Name: mating-based overexpression library screening in yeast
Uploaded: 2018-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast at JoVE.com

Biz üyeleri Ju laboratuvar ve Zhong laboratuvar ve finansal destek Wright State Üniversitesi'nden düşünceli tartışmalarla için müteşekkir.

Not: burada açıklanan protokol on 96-şey levha bulunan Kütüphane plazmid eleme için tasarlanmıştır ancak ölçeklendirilebilir yukarı ya da buna göre aşağı. Protokol bütün kütüphane tarama tamamlamak için yinelenmesi gerekir. Genellikle, tarama Kütüphane genlerin 10 plaka karşı her zaman rahat 1 kişi tarafından ele alınabilir.
1. 96-şey Maya dönüştürme için hazırlık
Not: Bu adım olarak daha önce açıklanan7,10yapılıyor.
<ol><li>Aliquot 5 µL (yaklaşık 50-100 ng), plazmid DNA bir yuvarlak alt 96-şey plaka her kuyuya dizilmiş plazmid kitaplıktan. Not: Bir örnek, böyle bir kütüphane bir Maya gen overexpression Kütüphane10olacaktır.</li>
	<li>Maya pepton Dekstroz (YPD) 500 mL şişe haploit Maya soy W303α bir kolonisi (2-3 mm çapında) ile medyada 150 mL aşılamak. Onları gecede 30 ° C'de (200 devir/dakika) sallayarak ile kuluçkaya.</li>
	<li>Ertesi sabah, gecede kültür OD600 ölçmek ve Maya kültür OD600 seyreltik = 0.1 inç (ilâ) 2 U YPD. Kültür OD600 ulaşıncaya kadar bu (200 devir/dakika) sallayarak ile 30 ° c ~ 5 h için kuluçkaya 0.4-0.6 =.</li>
</ol>2. Maya dönüştürme
<ol><li>8 steril 250 ml'lik santrifüj şişe dolum ve onları 3000 x g 10 dakika süreyle de oda sıcaklığında centrifuging tarafından Maya kültür dökün süpernatant Pelet aksatmadan hasat. Not: oda sıcaklığında tüm Santrifüjü adımları uygulayın.</li>
	<li>Maya steril distile H2O. ile yıkayın Bunun için 100 mL steril H2O her santrifüj şişe ve girdap eklemek hücre Pelet resuspend için. 2 şişe ve onlara 3000 x g 5 dakika süreyle süpernatant dökün santrifüj içine yıkanmış hücreleri birleştirin.</li>
	<li>Her şişe 100 ml 0.1 M LiOAc/1XTE (100 mM LiOAc; 10 mM Tris, pH 8.0; 1 mM EDTA), hücrelerde yıkama ve onları 3000 x g 5 dk. Pour süpernatant kapalı için de santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Centrifuging, somon sperm DNA (10 mg/mL) bir blok ısıtıcı 3 dakikadır kullanarak 100 ° C'de 5 mL kaynatın ve sonra buz üzerinde cool.</li>
	<li>Hücre Pelet 25 ml 0.1 M LiOAc/1XTE her şişe resuspend, resuspended hücreleri birleştirmek ve 150 mL şişe aktarmak. Önceden soğutulmuş somon sperm DNA 5 mL ekleyin ve 30 ° C'de (225 rpm) için 30 dk sallayarak ile kuluçkaya.</li>
	<li>Hücre karışımı bir steril tek kullanımlık reaktif rezervuar dökün ve bir çok kanallı pipet kullanarak, cep karışımı 35 µL Kütüphane plazmid DNA içeren yuvarlak alt 96-şey plaka her şey için transfer. Girdap 96-şey plaka plaka vortexer 1 dk 1000 rpm kullanarak. Plakalar için 30 ° C'de 30 dk sallayarak olmadan kuluçkaya. Not: ısı daha verimli bir şekilde transfer edebilirsiniz yüzden plakaları, yığın değil. Biz vortexing 96-şey tabak 1000 devirde wells dışarı dökmek için sıvı neden olmaz, ancak güvenli girdap hız-meli var olmak sınav belgili tanımlık adım gerçekleştirmeden önce bulduk.</li>
	<li>Bir şişesi 200 mL % 40 ' PEG3350 son bir konsantrasyon, % 10 DMSO ve 0.1 M LiOAc içeren dönüştürme arabelleği hazırlayın. Dönüştürme arabelleği kullanımdan hemen önce hazırlamak ve sallayarak iyice karıştırın.</li>
	<li>30 ° C kuluçka makinesi üzerinden kaldır 96-şey plakaları ve mix onları için 30 s 1000 devirde plaka vortexer kullanarak. 125 µL dönüştürme arabelleği her şey ve sonra girdap plakalar için 1 dk 1000 devir / dakikada ekleyin.</li>
	<li>Plakalar için 30 dk 30 ° C'de kuluçkaya ve sonra şok Maya için 15 dk 42 ° C kuluçka tabakları koyarak ısı. Not: plakaları yığını değil.</li>
	<li>Plakalar için 3000 x gde 5 dk santrifüj kapasitesi. Dönüştürme tampon plakaları üzerinde atık kutusu ters çevirme ve zorla plakaları arabelleğinden damping kuyulardan çıkarın. Hızlı bir şekilde ters tabak tabak üstünde herhangi bir sıvı kaldırmak için temiz kağıt havlu üzerinde leke.</li>
	<li>Hücreleri en az çıkarma orta seçilebilir işaretçiyi üzerinde Kütüphane plazmid karşılık gelen bir tabak 200 µL ekleyerek durulayın. Not: Biz sentetik bir Ura orta kullanılır.</li>
	<li>Plakalar için 3000 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi ve bir atık bin adım 2.10 olduğu gibi üzerinde süpernatant kaldırın.</li>
	<li>En az Ura-orta içeren % 2 glikoz 160 µL ekleyin. Girdap plakalar için 1 dk 1000 rpm ve onları 48 h 30 ° C'de kuluçkaya sallayarak olmadan. 48 saat sonra bir Pelet dönüştürülmüş Maya her şey alt kısmında görünür olduğunu unutmayın.</li>
	<li>Sıvı Sabunluk kullanarak 100 µL Ura-medya içeren glikoz 96-şey tabak yeni bir dizi her kuyunun içine ekleyin.</li>
	<li>Tabak 30 1000 rpm (Kimden adım 2.13) Maya dönüştürülmüş içeren steril plastik 96-pin Çoğalıcı kullanarak s., pimleri dönüştürülmüş Maya içeren kuyu yerleştirin ve sonra onları yeni plakaların wells ilgili aşılamak girdap medya ile dolu. Yeni plakalar için 24 h 30 ° C'de kuluçkaya. Not: Eğer 10 plakaları ile çalışma, Orta da kullanarak el ile çok kanallı pipetler reçete.</li>
	<li>24 saat sonra Maya Pelet başarıyla dönüştürülen Maya içeren her şey alt kısmında görünür olmalıdır. Bu maya suşları gliserol stokları kaydetmek için her şey için % 50 gliserol 50 µL eklemek girdap tabak 30 s 1000 rpm, bant mühürleme ile plakalarının ve bunları-80 ° C'de dondurmak Not: Yukarıdaki adımları yalnızca bir kez yapılması gerekir. Gelecek gösterimleri aynı Kütüphane tek kullanımlık reaktif rezervuar karşı farklı Maya modellerin gliserol stokları başlatmak ve hemen--dan belgili tanımlık merdiven aşağı devam edin.</li>
</ol>3. Kütüphane genler ve sorgu Maya içeren hücreler arasında çiftleşme
<ol><li>Kütüphane suşları gliserol stoktan canlandırmak için-80 ° C dondurucu, sızdırmazlık bandı ve izin Maya için yaklaşık 30 dakika oda sıcaklığında çözülmeye kaldır çöpten 96-şey plakaları alın.</li>
	<li>Maya çözdürülen steril plastik 96-pin Çoğalıcı gliserol hisse senetleri için taze Ura-medya içeren % 2 glikoz 96-şey tabak içinde 160 µL aşılamak ve hemen Kütüphane suşlar kullanılır sonra onları 24 h için 30 ° C'de kuluçkaya kılabilmesi için , bant mühürleme ile plakalarının ve-80 ° C dondurucu dönmelerini.</li>
	<li>Aynı gün kütüphane suşları (W303α) çözdürülen, sorgu Maya zorlanma aşılamak (burada, W303a FUS) 50 mL YPD için ve bir gecede 30 ° C'de 250 devir / dakikada sallayarak ile büyür.</li>
	<li>Ertesi sabah, sorgu Maya zorlanma bir steril tek kullanımlık reaktif rezervuar ve her şey bir çok kanallı pipet kullanarak bir 96-şey plaka için sorgu yük aliquot 160 µL dökün.</li>
	<li>Sıvı Sabunluk kullanarak, YPD medya 160 µL on 96-şey plakaların her kuyuya dağıtmak. Bu tabakları daha sonra sorgu Maya zorlanma Kütüphane Maya ile çiftleşme için kullanın.</li>
	<li>Kısaca girdap sorgu zorlanma ve sonra kullanın sorgu aktarmak için steril bir 96-pin Çoğalıcı içeren 96-şey plaka YPD plakayı süzün.</li>
	<li>Kısaca girdap Kütüphane plakaları strain ve her kütüphane zorlanma plaka için yeni bir steril 96-pin Çoğalıcı sorgu gerilme ile aşılanmış YPD plakaları Kütüphane suşları aktarmak için kullanın. Not: Gliserol hücrelerde birden çok erime-donma döngüsünden sonra canlılığı kaybetmek. Kütüphane suşları uzun süreli depolama (-80 ° C dondurucu) en kısa zamanda dönen Kütüphane kalitesi iyi tutmak ve gelecekte kullanılmak üzere hazır. Bakımı düzgün, gliserol stok donmuş ve en az 10 kez çözdürülen. A çalışma kopya ve gliserol hisse senedi yedek kopyalarını tutmak da önerilir. Çalışan hisse senedi çalışmıyor, hemen kopya yedek kopyasından yeni bir çalışma.</li>
	<li>YPD plakayı 24 h bir Pelet Maya her kuyunun içinde 24 saat sonra görünür olacağını not için 30 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>% 2 raffinose, karşılık gelen sorgu zorlanma plazmid yanı sıra Kütüphane plazmid (Örneğin, burada Ura - onun-) seçilebilir işaretleri içeren bir en az çıkarma orta ile dolgu 96-şey plakalar.</li>
	<li>Maya kültürleri seçici basına çiftleşme YPD aktarmak için steril bir 96-pin çoğaltıcısını kullanması. 96-şey plakaları için 48 h 30 ° C'de kuluçkaya; Sadece şeklindeki hücreleri Maya ve kurulan diploid hücre ve bu nedenle, her iki sorgu plazmid içerir ve Kütüphane plazmid bu medyada büyümek mümkün olacak. 2 gün sonra bir Pelet kuyu dibinde görünür olduğunu gözlemlemek.</li>
</ol>4. tahlil lekelenme
<ol><li>
Raffinose içeren seçmeli medya büyüme 48 saat sonra Maya ağar kaplamalar üzerinde spot.
	<ol>
<li>2 setleri açık polistren levhalar, bir içeren % 2 galaktoz ve diğer içeren % 2 glikoz kullanarak %2 agar içeren Ura-His-çıkarma hazırlayın.</li>
		<li>Girdap 96-şey plakalar için 1000 rpm, 1 dk sonra Maya %2 galaktoz ve %2 agar (FUS ile Kütüphane gen indüklenir) içeren Ura-His-çıkarma plakaları ve % 2 glikoz ve %2 agar (FUS ile Kütüphane gen içeren Ura-His-çıkarma plakaları spot hangi tarafından her kültürde de fark quadruplicate agar levha üzerine bir robot edindiği makine kullanarak baskı) (yani, 1 kültüründe de fark agar plaka üzerinde 4 noktalar).</li>
		<li>Sonra lekelenme, Kuru ve sonra baş aşağı 30 ° C kuluçka makinesine koyun ağar kaplamalar izin. Ağar kaplamalar her 24 h içinde sorgu zorlanma toksisite kurtarıldı daha hızlı/daha mantar büyüme kaydetmek için veya sorgu zorlanma toksisite şiddetlenir yavaş/daha az büyüme kaydetmek için fotoğraf. Tabakları için 4 gün kuluçkaya. Not: Her kültürde de ağar kaplamalar 1'e 1, bir önceki dönüşümü tabanlı Yöntem10' da gösterildii gibi lekeli olabilir. Ancak, 1-için-burada lekelenme (elverişli bir konuma sahip robot edindiği makine kullanarak ayarlamak) 4 yanlış pozitif sayısını azaltarak tahlil sağlamlığı önemli ölçüde artırır. Pozitif sayısı yalnızca otelde aynı dan tüm 4 kolonileri göstermek de benzer bir fenotip kabul edilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dujon, B. A., Louis, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+diversity+and+evolution+in+the+budding+yeasts+(Saccharomycotina).">Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina).</a> Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).</li><li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae:+why+cook+with+baker's+yeast.">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).</li><li>Willingham, S., Outeiro, T. F., DeVit, M. J., Lindquist, S. L., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+genes+that+enhance+the+toxicity+of+a+mutant+huntingtin+fragment+or+alpha-synuclein.">Yeast genes that enhance the toxicity of a mutant huntingtin fragment or alpha-synuclein.</a> Science. 302 (5651), 1769-1772 (2003).</li><li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+cells+provide+insight+into+alpha-synuclein+biology+and+pathobiology.">Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).</li><li>Cooper, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson's+models.">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313 (5785), 324-328 (2006).</li><li>Treusch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+links+between+Abeta+toxicity,+endocytic+trafficking,+and+Alzheimer's+disease+risk+factors+in+yeast.">Functional links between Abeta toxicity, endocytic trafficking, and Alzheimer's disease risk factors in yeast.</a> Science. 334 (6060), 1241-1245 (2011).</li><li>Ju, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+model+of+FUS/TLS-dependent+cytotoxicity.">A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity.</a> PLoS Biology. 9 (4), 1001052 (2011).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+and+genetic+modifiers+of+aggregation+and+toxicity+for+the+ALS+disease+protein+FUS/TLS.">Molecular determinants and genetic modifiers of aggregation and toxicity for the ALS disease protein FUS/TLS.</a> PLoS Biology. 9 (4), 1000614 (2011).</li><li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model:+Exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity.">A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (17), 6439-6444 (2008).</li><li>Fleming, M. S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+yeast+plasmid+overexpression+screen.">High-throughput yeast plasmid overexpression screen.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), e2836 (2011).</li><li>Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).</li><li>Suter, B., Auerbach, D., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast-based+functional+genomics+and+proteomics+technologies:+the+first+15+years+and+beyond.">Yeast-based functional genomics and proteomics technologies: the first 15 years and beyond.</a> Biotechniques. 40 (5), 625-644 (2006).</li><li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+toxicity+in+neuronal+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+by+hUPF1.">Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (25), 7821-7826 (2015).</li><li>Jackson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+forelimb+function+by+UPF1+gene+therapy+in+a+rat+model+of+TDP-43-induced+motor+paralysis.">Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced motor paralysis.</a> Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada, plazmid overexpression ekran Maya plazmid Kütüphane Maya modeli tanıtmak için çiftleşme kullanarak gerçekleştirmek için bir protokol açıklayın. Bu yaklaşımı kullanarak, birden fazla Maya modeli nörodejeneratif hastalık protein toksisite Maya bir plazmid kitaplıkla dönüştürdü aynı koleksiyonunu kullanarak gösterimi. Dönüşüm zahmetli süreci sadece sonra hangi yüksek verimli Maya çiftleşme plazmid kitaplığı sorgu yük tanıtmak için kullanılan bir kez yapılması gerekir. Bu ile...

Tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiae hücresel süreçler doğrudan insan hastalıkları ile ilgili anlamak için temel bilimsel araştırma1 ' de yaygın olarak kullanılmıştır. Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, Huntington hastalığı ve amyotrofik dahil olmak üzere en yaygın nörodejeneratif hastalıklar için bağlı olanlar gibi insan hastalık ilişkili proteinler eğitim için Ayrıca, bu bir model organizma kullanılmıştır Lateral skleroz (ALS)2. Maya modelin bir avantajı ile Genom geniş perde böylece onların toksisite mekanizmasının içine fikir veren proteinler, hastalığı ile ilgili toksisitesi ile ilgili hücresel yolları tanımlamak için gerçekleştirileceği kolaylığıdır. Böyle bir ekran içinde her dizilmiş bir kütüphanede 5.500 Maya genlerin hangi genlerin overexpressed zaman toksisite değiştirebilirsiniz tanımlamak için bir Maya modeli olarak dönüştürülür bir overexpression kitaplık ekranı denir. Proteinlerin huntingtin Huntington hastalığı3, α-synuclein Parkinson hastalığı4,5 için için de dahil olmak üzere birden çok nörodejeneratif hastalık ilişkili, Maya modellerinde bu tarama yöntemi başarıyla uygulandı , Aβ Alzheimer hastalığı6ve FUS ve TDP-43 ALS7,8,9. Genellikle bir yüksek-den geçerek şekilde10dakika sonra yapılır iken, ekranın en emek yoğun adım tek tek dizilmiş kitaplıktan 5.500 Maya genler dönüştürüyor. Bu adım her zaman tarama tekrarlanır gerçekleştirilmesi gerekir ve ne zaman yeni kurulan Maya manken belirlenmesi gerekiyor. Bu görevi yerine getirmek için daha verimli bir yol bulmak önemlidir.
Maya hücreleri haploit ve diploit formlarında stabil bulunabilir. İki haploit hücreleri, türü çiftleşme türleri çiftleşme karşısında bir ve her çiftleşme α. haploit hücreleri yazın üretmek ve için yalnızca ters çiftleşme türü hücreleri yanıt kendi belirli çiftleşme feromon salgılar. Bu arasında çiftleşme sağlar bir ve α hücreleri istikrarlı diploit hücreleri, bir/α üretmek için. Bu işlem kendiliğinden ve yüksek verimli11yaşında. Biz plazmid Kütüphane tanıtmak S. cerevisiae bu benzersiz yaşam döngüsünün yararlanabilirsiniz. Daha ayrıntılı olarak, her gen dizilmiş plazmid kütüphanede bir çiftleşme türü, yani, α hücre haploit hücreleri dönüştürülür. Kütüphane genleri içeren bu hücreler sonra gliserol stok dizilmiş 96-iyi biçimde depolanır. Taranması gereken her Maya model için Kütüphane genleri içeren Maya hücreleri gliserol stoktan çözdürülen ve tarama ters çiftleşme türü, yani, çiftleşme ilgi Maya modeli ile çiftleşme yoluyla yapılabilir bir. Maya iki gen getirmek birlikte çiftleşme kullanarak bu fikri yeni bir şey değil. İki-hibrid tarama, hangi bir yem oluşturmak (yani, Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı füzyon) bir çiftleşme yazıyla birlikte dizilmiş kitaplıktan bir av yapısı ile çiftleşme aracılığıyla getirilir yüksek üretilen iş Maya içinde başarıyla uygulandı 12. ancak, bu strateji asla her zaman geleneksel dönüşüm yöntemleri kullandım overexpression Kütüphane gösterimleri uygulanmıştır.
Bizim Laboratuvar Maya manken ALS ilişkili protein FUS7' nin daha önce kurulmuş. Dönüşüm yöntemi kullanarak overexpression Kütüphane tarama yoluyla overexpressed zaman FUS toksisite kurtarmak beş Maya genlerin (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1ve VHR1) keşfetti. Bu bulgular bağımsız olarak başka bir grup8tarafından benzer bir çalışma ile teyit edildi. hUPF1, ECM32, insan bir homolog daha sonra toksisite birincil nöronal hücre13 ' te ve ALS14 de hayvan modelinde bastırmak için gösterildi. Bu beş genlerin ilke kanıtı olarak kullanarak, çiftleşme tarafından FUS Maya modeli tanıtıldı zaman tüm beş genler benzer şekilde FUS toksisite kurtarmak göstermektedir. Maya hücreleri Kütüphane genleri içeren kalıcı olarak saklanan gliserol stokta ve gerektiğinde yeniden canlandırdı beri bu çiftleşme tabanlı yöntem dönüştürme karşı taranması için Kütüphane ihtiyacı her zaman zaman alan adım kaldırır. Çiftleşme herhangi plazmid bir dönüşüm dahil yüksek verimli olduğundan, bu strateji arıtma ve dönüşümü, bir büyük plazmid Kütüphane ile ilgili maliyet de önemli ölçüde azaltır. FUS Maya modeli karşı eleme bir kitaplığı başarıyla bu yöntem uygulanır.
Çiftleşme tabanlı tarama prosedürü kısaca Şekil 1' de anlatılan. Başlangıçta, dizilmiş plazmid kitaplık türü α her şey bir 96-şey plaka belirli kitaplık plazmid ile dönüştürülmüş Maya içeren bir yüksek-den geçerek Maya dönüştürme iletişim kuralı kullanılarak çiftleşme haploit Maya süzün içine aktarılır. Bu koleksiyon dönüştürülmüş Maya çözdürülen ve kullanım için daha sonra canlanan bir gliserol stok olarak kaydedilir. İlgi bu durumda FUS toksisitesi, Maya model haploit Maya gerilme zıt eşleşme türü ile oluşturulan gerekir (türü çiftleşme bir). Steril 96-pin Çoğalıcılar kullanarak bir yüksek-den geçerek şekilde FUS zorlanma ve maya suşları plazmid kitaplığı içeren zengin medya içeren 96-şey plakaları için transfer ve mate için izin. Çiftleşme, her küçük bir birimden takip iyi çiftleşme kültürünün 96-şey plakalar sentetik çıkarma medyada her iki FUS içeren hangi sadece diploit Maya içeren aktarılmasına ve Kütüphane genler büyüyebilir. Bir robot edindiği makine sonra Maya kültür üzerine ağar kaplamalar ve daha nerede FUS ve Kütüphane genlerin ifadesi indüklenen her kuyudan aktarmak için kullanılır.  Ayrıca, Maya kültür nerede FUS ve Kütüphane genler değil ifade edilir ağar kaplamalar denetlemek için fark edilir. Ağar kaplamalar üzerinde büyüme kurtarma veya FUS toksisite azdırmak genlerin tespit edilecektir.

<table><tbody><tr><td>salmon Sperm DNA (SS-DNA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp; D1626</td><td></td></tr><tr><td>YPD broth</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>Y20090</td><td></td></tr><tr><td>Granulated Agar</td><td>Fisher Sci</td><td>BP97445</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>G32040</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Galactose</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>G33000</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Raffinose Pentahydrate</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>R20500</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Sulfate</td><td>Fisher Sci</td><td>A702-500</td><td></td></tr><tr><td>Synthetic Ura- drop out medium</td><td>Clontech</td><td>630416</td><td></td></tr><tr><td>Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil</td><td>Clontech</td><td>630422</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>Y20060</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Sci</td><td>S67496</td><td></td></tr><tr><td>Lithium acetate, anhydrous</td><td>Fisher Sci</td><td>AC268640010</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350)</td><td>Spectrum Chemical&amp;nbsp;</td><td>PO125-12KG</td><td></td></tr><tr><td>96 Pin Replicator&amp;nbsp;</td><td>Scinomix</td><td>SCI-5010-OS</td><td></td></tr><tr><td>Nunc OmniTray</td><td>Thermo Sci</td><td>140156</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid</td><td>Fisher Sci</td><td>07-200-760</td><td>non-treated, sterile</td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;Research plus Multichannel Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>TI13690052</td><td>30-300ul volume</td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters</td><td>Fisher Sci</td><td>88-860-023</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;MixMate</td><td>Eppendorf</td><td>21-379-00</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5810R Centrifuge</td><td>Fisher Sci</td><td>05-413-112</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-26 XPI Centrifuge</td><td>Beckman</td><td>393127</td><td></td></tr><tr><td>MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor HDA&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mating-based overexpression library screening in yeast

Mayası yaygın insan hastalıkları ile ilişkili proteinler eğitim bir model olarak kullanılmıştır. Genom genelindeki genetik tarama Maya çalışmalarda yaygın olarak kullanılan güçlü bir araçtır. Nörodejeneratif hastalık ilişkili proteinler Maya bir dizi ifade sitotoksisite ve toplama oluşumu, bu bozuklukları olan hastalarda görülen bulguları recapitulating neden olur. Burada, bir Maya model değiştiriciler, toksisite için amyotrofik Lateral skleroz ilişkili protein FUS süzmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Dönüştürme kullanmak yerine, bu yeni tarama platform plazmid dizilmiş bir kütüphane Maya modeli tanıtmak için Maya çiftleşme üzerinde dayanır. Çiftleşme yöntemi iki açık avantajları vardır: Birincisi, yüksek verimli; İkinci olarak, önceden dönüştürülmüş dizilmiş kütüphanede plazmidleri, bir gliserol hisse senedi olarak uzun vadeli ve diğer ekranların Maya modeline dönüştürme adım emek yoğun olmadan hızlı bir şekilde uygulanan her zaman saklanır. Biz nasıl bu yöntem başarıyla kullanılabileceğini göstermek için ekran FUS toksisite değiştirmek genler.

ALS ilişkili protein FUS, bir RNA/DNA bağlayıcı protein daha önce haploit Maya7,8' incelenmiştir. Genetik kullanarak tarama dönüşüm tabanlı yöntemi FUS toksisite bastırmak birkaç Maya genler keşfetti. Bir Maya genlerin insan homolog daha sonra birincil nöronal hücre ve fare modeli ALS13toksisite bastırma etkili olduğu gösterilmiştir. Burada, overexpression Kütüphane tarama etkili çif...

Watch this Scientific Journal Video about Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast at JoVE.com

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Bu makalede bir dizilmiş plazmid kütüphaneyi kullanan mayası overexpression tarama kolaylaştırmak için bir çiftleşme tabanlı yöntem sunuyor.

Maya Overexpression çiftleşme tabanlı Kütüphane tarama

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

mating-based-overexpression-library-screening-in-yeast

Research

JoVE Journal

Genetics

7.6K Görüntüleme.  Wright State University. Bu makalede bir dizilmiş plazmid kütüphaneyi kullanan mayası overexpression tarama kolaylaştırmak için bir çiftleşme tabanlı yöntem sunuyor.

Video: Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the discovery of high-affinity interactors that are highly enriched in the library of interacting candidates. In a traditional format, the yeast 2-hybrid assay can yield too many colonies to analyze when conducted at low stringency where low affinity interactors might be found. Moreover, without a comprehensive and complete interrogation of the same library against different bait plasmids, a comparative analysis cannot be achieved. Although some of these problems can be addressed using arrayed prey libraries, the cost and infrastructure required to operate such screens can be prohibitive. As an alternative, we have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing a strategy termed DEEPN (Dynamic Enrichment for Evaluation of Protein Networks), which incorporates high-throughput DNA sequencing and computation to follow the evolution of a population of plasmids that encode interacting partners. Here, we describe customized reagents and protocols that allow a DEEPN screen to be executed easily and cost-effectively.

Batch processing of yeast 2-hybrid screens allows for direct comparison of the interaction profiles of multiple bait proteins with a highly complex set of prey fusion proteins. Here, we describe refined methods, new reagents, and how to implement their use for such screens.

Bir Maya 2-melez ekran Protein etkileşimleri karşılaştırmak için bir toplu iş

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Biyokimya

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

Fisyon mayası Schizosaccharomyces pombe derin sıralama yoluyla, kendiliğinden bastırıcı ekran

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Genetik

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and computational approaches. One such method is the yeast one-hybrid (Y1H) assay, in which interactions between TFs and DNA regions are tested in the milieu of the yeast nucleus using reporter genes. Y1H assays involve two components: a &#8216;DNA-bait&#8217; (e.g., promoters, enhancers, silencers, etc.) and a &#8216;TF-prey,&#8217; which can be screened for reporter gene activation. Most published protocols for performing Y1H screens are based on transforming TF-prey libraries or arrays into DNA-bait yeast strains. Here, we describe a pipeline, called enhanced Y1H (eY1H) assays, where TF-DNA interactions are interrogated by mating DNA-bait strains with an arrayed collection of TF-prey strains using a high density array (HDA) robotic platform that allows screening in a 1,536 colony format. This allows for a dramatic increase in throughput (60 DNA-bait sequences against &#62;1,000 TFs takes two weeks per researcher) and reproducibility. We illustrate the different types of expected results by testing human promoter sequences against an array of 1,086 human TFs, as well as examples of issues that can arise during screens and how to troubleshoot them.

Here, we present an enhanced yeast one-hybrid screening protocol to identify the transcription factors (TFs) that can bind to a human DNA region of interest. This method uses a high-throughput screening pipeline that can interrogate the binding of &#62;1,000 TFs in a single experiment.

İnsan DNA dizileri için bağlama transkripsiyon faktörü belirlemek için gelişmiş Maya bir melez ekranlar

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

Ana-Patojen protein-protein etkileşimleri ve Peyzaj karakterize etmek Karşılaştırmalı Bir Yaklaşım

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

Yüksek verim Maya Plazmid overekspresyonu Ekran

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Biyoloji

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

<meta charset="utf8"></head><body>Maya Yüzey Görüntüleme Teknikleri ile Protein Fonksiyonlarının Optimize Edilmesi

Protein Engineering by Yeast Surface Display

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and versatile tools in the protein engineering field is yeast surface display, where a pool of randomized proteins is expressed on the surface of yeast. The linkage of phenotype (e.g., binding of the yeast-displayed protein to the antigen of interest) and genotype (the plasmid encoding for the protein variant) enables selection of this library for desired properties and subsequent sequencing of enriched variants. By combining magnetic bead selection with flow cytometric sorting, protein variants with enhanced binding to a target antigen can be selected and enriched. Notably, in addition to affinity maturation, binding to a target can also be achieved without any initial binding affinity. Here, we provide a step-by-step protocol that covers all essential parts of a yeast surface display selection campaign and gives examples of typical yeast surface display results. We demonstrate that yeast surface display is a broadly applicable and robust method that can be established in any molecular biology laboratory with access to flow cytometry.

<meta charset="utf8"></head><body>Maya Yüzey Ekranı ile Protein Mühendisliği

This protocol describes the essential steps for conducting yeast surface display selection campaigns to enrich protein variants binding to an antigen of interest.

Maya Yüzey Ekranı ile Protein Mühendisliği

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and ...

Biyomühendislik

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Evrim Yöntemi yönettiği<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Kütüphane Oluşturma ve Tarama

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

Maya Overexpression çiftleşme tabanlı Kütüphane tarama

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Bir Maya 2-melez ekran Protein etkileşimleri karşılaştırmak için bir toplu iş

Fisyon mayası Schizosaccharomyces pombe derin sıralama yoluyla, kendiliğinden bastırıcı ekran

İnsan DNA dizileri için bağlama transkripsiyon faktörü belirlemek için gelişmiş Maya bir melez ekranlar

Ana-Patojen protein-protein etkileşimleri ve Peyzaj karakterize etmek Karşılaştırmalı Bir Yaklaşım

Yüksek verim Maya Plazmid overekspresyonu Ekran

Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar

Maya Yüzey Ekranı ile Protein Mühendisliği

Maya Yüzey Ekranı ile Protein Mühendisliği

Maya Yüzey Ekranı ile Protein Mühendisliği

Evrim Yöntemi yönettiği