Agradecemos a Sra. LourdesCarreon G Tan para lhe ajuda a manter as instalações de medaka e Anthony Peltier para as figuras ilustrativas. Este trabalho foi financiado pelo NMBU e pelo Conselho de pesquisa da Noruega, concessão números 244461 (programa de aquicultura) e 248828 (programa de vida Digital Noruega).

Todo animal manipulação foi realizada de acordo com as recomendações para o cuidado e bem-estar dos animais de pesquisa na Universidade Norueguesa de Ciências da vida e sob a supervisão de pesquisadores autorizados.
1. preparação de soluções e instrumentos
Nota: Todas as soluções devem ser esterilizadas. Cuidadosa atenção deve ser dada para o pH e a pressão osmótica (osmol/kg de água) de todas as soluções, que deve ser cuidadosamente adaptada para o ambiente extracelular das espécies estudadas. pH e pressão osmótica devem ser ajustados com equipamentos eletrônicos precisos como o medidor de pH e ponto de congelamento aparelhos respectivamente.
<ol><li>
Fazer 500 mL de solução extracelular sem Ca2 + (Ca2 + livre CE): 150 mM de NaCl, 5 mM KCl, 1,3 mM MgCl2, glicose de 4 mM, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>Dissolver 4,38 g de NaCl, 186,37 mg de KCl, 61,89 mg de MgCl2, 360,32 mg de glicose e 1,19 g de HEPES em 450 mL de ultrapura (0,055 uS / cm a 25 ° C, a resistividade de 18,2 MOhm) H2O num copo de vidro, utilizando um agitador magnético.</li>
		<li>Ajuste o pH a 7.75 com NaOH.</li>
		<li>Transferi a solução para um balão volumétrico de 500 mL. Encha o balão volumétrico com ultrapura H2O até 500 mL.</li>
		<li>Misture a solução bem antes de medir a osmolalidade. Ajuste para 290 – 300 mOsm com manitol. Filtro de esterilizar a solução usando o sistema de aspiração de água e filtro de 0,2 µm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fazer 500 mL de solução extracelular (CE): 150 mM de NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, glicose de 4 mM, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>Dissolva 4,38 g de NaCl, 186,37 mg de KCl, 147,01 mg de CaCl2, 61,89 mg de MgCl2, 360,32 mg de glicose e 1,19 g de HEPES em 450 mL de ultrapura H2O num copo de vidro, utilizando um agitador magnético.</li>
		<li>Ajuste o pH a 7.75 com NaOH.</li>
		<li>Transferi a solução para um balão volumétrico de 500 mL. Encha o balão volumétrico com ultrapura H2O até 500 mL.</li>
		<li>Misture a solução bem antes de medir a osmolalidade. Ajuste para 290 – 300 mOsm com manitol. Filtro de esterilizar a solução usando o sistema de aspiração de água e filtro de 0,2 µm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fazer 500 mL de solução extracelular com 0,1% albumina de soro bovino (CE com BSA): 150 mM de NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, glicose de 4 mM, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>Dissolva 4,38 g de NaCl, 186,37 mg de KCl, 147,01 mg de CaCl2, 61,89 mg de MgCl2, 360,32 mg de glicose e 1,19 g de HEPES em 450 mL de ultrapura H2O num copo de vidro, utilizando um agitador magnético.</li>
		<li>Ajuste o pH a 7.75 com NaOH.</li>
		<li>Transferi a solução para um balão volumétrico de 500 mL. Encha o balão volumétrico com ultrapura H2O até 500 mL.</li>
		<li>Misture a solução bem antes de medir a osmolalidade. Ajuste para 290 – 300 mOsm com manitol. Filtro de esterilizar a solução usando o sistema de aspiração de água e filtro de 0,2 µm. Adicione 50 mg de BSA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fazer 250 mL de solução intracelular (IC): 110 mM KOH, 20 mM KCl, 10 mM Hepes, sacarose 20 mM.
	<ol>
<li>Dissolva 1,54 g KOH, 327,75 mg de KCl, 595,75 mg de HEPES e 1,712 g de sacarose em 450 mL de ultrapura H2O num copo de vidro, utilizando um agitador magnético.</li>
		<li>Ajuste o pH para 7.2 com (N-Morpholinos) etano (MES) sulfônico.</li>
		<li>Transferi a solução para um balão aferido de 250 mL. Encha o balão volumétrico com ultrapura H2O até 250 mL.</li>
		<li>Misture a solução bem antes de medir a osmolalidade. Ajuste a 280 – 290 mOsm (10 mOsm inferior CE) com sacarose. Filtro de esterilizar a solução usando o sistema de aspiração de água e filtro de 0,2 µm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fazer 100 mL de solução de agarose derretimento baixo de 2% de Ca2 + e BSA CE livre (livre de 2 g de agarose derretimento baixo em 100 mL de Ca2 + CE). Dissolver usando um microondas e coloque o agarose derretido em um banho de água a 40 ° C. Deixe arrefecer até atingir 40 ° C antes de usar sobre os tecidos. Nota: CE, Ca2 + CE livre pode ser armazenado a 4 ° C por várias semanas se estéril e soluções de IC a-20 ° C, durante vários meses. Agarose pode ser armazenado por uma semana a 4 ° C e pode ser reutilizado em 3 a 5 vezes por microondas brevemente. Reutilização excessiva conduzirá a evaporação e alteração de agarose e concentração de sal e de qualidade.</li>
	<li>
Fazer a ponte de ágar:
	<ol>
<li>Capilares de vidro de borosilicato longa 7,5 mm com diâmetro externo (OD) 2mm de calor e dentro diâmetro (identificação) 1,16 mm, utilizando um bico de Bunsen em um focal ponto cerca de 1/3 de uma ponta até o vidro começa a dobrar. Retirar o vidro da chama e deixar o vidro dobrar com um ângulo de cerca de 120 graus(Figura 2).</li>
		<li>Derreta 2% de ágar na CE normal sem glicose usando um microondas, e enquanto a agarose é líquido preencher o capilar usando a capilaridade de vidro pré-fabricados forças, colocando uma das extremidades do vidro no líquido e, esperando por alguns minutos. Loja pontes até o uso em 4 ° C na CE sem glicose.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare-se vidro de borosilicato com pipetas de remendo de filamento usando um extrator de pipeta apropriada. Consulte o manual do extrator de pipeta para obter a resistência desejada do eletrodo. Nota: O cone da pipeta deve ser tão curto quanto possível. Atarraxamento curta pipeta é conseguida usando-se puxando passos 4-6. A resistência do eletrodo deve ser entre 2 e 6 MΩ dependendo do tamanho da célula.</li>
	<li>
Para evitar o movimento do tecido durante os experimentos de remendo-braçadeira revestir a superfície da câmara de gravação com 0,1% do polyethylenimine (PEI) em tampão de borato.
	<ol>
<li>Prepare 500 mL de tampão de borato (25 mM):<ol>
<li>Dissolva 4,768 g de Na2B4O710 H2O em 450 mL de ultrapura H2O num copo de vidro, utilizando um agitador magnético.</li>
			<li>Ajuste o pH para 8,4 com HCl.</li>
			<li>Transferi a solução para um balão volumétrico de 500 mL. Encha o balão volumétrico com ultrapura H2O até 500 mL e 0,2 µm filtro esterilizar a solução usando o sistema de aspiração de água.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Prepare uma solução de 1% das ações de PEI (1 mL 50% PEI para 49 mL de tampão de borato 25 mM) e uma diluição de PEI 0,1% diluição 10 µ l de solução 1% em 100 µ l de tampão de borato para utilização final.</li>
		<li>Adicione 2 mL de 0.1% PEI no vidro do titular da fatia e deixe o revestimento incubar durante 1 minuto. Então brevemente lavar o copo duas vezes com 5 mL de ultrapura H2O... e deixe o ar seco até o uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prepare soluções de anfotericina B.
	<ol>
<li>Faça 60 mg/mL de solução dissolvendo-se 3 mg de anfotericina B em pó em 50 µ l dimetil sulfóxido (DMSO), em um tubo de 1 mL, protegido da luz. Vórtice na velocidade máxima por 30 s e proceda à sonicação durante 15 min homogeneizar. Armazenar as alíquotas para tubos de 3 – 5 a-20 ° C e usar a alíquota de um por dia. Nota: Se a solução estoque de anfotericina B não é clara e amarela cor mas leitoso (amarelo ainda), depois de 15 – 20 min sonication tornar-se uma nova solução.</li>
		<li>Fazer solução de IC com anfotericina B por pipetagem 2ml do IC para um copo de vidro limpo com mais de 10 mL de capacidade. Adicionar 8 µ l de solução-mãe de anfotericina B para a solução da pipeta e misture por pipetagem. Envolva o copo com folha de alumínio e coloque no gelo até o uso e renová-lo a cada 3h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. dissecção e cortar com Vibratome
<ol><li>Prepare as ferramentas de dissecação antes de dissecar, incluindo uma afiada e uma pinça forte com uma tesoura. Limpar as ferramentas (suporte do tecido, pincel, pinça) com etanol e certifique-se de que eles são usados apenas para fins de dissecação e nunca em contacto com tecidos fixos. Mantê-los em uma caixa separada para evitar contaminação.</li>
	<li>Eutanásia o peixe em água fria de gelo por 1 min.</li>
	<li>
Siga as etapas subsequentes para dissecar rapidamente o medaka cérebro e hipófise com Pinças afiadas (usar não mais que 3 min).
	<ol>
<li>Enquanto segurando o peixe com a pinça forte grave os dois nervos ópticos atrás dos olhos com uma tesoura ou pinça em ponto.</li>
		<li>Abra a parte dorsal do crânio do posterior para o lado anterior por quebrar os ossos do crânio passo a passo com pinça forte.</li>
		<li>Retire o crânio de um lado com pinça forte.</li>
		<li>Grave da medula espinhal com tesoura ou pinça afiada.</li>
		<li>Suavemente, pegar a medula espinhal com a pinça, virar o cérebro de posterior para anterior e coloque-o em um prato com o gelado Ca2 + grátis CE.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Encher um molde de metal3 1,5 a 2 cm com agarose líquido e coloque-o no gelo.</li>
	<li>Antes da agarose solidifica (em torno de 25 – 30 ° C), gentilmente agarrar o cérebro pela medula espinhal com o fórceps, secar a pinça com um pedaço de papel fino e coloque o tecido no agarose. Misture rapidamente o agarose para diluir os vestígios da CE o tecido parietal esquerdo e orientar o tecido e deixar o molde em gelo por alguns segundos até que a agarose endurece. Nota: É essencial para esta etapa ser rápido. A agarose solidifica rapidamente como o molde metálico é arrefecido pelo gelo.</li>
	<li>Corte um bloco quadrado de agarose contendo o tecido com uma lâmina de bisturi e cola-lo no porta-amostra vibratome usando cola de cirurgia (tóxicos).</li>
	<li>Encher a cubeta do vibratome receber o suporte de amostra (cérebro-pituitária) com gelado Ca2 + grátis CE.</li>
	<li>Introduza o suporte do espécime a vibratome e cortar o bloco de agarose para tornar parasagital seções de 150 µm, usando a alta frequência e a baixa velocidade para o corte. Recolher as seções selecionadas e colocá-los na câmara de gravação de remendo-braçadeira com 3ml da gelada Ca2 + grátis CE.</li>
	<li>Coloque a harpa de grade (Figura 2B) na seção de tecido. Nota: A harpa será junto com o revestimento estabilizar o tecido e impedir a movimentação durante as gravações de remendo-braçadeira.</li>
	<li>Depois a harpa está no lugar, mude o Ca2 + grátis CE médio para o CE normal com Ca2 + e BSA. Deixe o resto de tecido por 10 min.</li>
</ol>3. perfurado Patch-clamp e eletrofisiológicas gravações
<ol><li>Antes de iniciar o experimento, o cloreto de prata fio eletrodos pelas seguintes etapas: primeiro, use uma lixa fina (p180) para limpar os eletrodos de fio de prata. Em segundo lugar, enxague com 2 mL, de etanol a 70%. Em terceiro lugar, mergulhe os fios em 2 mL, 2 – 5% de cloro por 10 min. Finalmente, enxaguar com 2 mL, ultrapura H2O.</li>
	<li>Coloque a câmara de gravação com a fatia de cérebro-hipófise na fase de microscópio e localizar a área de alvo (hipófise) com objetivo de X 10 e inspecionar as células com o objectivo de X 40. Nota: Se a preparação for bem sucedida, muito poucas células redondas devem ser visíveis. Esses redondos são células geralmente danificadas que são desanexação do tecido.</li>
	<li>Coloque o eletrodo de aterramento através da ponte de ágar de 2% para o banho do CE.</li>
	<li>Localize uma célula saudável usando o objectivo X 40. Nota: Uma célula saudável deve ser firmemente anexada para o pedaço de tecido e não arredondada e desanexada da fatia.</li>
	<li>Definir o amplificador em tensão-braçadeira (VC; Modo de Figura 4A ponto 1). Abrir o selo teste janela e pressione o banho configuração (Figura 4B os pontos 1 e 2. Use um pulso de 5-mV para monitorar a resistência de pipeta (Figura 4B ponto 3).</li>
	<li>A ponta da pipeta com a solução de IC antifúngica gratuita antes de adicionar a solução de IC com anfotericina B, utilizando uma seringa de enchimento microremendo de aterramento (ver Figura 3).</li>
	<li>Adicione uma pressão ligeiramente positiva de ar dentro da pipeta de remendo usando a seringa de 1 mL. Nota: Isto faz um pequeno fluxo líquido da pipeta remendo que evite a contaminação da ponta.</li>
	<li>Uma vez no banho, avaliar a resistência de uma pipeta de remendo e certifique-se de que nenhuma partícula é anexada a ponta da pipeta (Figura 4). Nota: Um pequeno pedaço de fita é anexado para o monitor exibindo a forma de gravação de vídeo, o campo de visão. Isso faz com que o posicionamento da pipeta remendo em relação à célula mais fácil quando o objetivo é não focando a célula.</li>
	<li>Guia da pipeta de remendo para baixo a célula usando Micromanipuladores. Nota: Certifique-se que a pipeta é limpa, procurando por pequenas partículas que podem ter ligado para a ponta da pipeta. Mudanças súbitas na resistência também podem ser um resultado de partículas preso na ponta da pipeta.</li>
	<li>Reajustar a pipeta quando alguns mícrons acima a célula para que a ponta da pipeta tocará a célula 1/3 do meio da célula, como mostrado na Figura 5. Quando tocar o celular, liberar a pressão e aplicar a sucção suave para fazer uma vedação. Nota: O tempo da pipeta remendo entra o banho para uma bem sucedida selo deve ser mantido tão curtos quanto possível. Não mais do que 1 – 1,5 min para evitar a anfotericina B, atingindo a ponta da pipeta e fuga para o banho.</li>
	<li>Imediatamente, alterne para a janela de remendo no software remendo-braçadeira (Figura 4 D ponto 1) e têm um potencial de exploração entre-50 e a-60 mV (ponto4 da figura 2). Zero fora a capacitância rápida composta pela pipeta de vidro (ponto4 da figura 3).</li>
	<li>Alterne para a janela da cela no software remendo-braçadeira (Figura 4E os pontos 1 e 2) e iniciar o monitoramento de resistência de acesso, Ra, exibida na janela. Zerar a capacitância de membrana no software do amplificador (Figura 4E ponto 3) após acesso suficiente. Nota: Acesso suficiente pode demorar de 10 a 30 min (Figura 4E ponto 2). Um bom acesso para gravações de braçadeira atual deve estar abaixo de 20 M.</li>
	<li>Alternar para braçadeira atual, IC, na janela de software do amplificador (Figura 4F ponto 1). Ajuste as correntes rápido-capacitivo na janela - braçadeira do software para o mesmo valor 3.12 amplificador (Figura 4F ponto 2 e 3). Verifica o potencial de membrana (Figura 4F ponto 1). Nota: Importante, se o potencial de membrana é superficial (típico acima -35 mV) a célula pode estar danificada. Cancelar a gravação e encontrar uma nova célula.</li>
	<li>Depois de encontrar uma célula saudável (firmemente ligado ao tecido com membrana potencial abaixo de -40 mV), começam as gravações experimentais como detalhadas do fabricante protocolo 33,34.</li>
</ol>

<ol>
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Os autores não têm nada a divulgar

Eletrofisiológicas gravações usando a técnica patch-clamp em fatias de cérebro-hipófise exigem cuidadosa otimização. Protocolos bem otimizados para a realização de investigações de viver-pilha especificamente em teleósteos são limitados, com a maioria das publicações usando protocolos baseados em sistemas de mamíferos. A este respeito, é importante estar ciente do fato de que vários parâmetros fisiológicos como pH e pressão osmótica são não só espécies dependentes, mas também muito dependente ...

A hipófise é um órgão endócrino chave nos vertebrados, localizados abaixo do hipotálamo e posteriores para o quiasma óptico. Produz e secreta hormônios de seis a oito dos tipos de célula específica. Hormônios hipofisários constituem um intermediário entre o cérebro e os órgãos periféricos e conduzir a uma grande variedade de processos fisiológicos essenciais, incluindo o crescimento, reprodução e regulação da homeostase. Semelhante a neurônios, células endócrinas da hipófise são eletricamente excitáveis com a capacidade de potenciais de ação de fogo espontaneamente 1. O papel destes potenciais de ação é dependente de célula. Em vários tipos de células da hipófise mamíferos, potenciais de ação podem elevar o intracelular Ca2 + suficientemente para uma liberação sustentada de hormônio 2. Além disso, a hipófise recebe informações estimulatórios e inibitórias do cérebro que afeta o potencial de membrana das células 3,4,5,6. Normalmente, entrada estimulatório aumenta a excitabilidade e muitas vezes envolve a liberação de Ca2 + de lojas intracelulares bem como aumentou a frequência 7a disparar. Compreender como a célula utiliza a composição de canais de íon e adapta-se a estes sinais de entrada do cérebro é chave para a síntese de hormônio de compreensão e libertação.
A técnica da remendo-braçadeira foi desenvolvida na década de 1970 pela Sakmann e Neher 8,9,10 e melhorada pelo Hamill 11e permite investigações detalhadas das propriedades eletrofisiológicas das células até canais de íon único. Além disso, a técnica pode ser usada para estudar a corrente e a tensão. Hoje, remendo de aperto é o padrão de ouro para medir propriedades eletrofisiológicas da célula. Quatro configurações principais da técnica patch-clamp selo apertado foram desenvolvidos 11; o celular conectado, de dentro para fora, o fora-out e o patch de células inteiras. As três primeiras configurações são normalmente utilizadas para investigações de canal único íon. Para o quarto, seguindo a configuração de conexão de celular, um buraco na membrana celular é feito usando a pressão atmosférica sub. Esta configuração também permite que as investigações da composição iônica canal do celular total 12. No entanto, uma limitação dessa técnica é que moléculas citoplasmáticas são diluídas pelo patch pipeta solução 13 (Figura 1A), afetando as respostas elétricas e fisiológicas das células estudadas. Na verdade, algumas dessas moléculas podem desempenhar um papel importante na transdução do sinal ou na regulação dos canais iônicos diferentes. Para evitar isso, Lindau e Fernandez 14 desenvolveu um método onde um composto formadoras de poros é adicionado para a pipeta de remendo. Após a configuração de conexão de celular, o composto irá incorporar a membrana plasmática sob o patch e lentamente perfurar a membrana criando contato elétrico com o citosol (Figura 1B). Podem ser usado vários diferentes antifúngicos tais como nistatina 15 e anfotericina B 16, ou surfactantes como o beta-escina de saponina 17,18 . Estes compostos criar poros grandes o suficiente para permitir que o cátion monovalente e Cl– difusão entre o citosol e a pipeta de remendo, preservando os níveis citosólico de macromoléculas e o maiores íons como Ca2 + 15, 16.
O desafio de usar patch perfurada é a resistência série potencialmente elevados. Resistência série (Rs) ou acesso de resistência é a resistência combinada sobre a pipeta de remendo em relação ao solo. Durante as gravações do remendo-braçadeira, o Rs será em paralelo com a resistência da membrana (Rm). Rm e Rs em trabalho paralelo como um divisor de tensão. Com a alta Rs, a tensão vai cair o Rs dando erros nas gravações. O erro se tornará maior com maiores correntes gravadas. Além disso, o divisor de tensão é também frequência dependente, criando um filtro passa-baixa, afectando assim a resolução temporal. Com efeito, o patch perfurado pode não sempre permitir gravações do grandes e rápidas as correntes como a voltagem dependente correntes at+ (para leituras detalhadas consulte referência 19). Além disso, Rs pode variar durante gravações de remendo-braçadeira, novamente, levando a mudanças na corrente gravada. Assim, falsos positivos podem ocorrer em situações onde Rs muda durante a aplicação da droga.
A eletrofisiologia no tecido cortado foi introduzida primeiramente pelo laboratório para o estudo eletrofisiológicas características dos neurônios no cérebro 20Andersen. A técnica pavimentou o caminho para investigações detalhadas de células únicas, bem como circuitos de comunicações e célula célula célula num ambiente mais intacto. Uma técnica semelhante para fazer fatias da hipófise foi introduzida em 1998 por Guérineau et al 21. no entanto, não foi antes de 2005, que a preparação da fatia do cérebro-hipófise foi usada com sucesso para estudos de remendo-braçadeira em teleósteos 22. Neste estudo, os autores também relataram o uso de gravações de remendo-braçadeira perfurada. No entanto, de longe, a maioria das investigações eletrofisiológicas das células da hipófise foram realizada em mamíferos e apenas um punhado de outros vertebrados, incluindo peixes teleósteos 1,2,22,23 . Em teleósteos, quase todos os estudos foram realizados em células dissociadas primária 24,25,26,,27,28,29,30 .
No presente trabalho, descrevem um protocolo otimizado para preparação de fatias de cérebro-hipófise saudáveis de medaka de peixe o modelo. A abordagem representa várias vantagens em comparação com as culturas de células dissociadas primário. Primeiro, as células são gravadas em um ambiente relativamente preservado em relação ao dissociar as condições de cultura celular. Em segundo lugar, preparações de fatia nos permitem estudar vias indiretas, mediadas por célula-célula comunicação 22, que não é possível em condições de cultura de células dissociadas. Além disso, demonstraremos como realizar gravações eletrofisiológicas sobre as fatias de tecido obtidos utilizando a técnica de perfurada células inteiras remendo-braçadeira com anfotericina B como o agente de formação de poros.
Medaka é um pequeno peixe de água doce nativo da Ásia, encontrada principalmente no Japão. A fisiologia, embriologia e genética do medaka têm sido muito estudadas por mais de 100 anos, 31, e é um modelo de pesquisa comumente usado em muitos laboratórios. De particular importância para este papel é a organização morfológica distinta do complexo hipotálamo-hipófise em peixes teleósteos: Considerando que em mamíferos e aves, os neurônios do hipotálamo liberar os neuro-hormônios regulam as células endócrinas da hipófise para o sistema portal da Eminência mediana, há uma projeção nervosa direta dos neurônios hipotalâmicas para as células endócrinas da hipófise em peixes teleósteos 32. Assim, corte cuidadosamente conduzido de cérebro-hipófise é de particular importância no peixe, que nos permite investigar características eletrofisiológicas das células da hipófise em uma rede de cérebro-hipófise bem preservada e em particular como na hipófise células controlar sua excitabilidade e, assim, a homeostase de Ca2 + .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1065px;" width="1065">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Vibratome</td>
			<td style="width:171px;">Leica</td>
			<td style="width:157px;">VT1000 S</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Chirurgical glue</td>
			<td style="width:171px;">WPI</td>
			<td>VETBOND</td>
			<td style="width:428px;">3M Vetbond Tissue Adhesive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Stainless steel blades</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>752-1-SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">metal molds</td>
			<td style="width:171px;">SAKURA</td>
			<td style="width:157px;">4122</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">steel harp</td>
			<td style="width:171px;">Warner instruments</td>
			<td style="width:157px;">64-1417</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">PBS</td>
			<td style="width:171px;">SIGMA</td>
			<td style="width:157px;">D8537</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Ultrapure LMP agarose</td>
			<td style="width:171px;">invitrogen</td>
			<td style="width:157px;">166520-100</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:309px;">patch pipettes</td>
			<td style="width:171px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:157px;">BF150-110-10HP</td>
			<td style="width:428px;">Borosilicate with filament O.D.:1.5mm, I.D.:1.10mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Microscope Slicescope</td>
			<td style="width:171px;">Scientifica</td>
			<td style="width:157px;">pro6000</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">P-Clamp10</td>
			<td style="width:171px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:157px;">#1-2500-0180</td>
			<td style="width:428px;">sofware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Digitizer Digidata 1550A1</td>
			<td style="width:171px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:157px;">DD1550</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B</td>
			<td style="width:171px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:157px;">1-CV-7B</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">GnRH</td>
			<td style="width:171px;">Bachem</td>
			<td style="width:157px;">4108604</td>
			<td style="width:428px;">H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">pipette puller</td>
			<td style="width:171px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:157px;">P-1000</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">amphotericin B</td>
			<td style="width:171px;">SIGMA</td>
			<td style="width:157px;">A9528</td>
			<td style="width:428px;">pore-forming antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">polyethylenimine&#160;</td>
			<td style="width:171px;">SIGMA</td>
			<td style="width:157px;">P3143</td>
			<td style="width:428px;">50% PEI solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">microfiler syringe</td>
			<td style="width:171px;">WPI</td>
			<td style="width:157px;">MF28/g67-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">glass for the agar bridge</td>
			<td style="width:171px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:157px;">BF200-116-15</td>
			<td style="width:428px;">Borosilicate with filament O.D.:2.0mm, I.D.:1.16mm Fire polished</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-Manager software</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:428px;">Open Source Microscopy Software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">optiMOS sCMOS camera</td>
			<td style="width:171px;">Qimaging</td>
			<td style="width:157px;">&#160;01-OPTIMOS-R-M-16-C</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">sonicator</td>
			<td style="width:171px;">Elma</td>
			<td style="width:157px;">D-7700 singen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">NaCl</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">KCl</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">MgCl2</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">G5400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Hepes</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">CaCl2</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Sucrose</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td align="right" style="width:157px;">84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">D-mannitol</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td align="right" style="width:157px;">63565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">MES-acid</td>
			<td style="width:171px;">SIGMA</td>
			<td style="width:157px;">M0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">BSA</td>
			<td style="width:171px;">SIGMA</td>
			<td style="width:157px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish

Foram realizadas investigações eletrofisiológicas das células da hipófise em numerosas espécies de vertebrados, mas muito poucos em peixes teleósteos. Entre estes, a maioria clara foram realizada na dissociadas as células primárias. Para melhorar a nossa compreensão de como teleósteos células da hipófise, comportar-se em um ambiente mais biologicamente relevante, este protocolo mostra como preparar fatias de cérebro-hipófise viáveis usando o medaka pequenos peixes de água doce (Oryzias latipes). Fazendo as fatias de cérebro-pituitária, pH e pressão osmótica de todas as soluções foram ajustados aos valores encontrados em fluidos do corpo dos peixes de água doce, vivendo a 25 a 28 ° C. Após a preparação da fatia, o protocolo demonstra como realizar gravações eletrofisiológicas, usando a técnica de perfurada remendo-braçadeira de células inteiras. A técnica patch-clamp é uma ferramenta poderosa com resolução temporal sem precedentes e sensibilidade, permitindo a investigação das propriedades elétricas das células inteira intactas até canais iônicos único. Remendo perfurado é o único que mantém o ambiente intracelular intacto impedindo que elementos reguladores no citosol sendo diluído pela solução de eletrodo de pipeta de remendo. Em contraste, ao realizar gravações de células inteiras tradicionais, observou-se que as células da hipófise medaka rapidamente perdem a capacidade de disparar potenciais de ação. Entre as várias técnicas de perfuração disponíveis, este protocolo demonstra como realizar a perfuração da membrana remendada usando o fungicida anfotericina b.

Este protocolo demonstra um protocolo passo a passo de como conseguir confiança gravações eletrofisiológicas de células da hipófise (gonadotróficas), usando uma linha de transgénicos medaka [Tg (CLB- hrGfpII)] onde o alvo células (Lh-produzindo gonadotropes) são etiquetados com proteína verde fluorescente (GFP).
Inicialmente, as investigações eletrofisiológicas foram realizadas usando a configuração de c...

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Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish

O artigo descreve um protocolo otimizado para fazer fatias de tecido cerebral-hipófise viável, usando o medaka peixes teleósteos (Oryzias latipes), seguido por gravações eletrofisiológicas de células da hipófise, usando a técnica de remendo-braçadeira com o configuração de remendo perfurada.

Fatias de cérebro-hipófise saudáveis para investigações eletrofisiológicas das células da hipófise em peixes teleósteos

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the ...

healthy-brain-pituitary-slices-for-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.7K visualizações.  Norwegian University of Life Sciences. O artigo descreve um protocolo otimizado para fazer fatias de tecido cerebral-hipófise viável, usando o medaka peixes teleósteos (Oryzias latipes), seguido por gravações eletrofisiológicas de células da hipófise, usando a técnica de remendo-braçadeira com o configuração de remendo perfurada.

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Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" (or "startle") response during the adult stage is mediated by the multi-component neuronal circuit called the Giant Fiber System (GFS). The comparative large size of the neurons, their distinctive morphology and simple connectivity make the GFS an attractive model system for studying neuronal circuitry. The GFS pathway is composed of two bilaterally symmetrical Giant Fiber (GF) interneurons whose axons descend from the brain along the midline into the thoracic ganglion via the cervical connective. In the mesothoracic neuromere (T2) of the ventral ganglia the GFs form electro-chemical synapses with 1) the large medial dendrite of the ipsilateral motorneuron (TTMn) which drives the tergotrochanteral muscle (TTM), the main extensor for the mesothoracic femur/leg, and 2) the contralateral peripherally synapsing interneuron (PSI) which in turn forms chemical (cholinergic) synapses with the motorneurons (DLMns) of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), the wing depressors. The neuronal pathway(s) to the dorsovental muscles (DVMs), the wing elevators, has not yet been worked out (the DLMs and DVMs are known jointly as indirect flight muscles - they are not attached directly to the wings, but rather move the wings indirectly by distorting the nearby thoracic cuticle) (King and Wyman, 1980; Allen et al., 2006). The di-synaptic activation of the DLMs (via PSI) causes a small but important delay in the timing of the contraction of these muscles relative to the monosynaptic activation of TTM (~0.5 ms) allowing the TTMs to first extend the femur and propel the fly off the ground. The TTMs simultaneously stretch-activate the DLMs which in turn mutually stretch-activate the DVMs for the duration of the flight. The GF pathway can be activated either indirectly by applying a sensory (e.g."air-puff" or "lights-off") stimulus, or directly by a supra-threshold electrical stimulus to the brain (described here). In both cases, an action potential reaches the TTMs and DLMs solely via the GFs, PSIs, and TTM/DLM motoneurons, although the TTMns and DLMns do have other, as yet unidentified, sensory inputs. Measuring "latency response" (the time between the stimulation and muscle depolarization) and the "following to high frequency stimulation" (the number of successful responses to a certain number of high frequency stimuli) provides a way to reproducibly and quantitatively assess the functional status of the GFS components, including both central synapses (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) and the chemical (glutamatergic) neuromuscular junctions (TTMn-TTM and DLMn-DLM). It has been used to identify genes involved in central synapse formation and to assess CNS function.

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

The Giant Fiber System is a simple neuronal circuit of adult Drosophila melanogaster containing the largest neurons in the fly. We describe the protocol for monitoring synaptic transmission through this pathway by recording post synaptic potentials in dorsal longitudinal (DLM) and tergotrochanteral (TTM) muscles following direct stimulation of the Giant Fiber interneurons.

As gravações eletrofisiológicas da via fibra Gigante da D. melanogaster</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

Neurociência

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Em células vivas, imagens de células precursoras de órgãos sensoriais na Intact Drosophila As pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological techniques, in the understanding of the underlying pathophysiology1. Here we describe a method to perform electrophysiological studies on mouse sciatic nerves in vivo.
The animals are anesthetized with isoflurane in order to ensure analgesia for the tested mice and undisturbed working environment during the measurements that take about 30 min/animal. A constant body temperature of 37 &#176;C is maintained by a heating plate and continuously measured by a rectal thermo probe2. Additionally, an electrocardiogram (ECG) is routinely recorded during the measurements in order to continuously monitor the physiological state of the investigated animals.
Electrophysiological recordings are performed on the sciatic nerve, the largest nerve of the peripheral nervous system (PNS), supplying the mouse hind limb with both motoric and sensory fiber tracts. In our protocol, sciatic nerves remain in situ and therefore do not have to be extracted or exposed, allowing measurements without any adverse nerve irritations along with actual recordings. Using appropriate needle electrodes3 we perform both proximal and distal nerve stimulations, registering the transmitted potentials with sensing electrodes at gastrocnemius muscles. After data processing, reliable and highly consistent values for the nerve conduction velocity (NCV) and the compound motor action potential (CMAP), the key parameters for quantification of gross peripheral nerve functioning, can be achieved.

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Measurements of nerve conduction properties in vivo exemplify a powerful tool to characterize various animal models of neuromuscular diseases. Here, we present an easy and reliable protocol by which electrophysiological analysis on sciatic nerves of anesthetized mice can be performed.

Em Medidas Vivo eletrofisiológicos nos nervos ciático Rato

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Eletrofisiológica e Caracterização Morfológica de Neuronal Microcircuits em aguda fatias do cérebro do Usando Emparelhados patch-clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Ex Vivo optogenética Dissection de Circuitos medo no cérebro Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in these preparations is perpendicular to the retinal surface, making it ideal for the study of radially oriented neurons like photoreceptors and bipolar cells. However, the large dendritic arbors of horizontal cells, wide-field amacrine cells, and ganglion cells are mostly truncated, leaving markedly reduced synaptic activity in these cells. Whereas ganglion cells and displaced amacrine cells can be studied in a whole-mounted preparation of the retina, horizontal cells and amacrine cells located in the inner nuclear layer are only poorly accessible for electrodes in whole retina tissue.
To achieve maximum accessibility and synaptic integrity, we developed a horizontal slice preparation of the mouse retina, and studied signal transmission at the synapse between photoreceptors and horizontal cells. Horizontal sectioning allows&#160;(1) easy and unambiguous visual identification of horizontal cell bodies for electrode targeting, and (2) preservation of the extended horizontal cell dendritic fields, as a prerequisite for intact and functional cone synaptic input to horizontal cell dendrites.
Horizontal cells from horizontal slices exhibited tonic synaptic activity in the dark, and they responded to brief flashes of light with a reduction of inward current and diminished synaptic activity. Immunocytochemical evidence indicates that almost all cones within the dendritic field of a horizontal cell establish synapses with its peripheral dendrites. The horizontal slice preparation is therefore well suited to study the physiological properties of horizontally extended retinal neurons as well as sensory signal transmission and integration across selected synapses.

We developed a horizontal slice preparation of the adult mammalian retina with the plane of sectioning parallel to the retinal surface. Dendritic fields of nonradially oriented retinal neurons were not truncated, allowing the study of signal processing with patch-clamp and imaging techniques.

Preparação de horizontais Fatias de rato adulto Retina de Estudos eletrofisiológicos

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Electrophysiological Investigations of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapse Function

The lateral geniculate nucleus is the first relay station for the visual information. Relay neurons of this thalamic nucleus integrate input from retinal ganglion cells and project it to the visual cortex. In addition, relay neurons receive top-down excitation from the cortex. The two main excitatory inputs to the relay neurons differ in several aspects. Each relay neuron receives input from only a few retinogeniculate synapses, which are large terminals with many release sites. This is reflected by the comparably strong excitation, the relay neurons receive, from retinal ganglion cells. Corticogeniculate synapses, in contrast, are simpler with few release sites and weaker synaptic strength. The two synapses also differ in their synaptic short-term plasticity. Retinogeniculate synapses have a high release probability and consequently display a short-term depression. In contrast, corticogeniculate synapses have a low release probability. Corticogeniculate fibers traverse the reticular thalamic nuclei before entering the lateral geniculate nucleus. The different locations of the reticular thalamic nucleus (rostrally from the lateral geniculate nucleus) and optic tract (ventro-laterally from the lateral geniculate nucleus) allow stimulating corticogeniculate or retinogeniculate synapses separately with extracellular stimulation electrodes. This makes the lateral geniculate nucleus an ideal brain area where two excitatory synapses with very different properties impinging onto the same cell type, can be studied simultaneously. Here, we describe a method to investigate the recording from relay neurons and to perform detailed analysis of the retinogeniculate and corticogeniculate synapse function in acute brain slices. The article contains a step-by-step protocol for the generation of acute brain slices of the lateral geniculate nucleus and steps for recording activity from relay neurons by stimulating the optic tract and corticogeniculate fibers separately.

Here, we present protocols for the preparation of acute brain slices containing the lateral geniculate nucleus and the electrophysiological investigation of retinogeniculate and corticogeniculate synapses function. This protocol provides an efficient way to study synapses with the high-release and low-release probability in the same acute brain slices.

Investigações eletrofisiológicas de Retinogeniculate e função do Synapse de Corticogeniculate

The lateral geniculate nucleus is the first relay station for the visual information. Relay neurons of this thalamic nucleus integrate input from retinal ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Avaliação da indução de depressão em longo prazo em fatias Cerebelares adultas

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Wireless Electrophysiological Recording of Neurons by Movable Tetrodes in Freely Swimming Fish

The neural mechanisms governing fish behavior remain mostly unknown, although fish constitute the majority of all vertebrates. The ability to record brain activity from freely moving fish would advance research on the neural basis of fish behavior considerably. Moreover, precise control of the recording location in the brain is critical to studying coordinated neural activity across regions in fish brain. Here, we present a technique that records wirelessly from the brain of freely swimming fish while controlling for the depth of the recording location. The system is based on a neural logger associated with a novel water-compatible implant that can adjust the recording location by microdrive-controlled tetrodes. The capabilities of the system are illustrated through recordings from the telencephalon of goldfish.

A novel wireless technique for recording extracellular neural signals from the brain of freely swimming goldfish is presented. The recording device is composed of two tetrodes, a microdrive, a neural data logger, and a waterproof case. All parts are custom-made except for the data logger and its connector.

Gravação eletrofisiológica sem fio dos neurônios por tetrodes móveis em peixes livremente da natação

The neural mechanisms governing fish behavior remain mostly unknown, although fish constitute the majority of all vertebrates. The ability to record brain ...