Bu işlemin genel amacı beyin ve teleost balık hipofiz kan damarları etiket etmektir, ve biz model tür medaka DiI içeren bir fiksatif ile kardiyak perfüzyon kullanın. Yani basit ve verimli olan bu teknik, teleost balıklarının beyindeki damar anatomisi ve hipofiz ile nöronlar veya endokrin hücreler ve kan damarları arasındaki ilişki ile ilgili önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olacaktır. Bu tekniğin bazı avantajları hızlı ve kolay basit hazırlık ve teleost balık türlerine adaptasyon içerir.
Bir balık tutucu hazırlamak için, beş santimetre uzunluğunda, üç santimetre genişliğinde ve iki santimetre kalınlığında polistiren bir parça kesti ve dokuz santimetre çapında plastik çanak polistiren yapıştırın. Sonra polistiren üç santimetrelik tekne şeklinde delik yapmak için bir neşter kullanın. Perfüzyon sistemini hazırlamak için perfüzyon sistemi iğnesinin ekstremitesine 30 ila 50 santimetre uzunluğunda plastik kanül ekleyin.
Beş santimetrelik cam pipetler hazırlamak için, üreticinin talimatlarına göre tek tek cam kılcal damarlar germek için bir pipet çekmece kullanın. Diseksiyona başlamadan önce, hazırlanan DiI fiksatif solüsyonla 10 mililitrelik bir şırınga yükleyin ve şırınganın ekstremitesinden bir kanül ile bir iğne yerleştirin. Daha sonra, şırıngayı tezgaha sabitlemek için farklı yönlere yerleştirilen birkaç bant parçası kullanın ve diseksiyonu zonksiyon için iyi bir pozisyon elde etmek ve şırınga pistonunu dirsekile bastırmak için mikroskobun ve koltuğun konumunu ayarlayın.
Daha sonra, balık tutucu karın tarafına ötenazi yapılan bir balık yerleştirin ve baş ve kuyruk pimleri ile güvenli. Ön karın açmak için yatay cildin yüzeysel tabakası kesmek için makas kullanın, ve ventrikül ve bulbus arteriosus net bir erişim elde edilene kadar kalbin üstündeki deri kaldırmak için forseps kullanın. Kılcal damar ekstremite bir cam boru ekleyin ve pipet ucu kırmak.
Cam boruyu ventriküle yaklaştırın ve kalp ventrikülü pipetle sabitlerken sıvıyı dışarı çıkarmak için şırınga pistonuna dirsek basıncı ekleyin. Sonra hemen dolaşımdan kan serbest bırakmak için forseps ile sinüs venöz delik. Ventrikül itibaren, bulbus arteriosus girişini bulmak için cam pipet açısını ayarlayın, ve bulbus arteriosus içinde açılan pipet hareket ettirin.
Sonra bulbus arteriosus içinde pipet tutarken ek bir 30 ila 60 saniye için şırınga basınç ekleyin. Tüm kan damarlarının optimal etiketleme için dii-fiksatif çözüm ile tüm kan yerine yeterince uzun bulbus arteriosus içine perfüzyon için önemlidir. Perfüzyon yaklaşık 60 saniye sonra, daha fazla kan sızıntısı gözlendiğinde, balık cam pipet ve iğneler çıkarın ve karanlıkta oda sıcaklığında iki saat boyunca taze% 4 paraformaldehit içine beyin ve hipofiz hasat.
Daha sonra numuneleri görüntülemeye hazırlamadan önce, taze PBS'de iki kez yıkama başına 10 dakika durulayın. Gösterildiği gibi DiI içeren bir fiksatif çözeltinin kardiyak enjeksiyonundan sonra, etiketli kan damarları floresan stereo mikroskopi ile doku dilimlerinde veya konfokal mikroskopi ile tüm dokuda gözlemlenebilir. Çözelti bulbus arteriosus yerine kalp ventrikül enjekte edilirse veya çözelti çok düşük bir basınç ve / veya çok kısa bir süre için enjekte edilirse, damarların yetersiz etiketleme gözlenecektir.
Buna ek olarak, aynı görüntüleme parametreleri ile aynı doku görüntülenirken, etiketleme yoğunluğunda bir azalma birkaç gün sonra gözlenebilir, sinyal doku örneği içinde daha yayılır görünen ile. İlgi hücrelerinin floresan muhabiri proteinleri ifade ettiği transgenik çizgilerden elde edilen doku dilimleri, kan damarları ve diğer hücre tipleri arasındaki etkileşimlerin araştırılmasına olanak sağlayan standart immünoresans protokolleri kullanılarak belirli ilgi proteinleri için daha fazla etiketlenebilir. Bu bulbus arteriosus ulaşmak için önemlidir.
Bu elde edildiğinde, şırınga piston basınç ekleyerek başarılı bir prosedür onaylayan bulbus bir genişleme neden olmalıdır. Bu teknik genel olarak teleost hipofiz endokrin hücreleri ve kan damarları arasındaki etkileşimi araştırmak için kullanılabilir, ama belki daha özel teleost ve memeliler portal sistemleri arasındaki olası farklılıkları veya benzerlikleri araştırmak için. Çünkü bu politik kullanım da gaz maskesi ve havalandırmalı oda kullanımı gibi toksik ve uçucu bileşikler insaları bu işlemler icra edilirken her zaman alınmalıdır.
