Grazie Sig. ra LourdesCarreon G Tan per il suo aiuto mantenere la struttura di medaka e Anthony Peltier per le figure illustrative. Questo lavoro è stato finanziato da NMBU e dal Consiglio della ricerca della Norvegia, grant numeri 244461 (programma di acquacoltura) e 248828 (programma di vita digitale Norvegia).

Tutti gli animali gestione è stata eseguita secondo le raccomandazioni per la cura e il benessere degli animali di ricerca presso l'Università norvegese di Scienze della vita e sotto la supervisione di ricercatori autorizzati.
1. preparazione di strumenti e soluzioni
Nota: Tutte le soluzioni devono essere sterili. Attenzione occorre prestare attenzione per il pH e l'osmolalità (osmol/kg di acqua) di tutte le soluzioni, che dovrebbe essere attentamente adattato all'ambiente extracellulare delle specie studiate. pH e osmolalità deve essere regolati con precisione apparecchiature elettroniche, quali pH-metro e punto di congelamento Osmometro rispettivamente.
<ol><li>
Fare 500 mL di soluzione extracellulare senza Ca2 + (Ca2 + libero CE): 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,3 mM MgCl2, glucosio di 4 mM, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>Sciogliere 4,38 g di NaCl, 186,37 mg di KCl, 61,89 mg di MgCl2, 360,32 mg di glucosio e 1,19 g di HEPES in 450 mL di ultrapura (0,055 uS / cm a 25 ° C, la resistività del 18,2 MOhm) H2O in un becher di vetro usando un agitatore magnetico.</li>
		<li>Regolare il pH a 7.75 con NaOH.</li>
		<li>Trasferire la soluzione in un matraccio tarato da 500 mL. Riempire il matraccio tarato con ultrapura H2O fino a 500 mL.</li>
		<li>Mescolare bene prima di misurare il osmolality. Regolare a 290-300 mOsm con mannitolo. Filtro sterilizzare la soluzione utilizzando il sistema di vuoto di acqua e filtro di 0,2 µm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fare 500 mL di soluzione extra-cellulare (CE): 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2mm CaCl2, 1,3 mM MgCl2, glucosio di 4 mM, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>Sciogliere 4,38 g di NaCl, 186,37 mg di KCl, 147,01 mg di CaCl2, 61,89 mg di MgCl2, 360,32 mg di glucosio e 1,19 g di HEPES in 450 mL di ultrapura H2O in un becher di vetro usando un agitatore magnetico.</li>
		<li>Regolare il pH a 7.75 con NaOH.</li>
		<li>Trasferire la soluzione in un matraccio tarato da 500 mL. Riempire il matraccio tarato con ultrapura H2O fino a 500 mL.</li>
		<li>Mescolare bene prima di misurare il osmolality. Regolare a 290-300 mOsm con mannitolo. Filtro sterilizzare la soluzione utilizzando il sistema di vuoto di acqua e filtro di 0,2 µm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fare 500 mL di soluzione extracellulare con 0,1% di sieroalbumina bovina (CE con BSA): 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2mm CaCl2, 1,3 mM MgCl2, glucosio di 4 mM, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>Sciogliere 4,38 g di NaCl, 186,37 mg di KCl, 147,01 mg di CaCl2, 61,89 mg di MgCl2, 360,32 mg di glucosio e 1,19 g di HEPES in 450 mL di ultrapura H2O in un becher di vetro usando un agitatore magnetico.</li>
		<li>Regolare il pH a 7.75 con NaOH.</li>
		<li>Trasferire la soluzione in un matraccio tarato da 500 mL. Riempire il matraccio tarato con ultrapura H2O fino a 500 mL.</li>
		<li>Mescolare bene prima di misurare il osmolality. Regolare a 290-300 mOsm con mannitolo. Filtro sterilizzare la soluzione utilizzando il sistema di vuoto di acqua e filtro di 0,2 µm. Aggiungere 50 mg di BSA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fare 250 mL di soluzione intracellulare (IC): 110 mM KOH, 20 mM KCl, 10 mM Hepes, saccarosio 20 mM.
	<ol>
<li>Sciogliere 1,54 g KOH, 327,75 mg di KCl, 595,75 mg di HEPES e 1,712 g di saccarosio in 450 mL di ultrapura H2O in un becher di vetro usando un agitatore magnetico.</li>
		<li>Regolare il pH a 7,2 con (N-morfolino) etano (MES) acidi solfonici.</li>
		<li>Trasferire la soluzione in un matraccio tarato da 250 mL. Riempire il matraccio tarato con ultrapura H2O fino a 250 mL.</li>
		<li>Mescolare bene prima di misurare il osmolality. Regolare a 280-290 mOsm (10 mOsm inferiore CE) con saccarosio. Filtro sterilizzare la soluzione utilizzando il sistema di vuoto di acqua e filtro di 0,2 µm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fare 100 mL di soluzione di agarosio fusione basso di 2% in Ca2 + e CE gratis BSA (2 g di agarosio bassa fusione in 100 mL di Ca2 + gratis CE). Sciogliere utilizzando un forno a microonde e posizionare l'agarosio fuso in un bagno di acqua a 40 ° C. Lasciate raffreddare fino a quando non raggiunge i 40 ° C prima dell'uso sui tessuti. Nota: CE, Ca2 + gratis CE può essere conservati a 4 ° C per diverse settimane se sterile e soluzioni IC a-20 ° C, per diversi mesi. Agarosio può essere conservato per una settimana a 4 ° C e può essere riutilizzato 3 – 5 volte da brevemente microwaving. Eccessivo riutilizzo porterà ad evaporazione e alterazione di agarosio e la concentrazione di sale e la qualità.</li>
	<li>
Fare ponte di agar:
	<ol>
<li>Riscaldare i capillari di vetro borosilicato lungo 7,5 mm con diametro esterno (O.D.) 2 mm e diametro interno (I.D.) 1,16 mm utilizzando un bruciatore di Bunsen a una focale punto circa 1/3 da un'estremità fino a quando il vetro comincia a piegarsi. Togliere il vetro dal fuoco e lasciare il vetro da piegare con un angolo di circa 120 gradi (Figura 2A).</li>
		<li>Sciogliere 2% agar CE normale senza glucosio facendo uso di un forno a microonde, e mentre l'agarosio è liquido riempire il vetro pre-fatto capillare utilizzando capillarità forze mettendo una delle estremità del vetro nel liquido e un'attesa di pochi minuti. Negozio ponti fino all'utilizzo a 4 ° C in CE senza glucosio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare in vetro borosilicato con pipette di patch di filamento con l'estrattore adatto pipetta. Consultare il manuale di estrattore di pipetta per ottenere la resistenza desiderata dell'elettrodo. Nota: Il cono della pipetta deve essere più corto possibile. Breve pipetta cono è realizzato usando 4 – 6 operazioni di trazione. La resistenza dell'elettrodo dovrebbe essere tra 2 e 6 MΩ a seconda delle dimensioni della cella.</li>
	<li>
Per evitare il movimento del tessuto durante gli esperimenti di patch-clamp rivestire la superficie della camera di registrazione con 0,1% di polyethylenimine (PEI) in tampone borato.
	<ol>
<li>Preparare 500 mL di tampone borato (25 mM):<ol>
<li>Sciogliere g 4,768 di Na2B4O710 H2O in 450 mL di ultrapura H2O in un becher di vetro usando un agitatore magnetico.</li>
			<li>Regolare il pH a 8.4 con HCl.</li>
			<li>Trasferire la soluzione in un matraccio tarato da 500 mL. Riempire il matraccio tarato con ultrapura H2O fino a 500 mL e 0,2 µm filtro sterilizzare la soluzione utilizzando acqua sistema di vuoto.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparare una soluzione stock di 1% di PEI (1 mL 50% PEI per tampone borato di 49 mL 25 mM) e una diluizione di PEI 0,1% da diluire 10 µ l di soluzione di riserva 1% a 100 µ l di tampone borato per uso finale.</li>
		<li>Aggiungere 2 mL di 0,1% PEI sul vetro del titolare fetta e lasciare che il rivestimento Incubare per 1 minuto. Poi brevemente lavare il vetro due volte con 5 mL di ultrapura H2O e lasciare asciugare fino all'utilizzo aria.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparare soluzioni di anfotericina B.
	<ol>
<li>Fanno 60 mg/mL di soluzione madre sciogliendo 3 mg di polvere di amfotericina B in 50 µ l dimetil solfossido (DMSO), in un tubo di 1 mL al riparo dalla luce. Vortice alla velocità massima per 30 s e Sonicare per 15 min omogeneizzare. Conservare le aliquote in 3 – 5 provette a-20 ° C e utilizzare un'aliquota al giorno. Nota: Se la soluzione di riserva di anfotericina B non è chiaro e giallo colore ma latteo (ancora giallo) dopo 15 – 20 min sonicazione assicurarsi una nuova soluzione di riserva.</li>
		<li>Rendono il IC soluzione con anfotericina B pipettaggio 2 mL di IC in un becher di vetro pulito con più di 10 mL di capacità. Aggiungere 8 µ l di soluzione madre di amfotericina B nella soluzione pipetta e Miscelare pipettando. Avvolgere il becher con foglio di alluminio e posto sul ghiaccio fino all'utilizzo e rinnovarlo ogni 3 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. dissezione e affettare con Vibratome
<ol><li>Preparare gli strumenti di dissezione prima di dissezione, tra cui uno sharp e un forcipe forte con le forbici. Pulire gli attrezzi (Portarotolo, pennello, forcipe) con etanolo e assicurarsi che essi sono utilizzati solo a fini di dissezione e mai a contatto con tessuti fissi. Tenerli in una scatola separata per evitare la contaminazione.</li>
	<li>Eutanasia il pesce in acqua fredda ghiaccio per 1 min.</li>
	<li>
Seguire i passaggi successivi per sezionare rapidamente medaka cervello e ipofisi con pinze taglienti (utilizzare non più di 3 min).
	<ol>
<li>Tenendo il pesce con il forcipe forte severa dei due nervi ottici dietro gli occhi con le forbici o pinze di taglienti.</li>
		<li>Aprire la parte dorsale del cranio da posteriore al lato anteriore rompendo le ossa del cranio passo dopo passo con il forcipe forte.</li>
		<li>Staccare il cranio su un lato con il forcipe forte.</li>
		<li>Grave del midollo con forbici o pinze taglienti.</li>
		<li>Delicatamente, afferrare il midollo spinale con il forcipe, capovolgere il cervello da posteriore ad anteriore e metterlo in un piatto con la gelida Ca2 + gratis CE.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Riempire uno stampo di metallo3 1,5-2 cm con agarosio liquido e collocarlo sul ghiaccio.</li>
	<li>Poco prima l'agarosio si solidifica (a circa 25 – 30 ° C), delicatamente afferrare il cervello dal midollo spinale con il forcipe, asciugare il forcipe con un pezzo di carta fine e mettere il tessuto in agarosio. Mescolare rapidamente l'agarosio per diluire le tracce della CE a sinistra intorno al tessuto e orientare il tessuto e lasciate lo stampo sul ghiaccio per pochi secondi fino a quando l'agarosio si indurisce. Nota: È essenziale per questo passaggio di essere veloce. L'agarosio si solidifica rapidamente come lo stampo di metallo si è raffreddato dal ghiaccio.</li>
	<li>Tagliare un blocco quadrato di agarosio contenente il tessuto con un bisturi e colla sul portacampioni vibratome utilizzando colla di chirurgia (non tossico).</li>
	<li>Riempire la cuvetta del vibratome ricevendo il portacampioni (cervello-ipofisi) con gelida Ca2 + gratis CE.</li>
	<li>Inserire il portacampioni del vibratome e tagliare il blocco di agarosio per rendere parasagittal sezioni di 150 µm, utilizzando ad alta frequenza e bassa velocità per il sezionamento. Raccogliere le sezioni selezionate e metterli nella camera di registrazione di patch-clamp con 3 mL della ghiacciata Ca2 + gratis CE.</li>
	<li>Posizionare l'arpa di griglia (Figura 2B) sulla sezione del tessuto. Nota: L'arpa sarà insieme con il rivestimento stabilizzare il tessuto ed evitare che si sposti durante le registrazioni di patch-clamp.</li>
	<li>Dopo l'arpa è a posto, è possibile modificare il Ca2 + CE mezzo libero alla CE normale con Ca2 + e BSA. Lasciate riposare il tessuto per 10 min.</li>
</ol>3. perforata del Patch-clamp e registrazioni elettrofisiologiche
<ol><li>Prima di iniziare l'esperimento, cloruro di argento filo elettrodi mediante le seguenti fasi: in primo luogo, utilizzare una carta vetrata fine (p180) per pulire gli elettrodi di filo d'argento. In secondo luogo, lavare con 2 mL, etanolo al 70%. In terzo luogo, immergere i fili in 2 mL, 2 – 5% di cloro per 10 min. Infine, risciacquare con 2 mL, ultrapura H2O.</li>
	<li>Posizionare la camera di registrazione con la fetta di cervello-ipofisi in fase di microscopio e individuare l'area di destinazione (pituitaria) utilizzando obiettivo 10x e ispezionare le celle utilizzando obiettivo 40x. Nota: Se la preparazione è successo, molto poche cellule rotonde devono essere visibile. Queste cellule rotonde sono solitamente danneggiate le cellule che sono lo scollegamento dal tessuto.</li>
	<li>Posizionare l'elettrodo di messa a terra attraverso il ponte di 2% agar nel bagno di CE.</li>
	<li>Individuare una cellula sana usando l'obiettivo 40x. Nota: Una cellula sana dovrebbe essere saldamente attaccata alla fetta di tessuto e non arrotondata e staccata dal slice.</li>
	<li>Impostare l'amplificatore in tensione-morsetto (VC; Modalità del punto 1 di Figura 4A ). Aprire il sigillo test finestra e premere il bagno configurazione (Figura 4B punto 1 e 2. Utilizzare un impulso di 5-mV per monitorare pipetta resistenza (Figura 4B punto 3).</li>
	<li>Recupero informazioni la punta della pipetta patch con la soluzione di IC antifungina gratuita prima di aggiungere la soluzione di IC con anfotericina B utilizzando una siringa di micro-filler (Vedi Figura 3).</li>
	<li>Aggiungere una pressione d'aria leggermente positivo nella pipetta patch usando la siringa da 1 mL. Nota: In questo modo un piccolo flusso di liquido dalla pipetta patch che evitare la contaminazione della punta.</li>
	<li>Una volta nel bagno, valutare la resistenza di pipetta patch e assicurarsi che le particelle non sono attaccate alla punta della pipetta (Figura 4). Nota: Un piccolo pezzo di nastro è collegato sul monitor visualizzare il form di registrazione video, il campo di vista. Questo rende il posizionamento della pipetta patch relativa cella più facile quando l'obiettivo non mette a fuoco sulla cella.</li>
	<li>Guida la pipetta patch fino alla cella utilizzando micromanipolatori. Nota: Assicurarsi che la pipetta sia pulita cercando di piccole particelle che possono avere attaccato alla punta della pipetta. Improvvisi cambiamenti di resistenza possono anche essere un risultato di particelle bloccato nella punta della pipetta.</li>
	<li>Regolare di nuovo la pipetta quando alcuni micron sopra la cella affinché la punta della pipetta toccherà la cella 1/3 dalla metà della cella, come illustrato nella Figura 5. Quando si tocca la cella, rilasciare la pressione e applicare l'aspirazione delicata per fare un sigillo. Nota: Il tempo dalla pipetta patch entra il bagno ad un successo guarnizione dovrebbe essere tenuto più corto possibile. Non più di 1 – 1,5 min al fine di evitare di anfotericina B raggiungendo la punta della pipetta e perdita nel bagno.</li>
	<li>Immediatamente passare alla finestra di patch del software di patch-clamp (Figura 4 D punto 1) e hanno un potenziale di tenuta tra-50 e -60 mV (Figura 4 punto 2). Zero out la capacitanza veloce composto dalla pipetta di vetro (Figura 4 punto 3).</li>
	<li>Passare alla finestra delle cellule nel software di patch-clamp (Figura 4E punto 1 e 2) e avviare il monitoraggio resistenza di accesso, Ra, visualizzato nella finestra. Azzerare la capacità di membrana nel software amplificatore (Figura 4E punto 3) dopo un accesso sufficiente. Nota: Diritti di accesso sufficienti potrebbe richiedere 10 a 30 min (Figura 4E punto 2). Un buon accesso per le registrazioni di morsetto corrente dovrebbe essere inferiore a 20 M.</li>
	<li>Passare alla pinza amperometrica, IC, nella finestra del software di amplificatore (Figura 4F punto 1). Regolare le correnti fast-capacitivo nella finestra del software amplificatore (Figura 4F punto 2 e 3) sul valore stesso come 3.12 - morsetto . Controllare il potenziale di membrana (Figura 4F punto 1). Nota: La cosa importante, se il potenziale di membrana è bassa (tipico sopra -35 mV) la cella potrebbe essere danneggiata. Annullare la registrazione e trovare una nuova cella.</li>
	<li>Dopo aver trovato una cellula sana (saldamente attaccato al tessuto con membrana potenziale sotto -40 mV), avviare le registrazioni sperimentali come dettagliate nel protocollo 33,34 del produttore.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare

Le registrazioni elettrofisiologiche usando la tecnica del patch-clamp su fettine di cervello-ipofisi richiedono attenta ottimizzazione. Protocolli ben ottimizzati per lo svolgimento di indagini di cellule vive specificamente in teleostei sono limitati, con la maggior parte delle pubblicazioni che utilizzano protocolli basati su sistemi mammiferi. A questo proposito, è importante essere consapevoli del fatto che diversi parametri fisiologici come pH e osmolalità sono non solo specie dipendente, ma anche molto dipende s...

L'ipofisi è un organo endocrino chiave nei vertebrati situati sotto l'ipotalamo e posteriormente al chiasma. Produce e secerne ormoni di sei-otto dai tipi cellulari specifici. Ormoni ipofisari costituiscono un intermedio tra il cervello e gli organi periferici e pilotare un'ampia gamma di processi fisiologici essenziali tra cui la crescita, la riproduzione e la regolazione dell'omeostasi. Simili ai neuroni, cellule endocrine dell'ipofisi sono eccitabili elettricamente con la capacità di fuoco spontaneamente i potenziali di azione 1. Il ruolo di questi potenziali di azione è cella dipendente. In diversi tipi di cellule dell'ipofisi dei mammiferi, i potenziali di azione possono elevare l'intracellulare Ca2 + sufficientemente per un rilascio prolungato dell'ormone 2. Inoltre, l'ipofisi riceve informazioni sia stimolatori e inibitori del cervello che colpisce il potenziale di membrana delle cellule 3,4,5,6. In genere, stimolatori input aumenta l'eccitabilità e spesso comporta il rilascio di Ca2 + dai depositi intracellulari nonché aumentata frequenza 7di infornamento. Comprendere come la cella utilizza la composizione di canale ionico e si adatta a questi segnali di input dal cervello è la chiave alla comprensione dell'ormone sintesi ed il rilascio.
La tecnica del patch-clamp è stata sviluppata nel tardo 1970 da Sakmann e Neher 8,9,10 e ulteriormente migliorata da Hamill 11e permette indagini dettagliate delle proprietà elettrofisiologiche delle cellule giù per i canali ionici singolo. Inoltre, la tecnica può essere utilizzata per lo studio di tensione e corrente. Oggi, patch di bloccaggio è il gold standard per le proprietà elettrofisiologiche della cella di misura. Quattro configurazioni principali della tecnica del patch-clamp tenuta sono stati sviluppati 11; la cella collegata, dentro-fuori, fuori-fuori e la patch di cellule intere. Le tre configurazioni prime in genere sono utilizzate per le indagini di canale singolo ione. Per il quarto, dopo la configurazione di cella-associata, un buco nella membrana cellulare avviene tramite pressione sub-atmosferica. Questa configurazione consente inoltre di indagini della composizione canale ionico dell' intera cellula 12. Tuttavia, una limitazione di questa tecnica è che molecole citoplasmatiche sono diluiti dai patch pipetta soluzione 13 (Figura 1A), influenzando così le risposte elettriche e fisiologiche delle cellule studiate. Infatti, alcune di queste molecole possono svolgere ruoli importanti nella trasduzione del segnale o nella regolazione dei canali ionici diversi. Per evitare questo, Lindau e Fernandez 14 ha sviluppato un metodo dove un composto pore-forming viene aggiunto alla pipetta patch. In seguito la configurazione collegata alla cella, il composto sarà incorporare nella membrana del plasma sotto la patch e lentamente perforare la membrana creazione contatto elettrico con il citosol (Figura 1B). Parecchi diversi antimicotici quali nistatina 15 e amfotericina B 16, o tensioattivi come le saponine beta-escina 17,18 possono essere utilizzato. Questi composti creare pori abbastanza grandi da permettere di cationi monovalenti e Cl– diffusione tra il citosol e la pipetta patch preservando i livelli citosolici di macromolecole e più grandi ioni come Ca2 + 15, 16.
La sfida di utilizzare perforato patch è la resistenza serie potenzialmente elevato. Resistenza in serie (Rs) o accesso resistenza è la resistenza combinata sopra la pipetta patch rispetto al suolo. Durante le registrazioni di patch-clamp, la Rs sarà in parallelo con la resistenza di membrana (Rm). Rm e Rs a lavoro parallelo come un partitore di tensione. Con l'alta Rs, la tensione cadrà sopra la Rs dà errori nelle registrazioni. L'errore diventerà più grande con correnti elevate registrate. Inoltre, il partitore di tensione è anche frequenza dipendente dalla creazione di un filtro passa-basso, influenzando così la risoluzione temporale. In effetti, la patch perforata potrebbe non sempre consentire registrazioni delle ampie e veloci correnti come la tensione gated le correnti Na+ (per letture dettagliate vedi riferimento 19). Inoltre, Rs possono variare durante le registrazioni di patch-clamp, nuovamente portando a cambiamenti nella corrente registrata. Così, falsi positivi possono verificarsi in situazioni dove Rs cambia durante l'applicazione del farmaco.
L'elettrofisiologia sul tessuto affettato è stato introdotto al laboratorio di Andersen per studiare le caratteristiche elettrofisiologiche dei neuroni nel cervello 20. La tecnica ha aperto la strada per indagini dettagliate delle singole cellule così come i circuiti di comunicazioni e cellula-cellula in un ambiente intatto. Una tecnica simile per fare fette pituitari è stato introdotto nel 1998 da Guérineau et al. 21. Tuttavia, non era prima del 2005, quella fetta di cervello-ipofisi preparazione è stata utilizzata con successo per gli studi di patch-clamp in teleostei 22. In questo studio, gli autori hanno segnalato anche l'utilizzo di registrazioni perforato patch clamp. Tuttavia, di gran lunga, la maggior parte delle indagini elettrofisiologiche delle cellule ipofisarie sono stati condotti nei mammiferi e solo una manciata di altri vertebrati, tra cui pesci teleostei 1,2,22,23 . In teleostei, quasi tutti gli studi sono stati effettuati su cellule dissociate primarie 24,25,26,27,28,29,30 .
Nel presente documento, abbiamo delineare un protocollo ottimizzato per la preparazione di fette di cervello-ipofisi sane da medaka di pesce il modello. L'approccio rappresenta diversi vantaggi rispetto alle colture primarie di cellule dissociate. In primo luogo, le cellule vengono registrate in un ambiente relativamente conservato rispetto al dissociato condizioni di coltura delle cellule. In secondo luogo, fetta preparazioni ci permettono di studiare percorsi indirette mediate dalla cella comunicazione 22, che non è possibile in condizioni di coltura delle cellule dissociate. Inoltre, dimostriamo come condurre le registrazioni elettrofisiologiche sulle fette di tessuto ottenuti usando la tecnica perforata della intero-cellula patch-clamp con amfotericina B come l'agente pore-forming.
Medaka è un piccolo pesce d'acqua dolce originario dell'Asia, trovato principalmente in Giappone. La fisiologia, embriologia e genetica di medaka è stata studiata estesamente per oltre 100 anni 31, ed è un modello di ricerca comunemente utilizzati in molti laboratori. Di particolare importanza per questa carta è l'organizzazione morfologica distinta del complesso ipotalamo-ipofisario nei pesci Teleostei: considerando che nei mammiferi e uccelli i neuroni ipotalamici rilasciano loro neuro-ormoni che regolano le cellule endocrine ipofisarie nel sistema portale dell'eminenza mediana, c'è una proiezione nervosa diretta dei neuroni ipotalamici sulle cellule endocrine dell'ipofisi in pesci teleostei 32. Così, attentamente condotta cervello-ipofisi affettare è di particolare importanza nei pesci, che ci permette di studiare le caratteristiche elettrofisiologiche delle cellule ipofisarie in una rete di cervello-ipofisi ben conservata e cellule in particolare come ipofisi controllare loro eccitabilità e quindi omeostasi del Ca2 + .

<table><tbody><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgical glue</td><td>WPI</td><td>VETBOND</td><td>3M Vetbond Tissue Adhesive</td></tr><tr><td>Stainless steel blades</td><td>Campden Instruments</td><td>752-1-SS</td><td></td></tr><tr><td>metal molds</td><td>SAKURA</td><td>4122</td><td></td></tr><tr><td>steel harp</td><td>Warner instruments</td><td>64-1417</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>SIGMA</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure LMP agarose</td><td>invitrogen</td><td>166520-100</td><td></td></tr><tr><td>patch pipettes</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-110-10HP</td><td>Borosilicate with filament O.D.:1.5 mm, I.D.:1.10 mm</td></tr><tr><td>Microscope Slicescope</td><td>Scientifica</td><td>pro6000</td><td></td></tr><tr><td>P-Clamp10</td><td>Molecular Devices</td><td>#1-2500-0180</td><td>sofware</td></tr><tr><td>Digitizer Digidata 1550A1</td><td>Molecular Devices</td><td>DD1550</td><td></td></tr><tr><td>Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B</td><td>Molecular Devices</td><td>1-CV-7B</td><td></td></tr><tr><td>GnRH</td><td>Bachem</td><td>4108604</td><td>H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>pipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>amphotericin B</td><td>SIGMA</td><td>A9528</td><td>pore-forming antibiotic</td></tr><tr><td>polyethylenimine&amp;nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>P3143</td><td>50% PEI solution</td></tr><tr><td>microfiler syringe</td><td>WPI</td><td>MF28/g67-5</td><td></td></tr><tr><td>glass for the agar bridge</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF200-116-15</td><td>Borosilicate with filament O.D.:2.0 mm, I.D.:1.16 mm Fire polished</td></tr><tr><td>Micro-Manager software</td><td></td><td></td><td>Open Source Microscopy Software</td></tr><tr><td>optiMOS sCMOS camera</td><td>Qimaging</td><td>&amp;nbsp;01-OPTIMOS-R-M-16-C</td><td></td></tr><tr><td>sonicator</td><td>Elma</td><td>D-7700 singen</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SiGMA</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>SiGMA</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>SiGMA</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>SiGMA</td><td>G5400</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>SiGMA</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>SiGMA</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>SiGMA</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>SiGMA</td><td>63565</td><td></td></tr><tr><td>MES-acid</td><td>SIGMA</td><td>M0895</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA</td><td>A2153</td><td></td></tr></tbody></table>

healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish

Sono state condotte indagini elettrofisiologiche delle cellule ipofisarie in numerose specie di vertebrati, ma molto pochi in pesci teleostei. Tra questi, la netta maggioranza è stata effettuata su cellule primarie dissociate. Per migliorare la nostra comprensione di come Teleostei cellule ipofisarie, si comportano in un ambiente più biologicamente rilevante, questo protocollo viene illustrato come preparare fette di cervello-ipofisi vitali utilizzando il medaka (Oryzias latipes) di piccoli pesci d'acqua dolce. Rendendo le fette di cervello-ipofisi, pH e osmolalità di tutte le soluzioni sono stati adeguati ai valori trovati nei liquidi corporei di pesci d'acqua dolce che vivono a 25-28 ° C. Dopo la preparazione della fetta, il protocollo viene illustrato come effettuare registrazioni elettrofisiologiche usando la tecnica perforata della intero-cellula patch-clamp. La tecnica del patch-clamp è un potente strumento con risoluzione temporale senza precedenti e sensibilità, che permette di indagine delle proprietà elettriche da cellule intatte tutta giù per canali ionici singolo. Patch di perforata è unico in quanto mantiene l'ambiente intracellulare intatto impedendo elementi regolatori nel citosol di essere diluito la soluzione di elettrodo pipetta patch. Al contrario, quando si eseguono registrazioni della intero-cellula tradizionale, è stato osservato che cellule ipofisarie medaka perdono rapidamente la capacità di potenziali di azione del fuoco. Tra le varie tecniche di perforazione disponibili, questo protocollo viene illustrato come ottenere la perforazione della membrana con patch utilizzando il fungicida anfotericina b.

Questo protocollo viene illustrato un protocollo passo dopo passo di come realizzare registrazioni elettrofisiologiche affidabile dalle cellule di ipofisi (gonadotrope), utilizzando una linea transgenica di medaka [Tg (lhb- hrGfpII)] dove il bersaglio delle cellule (produzione di Lh gonadotropes) sono etichettati con la proteina fluorescente verde (GFP).
Inizialmente, le indagini elettrofisiologiche sono stati condotti ...

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Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish

L'articolo descrive un protocollo ottimizzato per fare fette di tessuto vitale del cervello-ipofisi, utilizzando il medaka pesci teleostei (Oryzias latipes), seguita da registrazioni elettrofisiologiche delle cellule ipofisarie utilizzando la tecnica del patch-clamp con il configurazione di patch perforato.

Fette di cervello-ipofisi sane per le indagini elettrofisiologiche delle cellule ipofisarie in pesci teleostei

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the ...

healthy-brain-pituitary-slices-for-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.7K Views.  Norwegian University of Life Sciences. L'articolo descrive un protocollo ottimizzato per fare fette di tessuto vitale del cervello-ipofisi, utilizzando il medaka pesci teleostei (Oryzias latipes), seguita da registrazioni elettrofisiologiche delle cellule ipofisarie utilizzando la tecnica del patch-clamp con il configurazione di patch perforato.

Video: Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

Registrazione intera cella da un Preparazione Tagliare organotipica della neocorteccia

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Ricerca

Neuroscienze

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

Patch-clamp Misure di capacità e Ca 2 + Imaging terminazioni nervose della retina singola in Fette

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

La registrazione dell&#39;attività elettrica dai neuroni identificati nel cervello intatto di pesci transgenici

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Registrazione elettrofisiologica nel cervello di intatto Zebrafish adulti

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Elettrofisiologici e morfologica Caratterizzazione neuronali Microcircuiti in Acute Fette cervello Utilizzando accoppiati di patch-clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one of the first organs to start functioning during development. Mechanisms of blood vessel formation have become a subject of high scientific and clinical interest. In adults however, it is difficult to visualize the vasculature in most living animals due to their localization deep within other tissues. Nevertheless, visualization of blood vessels remains important for several studies such as endocrinology and neurobiology. While several transgenic lines have been developed in zebrafish, with blood vessels directly visualized through expression of fluorescent proteins, no such tools exist for other teleost species. Using medaka (Oryzias latipes) as a model, the current protocol presents a quick and direct technique to label blood vessels in brain and pituitary by perfusing through the heart with fixative containing DiI. This protocol allows improvement of our understanding on how brain and pituitary cells interact with blood vasculature in whole tissue or thick tissue slices.

The article describes a quick protocol for labeling blood vessels in a teleost fish by cardiac perfusion of DiI diluted in fixative, using medaka (Oryzias latipes) as a model and focusing on brain and pituitary tissue.

Etichettatura dei vasi sanguigni nel cervello teleost e pituitario utilizzando la perfusione cardiaca con un DiI-fissativo

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...

Bioingegneria

Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled environment. Despite vast differences in the physiology between mammals and fish, primary cell culture protocols from fish are often based on mammalian culture conditions, often with only minor modifications. The environmental differences affect not only body temperature, but also blood serum parameters such as osmolality, pH, and pH buffer capacity. As cell culture media and similar working solutions are meant to mimic characteristics of the extracellular fluid and/or blood serum to which a cell is adapted, it is crucial that these parameters are adjusted specifically to the animal in question.
The current protocol describes optimized primary culture conditions for medaka (Oryzias latipes). The protocol provides detailed steps on how to isolate and maintain healthy dissociated pituitary cells for more than one week and includes the following steps: 1. the adjustment of the osmolality to the values found in medaka blood plasma, 2. the adjustment of the incubation temperature to normal medaka temperature (here in the aquarium facility), and 3. the adjustment of the pH and bicarbonate buffer to values comparable to other fish species living at similar temperatures. The results presented using the described protocol promote physiologically meaningful results for medaka and can be used as a reference guide by scientists making primary cell cultures from other non-mammalian species.

Here we describe a protocol to prepare and maintain primary pituitary cell cultures from medaka (Oryzias latipes). The optimized conditions in this protocol take important parameters such as temperature, osmolality, and pH into consideration by mimicking the physiological conditions of the fish, thereby enabling physiologically more meaningful results.

Preparazione di una cultura di cellula primaria di alta qualità da cadaveri di pesci

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled ...

Electrophysiological Investigations of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapse Function

The lateral geniculate nucleus is the first relay station for the visual information. Relay neurons of this thalamic nucleus integrate input from retinal ganglion cells and project it to the visual cortex. In addition, relay neurons receive top-down excitation from the cortex. The two main excitatory inputs to the relay neurons differ in several aspects. Each relay neuron receives input from only a few retinogeniculate synapses, which are large terminals with many release sites. This is reflected by the comparably strong excitation, the relay neurons receive, from retinal ganglion cells. Corticogeniculate synapses, in contrast, are simpler with few release sites and weaker synaptic strength. The two synapses also differ in their synaptic short-term plasticity. Retinogeniculate synapses have a high release probability and consequently display a short-term depression. In contrast, corticogeniculate synapses have a low release probability. Corticogeniculate fibers traverse the reticular thalamic nuclei before entering the lateral geniculate nucleus. The different locations of the reticular thalamic nucleus (rostrally from the lateral geniculate nucleus) and optic tract (ventro-laterally from the lateral geniculate nucleus) allow stimulating corticogeniculate or retinogeniculate synapses separately with extracellular stimulation electrodes. This makes the lateral geniculate nucleus an ideal brain area where two excitatory synapses with very different properties impinging onto the same cell type, can be studied simultaneously. Here, we describe a method to investigate the recording from relay neurons and to perform detailed analysis of the retinogeniculate and corticogeniculate synapse function in acute brain slices. The article contains a step-by-step protocol for the generation of acute brain slices of the lateral geniculate nucleus and steps for recording activity from relay neurons by stimulating the optic tract and corticogeniculate fibers separately.

Here, we present protocols for the preparation of acute brain slices containing the lateral geniculate nucleus and the electrophysiological investigation of retinogeniculate and corticogeniculate synapses function. This protocol provides an efficient way to study synapses with the high-release and low-release probability in the same acute brain slices.

Indagini elettrofisiologiche sulla funzione di sinapla Retinogeniculate e Corticogeniculate

The lateral geniculate nucleus is the first relay station for the visual information. Relay neurons of this thalamic nucleus integrate input from retinal ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for sudden death. Despite an abundance of available treatment options, about 30% of patients are drug-resistant. Several novel therapeutics have been developed using animal models, though the rate of drug-resistant patients remains unaltered. One of probable reasons is the lack of translation between rodent models and humans, such as a weak representation of human pharmacoresistance in animal models. Resected human brain tissue as a preclinical evaluation tool has the advantage to bridge this translational gap. Described here is a method for high quality preparation of human hippocampal brain slices and subsequent stable induction of epileptiform activity. The protocol describes the induction of burst activity during application of 8 mM KCl and 4-aminopyridin. This activity is sensitive to established AED lacosamide or novel antiepileptic candidates, such as dimethylethanolamine (DMEA). In addition, the method describes induction of seizure-like events in CA1 of human hippocampal brain slices by reduction of extracellular Mg2+ and application of bicuculline, a GABAA receptor blocker. The experimental set-up can be used to screen potential antiepileptic substances for their effects on epileptiform activity. Furthermore, mechanisms of action postulated for specific compounds can be validated using this approach in human tissue (e.g., using patch-clamp recordings). To conclude, investigation of vital human brain tissue ex vivo (here, resected hippocampus from patients suffering from temporal lobe epilepsy) will improve the current knowledge of physiological and pathological mechanisms in the human brain.

The presented protocol describes the transport and preparation of resected human hippocampal tissue with the ultimate goal to use vital brain slices as a preclinical evaluation tool for potential antiepileptic substances.

Preparazione di fette acute di ippocampale umano per registrazioni elettrofisiologiche

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Preparing Acute Brain Slices from the Dorsal Pole of the Hippocampus from Adult Rodents

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of cellular and synaptic properties. Nevertheless, there is an ever increasing need to perform correlated analyses between different experimental modes in addition to slice electrophysiology, for example: immunohistochemistry, molecular biology, in vivo imaging or electrophysiological recording; to answer evermore complex questions of brain function. However, making meaningful conclusions from these various experimental approaches is not straightforward, as even within relatively well described brain structures, a high degree of sub-regional variation of cellular function exists. Nowhere is this better exemplified than in the CA1 of the hippocampus, which has well-defined dorso-ventral properties, based on cellular and molecular properties. Nevertheless, many published studies examine protein expression patterns or behaviorally correlated in vivo activity in the dorsal extent of the hippocampus; and explain findings mechanistically with cellular electrophysiology from the ventro-medial region. This is further confounded by the fact that many acute slice electrophysiological experiments are performed in juvenile animals, when other experimental modes are performed in more mature animals. To address these issues, this method incorporates transcardial perfusion of mature (&#62;60 day old rodents) with artificial cerebrospinal fluid followed by preparation of modified coronal slices including the septal pole of the dorsal hippocampus to record from CA1 pyramidal cells. This process leads to the generation of healthy acute slices of dorsal hippocampus allowing for slice-based cellular electrophysiological interrogation matched to other measures.

The purpose of this protocol is to describe a method to produce slices of the dorsal hippocampus for electrophysiological examination. This procedure employs perfusion with chilled ACSF prior to slice preparation with a near-coronal slicing angle which allows for preservation of healthy principal neurons.

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of ...

Fette di cervello-ipofisi sane per le indagini elettrofisiologiche delle cellule ipofisarie in pesci teleostei

Riepilogo

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