PH 7.2 asitle (N-morpholino) etan sulfonic (MES) için ayarlayın.</li>
		<li>Çözüm 250 mL volumetric flask aktarın. Volumetric flask ultrasaf H2ile O kadar 250 mL doldurun.</li>
		<li>Çözüm de osmolalite ölçme önce karıştırın. Sükroz ile 280-290 mOsm (10 mOsm EC düşük) için ayarlayın. Filtre su vakum sistemi ve 0.2 µm filtresi kullanarak çözüm sterilize.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ca2 + ve BSA ücretsiz EC 100 mL % 2 düşük erime özel çözeltisi yapmak (düşük erime özel Ca2 + 100 ml 2 g ücretsiz EC). Bir mikrodalga kullanılarak dağıtılması ve erimiş özel bir su banyosu 40 ° C'de yerleştirin 40 ° C dokular üzerinde kullanmadan önce ulaşıncaya kadar aşağı soğumaya bırakın. Not: EC, ücretsiz EC 4 ° C'de birkaç hafta Eğer steril ve IC çözümleri-20 ° C'de için birkaç ay depolanabilir Ca2 + . Özel bir hafta 4 ° C'de depolanan ve 3-5 kez kısaca mikrodalga tarafından yeniden kullanılabilir. Aşırı yeniden buharlaşma ve değişiklik özel ve tuz konsantrasyonu ve kalite yol açacaktır.</li>
	<li>
Agar köprü yapmak:
	<ol>
<li>7.5 mm uzun borosilikat cam kılcal dış çap (OD) 2 mm ile ısı ve cam bend başlayıncaya kadar iç çapı (kimlik) 1.16 Bunsen burner bir odak kullanarak mm yaklaşık 1/3 bir ucundan üzerine gelin. Cam alev kaldırmak ve cam (Şekil 2A) yaklaşık 120 derecelik bir açı ile viraj izin.</li>
		<li>Normal EC %2 agar olmadan bir mikrodalga kullanarak glikoz ve özel sıvı dolgu cam ucuna birini sıvı içine koyarak ve birkaç dakika için bekleyen önceden yapılmış cam capillarity kullanarak kapiller kuvvetleri ise boğulmak. EC 4 ° C glikoz olmadan kullanımı kadar köprüleri depolamak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Borosilikat cam bir uygun pipet çektirmenin kullanarak filaman yama Pipetler ile hazırlayın. İstenen elektrot direnç elde etmek için pipet çektirme el kitabına başvurun. Not: Pipet ucu olabildiğince kısa olmalıdır. Kısa pipet konik 4-6 çekerek adımlar kullanılarak elde edilir. Elektrot direnç 2 ve 6 MΩ bağlı olarak hücre boyutu arasında olmalıdır.</li>
	<li>
Yama-kelepçe deneyler sırasında doku hareketi önlemek için kayıt odası % 0,1 oranında polyethylenimine (PEI) Bor tampon ile yüzey kat.
	<ol>
<li>Bor arabelleği (25 mM) 500 mL hazırlayın:<ol>
<li>Na2B4O710 H2O 450 ml ultrasaf H2O manyetik karıştırıcı kullanarak bir cam ölçek 4.768 g geçiyoruz.</li>
			<li>PH HCl ile 8,4 için ayarlayın.</li>
			<li>Çözüm 500 mL volumetric flask aktarın. Volumetric flask ultrasaf H2ile O su vakum sistemi kullanarak solüsyonu 500 mL ve 0.2 µm filtre sterilize dolduramazsınız.</li>
		</ol>
</li>
		<li>% 1'stok çözüm PEI (1 mL % 50 PEI 49 mL 25 mM bor arabelleğine) ve % 0.1 PEI seyreltme sulandrarak 10 µL bor arabelleği 100 µL % 1'stok çözümün nihai kullanım için hazırlayın.</li>
		<li>Dilim tutucu camın üzerine 2 mL % 0,1 PEI eklemek ve 1 dakikadır kuluçkaya kaplama. O zaman kısaca ultrasaf H2O iki kez ile 5 mL bardak yıkama ve kullanım kadar kuru hava girsin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Amfoterisin B çözümleri hazırlayın.
	<ol>
<li>60 mg/mL stok çözüm 3 mg 50 µL dimetil sülfoksit (DMSO), Amfoterisin B tozu çözülerek ışıktan korunan 1 mL tüp içinde olun. Girdap 30 için maksimum hızda s ve 15dk için homojenize solüsyon içeren temizleyicide. -20 ° C'de 3-5 tüpler içine aliquots kapaklarý takýlý günlük bir aliquot. Not: Amfoterisin B hisse senedi çözüm açık ve sarı yoksa renk ama sonra 15-20 dk sonication sütlü (hala sarı) yeni bir hisse senedi çözüm alın.</li>
		<li>IC çözüm Amfoterisin B ile IC tarafından pipetting 2 mL 10 mL kapasite fazlası ile temiz cam kabı içine olun. Amfoterisin B hisse senedi çözüm 8 µL pipet çözüm içine ve pipetting tarafından karıştırın. Alüminyum folyo ve yer ile kabı buz kadar kullanmak sarın ve her 3 h yenilemek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. diseksiyon ve Vibratome ile dilimleme
<ol><li>Diseksiyon araçları dissekan önce bir güçlü forseps ve keskin bir makasla dahil olmak üzere hazırlayın. Etanol araçlarıyla (doku tutucu, fırça, forseps) temiz ve diseksiyon amaçlı ve asla sabit dokular ile temas halinde kullanıldıkları emin olun. Onları kirlenmesini önlemek için ayrı bir kutuda tutun.</li>
	<li>1 dk. için soğuk buz suda balık ötenazi.</li>
	<li>
Hızlı bir şekilde medaka beyin ve hipofiz keskin forseps (en fazla 3 dk kullanın) incelemek için sonraki adımları izleyin.
	<ol>
<li>Balık güçlü forseps ile şiddetli gözlerinin arkasında iki görme sinirini makasla tutarak iken veya forseps keskin.</li>
		<li>Dorsal Kafatası parçası arka ön tarafına güçlü forseps ile adım adım kafatası kemikleri kırarak açın.</li>
		<li>Bir tarafta kafatası akasındaki güçlü forseps ile.</li>
		<li>Şiddetli makas veya keskin forseps ile spinal kord.</li>
		<li>Yavaşça, spinal kord forseps ile kapmak için anterior posterior beyinden flip ve buz gibi Ca2 + ücretsiz EC ile bir çanak içine yerleştirin</li>
	</ol>
</li>
	<li>İle sıvı özel bir 1,5-2 cm3 metal kalıp doldurmak ve buz üzerinde yerleştirin.</li>
	<li>Sadece özel (yaklaşık 25-30 ° C'de) katılaşır önce hafifçe beyin omurilik tarafından forseps ile kapmak, forseps iyi kağıt ile Kuru ve doku özel koymak. Hızlı bir şekilde sol doku EC izleri sulandırmak ve doku yönlendirmek ve kalıp buz üzerinde özel sertleşir kadar birkaç saniye için izin için özel karışımı. Not: Hızlı olmak için bu adım gereklidir. Metal kalıp buz tarafından soğuduktan gibi özel çabuk katılaşır.</li>
	<li>Bir neşter bıçakla doku içeren özel bir kare blok döşeme ve cerrahi (non-toksik) tutkal kullanarak vibratome numune tutucu üzerinde tutkallayın.</li>
	<li>Buz gibi Ca2 + ücretsiz EC ile numune (beyin-hipofiz) sahibi alma vibratome küvet doldurmak</li>
	<li>Vibratome yer numune tutucu ve özel blok 150 µm, yüksek frekans ve düşük hızlı kesit için kullanarak parasagittal bölümlerini yapmak için kesti. Seçili bölümleri toplamak ve buz gibi Ca2 + ücretsiz EC 3 mL ile yama-kelepçe kayıt odasına koyun</li>
	<li>Kılavuz ARP (Şekil 2B) doku bölümüne yerleştirin. Not: ARP kaplama ile birlikte doku stabilize ve yama-kelepçe kayıtları sırasında taşınmasını engelleme.</li>
	<li>ARP yer sonra Ca2 + ücretsiz EC orta ile Ca2 + normal EC ve BSA için değiştirin. 10 dk için doku dinlensin.</li>
</ol>3. delikli yama-kelepçe ve elektrofizyolojik kayıtlar
<ol><li>Deneme başlamadan önce klorür gümüş tel elektrotlar tarafından aşağıdaki adımları: Öncelikle, gümüş tel elektrot temizlemek için ince zımpara (p180) kullanın. İkinci olarak, 2 mL % 70 etanol ile yıkayın. Üçüncü olarak, 2 ml, 2-%5 klor 10 dk teller daldırma. Son olarak, 2 mL, ultrasaf H2O. durulama</li>
	<li>Kayıt odası beyin hipofiz dilim ile mikroskop aşamasında yer ve 10 X objektif kullanarak hedef alan (hipofiz) belirleyin ve 40 X objektif kullanarak hücreleri incelemek. Not: hazırlık başarılı olursa, çok az yuvarlak hücre görünür olmalıdır. Dokudan ayırma genellikle zarar görmüş hücreleri bu yuvarlak hücrelerdir.</li>
	<li>%2 agar Köprüsü üzerinden Topraklama elektrot EC banyo içine yerleştirin.</li>
	<li>40 X objektif kullanarak bir sağlıklı hücreye bulun. Not: Sağlıklı hücre olmalı sıkıca doku dilime bağlı ve değil yuvarlanır ve dilimden ilişkisi kesildi.</li>
	<li>Amplifikatör gerilim-kelepçe (VC; ayarla Şekil 4A nokta 1) modu. Açık mühür test pencere ve basın banyo yapılandırması (4B rakam noktası 1 ve 2. 5-mV nabzı pipet direnç (4B rakam noktası 3) izlemek için kullanın.</li>
	<li>Backfill IC çözüm Amfoterisin B ile mikro-dolgu kullanarak eklemeden önce antifungal ücretsiz IC çözüm ile yama pipet ucu (bkz. Şekil 3).</li>
	<li>Biraz olumlu hava basıncı 1 mL şırınga kullanarak düzeltme eki pipet ekleyin. Not: Bu uç kontaminasyon yama pipet küçük bir sıvı akışı yapar.</li>
	<li>Bir kez banyo, yama pipet direnç değerlendirmek ve hiçbir parçacıklar pipet (Şekil 4 c) ucuna bağlı emin olun. Not: Küçük bir parça bant video kayıt formu görüş alanı gösteren monitör eklenir. Bu ne zaman amaç cepten odaklanarak değil yama pipet hücreye göre daha kolay konumlandırma yapar.</li>
	<li>Yama pipet micromanipulators kullanarak hücre aşağı yol. Not: pipet pipet ucu bağlı küçük parçacıklar yaşar temiz olduğundan emin olun. Direnç ani değişiklikler de pipet ucu sıkışmış parçacıklar bir sonucu olabilir.</li>
	<li>Ne zaman bir kaç pipet yeniden düzenlemek mikron hücrenin üstündeki pipet ucu 1/3 Orta hücre, hücre Şekil 5' te gösterildiği gibi dokunmatik olacak böylece. Ne zaman hücre dokunmadan, basınç ve yumuşak emici bir mühür yapmak uygulamak. Not: Yama pipet zaman banyo başarılı bir girer mühür tutulan olabildiğince kısa. Fazla 1-1,5 Amfoterisin B sızıntı ve Pipet Ucu banyo içine ulaşan önlemek için min.</li>
	<li>Hemen yama-kelepçe yazılım (Şekil 4 D noktası 1) Düzeltme Eki penceresinde geçiş ve -50 ve -60 mV (Şekil 4 d noktası 2) arasında bir holding potansiyele sahiptir. Sıfır out hızlı kapasite Cam Pipet (Şekil 4 d 3 nokta) tarafından yapılmış.</li>
	<li>Yama-kelepçe yazılım (4E rakam noktası 1 ve 2) hücre penceresine geçin ve erişim direnç, Ra, pencerede görüntülenen izleme başlatın. Membran kapasitans amplifikatör yazılım (4E rakam noktası 3) dışarı sonra yeterli erişim sıfır. Not: Yeterli erişim 10-30 dk (4E rakam noktası 2) alabilir. Ulaşım için geçerli kelepçe kayıtları 20 M olmalıdır.</li>
	<li>Geçerli kelepçe, IC, amplifikatör yazılım penceresinde (4F rakam nokta 1) geçin. Hızlı kapasitif akımlar 3.12 olduğu gibi aynı değere amplifikatör yazılım (4F rakam noktası 2 ve 3) ben-kelepçe penceresinde ayarlayın. Membran potansiyeli (4F rakam nokta 1) kontrol edin. Not: Önemlisi, potansiyel membran sığ ise (tipik -35 yukarıda mV) hücre zarar görmüş olabilir. Kaydı iptal et ve yeni bir hücre bulma.</li>
	<li>Sağlıklı hücre bulduktan sonra (membran -40 altında potansiyel dokuyla sıkıca bağlı mV), deneysel kayıtları üreticinin iletişim kuralı 33,34detaylı olarak başlatın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Stojilkovic, S. S., Tabak, J., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+and+signaling+in+the+pituitary+gland.">Ion channels and signaling in the pituitary gland.</a> Endocr Rev. 31 (6), 845-915 (2010).</li><li>Stojilkovic, S. S., Zemkova, H., Van Goor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+basis+of+pituitary+cell+type-specific+Ca2++signaling-secretion+coupling.">Biophysical basis of pituitary cell type-specific Ca2+ signaling-secretion coupling.</a> Trends Endocrinol Metab. 16 (4), 152-159 (2005).</li><li>Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine-D2+actions+on+voltage-dependent+calcium+current+and+gonadotropin-II+secretion+in+cultured+goldfish+gonadotrophs.">Dopamine-D2 actions on voltage-dependent calcium current and gonadotropin-II secretion in cultured goldfish gonadotrophs.</a> J Neuroendocrinol. 10 (3), 175-186 (1998).</li><li>Chang, J. P., Pemberton, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+GnRH-Stimulated+signal+transduction+in+the+vertebrate+pituitary+-+Contributions+from+teleost+model+systems.">Comparative aspects of GnRH-Stimulated signal transduction in the vertebrate pituitary - Contributions from teleost model systems.</a> Mol Cell Endocrinol. , (2017).</li><li>Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inward+membrane+currents+and+electrophysiological+responses+to+GnRH+in+ovine+gonadotropes.">Inward membrane currents and electrophysiological responses to GnRH in ovine gonadotropes.</a> Neuroendocrinology. 61 (6), 609-621 (1995).</li><li>Ben-Jonathan, N., Hnasko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+as+a+Prolactin+(PRL)+Inhibitor.">Dopamine as a Prolactin (PRL) Inhibitor.</a> Endocrine Reviews. 22 (6), 724-763 (2001).</li><li>Sanchez-Cardenas, C., Hernandez-Cruz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GnRH-Induced+[Ca2+]i-signalling+patterns+in+mouse+gonadotrophs+recorded+from+acute+pituitary+slices+in+vitro.">GnRH-Induced [Ca2+]i-signalling patterns in mouse gonadotrophs recorded from acute pituitary slices in vitro.</a> Neuroendocrinology. 91 (3), 239-255 (2010).</li><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres.">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li><li>Neher, E., Baker, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Techniques in cellular physiology. , 4-19 (1981).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).</li><li>Cahalan, M., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques:+an+overview.">Patch clamp techniques: an overview.</a> Methods Enzymol. 207, 3-14 (1992).</li><li>Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single Channel Recording. , 113-114 (1983).</li><li>Lindau, M., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgE-mediated+degranulation+of+mast+cells+does+not+require+opening+of+ion+channels.">IgE-mediated degranulation of mast cells does not require opening of ion channels.</a> Nature. 319 (6049), 150-153 (1986).</li><li>Horn, R., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscarinic+activation+of+ionic+currents+measured+by+a+new+whole-cell+recording+method.">Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method.</a> J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).</li><li>Rae, J., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+access+resistance+perforated+patch+recordings+using+amphotericin+B.">Low access resistance perforated patch recordings using amphotericin B.</a> J Neurosci Methods. 37 (1), 15-26 (1991).</li><li>Fan, J. S., Palade, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforated+patch+recording+with+beta-escin.">Perforated patch recording with beta-escin.</a> Pflugers Arch. 436 (6), 1021-1023 (1998).</li><li>Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+conditions+for+primary+culture+of+pituitary+cells+from+the+Atlantic+cod+(Gadus+morhua).+The+importance+of+osmolality,+pCO(2),+and+pH.">Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO(2), and pH.</a> Gen Comp Endocrinol. 178 (2), 206-215 (2012).</li><li>Sigworth, F. J., Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording. , 3-35 (1983).</li><li>Andersen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+slices+-+a+neurobiological+tool+of+increasing+usefulness.">Brain slices - a neurobiological tool of increasing usefulness.</a> Trends in Neurosciences. 4, 53-56 (1981).</li><li>Guerineau, N. C., Bonnefont, X., Stoeckel, L., Mollard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+spontaneous+Ca2++transients+in+acute+anterior+pituitary+slices.">Synchronized spontaneous Ca2+ transients in acute anterior pituitary slices.</a> J Biol Chem. 273 (17), 10389-10395 (1998).</li><li>Levavi-Sivan, B., Bloch, C. L., Gutnick, M. J., Fleidervish, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotonic+coupling+in+the+anterior+pituitary+of+a+teleost+fish.">Electrotonic coupling in the anterior pituitary of a teleost fish.</a> Endocrinology. 146 (3), 1048-1052 (2005).</li><li>Guerineau, N. C., McKinney, R. A., Debanne, D., Mollard, P., Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+cultures+of+the+rat+anterior+pituitary:+morphology,+physiology+and+cell-to-cell+communication.">Organotypic cultures of the rat anterior pituitary: morphology, physiology and cell-to-cell communication.</a> J Neurosci Methods. 73 (2), 169-176 (1997).</li><li>Yu, Y., Ali, D. W., Chang, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+ionic+currents+and+electrophysiological+properties+of+goldfish+somatotropes+in+primary+culture.">Characterization of ionic currents and electrophysiological properties of goldfish somatotropes in primary culture.</a> Gen Comp Endocrinol. 169 (3), 231-243 (2010).</li><li>Price, C. J., Goldberg, J. I., Chang, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-activated+ionic+currents+in+goldfish+pituitary+cells.">Voltage-activated ionic currents in goldfish pituitary cells.</a> Gen Comp Endocrinol. 92 (1), 16-30 (1993).</li><li>Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+membrane+properties+and+ionic+currents+in+cultured+goldfish+gonadotrophs.">Electrical membrane properties and ionic currents in cultured goldfish gonadotrophs.</a> Can J Physiol Pharmacol. 74 (6), 729-743 (1996).</li><li>Xu, S., Shimahara, T., Cooke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitance+increases+of+dissociated+tilapia+prolactin+cells+in+response+to+hyposmotic+and+depolarizing+stimuli.">Capacitance increases of dissociated tilapia prolactin cells in response to hyposmotic and depolarizing stimuli.</a> Gen Comp Endocrinol. 173 (1), 38-47 (2011).</li><li>Haug, T. M., Hodne, K., Weltzien, F. A., Sand, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+properties+of+pituitary+cells+in+primary+culture+from+Atlantic+cod+(Gadus+morhua).">Electrophysiological properties of pituitary cells in primary culture from Atlantic cod (Gadus morhua).</a> Neuroendocrinology. 86 (1), 38-47 (2007).</li><li>Strandabo, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+involved+in+GnRH2-stimulation+of+identified+LH-producing+gonadotropes+from+lhb-GFP+transgenic+medaka+(Oryzias+latipes).">Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes).</a> Mol Cell Endocrinol. 372 (1-2), 128-139 (2013).</li><li>Hodne, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+differences+between+fshb-+and+lhb-expressing+gonadotropes+in+primary+culture.">Electrophysiological differences between fshb- and lhb-expressing gonadotropes in primary culture.</a> Endocrinology. 154 (9), 3319-3330 (2013).</li><li>Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medaka--a+model+organism+from+the+far+East.">Medaka--a model organism from the far East.</a> Nat Rev Genet. 3 (1), 53-64 (2002).</li><li>Ball, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+control+of+the+pars+distalis+in+fishes,+amphibians,+and+reptiles.">Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles.</a> Gen Comp Endocrinol. 44 (2), 135-170 (1981).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pCLAMP+10+Data+Acquisition+and+Analysis+For+Comprehensive+Electrophysiology+User+Guide.">pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis For Comprehensive Electrophysiology User Guide.</a> Molecular Devices Corporation. , (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiClamp+700B+COMPUTER-CONTROLLED+MICROELECTRODE+AMPLIFIER+Theory+and+Operation.">MultiClamp 700B COMPUTER-CONTROLLED MICROELECTRODE AMPLIFIER Theory and Operation.</a> Axon Instruments / Molecular Devices Corp. , (2005).</li><li>Dominguez-Mancera, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+regulation+of+inward+membrane+currents,+electrical+activity+and+LH+release+in+isolated+bovine+gonadotropes.">Leptin regulation of inward membrane currents, electrical activity and LH release in isolated bovine gonadotropes.</a> Biochem Biophys Res Commun. 491 (1), 53-58 (2017).</li><li>Schmidt-Nielsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Animal Physiology : adptation and environment fifth edition. , 613 (1997).</li><li>Burton, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+determinants+of+normal+arterial+plasma+pH+in+ectothermic+vertebrates.">Evolutionary determinants of normal arterial plasma pH in ectothermic vertebrates.</a> J Exp Biol. 205, 641-650 (2002).</li><li>Burton, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dependence+of+normal+arterial+blood+pH+on+sodium+concentration+in+teleost+fish.">The dependence of normal arterial blood pH on sodium concentration in teleost fish.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 114 (2), 111-116 (1996).</li><li>Heming, T. A., Blumhagen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+acid-base+and+electrolyte+states+of+rainbow+trout+exposed+to+alum+(aluminum+sulphate)+in+acidic+and+alkaline+environments.">Plasma acid-base and electrolyte states of rainbow trout exposed to alum (aluminum sulphate) in acidic and alkaline environments.</a> Aquatic Toxicology. 12 (2), 125-139 (1988).</li><li>Reeves, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+body+temperature+and+acid-base+balance+in+ectothermic+vertebrates.">The interaction of body temperature and acid-base balance in ectothermic vertebrates.</a> Annu Rev Physiol. 39, 559-586 (1977).</li><li>Baicu, S. C., Taylor, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-base+buffering+in+organ+preservation+solutions+as+a+function+of+temperature:+new+parameters+for+comparing+buffer+capacity+and+efficiency.">Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency.</a> Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).</li><li>Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Past+seawater+experience+enhances+seawater+adaptability+in+medaka,+Oryzias+latipes.">Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes.</a> Zoological Lett. 2, 12 (2016).</li><li>Cass, A., Finkelstein, A., Krespi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ion+permeability+induced+in+thin+lipid+membranes+by+the+polyene+antibiotics+nystatin+and+amphotericin+B.">The ion permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B.</a> J Gen Physiol. 56 (1), 100-124 (1970).</li><li>Holz, R., Finkelstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+water+and+nonelectrolyte+permeability+induced+in+thin+lipid+membranes+by+the+polyene+antibiotics+nystatin+and+amphotericin+B.">The water and nonelectrolyte permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B.</a> J Gen Physiol. 56 (1), 125-145 (1970).</li></ol>

Yazarlar ifşa yoktur

Elektrofizyolojik kayıtlar yama-klemp tekniği beyin hipofiz dilimleri kullanarak dikkatli optimizasyonu gerektirir. Teleosts araştırmalarda özellikle canlı hücre yürütmek için iyi optimize edilmiş memeli sistemlere dayalı iletişim kuralları kullanarak yayınlar çoğunluğu ile sınırlı iletişim kurallarıdır. Bu bağlamda, olmak önemlidir gibi parametreleri çeşitli fizyolojik pH ve osmolalite aslında farkında değil sadece tür bağımlı ama de çok bağımlı olup söz konusu organizma karada ve...

Hipofiz omurgalılarda hipotalamus aşağıda yer alan ve posterior optik hemisferlerine için anahtar bir endokrin organdır. Bu üretir ve altı ya da sekiz hormonlar belirli hücre türleri salgılar. Hipofiz hormonları beyin ve periferik organlarda arasında bir ara oluşturmaktadır ve temel fizyolojik süreçleri büyüme, üreme ve homeostasis düzenlenmesi de dahil olmak üzere geniş bir sürücü. Nöronlar, hipofiz endokrin hücreleri benzeri elektrikle heyecanlı aksiyon potansiyelleri kendiliğinden ateş yeteneği ile 1. Bu aksiyon potansiyelleri hücre bağımlı roldür. Birkaç hücre tür memeli hipofiz, Aksiyon potansiyelleri intrasellüler Ca2 + hormon 2sürekli bir sürümü için yeteri kadar yükseltebilir. Buna ek olarak, hipofiz hücreleri 3,4,5,6membran potansiyelini etkileyen beyin uyarıcı ve inhibitör bilgilerini alır. Genellikle, uyarıcı giriş uyarılabilirlik artırır ve sık sık açıklaması, Ca2 + hücre içi mağaza içerir yanı sıra frekans 7ateş arttı. Nasıl hücre iyon kanal kompozisyon kullanır ve bu giriş sinyalleri beyinden adapte anlayış hormon sentezi ve serbest bırakmak için anahtardır.
Yama-klemp tekniği 1970'lerin sonunda Sakmann ve Neher 8,9,10 tarafından geliştirilen ve Hamill 11tarafından daha da geliştirilmiş ve ayrıntılı araştırmalar hücrelerin elektrofizyolojik özellikleri sağlar tek iyon kanalları aşağı. Ayrıca, teknik akım ve gerilim eğitim için kullanılabilir. Bugün, yama sıkma elektrofizyolojik hücre özelliklerini ölçmek için altın standart 's. Dört büyük yapılandırmaları sıkı mühür yama-klemp tekniği, Gelişmiş 11gelmiş; hücre bağlı, Inside out, dış-out ve bütün hücreli yama. Üç ilk yapılandırmasından genellikle tek iyon kanal araştırmalar için kullanılır. Hücre bağlı yapılandırma aşağıdaki 4 Temmuz'da, hücre zarının delik alt atmosferik basınç kullanılarak yapılır. Bu yapılandırma aynı zamanda araştırmalar iyon kanal kompozisyon tüm cep telefonu 12sağlar. Ancak, bir bu teknik sitoplazmik molekülleri böylece okudu hücrelerinin elektrik ve fizyolojik tepkileri etkileyen yama pipet çözüm 13 tarafından (Şekil 1A), seyreltilmiş kısıtlamasıdır. Nitekim, bazı bu moleküller sinyal iletim veya farklı iyon kanalları düzenlenmesi önemli rol oynayabilir. Bunu önlemek için bir gözenek oluşturmayan bileşik yama pipet eklendiği Lindau ve Fernandez 14 bir yöntem geliştirdi. Hücre bağlı yapılandırma bileşik yama altında plazma zarı içine dahil ve yavaş yavaş elektriksel temas sitozol (Şekil 1B) ile oluşturma membran sorgulamaktı. Nistatin 15 ve Amfoterisin B 16gibi birkaç farklı antifungaller veya yüzey saponin beta-escin 17,18 gibi kullanılabilir. Bu bileşiklerin gözenekleri monovalent katyon ve Cl- difüzyon sitozol ve yama pipet arasında sitozolik düzeyini oluştururlar ve Ca2 + 15gibi daha büyük iyonları korunması sırasında izin vermek için yeterince büyük oluşturmak, 16.
Delikli yama kullanılarak meydan potansiyel yüksek serisi dirençtir. Seri direnç (Rs) ya da erişim direnç yama pipet yere göre kombine direniş bitti. Yama-kelepçe kayıtları sırasında Rs membran direnci ile paralel olacak (Rm). Rm ve Rs bir gerilim bölücü olarak paralel çalışma. İle yüksek Rs, gerilim hataları kayıtları veren Rs üzerine düşecek. Hata kaydedilen büyük akımları ile daha büyük olacak. Buna ek olarak, gerilim bölücü de böylece zamansal çözünürlük etkileyen bir alçak geçiren filtre oluşturma bağımlı sıklığıdır. (Bkz: ayrıntılı okumalar referans 19için) gerilim Na+ akımları geçişli gibi sonuç olarak, delikli yama her zaman daha büyük ve hızlı akıntılar kayıtları izin vermeyebilir. Ayrıca, Rs yama-kelepçe kayıtları, yeniden kaydedilen geçerli değişiklikleri önde gelen sırasında değişebilir. Bu nedenle, yanlış pozitif Rs ilaç uygulama sırasında değiştiği durumlarda oluşabilir.
Elektrofizyoloji dilimlenmiş doku üzerinde ilk beyin 20nöronlarda elektrofizyolojik özellikleri çalışmaya Andersen laboratuvar tarafından kullanılmıştır. Tekniği detaylı araştırmalar tek hücreleri hem de daha sağlam bir ortamda hücre-hücre iletişim ve hücre devreleri açtı. Hipofiz dilimleri yapmak için benzer bir teknik Guérineau ve ark. tarafından 1998 yılında tanıtıldı 21. ancak, değildi 2005'ten önce bu beyin hipofiz dilim hazırlık şekilde teleost 22çalışmalarda yama-kelepçe için kullanıldı. Bu çalışmada yazarlar da delikli yama-kelepçe kayıtları kullanımı bildirdi. Ancak, uzak, hipofiz hücreleri elektrofizyolojik araştırmalar çoğu memeliler ve diğer omurgalı teleost balık 1,2,22,23 de dahil olmak üzere, sadece bir avuç yapılmıştır . Teleosts içinde birincil Disosiye hücreleri 24,25,26,27,28,29tarihinde,30 neredeyse tüm çalışmaları yapıldı .
Bugünkü yazıda, sağlıklı beyin hipofiz dilimleri modeli balık medaka üzerinden hazırlanması için en iyi duruma getirilmiş bir protokol anahat. Yaklaşım birçok avantaj birincil Disosiye hücre kültürleri için karşılaştırıldığında temsil eder. İlk olarak, hücreleri ayrışmış olan hücre kültür koşulları ile karşılaştırıldığında göreceli olarak korunmuş bir ortamda kaydedilir. İkinci olarak, dilim hazırlıklar dolaylı yollar hücre-hücre iletişim 22tarafından hangi Disosiye hücre kültür koşullarda mümkün değildir aracılı çalışma izin. Ayrıca, biz nasıl yürütüleceği delikli bütün hücreli yama-klemp tekniği Amfoterisin B ile gözenek oluşturan Aracısı olarak kullanarak elde edilen doku dilimleri üzerinde elektrofizyolojik kayıtları göstermek.
Medaka Asya, öncelikle Japonya'da bulunan yerel bir küçük tatlı su balığı var. Fizyoloji, Embriyoloji ve genetik medaka, 100'den fazla yıl 31için kapsamlı bir şekilde incelenmiştir ve birçok laboratuarlarında yaygın olarak kullanılan araştırma modeli. Bu kağıt için özellikle önem farklı morfolojik teleost balık hipotalamus-hipofiz kompleks organizasyondur: memeliler ve kuşlar hipotalamik nöronlar nöro-hipofiz bezi endokrin hücreleri düzenleyen hormonları yayın ise medyan Hazretleri, portal sisteme doğrudan sinir projeksiyon teleost balık 32hipofiz endokrin hücreleri üzerine hipotalamik nöronların vardır. Böylece, dikkatle yürütülen beyin hipofiz Dilimleme 's ile balık, iyi korunmuş bir beyin hipofiz ağ hipofiz hücreleri ve özellikle nasıl hipofiz hücreleri elektrofizyolojik özellikleri araştırmak bize izin verdiği önem onların uyarılabilirlik kontrol ve böylece Ca2 + homeostazı.

<table><tbody><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgical glue</td><td>WPI</td><td>VETBOND</td><td>3M Vetbond Tissue Adhesive</td></tr><tr><td>Stainless steel blades</td><td>Campden Instruments</td><td>752-1-SS</td><td></td></tr><tr><td>metal molds</td><td>SAKURA</td><td>4122</td><td></td></tr><tr><td>steel harp</td><td>Warner instruments</td><td>64-1417</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>SIGMA</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure LMP agarose</td><td>invitrogen</td><td>166520-100</td><td></td></tr><tr><td>patch pipettes</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-110-10HP</td><td>Borosilicate with filament O.D.:1.5 mm, I.D.:1.10 mm</td></tr><tr><td>Microscope Slicescope</td><td>Scientifica</td><td>pro6000</td><td></td></tr><tr><td>P-Clamp10</td><td>Molecular Devices</td><td>#1-2500-0180</td><td>sofware</td></tr><tr><td>Digitizer Digidata 1550A1</td><td>Molecular Devices</td><td>DD1550</td><td></td></tr><tr><td>Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B</td><td>Molecular Devices</td><td>1-CV-7B</td><td></td></tr><tr><td>GnRH</td><td>Bachem</td><td>4108604</td><td>H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>pipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>amphotericin B</td><td>SIGMA</td><td>A9528</td><td>pore-forming antibiotic</td></tr><tr><td>polyethylenimine&amp;nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>P3143</td><td>50% PEI solution</td></tr><tr><td>microfiler syringe</td><td>WPI</td><td>MF28/g67-5</td><td></td></tr><tr><td>glass for the agar bridge</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF200-116-15</td><td>Borosilicate with filament O.D.:2.0 mm, I.D.:1.16 mm Fire polished</td></tr><tr><td>Micro-Manager software</td><td></td><td></td><td>Open Source Microscopy Software</td></tr><tr><td>optiMOS sCMOS camera</td><td>Qimaging</td><td>&amp;nbsp;01-OPTIMOS-R-M-16-C</td><td></td></tr><tr><td>sonicator</td><td>Elma</td><td>D-7700 singen</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SiGMA</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>SiGMA</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>SiGMA</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>SiGMA</td><td>G5400</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>SiGMA</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>SiGMA</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>SiGMA</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>SiGMA</td><td>63565</td><td></td></tr><tr><td>MES-acid</td><td>SIGMA</td><td>M0895</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA</td><td>A2153</td><td></td></tr></tbody></table>

healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish

Çok sayıda omurgalı tür, ama çok az teleost balık hipofiz hücreleri elektrofizyolojik araştırmalar yapılmıştır. Bunlar arasında açık çoğunluk Disosiye primer hücre gerçekleştirdiniz. Daha biyolojik ilgili bir ortamda davranır, nasıl teleost hipofiz hücreleri anlayışımızı geliştirmek için bu protokol küçük tatlı su balığı medaka (Oryzias latipes) kullanarak kalıcı beyin hipofiz dilimleri hazırlamak gösterilmiştir. Beyin hipofiz dilimleri yapma, pH ve tüm çözümleri osmolalite vücut sıvıları 25-28 ° C'de yaşayan tatlı su balık içinde bulunan değerleri için ayarlandı Dilim hazırlık protokol elektrofizyolojik kayıtlar delikli bütün hücreli yama-klemp tekniği kullanarak yapmak gösterilmiştir. Yama-klemp tekniği benzeri görülmemiş zamansal çözünürlük ve hassasiyet, soruşturma tek iyon kanalları aşağı olduğu gibi tüm hücrelerden elektriksel özellikleri sağlayan güçlü bir araçtır. Delikli yama yama pipet elektrot çözüm tarafından seyreltilmiş sitozol düzenleyici elemanlarının bozulmadan önleme hücre içi çevre tutar benzersizdir. Buna ek olarak, geleneksel bütün hücreli kayıtları yapılırken, bu medaka hipofiz hücreleri hızlı bir şekilde Aksiyon potansiyelleri ateş yeteneklerini kaybedecekler gözlendi. Çeşitli perforasyon teknikleri arasında bu iletişim kuralını perforasyon Amfoterisin B. mantar ilacı kullanma yamalı membran ulaşmak gösterilmiştir

Bu iletişim kuralı bir medaka transgenik hat [Tg (lhb- hrGfpII)] nerede (Lh üreten gonadotropes) hedef hücreleri kullanılarak hipofiz (gonadotrope) hücrelerden güvenilir elektrofizyolojik kayıtları elde etmek nasıl adım adım protokolünden gösterir yeşil flüoresan protein (GFP) ile etiketlenir.
Başlangıçta, tüm hücreli yapılandırma'yı kullanarak elektrofizyolojik araştırmalar yapılmıştır. An...

Watch this Scientific Journal Video about Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish at JoVE.com

Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish

Hipofiz hücreleri ile yama-klemp tekniği kullanarak elektrofizyolojik kayıtlar ardından kalıcı beyin hipofiz doku dilimleri, teleost balık medaka (Oryzias latipes), kullanarak yapmak için en iyi duruma getirilmiş bir protokol makalede delikli yama yapılandırma.

Sağlıklı beyin hipofiz dilimleri Teleost balık hipofiz hücreleri elektrofizyolojik araştırmalar için

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the ...

healthy-brain-pituitary-slices-for-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.7K Görüntüleme.  Norwegian University of Life Sciences. Hipofiz hücreleri ile yama-klemp tekniği kullanarak elektrofizyolojik kayıtlar ardından kalıcı beyin hipofiz doku dilimleri, teleost balık medaka (Oryzias latipes), kullanarak yapmak için en iyi duruma getirilmiş bir protokol makalede delikli yama yapılandırma.

Video: Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish

A Time Differential Staining Technique Coupled with Full Bilateral Gill Denervation to Study Ionocytes in Fish

Branchial ionocytes (ICs) are the functional units for ionic regulation in fish. In adults, they are found on the filamental and lamellar epithelia of the gill where they transport ions such as Na+, Cl- and Ca2+ via a variety of ion channels, pumps and exchangers. The teleost gill is extrinsically innervated by the facial (VI), glossopharyngeal (IX) and vagus (X) nerves. The IX and X nerves are also the extrinsic source of branchial IC innervation. Here, two techniques used to study the innervation, proliferation and distribution of ICs are described: a time differential staining technique and a full bilateral gill denervation technique. Briefly, goldfish are exposed to a vital mitochondrion-specific dye (e.g., MitoTracker Red) which labels (red fluorescence) pre-existing ICs. Fish were either allowed to recover for 3 - 5 days or immediately underwent a full bilateral gill denervation. After 3 - 5 days of recovery, the gills are harvested and fixed for immunohistochemistry. The tissue is then stained with an &#945;-5 primary antibody (targets Na+/K+ ATPase containing cells) in conjunction with a secondary antibody that labels all (both new and pre-existing) ICs green. Using confocal imaging, it was demonstrated that pre-existing ICs appear yellow (labelled with both a viable mitochondrion-specific dye and &#945;-5) and new ICs appear green (labelled with &#945;-5 only). Both techniques used in tandem can be applied to study the innervation, proliferation and distribution of ICs on the gill filament when fish are exposed to environmental challenges.

This manuscript describes a protocol to track the re-distribution of branchial ionocytes and their innervation using a time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation.

Tam İkili Gill Denervasyonun ile birleştiğinde A Time Diferansiyel Boyama Tekniği Balık Ionocytes Eğitim için

Branchial ionocytes (ICs) are the functional units for ionic regulation in fish. In adults, they are found on the filamental and lamellar epithelia of the ...

Gelişim Biyolojisi

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

Patch-kelepçe Kapasitans Ölçümler ve Ca 2 + Retina Dilimleri Tek Sinir Terminalleri Görüntüleme

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Nörobilim

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

İç Kulak Saç Hücreleri Patch Clamp Kayıtlar İzole Zebrafish gelen

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked seizures, epilepsy can be acquired as a result of an insult to the brain or a genetic mutation. Efforts to model seizures in animals have primarily utilized acquired insults (convulsant drugs, stimulation or brain injury) and genetic manipulations (antisense knockdown, homologous recombination or transgenesis) in rodents. Zebrafish are a vertebrate model system1-3 that could provide a valuable alternative to rodent-based epilepsy research. Zebrafish are used extensively in the study of vertebrate genetics or development, exhibit a high degree of genetic similarity to mammals and express homologs for ~85% of known human single-gene epilepsy mutations. Because of their small size (4-6 mm in length), zebrafish larvae can be maintained in fluid volumes as low as 100 &mu;l during early development and arrayed in multi-well plates. Reagents can be added directly to the solution in which embryos develop, simplifying drug administration and enabling rapid in vivo screening of test compounds4. Synthetic oligonucleotides (morpholinos), mutagenesis, zinc finger nuclease and transgenic approaches can be used to rapidly generate gene knockdown or mutation in zebrafish5-7. These properties afford zebrafish studies an unprecedented statistical power analysis advantage over rodents in the study of neurological disorders such as epilepsy. Because the "gold standard" for epilepsy research is to monitor and analyze the abnormal electrical discharges that originate in a central brain structure (i.e., seizures), a method to efficiently record brain activity in larval zebrafish is described here. This method is an adaptation of conventional extracellular recording techniques and allows for stable long-term monitoring of brain activity in intact zebrafish larvae. Sample recordings are shown for acute seizures induced by bath application of convulsant drugs and spontaneous seizures recorded in a genetically modified fish.

A simple method to record extracellular field potentials in the larval zebrafish forebrain is described. The method provides a robust in vivo read-out of seizure-like activity. This technique can be used with genetically modified zebrafish larvae carrying epilepsy-related genes or seizures evoked by administration of convulsant drugs.

Larva Zebra balığı olarak önbeyin Elektrofizyolojik Kaydı

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

Transgenik Balık Sağlam Beyin Tespit Edilen nöronlar Elektrik Aktivitesi Kayıt

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and social interactions can be best studied by observing unrestrained, freely behaving animals. Weakly electric fish (WEF) display readily observable exploratory and social behaviors by emitting electric organ discharge (EOD). Here, we describe three effective techniques to synchronously measure the EOD, body position, and posture of a free-swimming WEF for an extended period of time. First, we describe the construction of an experimental tank inside of an isolation chamber designed to block external sources of sensory stimuli such as light, sound, and vibration. The aquarium was partitioned to accommodate four test specimens, and automated gates remotely control the animals&#39; access to the central arena. Second, we describe a precise and reliable real-time EOD timing measurement method from freely swimming WEF. Signal distortions caused by the animal&#39;s body movements are corrected by spatial averaging and temporal processing stages. Third, we describe an underwater near-infrared imaging setup to observe unperturbed nocturnal animal behaviors. Infrared light pulses were used to synchronize the timing between the video and the physiological signal over a long recording duration. Our automated tracking software measures the animal&#39;s body position and posture reliably in an aquatic scene. In combination, these techniques enable long term observation of spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish in a reliable and precise manner. We believe our method can be similarly applied to the study of other aquatic animals by relating their physiological signals with exploratory or social behaviors.

We describe a set of techniques for studying spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish over an extended period of time, by synchronously measuring the animal&#39;s electric organ discharge timing, body position and posture both accurately and reliably in a specially designed aquarium tank inside a sensory isolation chamber.

Serbestçe Yüzme Zayıf Elektrik Balık Uzun vadeli Davranış Takip

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Sağlam Yetişkin Zebra balığı Beyin Elektrofizyolojik Kayıt

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one of the first organs to start functioning during development. Mechanisms of blood vessel formation have become a subject of high scientific and clinical interest. In adults however, it is difficult to visualize the vasculature in most living animals due to their localization deep within other tissues. Nevertheless, visualization of blood vessels remains important for several studies such as endocrinology and neurobiology. While several transgenic lines have been developed in zebrafish, with blood vessels directly visualized through expression of fluorescent proteins, no such tools exist for other teleost species. Using medaka (Oryzias latipes) as a model, the current protocol presents a quick and direct technique to label blood vessels in brain and pituitary by perfusing through the heart with fixative containing DiI. This protocol allows improvement of our understanding on how brain and pituitary cells interact with blood vasculature in whole tissue or thick tissue slices.

The article describes a quick protocol for labeling blood vessels in a teleost fish by cardiac perfusion of DiI diluted in fixative, using medaka (Oryzias latipes) as a model and focusing on brain and pituitary tissue.

Teleost beyin ve hipofiz kan damarlarının bir dıı-fixative ile kardiyak perfüzyon kullanarak etiketleme

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...

Biyomühendislik

Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled environment. Despite vast differences in the physiology between mammals and fish, primary cell culture protocols from fish are often based on mammalian culture conditions, often with only minor modifications. The environmental differences affect not only body temperature, but also blood serum parameters such as osmolality, pH, and pH buffer capacity. As cell culture media and similar working solutions are meant to mimic characteristics of the extracellular fluid and/or blood serum to which a cell is adapted, it is crucial that these parameters are adjusted specifically to the animal in question.
The current protocol describes optimized primary culture conditions for medaka (Oryzias latipes). The protocol provides detailed steps on how to isolate and maintain healthy dissociated pituitary cells for more than one week and includes the following steps: 1. the adjustment of the osmolality to the values found in medaka blood plasma, 2. the adjustment of the incubation temperature to normal medaka temperature (here in the aquarium facility), and 3. the adjustment of the pH and bicarbonate buffer to values comparable to other fish species living at similar temperatures. The results presented using the described protocol promote physiologically meaningful results for medaka and can be used as a reference guide by scientists making primary cell cultures from other non-mammalian species.

Here we describe a protocol to prepare and maintain primary pituitary cell cultures from medaka (Oryzias latipes). The optimized conditions in this protocol take important parameters such as temperature, osmolality, and pH into consideration by mimicking the physiological conditions of the fish, thereby enabling physiologically more meaningful results.

Balık Pituitaries bir yüksek kaliteli birincil hücre kültürü hazırlanması

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled ...

Wireless Electrophysiological Recording of Neurons by Movable Tetrodes in Freely Swimming Fish

The neural mechanisms governing fish behavior remain mostly unknown, although fish constitute the majority of all vertebrates. The ability to record brain activity from freely moving fish would advance research on the neural basis of fish behavior considerably. Moreover, precise control of the recording location in the brain is critical to studying coordinated neural activity across regions in fish brain. Here, we present a technique that records wirelessly from the brain of freely swimming fish while controlling for the depth of the recording location. The system is based on a neural logger associated with a novel water-compatible implant that can adjust the recording location by microdrive-controlled tetrodes. The capabilities of the system are illustrated through recordings from the telencephalon of goldfish.

A novel wireless technique for recording extracellular neural signals from the brain of freely swimming goldfish is presented. The recording device is composed of two tetrodes, a microdrive, a neural data logger, and a waterproof case. All parts are custom-made except for the data logger and its connector.

Serbest Yüzme Balık hareketli Tetrodes tarafından Nöronların Kablosuz Elektrofizyolojik Kayıt

The neural mechanisms governing fish behavior remain mostly unknown, although fish constitute the majority of all vertebrates. The ability to record brain ...