Agradecemos a Sra. LourdesCarreon G Tan para lhe ajuda a manter as instalações de medaka e Anthony Peltier para as figuras ilustrativas. Este trabalho foi financiado pelo NMBU e pelo Conselho de pesquisa da Noruega, concessão números 244461 (programa de aquicultura) e 248828 (programa de vida Digital Noruega).

Todo animal manipulação foi realizada de acordo com as recomendações para o cuidado e bem-estar dos animais de pesquisa na Universidade Norueguesa de Ciências da vida e sob a supervisão de pesquisadores autorizados.
1. preparação de soluções e instrumentos
Nota: Todas as soluções devem ser esterilizadas. Cuidadosa atenção deve ser dada para o pH e a pressão osmótica (osmol/kg de água) de todas as soluções, que deve ser cuidadosamente adaptada para o ambiente extracelular das espécies estudadas. pH e pressão osmótica devem ser ajustados com equipamentos eletrônicos precisos como o medidor de pH e ponto de congelamento aparelhos respectivamente.
<ol><li>
Fazer 500 mL de solução extracelular sem Ca2 + (Ca2 + livre CE): 150 mM de NaCl, 5 mM KCl, 1,3 mM MgCl2, glicose de 4 mM, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>Dissolver 4,38 g de NaCl, 186,37 mg de KCl, 61,89 mg de MgCl2, 360,32 mg de glicose e 1,19 g de HEPES em 450 mL de ultrapura (0,055 uS / cm a 25 ° C, a resistividade de 18,2 MOhm) H2O num copo de vidro, utilizando um agitador magnético.</li>
		<li>Ajuste o pH a 7.75 com NaOH.</li>
		<li>Transferi a solução para um balão volumétrico de 500 mL. Encha o balão volumétrico com ultrapura H2O até 500 mL.</li>
		<li>Misture a solução bem antes de medir a osmolalidade. Ajuste para 290 – 300 mOsm com manitol. Filtro de esterilizar a solução usando o sistema de aspiração de água e filtro de 0,2 µm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fazer 500 mL de solução extracelular (CE): 150 mM de NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, glicose de 4 mM, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>Dissolva 4,38 g de NaCl, 186,37 mg de KCl, 147,01 mg de CaCl2, 61,89 mg de MgCl2, 360,32 mg de glicose e 1,19 g de HEPES em 450 mL de ultrapura H2O num copo de vidro, utilizando um agitador magnético.</li>
		<li>Ajuste o pH a 7.75 com NaOH.</li>
		<li>Transferi a solução para um balão volumétrico de 500 mL. Encha o balão volumétrico com ultrapura H2O até 500 mL.</li>
		<li>Misture a solução bem antes de medir a osmolalidade. Ajuste para 290 – 300 mOsm com manitol. Filtro de esterilizar a solução usando o sistema de aspiração de água e filtro de 0,2 µm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fazer 500 mL de solução extracelular com 0,1% albumina de soro bovino (CE com BSA): 150 mM de NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, glicose de 4 mM, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>Dissolva 4,38 g de NaCl, 186,37 mg de KCl, 147,01 mg de CaCl2, 61,89 mg de MgCl2, 360,32 mg de glicose e 1,19 g de HEPES em 450 mL de ultrapura H2O num copo de vidro, utilizando um agitador magnético.</li>
		<li>Ajuste o pH a 7.75 com NaOH.</li>
		<li>Transferi a solução para um balão volumétrico de 500 mL. Encha o balão volumétrico com ultrapura H2O até 500 mL.</li>
		<li>Misture a solução bem antes de medir a osmolalidade. Ajuste para 290 – 300 mOsm com manitol. Filtro de esterilizar a solução usando o sistema de aspiração de água e filtro de 0,2 µm. Adicione 50 mg de BSA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fazer 250 mL de solução intracelular (IC): 110 mM KOH, 20 mM KCl, 10 mM Hepes, sacarose 20 mM.
	<ol>
<li>Dissolva 1,54 g KOH, 327,75 mg de KCl, 595,75 mg de HEPES e 1,712 g de sacarose em 450 mL de ultrapura H2O num copo de vidro, utilizando um agitador magnético.</li>
		<li>Ajuste o pH para 7.2 com (N-Morpholinos) etano (MES) sulfônico.</li>
		<li>Transferi a solução para um balão aferido de 250 mL. Encha o balão volumétrico com ultrapura H2O até 250 mL.</li>
		<li>Misture a solução bem antes de medir a osmolalidade. Ajuste a 280 – 290 mOsm (10 mOsm inferior CE) com sacarose. Filtro de esterilizar a solução usando o sistema de aspiração de água e filtro de 0,2 µm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fazer 100 mL de solução de agarose derretimento baixo de 2% de Ca2 + e BSA CE livre (livre de 2 g de agarose derretimento baixo em 100 mL de Ca2 + CE). Dissolver usando um microondas e coloque o agarose derretido em um banho de água a 40 ° C. Deixe arrefecer até atingir 40 ° C antes de usar sobre os tecidos. Nota: CE, Ca2 + CE livre pode ser armazenado a 4 ° C por várias semanas se estéril e soluções de IC a-20 ° C, durante vários meses. Agarose pode ser armazenado por uma semana a 4 ° C e pode ser reutilizado em 3 a 5 vezes por microondas brevemente. Reutilização excessiva conduzirá a evaporação e alteração de agarose e concentração de sal e de qualidade.</li>
	<li>
Fazer a ponte de ágar:
	<ol>
<li>Capilares de vidro de borosilicato longa 7,5 mm com diâmetro externo (OD) 2mm de calor e dentro diâmetro (identificação) 1,16 mm, utilizando um bico de Bunsen em um focal ponto cerca de 1/3 de uma ponta até o vidro começa a dobrar. Retirar o vidro da chama e deixar o vidro dobrar com um ângulo de cerca de 120 graus(Figura 2).</li>
		<li>Derreta 2% de ágar na CE normal sem glicose usando um microondas, e enquanto a agarose é líquido preencher o capilar usando a capilaridade de vidro pré-fabricados forças, colocando uma das extremidades do vidro no líquido e, esperando por alguns minutos. Loja pontes até o uso em 4 ° C na CE sem glicose.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare-se vidro de borosilicato com pipetas de remendo de filamento usando um extrator de pipeta apropriada. Consulte o manual do extrator de pipeta para obter a resistência desejada do eletrodo. Nota: O cone da pipeta deve ser tão curto quanto possível. Atarraxamento curta pipeta é conseguida usando-se puxando passos 4-6. A resistência do eletrodo deve ser entre 2 e 6 MΩ dependendo do tamanho da célula.</li>
	<li>
Para evitar o movimento do tecido durante os experimentos de remendo-braçadeira revestir a superfície da câmara de gravação com 0,1% do polyethylenimine (PEI) em tampão de borato.
	<ol>
<li>Prepare 500 mL de tampão de borato (25 mM):<ol>
<li>Dissolva 4,768 g de Na2B4O710 H2O em 450 mL de ultrapura H2O num copo de vidro, utilizando um agitador magnético.</li>
			<li>Ajuste o pH para 8,4 com HCl.</li>
			<li>Transferi a solução para um balão volumétrico de 500 mL. Encha o balão volumétrico com ultrapura H2O até 500 mL e 0,2 µm filtro esterilizar a solução usando o sistema de aspiração de água.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Prepare uma solução de 1% das ações de PEI (1 mL 50% PEI para 49 mL de tampão de borato 25 mM) e uma diluição de PEI 0,1% diluição 10 µ l de solução 1% em 100 µ l de tampão de borato para utilização final.</li>
		<li>Adicione 2 mL de 0.1% PEI no vidro do titular da fatia e deixe o revestimento incubar durante 1 minuto. Então brevemente lavar o copo duas vezes com 5 mL de ultrapura H2O... e deixe o ar seco até o uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prepare soluções de anfotericina B.
	<ol>
<li>Faça 60 mg/mL de solução dissolvendo-se 3 mg de anfotericina B em pó em 50 µ l dimetil sulfóxido (DMSO), em um tubo de 1 mL, protegido da luz. Vórtice na velocidade máxima por 30 s e proceda à sonicação durante 15 min homogeneizar. Armazenar as alíquotas para tubos de 3 – 5 a-20 ° C e usar a alíquota de um por dia. Nota: Se a solução estoque de anfotericina B não é clara e amarela cor mas leitoso (amarelo ainda), depois de 15 – 20 min sonication tornar-se uma nova solução.</li>
		<li>Fazer solução de IC com anfotericina B por pipetagem 2ml do IC para um copo de vidro limpo com mais de 10 mL de capacidade. Adicionar 8 µ l de solução-mãe de anfotericina B para a solução da pipeta e misture por pipetagem. Envolva o copo com folha de alumínio e coloque no gelo até o uso e renová-lo a cada 3h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. dissecção e cortar com Vibratome
<ol><li>Prepare as ferramentas de dissecação antes de dissecar, incluindo uma afiada e uma pinça forte com uma tesoura. Limpar as ferramentas (suporte do tecido, pincel, pinça) com etanol e certifique-se de que eles são usados apenas para fins de dissecação e nunca em contacto com tecidos fixos. Mantê-los em uma caixa separada para evitar contaminação.</li>
	<li>Eutanásia o peixe em água fria de gelo por 1 min.</li>
	<li>
Siga as etapas subsequentes para dissecar rapidamente o medaka cérebro e hipófise com Pinças afiadas (usar não mais que 3 min).
	<ol>
<li>Enquanto segurando o peixe com a pinça forte grave os dois nervos ópticos atrás dos olhos com uma tesoura ou pinça em ponto.</li>
		<li>Abra a parte dorsal do crânio do posterior para o lado anterior por quebrar os ossos do crânio passo a passo com pinça forte.</li>
		<li>Retire o crânio de um lado com pinça forte.</li>
		<li>Grave da medula espinhal com tesoura ou pinça afiada.</li>
		<li>Suavemente, pegar a medula espinhal com a pinça, virar o cérebro de posterior para anterior e coloque-o em um prato com o gelado Ca2 + grátis CE.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Encher um molde de metal3 1,5 a 2 cm com agarose líquido e coloque-o no gelo.</li>
	<li>Antes da agarose solidifica (em torno de 25 – 30 ° C), gentilmente agarrar o cérebro pela medula espinhal com o fórceps, secar a pinça com um pedaço de papel fino e coloque o tecido no agarose. Misture rapidamente o agarose para diluir os vestígios da CE o tecido parietal esquerdo e orientar o tecido e deixar o molde em gelo por alguns segundos até que a agarose endurece. Nota: É essencial para esta etapa ser rápido. A agarose solidifica rapidamente como o molde metálico é arrefecido pelo gelo.</li>
	<li>Corte um bloco quadrado de agarose contendo o tecido com uma lâmina de bisturi e cola-lo no porta-amostra vibratome usando cola de cirurgia (tóxicos).</li>
	<li>Encher a cubeta do vibratome receber o suporte de amostra (cérebro-pituitária) com gelado Ca2 + grátis CE.</li>
	<li>Introduza o suporte do espécime a vibratome e cortar o bloco de agarose para tornar parasagital seções de 150 µm, usando a alta frequência e a baixa velocidade para o corte. Recolher as seções selecionadas e colocá-los na câmara de gravação de remendo-braçadeira com 3ml da gelada Ca2 + grátis CE.</li>
	<li>Coloque a harpa de grade (Figura 2B) na seção de tecido. Nota: A harpa será junto com o revestimento estabilizar o tecido e impedir a movimentação durante as gravações de remendo-braçadeira.</li>
	<li>Depois a harpa está no lugar, mude o Ca2 + grátis CE médio para o CE normal com Ca2 + e BSA. Deixe o resto de tecido por 10 min.</li>
</ol>3. perfurado Patch-clamp e eletrofisiológicas gravações
<ol><li>Antes de iniciar o experimento, o cloreto de prata fio eletrodos pelas seguintes etapas: primeiro, use uma lixa fina (p180) para limpar os eletrodos de fio de prata. Em segundo lugar, enxague com 2 mL, de etanol a 70%. Em terceiro lugar, mergulhe os fios em 2 mL, 2 – 5% de cloro por 10 min. Finalmente, enxaguar com 2 mL, ultrapura H2O.</li>
	<li>Coloque a câmara de gravação com a fatia de cérebro-hipófise na fase de microscópio e localizar a área de alvo (hipófise) com objetivo de X 10 e inspecionar as células com o objectivo de X 40. Nota: Se a preparação for bem sucedida, muito poucas células redondas devem ser visíveis. Esses redondos são células geralmente danificadas que são desanexação do tecido.</li>
	<li>Coloque o eletrodo de aterramento através da ponte de ágar de 2% para o banho do CE.</li>
	<li>Localize uma célula saudável usando o objectivo X 40. Nota: Uma célula saudável deve ser firmemente anexada para o pedaço de tecido e não arredondada e desanexada da fatia.</li>
	<li>Definir o amplificador em tensão-braçadeira (VC; Modo de Figura 4A ponto 1). Abrir o selo teste janela e pressione o banho configuração (Figura 4B os pontos 1 e 2. Use um pulso de 5-mV para monitorar a resistência de pipeta (Figura 4B ponto 3).</li>
	<li>A ponta da pipeta com a solução de IC antifúngica gratuita antes de adicionar a solução de IC com anfotericina B, utilizando uma seringa de enchimento microremendo de aterramento (ver Figura 3).</li>
	<li>Adicione uma pressão ligeiramente positiva de ar dentro da pipeta de remendo usando a seringa de 1 mL. Nota: Isto faz um pequeno fluxo líquido da pipeta remendo que evite a contaminação da ponta.</li>
	<li>Uma vez no banho, avaliar a resistência de uma pipeta de remendo e certifique-se de que nenhuma partícula é anexada a ponta da pipeta (Figura 4). Nota: Um pequeno pedaço de fita é anexado para o monitor exibindo a forma de gravação de vídeo, o campo de visão. Isso faz com que o posicionamento da pipeta remendo em relação à célula mais fácil quando o objetivo é não focando a célula.</li>
	<li>Guia da pipeta de remendo para baixo a célula usando Micromanipuladores. Nota: Certifique-se que a pipeta é limpa, procurando por pequenas partículas que podem ter ligado para a ponta da pipeta. Mudanças súbitas na resistência também podem ser um resultado de partículas preso na ponta da pipeta.</li>
	<li>Reajustar a pipeta quando alguns mícrons acima a célula para que a ponta da pipeta tocará a célula 1/3 do meio da célula, como mostrado na Figura 5. Quando tocar o celular, liberar a pressão e aplicar a sucção suave para fazer uma vedação. Nota: O tempo da pipeta remendo entra o banho para uma bem sucedida selo deve ser mantido tão curtos quanto possível. Não mais do que 1 – 1,5 min para evitar a anfotericina B, atingindo a ponta da pipeta e fuga para o banho.</li>
	<li>Imediatamente, alterne para a janela de remendo no software remendo-braçadeira (Figura 4 D ponto 1) e têm um potencial de exploração entre-50 e a-60 mV (ponto4 da figura 2). Zero fora a capacitância rápida composta pela pipeta de vidro (ponto4 da figura 3).</li>
	<li>Alterne para a janela da cela no software remendo-braçadeira (Figura 4E os pontos 1 e 2) e iniciar o monitoramento de resistência de acesso, Ra, exibida na janela. Zerar a capacitância de membrana no software do amplificador (Figura 4E ponto 3) após acesso suficiente. Nota: Acesso suficiente pode demorar de 10 a 30 min (Figura 4E ponto 2). Um bom acesso para gravações de braçadeira atual deve estar abaixo de 20 M.</li>
	<li>Alternar para braçadeira atual, IC, na janela de software do amplificador (Figura 4F ponto 1). Ajuste as correntes rápido-capacitivo na janela - braçadeira do software para o mesmo valor 3.12 amplificador (Figura 4F ponto 2 e 3). Verifica o potencial de membrana (Figura 4F ponto 1). Nota: Importante, se o potencial de membrana é superficial (típico acima -35 mV) a célula pode estar danificada. Cancelar a gravação e encontrar uma nova célula.</li>
	<li>Depois de encontrar uma célula saudável (firmemente ligado ao tecido com membrana potencial abaixo de -40 mV), começam as gravações experimentais como detalhadas do fabricante protocolo 33,34.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Stojilkovic, S. S., Tabak, J., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+and+signaling+in+the+pituitary+gland.">Ion channels and signaling in the pituitary gland.</a> Endocr Rev. 31 (6), 845-915 (2010).</li><li>Stojilkovic, S. S., Zemkova, H., Van Goor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+basis+of+pituitary+cell+type-specific+Ca2++signaling-secretion+coupling.">Biophysical basis of pituitary cell type-specific Ca2+ signaling-secretion coupling.</a> Trends Endocrinol Metab. 16 (4), 152-159 (2005).</li><li>Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine-D2+actions+on+voltage-dependent+calcium+current+and+gonadotropin-II+secretion+in+cultured+goldfish+gonadotrophs.">Dopamine-D2 actions on voltage-dependent calcium current and gonadotropin-II secretion in cultured goldfish gonadotrophs.</a> J Neuroendocrinol. 10 (3), 175-186 (1998).</li><li>Chang, J. P., Pemberton, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+GnRH-Stimulated+signal+transduction+in+the+vertebrate+pituitary+-+Contributions+from+teleost+model+systems.">Comparative aspects of GnRH-Stimulated signal transduction in the vertebrate pituitary - Contributions from teleost model systems.</a> Mol Cell Endocrinol. , (2017).</li><li>Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inward+membrane+currents+and+electrophysiological+responses+to+GnRH+in+ovine+gonadotropes.">Inward membrane currents and electrophysiological responses to GnRH in ovine gonadotropes.</a> Neuroendocrinology. 61 (6), 609-621 (1995).</li><li>Ben-Jonathan, N., Hnasko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+as+a+Prolactin+(PRL)+Inhibitor.">Dopamine as a Prolactin (PRL) Inhibitor.</a> Endocrine Reviews. 22 (6), 724-763 (2001).</li><li>Sanchez-Cardenas, C., Hernandez-Cruz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GnRH-Induced+[Ca2+]i-signalling+patterns+in+mouse+gonadotrophs+recorded+from+acute+pituitary+slices+in+vitro.">GnRH-Induced [Ca2+]i-signalling patterns in mouse gonadotrophs recorded from acute pituitary slices in vitro.</a> Neuroendocrinology. 91 (3), 239-255 (2010).</li><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres.">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li><li>Neher, E., Baker, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Techniques in cellular physiology. , 4-19 (1981).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).</li><li>Cahalan, M., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques:+an+overview.">Patch clamp techniques: an overview.</a> Methods Enzymol. 207, 3-14 (1992).</li><li>Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single Channel Recording. , 113-114 (1983).</li><li>Lindau, M., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgE-mediated+degranulation+of+mast+cells+does+not+require+opening+of+ion+channels.">IgE-mediated degranulation of mast cells does not require opening of ion channels.</a> Nature. 319 (6049), 150-153 (1986).</li><li>Horn, R., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscarinic+activation+of+ionic+currents+measured+by+a+new+whole-cell+recording+method.">Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method.</a> J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).</li><li>Rae, J., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+access+resistance+perforated+patch+recordings+using+amphotericin+B.">Low access resistance perforated patch recordings using amphotericin B.</a> J Neurosci Methods. 37 (1), 15-26 (1991).</li><li>Fan, J. S., Palade, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforated+patch+recording+with+beta-escin.">Perforated patch recording with beta-escin.</a> Pflugers Arch. 436 (6), 1021-1023 (1998).</li><li>Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+conditions+for+primary+culture+of+pituitary+cells+from+the+Atlantic+cod+(Gadus+morhua).+The+importance+of+osmolality,+pCO(2),+and+pH.">Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO(2), and pH.</a> Gen Comp Endocrinol. 178 (2), 206-215 (2012).</li><li>Sigworth, F. J., Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording. , 3-35 (1983).</li><li>Andersen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+slices+-+a+neurobiological+tool+of+increasing+usefulness.">Brain slices - a neurobiological tool of increasing usefulness.</a> Trends in Neurosciences. 4, 53-56 (1981).</li><li>Guerineau, N. C., Bonnefont, X., Stoeckel, L., Mollard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+spontaneous+Ca2++transients+in+acute+anterior+pituitary+slices.">Synchronized spontaneous Ca2+ transients in acute anterior pituitary slices.</a> J Biol Chem. 273 (17), 10389-10395 (1998).</li><li>Levavi-Sivan, B., Bloch, C. L., Gutnick, M. J., Fleidervish, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotonic+coupling+in+the+anterior+pituitary+of+a+teleost+fish.">Electrotonic coupling in the anterior pituitary of a teleost fish.</a> Endocrinology. 146 (3), 1048-1052 (2005).</li><li>Guerineau, N. C., McKinney, R. A., Debanne, D., Mollard, P., Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+cultures+of+the+rat+anterior+pituitary:+morphology,+physiology+and+cell-to-cell+communication.">Organotypic cultures of the rat anterior pituitary: morphology, physiology and cell-to-cell communication.</a> J Neurosci Methods. 73 (2), 169-176 (1997).</li><li>Yu, Y., Ali, D. W., Chang, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+ionic+currents+and+electrophysiological+properties+of+goldfish+somatotropes+in+primary+culture.">Characterization of ionic currents and electrophysiological properties of goldfish somatotropes in primary culture.</a> Gen Comp Endocrinol. 169 (3), 231-243 (2010).</li><li>Price, C. J., Goldberg, J. I., Chang, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-activated+ionic+currents+in+goldfish+pituitary+cells.">Voltage-activated ionic currents in goldfish pituitary cells.</a> Gen Comp Endocrinol. 92 (1), 16-30 (1993).</li><li>Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+membrane+properties+and+ionic+currents+in+cultured+goldfish+gonadotrophs.">Electrical membrane properties and ionic currents in cultured goldfish gonadotrophs.</a> Can J Physiol Pharmacol. 74 (6), 729-743 (1996).</li><li>Xu, S., Shimahara, T., Cooke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitance+increases+of+dissociated+tilapia+prolactin+cells+in+response+to+hyposmotic+and+depolarizing+stimuli.">Capacitance increases of dissociated tilapia prolactin cells in response to hyposmotic and depolarizing stimuli.</a> Gen Comp Endocrinol. 173 (1), 38-47 (2011).</li><li>Haug, T. M., Hodne, K., Weltzien, F. A., Sand, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+properties+of+pituitary+cells+in+primary+culture+from+Atlantic+cod+(Gadus+morhua).">Electrophysiological properties of pituitary cells in primary culture from Atlantic cod (Gadus morhua).</a> Neuroendocrinology. 86 (1), 38-47 (2007).</li><li>Strandabo, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+involved+in+GnRH2-stimulation+of+identified+LH-producing+gonadotropes+from+lhb-GFP+transgenic+medaka+(Oryzias+latipes).">Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes).</a> Mol Cell Endocrinol. 372 (1-2), 128-139 (2013).</li><li>Hodne, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+differences+between+fshb-+and+lhb-expressing+gonadotropes+in+primary+culture.">Electrophysiological differences between fshb- and lhb-expressing gonadotropes in primary culture.</a> Endocrinology. 154 (9), 3319-3330 (2013).</li><li>Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medaka--a+model+organism+from+the+far+East.">Medaka--a model organism from the far East.</a> Nat Rev Genet. 3 (1), 53-64 (2002).</li><li>Ball, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+control+of+the+pars+distalis+in+fishes,+amphibians,+and+reptiles.">Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles.</a> Gen Comp Endocrinol. 44 (2), 135-170 (1981).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pCLAMP+10+Data+Acquisition+and+Analysis+For+Comprehensive+Electrophysiology+User+Guide.">pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis For Comprehensive Electrophysiology User Guide.</a> Molecular Devices Corporation. , (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiClamp+700B+COMPUTER-CONTROLLED+MICROELECTRODE+AMPLIFIER+Theory+and+Operation.">MultiClamp 700B COMPUTER-CONTROLLED MICROELECTRODE AMPLIFIER Theory and Operation.</a> Axon Instruments / Molecular Devices Corp. , (2005).</li><li>Dominguez-Mancera, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+regulation+of+inward+membrane+currents,+electrical+activity+and+LH+release+in+isolated+bovine+gonadotropes.">Leptin regulation of inward membrane currents, electrical activity and LH release in isolated bovine gonadotropes.</a> Biochem Biophys Res Commun. 491 (1), 53-58 (2017).</li><li>Schmidt-Nielsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Animal Physiology : adptation and environment fifth edition. , 613 (1997).</li><li>Burton, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+determinants+of+normal+arterial+plasma+pH+in+ectothermic+vertebrates.">Evolutionary determinants of normal arterial plasma pH in ectothermic vertebrates.</a> J Exp Biol. 205, 641-650 (2002).</li><li>Burton, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dependence+of+normal+arterial+blood+pH+on+sodium+concentration+in+teleost+fish.">The dependence of normal arterial blood pH on sodium concentration in teleost fish.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 114 (2), 111-116 (1996).</li><li>Heming, T. A., Blumhagen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+acid-base+and+electrolyte+states+of+rainbow+trout+exposed+to+alum+(aluminum+sulphate)+in+acidic+and+alkaline+environments.">Plasma acid-base and electrolyte states of rainbow trout exposed to alum (aluminum sulphate) in acidic and alkaline environments.</a> Aquatic Toxicology. 12 (2), 125-139 (1988).</li><li>Reeves, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+body+temperature+and+acid-base+balance+in+ectothermic+vertebrates.">The interaction of body temperature and acid-base balance in ectothermic vertebrates.</a> Annu Rev Physiol. 39, 559-586 (1977).</li><li>Baicu, S. C., Taylor, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-base+buffering+in+organ+preservation+solutions+as+a+function+of+temperature:+new+parameters+for+comparing+buffer+capacity+and+efficiency.">Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency.</a> Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).</li><li>Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Past+seawater+experience+enhances+seawater+adaptability+in+medaka,+Oryzias+latipes.">Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes.</a> Zoological Lett. 2, 12 (2016).</li><li>Cass, A., Finkelstein, A., Krespi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ion+permeability+induced+in+thin+lipid+membranes+by+the+polyene+antibiotics+nystatin+and+amphotericin+B.">The ion permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B.</a> J Gen Physiol. 56 (1), 100-124 (1970).</li><li>Holz, R., Finkelstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+water+and+nonelectrolyte+permeability+induced+in+thin+lipid+membranes+by+the+polyene+antibiotics+nystatin+and+amphotericin+B.">The water and nonelectrolyte permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B.</a> J Gen Physiol. 56 (1), 125-145 (1970).</li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar

Eletrofisiológicas gravações usando a técnica patch-clamp em fatias de cérebro-hipófise exigem cuidadosa otimização. Protocolos bem otimizados para a realização de investigações de viver-pilha especificamente em teleósteos são limitados, com a maioria das publicações usando protocolos baseados em sistemas de mamíferos. A este respeito, é importante estar ciente do fato de que vários parâmetros fisiológicos como pH e pressão osmótica são não só espécies dependentes, mas também muito dependente ...

A hipófise é um órgão endócrino chave nos vertebrados, localizados abaixo do hipotálamo e posteriores para o quiasma óptico. Produz e secreta hormônios de seis a oito dos tipos de célula específica. Hormônios hipofisários constituem um intermediário entre o cérebro e os órgãos periféricos e conduzir a uma grande variedade de processos fisiológicos essenciais, incluindo o crescimento, reprodução e regulação da homeostase. Semelhante a neurônios, células endócrinas da hipófise são eletricamente excitáveis com a capacidade de potenciais de ação de fogo espontaneamente 1. O papel destes potenciais de ação é dependente de célula. Em vários tipos de células da hipófise mamíferos, potenciais de ação podem elevar o intracelular Ca2 + suficientemente para uma liberação sustentada de hormônio 2. Além disso, a hipófise recebe informações estimulatórios e inibitórias do cérebro que afeta o potencial de membrana das células 3,4,5,6. Normalmente, entrada estimulatório aumenta a excitabilidade e muitas vezes envolve a liberação de Ca2 + de lojas intracelulares bem como aumentou a frequência 7a disparar. Compreender como a célula utiliza a composição de canais de íon e adapta-se a estes sinais de entrada do cérebro é chave para a síntese de hormônio de compreensão e libertação.
A técnica da remendo-braçadeira foi desenvolvida na década de 1970 pela Sakmann e Neher 8,9,10 e melhorada pelo Hamill 11e permite investigações detalhadas das propriedades eletrofisiológicas das células até canais de íon único. Além disso, a técnica pode ser usada para estudar a corrente e a tensão. Hoje, remendo de aperto é o padrão de ouro para medir propriedades eletrofisiológicas da célula. Quatro configurações principais da técnica patch-clamp selo apertado foram desenvolvidos 11; o celular conectado, de dentro para fora, o fora-out e o patch de células inteiras. As três primeiras configurações são normalmente utilizadas para investigações de canal único íon. Para o quarto, seguindo a configuração de conexão de celular, um buraco na membrana celular é feito usando a pressão atmosférica sub. Esta configuração também permite que as investigações da composição iônica canal do celular total 12. No entanto, uma limitação dessa técnica é que moléculas citoplasmáticas são diluídas pelo patch pipeta solução 13 (Figura 1A), afetando as respostas elétricas e fisiológicas das células estudadas. Na verdade, algumas dessas moléculas podem desempenhar um papel importante na transdução do sinal ou na regulação dos canais iônicos diferentes. Para evitar isso, Lindau e Fernandez 14 desenvolveu um método onde um composto formadoras de poros é adicionado para a pipeta de remendo. Após a configuração de conexão de celular, o composto irá incorporar a membrana plasmática sob o patch e lentamente perfurar a membrana criando contato elétrico com o citosol (Figura 1B). Podem ser usado vários diferentes antifúngicos tais como nistatina 15 e anfotericina B 16, ou surfactantes como o beta-escina de saponina 17,18 . Estes compostos criar poros grandes o suficiente para permitir que o cátion monovalente e Cl– difusão entre o citosol e a pipeta de remendo, preservando os níveis citosólico de macromoléculas e o maiores íons como Ca2 + 15, 16.
O desafio de usar patch perfurada é a resistência série potencialmente elevados. Resistência série (Rs) ou acesso de resistência é a resistência combinada sobre a pipeta de remendo em relação ao solo. Durante as gravações do remendo-braçadeira, o Rs será em paralelo com a resistência da membrana (Rm). Rm e Rs em trabalho paralelo como um divisor de tensão. Com a alta Rs, a tensão vai cair o Rs dando erros nas gravações. O erro se tornará maior com maiores correntes gravadas. Além disso, o divisor de tensão é também frequência dependente, criando um filtro passa-baixa, afectando assim a resolução temporal. Com efeito, o patch perfurado pode não sempre permitir gravações do grandes e rápidas as correntes como a voltagem dependente correntes at+ (para leituras detalhadas consulte referência 19). Além disso, Rs pode variar durante gravações de remendo-braçadeira, novamente, levando a mudanças na corrente gravada. Assim, falsos positivos podem ocorrer em situações onde Rs muda durante a aplicação da droga.
A eletrofisiologia no tecido cortado foi introduzida primeiramente pelo laboratório para o estudo eletrofisiológicas características dos neurônios no cérebro 20Andersen. A técnica pavimentou o caminho para investigações detalhadas de células únicas, bem como circuitos de comunicações e célula célula célula num ambiente mais intacto. Uma técnica semelhante para fazer fatias da hipófise foi introduzida em 1998 por Guérineau et al 21. no entanto, não foi antes de 2005, que a preparação da fatia do cérebro-hipófise foi usada com sucesso para estudos de remendo-braçadeira em teleósteos 22. Neste estudo, os autores também relataram o uso de gravações de remendo-braçadeira perfurada. No entanto, de longe, a maioria das investigações eletrofisiológicas das células da hipófise foram realizada em mamíferos e apenas um punhado de outros vertebrados, incluindo peixes teleósteos 1,2,22,23 . Em teleósteos, quase todos os estudos foram realizados em células dissociadas primária 24,25,26,,27,28,29,30 .
No presente trabalho, descrevem um protocolo otimizado para preparação de fatias de cérebro-hipófise saudáveis de medaka de peixe o modelo. A abordagem representa várias vantagens em comparação com as culturas de células dissociadas primário. Primeiro, as células são gravadas em um ambiente relativamente preservado em relação ao dissociar as condições de cultura celular. Em segundo lugar, preparações de fatia nos permitem estudar vias indiretas, mediadas por célula-célula comunicação 22, que não é possível em condições de cultura de células dissociadas. Além disso, demonstraremos como realizar gravações eletrofisiológicas sobre as fatias de tecido obtidos utilizando a técnica de perfurada células inteiras remendo-braçadeira com anfotericina B como o agente de formação de poros.
Medaka é um pequeno peixe de água doce nativo da Ásia, encontrada principalmente no Japão. A fisiologia, embriologia e genética do medaka têm sido muito estudadas por mais de 100 anos, 31, e é um modelo de pesquisa comumente usado em muitos laboratórios. De particular importância para este papel é a organização morfológica distinta do complexo hipotálamo-hipófise em peixes teleósteos: Considerando que em mamíferos e aves, os neurônios do hipotálamo liberar os neuro-hormônios regulam as células endócrinas da hipófise para o sistema portal da Eminência mediana, há uma projeção nervosa direta dos neurônios hipotalâmicas para as células endócrinas da hipófise em peixes teleósteos 32. Assim, corte cuidadosamente conduzido de cérebro-hipófise é de particular importância no peixe, que nos permite investigar características eletrofisiológicas das células da hipófise em uma rede de cérebro-hipófise bem preservada e em particular como na hipófise células controlar sua excitabilidade e, assim, a homeostase de Ca2 + .

<table><tbody><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgical glue</td><td>WPI</td><td>VETBOND</td><td>3M Vetbond Tissue Adhesive</td></tr><tr><td>Stainless steel blades</td><td>Campden Instruments</td><td>752-1-SS</td><td></td></tr><tr><td>metal molds</td><td>SAKURA</td><td>4122</td><td></td></tr><tr><td>steel harp</td><td>Warner instruments</td><td>64-1417</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>SIGMA</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure LMP agarose</td><td>invitrogen</td><td>166520-100</td><td></td></tr><tr><td>patch pipettes</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-110-10HP</td><td>Borosilicate with filament O.D.:1.5 mm, I.D.:1.10 mm</td></tr><tr><td>Microscope Slicescope</td><td>Scientifica</td><td>pro6000</td><td></td></tr><tr><td>P-Clamp10</td><td>Molecular Devices</td><td>#1-2500-0180</td><td>sofware</td></tr><tr><td>Digitizer Digidata 1550A1</td><td>Molecular Devices</td><td>DD1550</td><td></td></tr><tr><td>Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B</td><td>Molecular Devices</td><td>1-CV-7B</td><td></td></tr><tr><td>GnRH</td><td>Bachem</td><td>4108604</td><td>H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>pipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>amphotericin B</td><td>SIGMA</td><td>A9528</td><td>pore-forming antibiotic</td></tr><tr><td>polyethylenimine&amp;nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>P3143</td><td>50% PEI solution</td></tr><tr><td>microfiler syringe</td><td>WPI</td><td>MF28/g67-5</td><td></td></tr><tr><td>glass for the agar bridge</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF200-116-15</td><td>Borosilicate with filament O.D.:2.0 mm, I.D.:1.16 mm Fire polished</td></tr><tr><td>Micro-Manager software</td><td></td><td></td><td>Open Source Microscopy Software</td></tr><tr><td>optiMOS sCMOS camera</td><td>Qimaging</td><td>&amp;nbsp;01-OPTIMOS-R-M-16-C</td><td></td></tr><tr><td>sonicator</td><td>Elma</td><td>D-7700 singen</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SiGMA</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>SiGMA</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>SiGMA</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>SiGMA</td><td>G5400</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>SiGMA</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>SiGMA</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>SiGMA</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>SiGMA</td><td>63565</td><td></td></tr><tr><td>MES-acid</td><td>SIGMA</td><td>M0895</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA</td><td>A2153</td><td></td></tr></tbody></table>

healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish

Foram realizadas investigações eletrofisiológicas das células da hipófise em numerosas espécies de vertebrados, mas muito poucos em peixes teleósteos. Entre estes, a maioria clara foram realizada na dissociadas as células primárias. Para melhorar a nossa compreensão de como teleósteos células da hipófise, comportar-se em um ambiente mais biologicamente relevante, este protocolo mostra como preparar fatias de cérebro-hipófise viáveis usando o medaka pequenos peixes de água doce (Oryzias latipes). Fazendo as fatias de cérebro-pituitária, pH e pressão osmótica de todas as soluções foram ajustados aos valores encontrados em fluidos do corpo dos peixes de água doce, vivendo a 25 a 28 ° C. Após a preparação da fatia, o protocolo demonstra como realizar gravações eletrofisiológicas, usando a técnica de perfurada remendo-braçadeira de células inteiras. A técnica patch-clamp é uma ferramenta poderosa com resolução temporal sem precedentes e sensibilidade, permitindo a investigação das propriedades elétricas das células inteira intactas até canais iônicos único. Remendo perfurado é o único que mantém o ambiente intracelular intacto impedindo que elementos reguladores no citosol sendo diluído pela solução de eletrodo de pipeta de remendo. Em contraste, ao realizar gravações de células inteiras tradicionais, observou-se que as células da hipófise medaka rapidamente perdem a capacidade de disparar potenciais de ação. Entre as várias técnicas de perfuração disponíveis, este protocolo demonstra como realizar a perfuração da membrana remendada usando o fungicida anfotericina b.

Este protocolo demonstra um protocolo passo a passo de como conseguir confiança gravações eletrofisiológicas de células da hipófise (gonadotróficas), usando uma linha de transgénicos medaka [Tg (CLB- hrGfpII)] onde o alvo células (Lh-produzindo gonadotropes) são etiquetados com proteína verde fluorescente (GFP).
Inicialmente, as investigações eletrofisiológicas foram realizadas usando a configuração de c...

Watch this Scientific Journal Video about Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish at JoVE.com

Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish

O artigo descreve um protocolo otimizado para fazer fatias de tecido cerebral-hipófise viável, usando o medaka peixes teleósteos (Oryzias latipes), seguido por gravações eletrofisiológicas de células da hipófise, usando a técnica de remendo-braçadeira com o configuração de remendo perfurada.

Fatias de cérebro-hipófise saudáveis para investigações eletrofisiológicas das células da hipófise em peixes teleósteos

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the ...

healthy-brain-pituitary-slices-for-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.7K visualizações.  Norwegian University of Life Sciences. O artigo descreve um protocolo otimizado para fazer fatias de tecido cerebral-hipófise viável, usando o medaka peixes teleósteos (Oryzias latipes), seguido por gravações eletrofisiológicas de células da hipófise, usando a técnica de remendo-braçadeira com o configuração de remendo perfurada.

Vídeo: Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

Patch-clamp medidas de capacitância e Ca 2 + Imaging nos terminais nervosos da retina único em Fatias

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Neurociência

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked seizures, epilepsy can be acquired as a result of an insult to the brain or a genetic mutation. Efforts to model seizures in animals have primarily utilized acquired insults (convulsant drugs, stimulation or brain injury) and genetic manipulations (antisense knockdown, homologous recombination or transgenesis) in rodents. Zebrafish are a vertebrate model system1-3 that could provide a valuable alternative to rodent-based epilepsy research. Zebrafish are used extensively in the study of vertebrate genetics or development, exhibit a high degree of genetic similarity to mammals and express homologs for ~85% of known human single-gene epilepsy mutations. Because of their small size (4-6 mm in length), zebrafish larvae can be maintained in fluid volumes as low as 100 &mu;l during early development and arrayed in multi-well plates. Reagents can be added directly to the solution in which embryos develop, simplifying drug administration and enabling rapid in vivo screening of test compounds4. Synthetic oligonucleotides (morpholinos), mutagenesis, zinc finger nuclease and transgenic approaches can be used to rapidly generate gene knockdown or mutation in zebrafish5-7. These properties afford zebrafish studies an unprecedented statistical power analysis advantage over rodents in the study of neurological disorders such as epilepsy. Because the "gold standard" for epilepsy research is to monitor and analyze the abnormal electrical discharges that originate in a central brain structure (i.e., seizures), a method to efficiently record brain activity in larval zebrafish is described here. This method is an adaptation of conventional extracellular recording techniques and allows for stable long-term monitoring of brain activity in intact zebrafish larvae. Sample recordings are shown for acute seizures induced by bath application of convulsant drugs and spontaneous seizures recorded in a genetically modified fish.

A simple method to record extracellular field potentials in the larval zebrafish forebrain is described. The method provides a robust in vivo read-out of seizure-like activity. This technique can be used with genetically modified zebrafish larvae carrying epilepsy-related genes or seizures evoked by administration of convulsant drugs.

Prosencéfalo gravação eletrofisiológico em larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

Registro da atividade elétrica dos neurônios identificados no cérebro intacto de peixes transgénicos

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and social interactions can be best studied by observing unrestrained, freely behaving animals. Weakly electric fish (WEF) display readily observable exploratory and social behaviors by emitting electric organ discharge (EOD). Here, we describe three effective techniques to synchronously measure the EOD, body position, and posture of a free-swimming WEF for an extended period of time. First, we describe the construction of an experimental tank inside of an isolation chamber designed to block external sources of sensory stimuli such as light, sound, and vibration. The aquarium was partitioned to accommodate four test specimens, and automated gates remotely control the animals&#39; access to the central arena. Second, we describe a precise and reliable real-time EOD timing measurement method from freely swimming WEF. Signal distortions caused by the animal&#39;s body movements are corrected by spatial averaging and temporal processing stages. Third, we describe an underwater near-infrared imaging setup to observe unperturbed nocturnal animal behaviors. Infrared light pulses were used to synchronize the timing between the video and the physiological signal over a long recording duration. Our automated tracking software measures the animal&#39;s body position and posture reliably in an aquatic scene. In combination, these techniques enable long term observation of spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish in a reliable and precise manner. We believe our method can be similarly applied to the study of other aquatic animals by relating their physiological signals with exploratory or social behaviors.

We describe a set of techniques for studying spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish over an extended period of time, by synchronously measuring the animal&#39;s electric organ discharge timing, body position and posture both accurately and reliably in a specially designed aquarium tank inside a sensory isolation chamber.

Longo prazo Behavioral Rastreamento de Livremente Natação fracamente elétrico dos peixes

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Gravação eletrofisiológica no cérebro de Intacta Zebrafish Adulto

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Gravações de células inteiras de patch-clamp em Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one of the first organs to start functioning during development. Mechanisms of blood vessel formation have become a subject of high scientific and clinical interest. In adults however, it is difficult to visualize the vasculature in most living animals due to their localization deep within other tissues. Nevertheless, visualization of blood vessels remains important for several studies such as endocrinology and neurobiology. While several transgenic lines have been developed in zebrafish, with blood vessels directly visualized through expression of fluorescent proteins, no such tools exist for other teleost species. Using medaka (Oryzias latipes) as a model, the current protocol presents a quick and direct technique to label blood vessels in brain and pituitary by perfusing through the heart with fixative containing DiI. This protocol allows improvement of our understanding on how brain and pituitary cells interact with blood vasculature in whole tissue or thick tissue slices.

The article describes a quick protocol for labeling blood vessels in a teleost fish by cardiac perfusion of DiI diluted in fixative, using medaka (Oryzias latipes) as a model and focusing on brain and pituitary tissue.

Rotulagem de vasos sanguíneos no cérebro Teleost e pituitária usando a perfusão cardíaca com um DiI-fixative

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...

Bioengenharia

Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled environment. Despite vast differences in the physiology between mammals and fish, primary cell culture protocols from fish are often based on mammalian culture conditions, often with only minor modifications. The environmental differences affect not only body temperature, but also blood serum parameters such as osmolality, pH, and pH buffer capacity. As cell culture media and similar working solutions are meant to mimic characteristics of the extracellular fluid and/or blood serum to which a cell is adapted, it is crucial that these parameters are adjusted specifically to the animal in question.
The current protocol describes optimized primary culture conditions for medaka (Oryzias latipes). The protocol provides detailed steps on how to isolate and maintain healthy dissociated pituitary cells for more than one week and includes the following steps: 1. the adjustment of the osmolality to the values found in medaka blood plasma, 2. the adjustment of the incubation temperature to normal medaka temperature (here in the aquarium facility), and 3. the adjustment of the pH and bicarbonate buffer to values comparable to other fish species living at similar temperatures. The results presented using the described protocol promote physiologically meaningful results for medaka and can be used as a reference guide by scientists making primary cell cultures from other non-mammalian species.

Here we describe a protocol to prepare and maintain primary pituitary cell cultures from medaka (Oryzias latipes). The optimized conditions in this protocol take important parameters such as temperature, osmolality, and pH into consideration by mimicking the physiological conditions of the fish, thereby enabling physiologically more meaningful results.

Preparação de uma cultura de célula primária de alta qualidade do peixe Pituitaries

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled ...

Electrophysiological Investigations of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapse Function

The lateral geniculate nucleus is the first relay station for the visual information. Relay neurons of this thalamic nucleus integrate input from retinal ganglion cells and project it to the visual cortex. In addition, relay neurons receive top-down excitation from the cortex. The two main excitatory inputs to the relay neurons differ in several aspects. Each relay neuron receives input from only a few retinogeniculate synapses, which are large terminals with many release sites. This is reflected by the comparably strong excitation, the relay neurons receive, from retinal ganglion cells. Corticogeniculate synapses, in contrast, are simpler with few release sites and weaker synaptic strength. The two synapses also differ in their synaptic short-term plasticity. Retinogeniculate synapses have a high release probability and consequently display a short-term depression. In contrast, corticogeniculate synapses have a low release probability. Corticogeniculate fibers traverse the reticular thalamic nuclei before entering the lateral geniculate nucleus. The different locations of the reticular thalamic nucleus (rostrally from the lateral geniculate nucleus) and optic tract (ventro-laterally from the lateral geniculate nucleus) allow stimulating corticogeniculate or retinogeniculate synapses separately with extracellular stimulation electrodes. This makes the lateral geniculate nucleus an ideal brain area where two excitatory synapses with very different properties impinging onto the same cell type, can be studied simultaneously. Here, we describe a method to investigate the recording from relay neurons and to perform detailed analysis of the retinogeniculate and corticogeniculate synapse function in acute brain slices. The article contains a step-by-step protocol for the generation of acute brain slices of the lateral geniculate nucleus and steps for recording activity from relay neurons by stimulating the optic tract and corticogeniculate fibers separately.

Here, we present protocols for the preparation of acute brain slices containing the lateral geniculate nucleus and the electrophysiological investigation of retinogeniculate and corticogeniculate synapses function. This protocol provides an efficient way to study synapses with the high-release and low-release probability in the same acute brain slices.

Investigações eletrofisiológicas de Retinogeniculate e função do Synapse de Corticogeniculate

The lateral geniculate nucleus is the first relay station for the visual information. Relay neurons of this thalamic nucleus integrate input from retinal ...

Preparing Acute Brain Slices from the Dorsal Pole of the Hippocampus from Adult Rodents

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of cellular and synaptic properties. Nevertheless, there is an ever increasing need to perform correlated analyses between different experimental modes in addition to slice electrophysiology, for example: immunohistochemistry, molecular biology, in vivo imaging or electrophysiological recording; to answer evermore complex questions of brain function. However, making meaningful conclusions from these various experimental approaches is not straightforward, as even within relatively well described brain structures, a high degree of sub-regional variation of cellular function exists. Nowhere is this better exemplified than in the CA1 of the hippocampus, which has well-defined dorso-ventral properties, based on cellular and molecular properties. Nevertheless, many published studies examine protein expression patterns or behaviorally correlated in vivo activity in the dorsal extent of the hippocampus; and explain findings mechanistically with cellular electrophysiology from the ventro-medial region. This is further confounded by the fact that many acute slice electrophysiological experiments are performed in juvenile animals, when other experimental modes are performed in more mature animals. To address these issues, this method incorporates transcardial perfusion of mature (&#62;60 day old rodents) with artificial cerebrospinal fluid followed by preparation of modified coronal slices including the septal pole of the dorsal hippocampus to record from CA1 pyramidal cells. This process leads to the generation of healthy acute slices of dorsal hippocampus allowing for slice-based cellular electrophysiological interrogation matched to other measures.

The purpose of this protocol is to describe a method to produce slices of the dorsal hippocampus for electrophysiological examination. This procedure employs perfusion with chilled ACSF prior to slice preparation with a near-coronal slicing angle which allows for preservation of healthy principal neurons.

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of ...