Estamos agradecidos por las discusiones reflexivas con miembros del laboratorio Ju y laboratorio de Zhong y el apoyo financiero de la Universidad de estado de Wright.

Nota: El protocolo descrito aquí está diseñado para la detección de plásmidos de la biblioteca contenidas en placas de 96 pocillos diez pero se pueden escalar hacia arriba o hacia abajo en consecuencia. El protocolo tiene que repetir para completar el tamizaje de toda biblioteca. Por lo general, proyección contra 10 placas de genes biblioteca cada vez que puede ser cómodamente manejado por 1 persona.
1. preparación para la transformación de la levadura de 96 pocillos
Nota: Este paso se realiza anteriormente descrito7,10.
<ol><li>Alícuota de 5 μl (aproximadamente 50-100 ng) del plásmido ADN desde una biblioteca de plásmidos vestida en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Nota: Un ejemplo de tal una biblioteca sería un gen de levadura sobreexpresión biblioteca10.</li>
	<li>Sembrar 150 mL de levadura peptona dextrosa (YPD) los medios de comunicación en un matraz de 500 mL con una colonia (2-3 mm de diámetro) de la cepa de levadura haploide W303α. Incúbelos durante la noche a 30 ° C con agitación (200 rpm).</li>
	<li>A la mañana siguiente, medir OD600 de la cultura durante la noche y diluir la cultura de la levadura a OD600 = 0.1 en (hasta) 2 L de YPD. Incubar a 30 ° C con agitación (200 rpm) durante ~ 5 h hasta que la cultura llegue a OD600 = 0,4 – 0,6.</li>
</ol>2. levadura transformación
<ol><li>Cosecha de la cultura de la levadura por llenado 8 botellas de centrífuga estériles de 250 mL y centrifugar a temperatura ambiente a 3.000 x g durante 10 minutos retirar el sobrenadante sin perturbar el pellet. Nota: Llevar a cabo todos los pasos de centrifugación a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavado de la levadura con agua destilada estéril H2O. Para esto, añadir 100 mL de estéril de H2O para cada botella de centrífuga y agitar para Resuspender el precipitado de células. Combinar las células lavadas en 2 botellas y centrifugar a 3.000 x g durante 5 minutos retirar el sobrenadante.</li>
	<li>Lavar las células en cada frasco en 100 mL de 0.1 M LiOAc/1XTE (LiOAc de 100 mM, 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA) y centrifugar a 3.000 x g durante 5 minutos verter fuera el sobrenadante.</li>
	<li>Centrifugación, hervir 5 mL de esperma de salmón ADN (10 mg/mL) a 100 ° C con un calentador del bloque por 3 min y luego enfriarlo con hielo.</li>
	<li>Resuspender el precipitado de células en 25 mL de 0.1 M LiOAc/1XTE en cada botella, combinar las células resuspendidas y transferirlos a un matraz de 150 mL. Añadir 5 mL de la esperma de salmón previamente enfriado ADN e incubar a 30 ° C con agitación (225 rpm) durante 30 minutos.</li>
	<li>Vierta la mezcla de células en un reservorio de reactivo desechable estéril y, usando una pipeta multicanal, transferir 35 μl de la mezcla de células en cada pocillo de la placa de 96 pocillos de fondo redondo que contiene el ADN del plásmido de biblioteca. Placas de Vortex 96-bien con un Vortex de la placa durante 1 min a 1.000 rpm. Incubar las placas durante 30 min a 30 ° C sin agitación. Nota: No apile las placas, por lo que el calor puede transferir de manera más eficiente. Hemos encontrado que Vortex no hace líquido se derrame de los pozos de las placas de 96 pozos a 1.000 rpm y una velocidad del vórtice seguro debe probarse antes de realizar el paso.</li>
	<li>En un matraz, preparar 200 mL de la solución de transformación que contiene una concentración final de 40% PEG3350, 10% DMSO y 0.1 M LiOAc. Preparar el tampón de transformación inmediatamente antes del uso y homogeneizar por agitación.</li>
	<li>Quitar 96 pocillos placas de la incubadora de 30 ° C y mezclar durante 30 s en 1.000 rpm mediante el Vortex de la placa. Añadir 125 μl del buffer de transformación a cada pozo y luego vórtice las placas durante 1 min a 1.000 rpm.</li>
	<li>Incubar las placas a 30 ° C durante 30 minutos y luego calor choque la levadura mediante la colocación de las placas en una incubadora de 42 ° C durante 15 minutos. Nota: No apile las placas.</li>
	<li>Centrifugue las placas durante 5 min a 3.000 x g. Eliminar el tampón de transformación de los pozos por invertir las placas sobre un cubo de basura y con fuerza descarga el buffer de las placas. Rápidamente secar las placas invertidas en una toalla de papel limpia para eliminar cualquier líquido en la parte superior de las placas.</li>
	<li>Enjuague las células añadiendo a los platos 200 μL de deserción mínimo media correspondiente al marcador seleccionable en el plásmido de la biblioteca. Nota: Se utilizó un medio sintético de Ura.</li>
	<li>Centrifugue las placas durante 5 min a 3.000 x g y eliminar el sobrenadante con un cubo de basura como en el paso 2.10.</li>
	<li>Añadir 160 μl de mínimo medio Ura que contiene 2% de glucosa. Vórtice de las placas durante 1 min a 1.000 rpm e incúbelos a 30 ° C por 48 h sin agitar. Después de 48 h, tenga en cuenta que una pelotilla de levadura transformada es visible en la parte inferior de cada pocillo.</li>
	<li>Mediante un dosificador de líquido, añada 100 μl de glucosa que contiene medios de Ura en cada pocillo de una nueva serie de placas de 96 pocillos.</li>
	<li>Vórtice de las placas que contiene la levadura transformada (de paso 2.13) a 1.000 rpm durante 30 s. con un duplicador de 96 pines de plástico estéril, coloque los pernos en los pozos que contiene la levadura transformada y entonces los inocule en los pocillos correspondientes de las placas nuevas llenado con medios de comunicación. Incubar las placas nuevas a 30 ° C durante 24 h. Nota: Si trabaja con placas de 10, el medio puede también dispensar manualmente utilizando pipetas de varios canales.</li>
	<li>Después de 24 h, un sedimento de levadura debe ser visible en la parte inferior de cada pocillo que contenga levadura transformada con éxito. Para guardar estas levaduras como las poblaciones de glicerol, añada 50 μl de glicerol al 50% a cada pocillo, vórtice las placas durante 30 s a 1.000 rpm, sellar las placas con cinta y congelar a-80 ° C. Nota: Los pasos anteriores sólo tiene que realizarse una vez. Futuras proyecciones de modelos diferentes de levadura contra el depósito de reactivo disponible biblioteca misma pueden iniciar desde las poblaciones de glicerol y proceden inmediatamente los pasos a continuación.</li>
</ol>3. acoplamiento entre las células que contienen Genes de biblioteca y consulta de levadura
<ol><li>Para reactivar las cepas biblioteca del stock de glicerol, sacar las placas de 96 pocillos el congelador de-80 ° C, retirar la cinta de sellado y dejar que la levadura se descongelación a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos.</li>
	<li>Una vez descongelado la levadura, usar un duplicador de 96 pines de plástico estéril para inocular las cepas de glicerol a 160 μl de fresco Ura-medios de comunicación que contiene 2% de glucosa en placas de 96 pocillos e incúbelos a 30 ° C por 24 h. inmediatamente después de las tensiones de la biblioteca se utilizan , sellar las placas con cinta y volver al congelador de-80 ° C.</li>
	<li>El mismo día se descongelan las cepas de la biblioteca (W303α), inocular la cepa de levadura de consulta (aquí, FUS en W303a) a 50 mL de YPD y crecer durante la noche a 30 ° C con agitación a 250 rpm.</li>
	<li>A la mañana siguiente, vierte la cepa de levadura de consulta para un reservorio de reactivo desechable estéril y alícuota 160 μl de la cepa de consulta en cada pocillo de una placa de 96 pozos utilizando una pipeta multicanal.</li>
	<li>Utilizando el dispensador líquido, dispensar 160 μl de medio YPD en cada pozo de diez placas de 96 pocillos. Use estas placas más tarde para el apareamiento de la cepa de levadura de consulta con la levadura de la biblioteca.</li>
	<li>Brevemente vórtice la placa de 96 pocillos que contienen la cepa consulta y usar un replicador estéril de 96 pines para transferir la consulta tensión a las placas YPD.</li>
	<li>Brevemente vórtice la biblioteca cepa placas y para cada placa de la cepa de biblioteca, use un nuevo replicador estéril de 96 pines para transferir las cepas de la biblioteca a las placas YPD que han sido inoculadas con la cepa de la consulta. Nota: Las células en glicerol pierden su viabilidad después de varios ciclos de congelación descongelación. Volviendo a las cepas de biblioteca para el almacenamiento a largo plazo (congelador de-80 ° C) tan pronto como sea posible mantener la biblioteca en buena calidad y listo para su uso futuro. Se mantiene apropiadamente, el stock de glicerol puede ser congelado y descongelado al menos 10 veces. Nosotros también recomendamos mantener una copia de trabajo y copias de seguridad de la población de glicerol. Cuando el stock de trabajo no funciona, inmediatamente hacer un nuevo trabajo copia de la copia de seguridad.</li>
	<li>Incubar las placas YPD en 30 ° C por 24 h. Nota que una pelotilla de la levadura será visible en la parte inferior de cada pocillo después de 24 h.</li>
	<li>Placas de relleno 96 pocillos con un medio de salida mínima que contienen rafinosa 2%, correspondiente a los marcadores seleccionables en el plásmido en la cepa de consulta así como en el plásmido de la biblioteca (p. ej., aquí Ura - su-).</li>
	<li>Usar un replicador estéril de 96 pines para transferir levadura de YPD apareamiento culturas a los medios selectivos. Incubar las placas de 96 pozos a 30 ° C por 48 h; sólo la levadura las células que se han acoplado y diploide formado de células y, por lo tanto, contienen tanto el plásmido de la consulta y el plásmido de biblioteca serán capaces de crecer en este medio. Después de 2 días, observar que un diábolo es visible en la parte inferior de los pozos.</li>
</ol>4. localización del ensayo
<ol><li>
Después de 48 h de crecimiento en los medios selectivos que contienen rafinosa, ver la levadura en las placas de agar.
	<ol>
<li>Preparar 2 juegos de placas, Ura su abandono con agar al 2% utilizando placas de poliestireno transparente, una galactosa que contiene de 2% y el otro que contiene 2% de glucosa.</li>
		<li>Placas Vortex 96-bien durante 1 min a 1.000 rpm, punto entonces la levadura a las placas de Ura su deserción que contiene galactosa 2% y 2% de agar (genes de FUS y biblioteca inducidos) y a las placas de Ura su deserción que contiene 2% de glucosa y 2% de agar (genes FUS y biblioteca reprimido) usando una máquina de telescopio robótica, por el cual la cultura en cada bien es descubierta en las placas de agar por cuadruplicado (es decir, la cultura en 1 bien es descubierta a 4 puntos en la placa de agar).</li>
		<li>Después de detectar, que las placas de agar seco y colocar boca abajo en una incubadora de 30 ° C. Fotografiar las placas de agar cada 24 h para registrar un crecimiento más rápido y más levadura que la toxicidad a la cepa de consulta es rescatada o para registrar un crecimiento más lento, menos en que se exacerba la toxicidad a la cepa de la consulta. Incubar las placas durante 4 días. Nota: La cultura en cada bien se puede observar en placas de agar 1 a 1, como se muestra en un método basado en la transformación anterior de10. Sin embargo, la 1-a-4 manchas aquí (que puede ser situado usando la máquina de telescopio robótica) aumenta significativamente la robustez del análisis al reducir el número de falsos positivos. Resultados positivos se consideran solamente cuando todas las 4 colonias de la misma bien muestran un fenotipo similar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dujon, B. A., Louis, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+diversity+and+evolution+in+the+budding+yeasts+(Saccharomycotina).">Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina).</a> Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).</li><li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae:+why+cook+with+baker's+yeast.">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).</li><li>Willingham, S., Outeiro, T. F., DeVit, M. J., Lindquist, S. L., Muchowski, P. 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(53), e2836 (2011).</li><li>Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).</li><li>Suter, B., Auerbach, D., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast-based+functional+genomics+and+proteomics+technologies:+the+first+15+years+and+beyond.">Yeast-based functional genomics and proteomics technologies: the first 15 years and beyond.</a> Biotechniques. 40 (5), 625-644 (2006).</li><li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+toxicity+in+neuronal+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+by+hUPF1.">Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (25), 7821-7826 (2015).</li><li>Jackson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+forelimb+function+by+UPF1+gene+therapy+in+a+rat+model+of+TDP-43-induced+motor+paralysis.">Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced motor paralysis.</a> Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, describimos un protocolo para realizar una pantalla de sobreexpresión de plásmido en la levadura mediante apareamiento para introducir la biblioteca del plásmido en el modelo de la levadura. Usando este acercamiento, pueden proyectará varios modelos de levadura de la toxicidad de la proteína enfermedad neurodegenerativas utilizando la misma colección de levadura transformada con una biblioteca de plásmidos. El laborioso proceso de transformación sólo necesita realizarse una vez, después de que levadura a...

La levadura de florecimiento Saccharomyces cerevisiae ha sido ampliamente utilizada en la investigación científica básica1 para entender procesos celulares relacionados directamente con enfermedades humanas. Por otra parte, se ha utilizado como organismo modelo para estudiar proteínas humanas asociadas a la enfermedad, tales como los relacionados con las enfermedades neurodegenerativas más comunes, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington y amiotrófica Esclerosis lateral (ALS)2. Una ventaja del modelo de la levadura es la facilidad con que se puede realizar una pantalla de genoma para identificar vías celulares relacionados con la toxicidad de las proteínas relacionadas con la enfermedad, dando la penetración en el mecanismo de su toxicidad. Una tal pantalla se llama una pantalla de biblioteca de sobreexpresión, en la que cada uno de los 5.500 genes de la levadura en una biblioteca matriz se transforma en un modelo de levadura a identificar qué genes pueden modificar la toxicidad cuando overexpressed. Este método de cribado se ha aplicado con éxito en los modelos de la levadura de múltiples neurodegenerative enfermedad proteínas asociadas, incluyendo huntingtina para la enfermedad de Huntington3, α-sinucleína para la enfermedad de Parkinson4,5 , Aβ para la enfermedad de Alzheimer6y FUS y TDP-43 para ALS7,8,9. Mientras que generalmente se realiza en un modo de alto rendimiento de10, el paso más trabajo de la pantalla está transformando individualmente 5.500 genes de la levadura de una biblioteca vestida. Este paso debe realizarse cada vez que la proyección se repite, y cada vez que un modelo de nueva levadura necesita ser estudiado. Es importante encontrar una manera más eficiente para llevar a cabo esta tarea.
Las células de levadura estable pueden existir en formas haploides y diploides. Hay dos opuestos tipos de células haploides, acoplamiento tipo de apareamiento a y α. células haploides de cada apareamiento tipo producir y secretan su propia feromona apareamiento específico, que sólo las células de tipo acoplamiento opuesto responden. Esto permite el acoplamiento entre una y las células α producen células diploides estables, a/α. Este proceso es espontáneo y altamente eficaz11. Podemos aprovechar este ciclo de vida único de S. cerevisiae para presentar la biblioteca de plásmido. Más específicamente, cada gen en la biblioteca de plásmido vestida se transformarán en células haploides de un tipo de cruzamiento, es decir, la célula α. Estas células que contienen los genes de la biblioteca se almacenará en stock de glicerol en un formato matriz de 96 pocillos. Para cada modelo de levadura que necesita ser defendido, las células de levadura que contiene los genes de la biblioteca pueden ser descongeladas del stock de glicerol, y la proyección puede realizarse a través de acoplamiento con el modelo de levaduras de interés en el acoplamiento tipo opuesto, es decir, tipo de cruzamiento una. Esta idea de la utilización de apareamiento para reunir a dos genes en la levadura no es nueva. Se ha aplicado con éxito en la levadura de alto rendimiento, proyección de dos híbridos, en que un cebo construir (es decir, fusiones de dominio Gal4-DNA-que atan) en un tipo de cruzamiento se reúne a través de apareamiento con una construcción de la presa de una biblioteca vestida 12. sin embargo, esta estrategia no se ha aplicado nunca en proyecciones de la biblioteca de sobreexpresión, que siempre han utilizado métodos de transformación tradicional.
Nuestro laboratorio había establecido previamente un modelo de levadura de la proteína asociada a ALS FUS7. A través de la proyección de la biblioteca de sobreexpresión utilizando el método de transformación descubrieron cinco genes de levadura (NAM8, SBP1, ECM32, SKO1y VHR1) que rescatan toxicidad de FUS cuando overexpressed. Estos resultados fueron confirmados independientemente con un estudio similar realizado por otro grupo8. hUPF1, un homólogo humano de ECM32, más adelante fue demostrado que suprimen la toxicidad en las células neuronales primarias13 y en un modelo animal de ALS14 así. Utilizando estos cinco genes como prueba del principio, demostramos que todos los cinco genes asimismo rescatar toxicidad FUS cuando se introducen en el modelo de la levadura FUS por apareamiento. Puesto que las células de levadura que contiene los genes de la biblioteca pueden ser almacenadas permanentemente en stock de glicerol y revivió cuando sea necesario, este método basado en apareamiento eliminará el paso lento de transformación cada vez que necesita ser defendido contra la biblioteca. Apareamiento es altamente eficiente con ninguna transformación del plásmido involucrado, esta estrategia disminuye también significativamente el costo asociado con la purificación y transformación de una biblioteca de plásmidos grandes. Con éxito se aplicará este método en una biblioteca de investigación contra el modelo de la levadura de FUS.
El procedimiento basado en el acoplamiento se describe brevemente en la figura 1. Inicialmente, la biblioteca de plásmido vestida se transforma en una cepa de levadura haploide de acoplamiento tipo α mediante un protocolo de transformación de levaduras de alto rendimiento en el que cada pocillo de una placa de 96 pocillos contiene levadura transformada con un plásmido de la biblioteca específica. Esta colección de levadura transformada se guarda como un stock de glicerol que puede ser descongelado y revivido para el uso más adelante. El modelo de levaduras de interés, en este caso toxicidad FUS, debe generarse en una cepa de levadura haploide con el tipo de apareamiento opuesto (acoplamiento tipo a). En alto rendimiento forma con estériles replicadores de 96 pines la cepa FUS cepas de levadura que contiene la biblioteca de plásmido transferidas a placas de 96 pocillos que contienen medios enriquecidos y permitió a mate. Tras el apareamiento, un pequeño volumen de cada bien de la cultura de acoplamiento se transfiere a placas de 96 pocillos que contienen medios sintéticos deserción que levadura sólo diploide que contiene tanto las FUS y genes biblioteca pueden crecer. Una máquina telescopio robótica entonces se utiliza para transferir la cultura de la levadura de cada pozo en placas de agar donde se induce la expresión de los genes de la biblioteca y FUS.  Además, cultura de la levadura es descubierta para controlar las placas de agar donde FUS y los biblioteca los genes no se expresan. Después de crecimiento en placas de agar, se identificarán genes que rescataran o exacerban la toxicidad FUS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:555px;" width="554">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">salmon Sperm DNA (SS-DNA)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:99px;">&#160; D1626</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:183px;">YPD broth</td>
			<td style="width:127px;">Research Products International (RPI)</td>
			<td style="width:99px;">Y20090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">Granulated Agar</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:99px;">BP97445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:183px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:127px;">Research Products International (RPI)</td>
			<td style="width:99px;">G32040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:183px;">D-(+)-Galactose</td>
			<td style="width:127px;">Research Products International (RPI)</td>
			<td style="width:99px;">G33000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:183px;">D-(+)-Raffinose Pentahydrate</td>
			<td style="width:127px;">Research Products International (RPI)</td>
			<td style="width:99px;">R20500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:99px;">A702-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">Synthetic Ura- drop out medium</td>
			<td style="width:127px;">Clontech</td>
			<td style="width:99px;">630416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:183px;">Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:183px;">Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:127px;">Research Products International (RPI)</td>
			<td style="width:99px;">Y20060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:99px;">S67496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">Lithium acetate, anhydrous</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:99px;">AC268640010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350)</td>
			<td style="width:127px;">Spectrum Chemical&#160;</td>
			<td style="width:99px;">PO125-12KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">96 Pin Replicator&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Scinomix</td>
			<td style="width:99px;">SCI-5010-OS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">Nunc OmniTray</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Sci</td>
			<td>140156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:183px;">Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:99px;">07-200-760</td>
			<td>non-treated, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">Eppendorf&#160;Research plus Multichannel Pipette</td>
			<td style="width:127px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:99px;">TI13690052</td>
			<td>30-300ul volume</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:183px;">Fisherbrand&#160;Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:99px;">88-860-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">Eppendorf&#160;MixMate</td>
			<td style="width:127px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:99px;">21-379-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">Eppendorf 5810R Centrifuge</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:99px;">05-413-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">Avanti J-26 XPI Centrifuge</td>
			<td style="width:127px;">Beckman</td>
			<td style="width:99px;">393127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser</td>
			<td style="width:127px;">BioTek</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">Rotor HDA&#160;&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mating-based overexpression library screening in yeast

Levadura de florecimiento ha sido ampliamente utilizada como modelo en el estudio de proteínas relacionadas con enfermedades humanas. Investigación genética genoma es una poderosa herramienta de uso general en estudios de levadura. La expresión de un número de proteínas asociada a enfermedad de neurodegenerative en levadura causa citotoxicidad y formación de agregados, recapitulando los resultados vistos en pacientes con estos trastornos. Aquí, describimos un método para la detección de un modelo de la levadura de la proteína asociada a la Esclerosis Lateral Amiotrófica FUS para modificadores de su toxicidad. En lugar de usar la transformación, esta nueva plataforma de proyección se basa en el acoplamiento de la levadura para introducir una matriz biblioteca de plásmidos en el modelo de la levadura. El método de apareamiento tiene dos claras ventajas: en primer lugar, es muy eficiente; en segundo lugar, la biblioteca matriz previamente transformada de plásmidos puede almacenarse a largo plazo como un stock de glicerol, y rápidamente aplicada a otras pantallas sin el paso intensivo de transformación en el modelo de levadura cada vez. Nos demuestran cómo se puede utilizar con éxito este método para detectar genes que modifican la toxicidad de FUS.

La proteína asociada a ALS FUS, una proteína de unión de ARN/ADN fue estudiada previamente en levadura haploide7,8. Genéticos de detección utilizando el método basado en la transformación descubrió varios genes de levadura que suprimen la toxicidad de FUS. El homólogo humano de uno de los genes de la levadura más adelante fue demostrado para ser eficaz en suprimir la toxicidad en un modelo de rata de ALS<sup class="xref"...

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Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Este artículo presenta un método basado en el acoplamiento para facilitar la detección de sobreexpresión en levadura de florecimiento utilizando una biblioteca de plásmidos vestida.

Proyección de biblioteca sobreexpresión basado en apareamiento en levaduras

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

7.6K vistas.  Wright State University. Este artículo presenta un método basado en el acoplamiento para facilitar la detección de sobreexpresión en levadura de florecimiento utilizando una biblioteca de plásmidos vestida.

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Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

Targeted<em&gt; In situ</em&gt; mutagénesis de histona genes en la levadura en ciernes

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Investigación

Genética

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 nuclease or a nuclease-dead dCas9 fusion protein) is targeted to a specific site in the genome by a small synthetic RNA known as the guide RNA, or gRNA. The bipartite nature of the CRISPR system enables its use in screening approaches since plasmid libraries containing expression cassettes of thousands of individual gRNAs can be used to interrogate many different sites in a single experiment. 
To date, gRNA sequences for the construction of libraries have been almost exclusively generated by oligonucleotide synthesis, which limits the achievable complexity of sequences in the library and is relatively cost-intensive. Here, a detailed protocol for CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity), a simple and cost-effective method for the generation of highly complex gRNA libraries based on enzymatic digestion of input DNA, is described. Since CORALINA libraries can be generated from any source of DNA, plenty of options for customization exist, enabling a large variety of CRISPR-based screens.

Methods for generating large-scale gRNA libraries should be simple, efficient and cost-effective. We describe a protocol for the production of gRNA libraries based on enzymatic digestion of target DNA. This method, CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity) presents an alternative to costly custom oligonucleotide synthesis.

Un protocolo Universal para la gRNA a gran escala de producción de la biblioteca de cualquier fuente de ADN

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

Robusto de ADN y la secuenciación de alto rendimiento biblioteca construcción de especímenes de herbario

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve random mutagenesis, error-prone PCR is a convenient and efficient strategy for generating a diverse pool of mutants (i.e., a mutant library). Error-prone PCR is the method of choice when a researcher seeks to mutate a pre-defined region, such as the coding region of a gene while leaving other genomic regions unaffected. After the mutant library is amplified by error-prone PCR, it must be cloned into a suitable plasmid. The size of the library generated by error-prone PCR is constrained by the efficiency of the cloning step. However, in the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, the cloning step can be replaced by the use of a highly efficient one-step fusion PCR to generate constructs for transformation. Mutants of desired phenotypes may then be selected using appropriate reporters. Here, we describe this strategy in detail, taking as an example, a reporter inserted at centromeric heterochromatin.

This article describes a detailed methodology for random mutagenesis of a target gene in fission yeast. As an example, we target rpt4+, which encodes a subunit of the 19S proteasome, and screen for mutations that destabilize heterochromatin.

Gene-dirigido mutagénesis al azar para seleccionar a mutantes de proteasoma desestabilizadoras de la heterocromatina en la levadura de fisión

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state when water is supplied. The genomic sequencing of microscopic animals such as tardigrades risks bacterial contamination that sometimes leads to erroneous interpretations, for example, regarding the extent of horizontal gene transfer in these animals. Here, we provide an ultralow input method to sequence the genome of the tardigrade, Hypsibius dujardini, from a single specimen. By employing rigorous washing and contaminant exclusion along with an efficient extraction of the 50 ~ 200 pg genomic DNA from a single individual, we constructed a library sequenced with a DNA sequencing instrument. These libraries were highly reproducible and unbiased, and an informatics analysis of the sequenced reads with other H. dujardini genomes showed a minimal amount of contamination. This method can be applied to unculturable tardigrades that could not be sequenced using previous methods.

Contamination during the genomic sequencing of microscopic organisms remains a large problem. Here, we show a method to sequence the genome of a tardigrade from a single specimen with as little as 50 pg of genomic DNA without whole genome amplification to minimize the risk of contamination.

Ultra bajo entrada genoma secuencia biblioteca elaboración de un solo espécimen Tardigrade

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect and count individual RNA molecules. Complementary to deep sequencing-based methods, smFISH provides information about the cell-to-cell variation in transcript abundance and the subcellular localization of a given RNA. Recently, we have used smFISH to study the expression of the gene&#160;NDC80&#160;during meiosis in budding yeast, in which two transcript isoforms exist and the short transcript isoform has its entire sequence shared with the long isoform. To confidently identify each transcript isoform, we optimized known smFISH protocols and obtained high consistency and quality of smFISH data for the samples acquired during budding yeast meiosis. Here, we describe this optimized protocol, the criteria that we use to determine whether high quality of smFISH data is obtained, and some tips for implementing this protocol in&#160;other yeast strains and growth conditions.

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

This single molecule fluorescence in situ hybridization protocol is optimized to quantify the number of RNA molecules in budding yeast during vegetative growth and meiosis.

Sola molécula fluorescencia In Situ hibridación (smFISH) análisis de florecimiento levadura crecimiento vegetativo y la Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

Caracterización de la histona modificación post-translacional alteraciones en modelos neurodegenerativos Proteinopathy de levadura

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

Una pantalla de supresor asistida por secuenciación profunda, espontánea en la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

CCCTC-binding factor (CTCF)-mediated stable topologically associating domains (TADs) play a critical role in constraining interactions of DNA elements that are located in neighboring TADs. CTCF plays an important role in regulating the spatial and temporal expression of HOX genes that control embryonic development, body patterning, hematopoiesis, and leukemogenesis. However, it remains largely unknown whether and how HOX loci associated CTCF boundaries regulate chromatin organization and HOX gene expression. In the current protocol, a specific sgRNA pooled library targeting all CTCF binding sites in the HOXA/B/C/D loci has been generated to examine the effects of disrupting CTCF-associated chromatin boundaries on TAD formation and HOX gene expression. Through CRISPR-Cas9 genetic screening, the CTCF binding site located between HOXA7/HOXA9 genes (CBS7/9) has been identified as a critical regulator of oncogenic chromatin domain, as well as being important for maintaining ectopic HOX gene expression patterns in MLL-rearranged acute myeloid leukemia (AML). Thus, this sgRNA library screening approach provides novel insights into CTCF mediated genome organization in specific gene loci and also provides a basis for the functional characterization of the annotated genetic regulatory elements, both coding and noncoding, during normal biological processes in the post-human genome project era.

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

A CRISPR/sgRNA library has been applied to interrogating protein-coding genes.However, the feasibility of a sgRNA library to uncover the function of a CTCF boundary in gene regulation remains unexplored. Here, we describe a HOX loci specific sgRNA library to elucidate the function of CTCF boundaries in HOX loci.

HOX Loci enfocado CRISPR/sgRNA biblioteca proyección identificación crítica CTCF límites

CCCTC-binding factor (CTCF)-mediated stable topologically associating domains (TADs) play a critical role in constraining interactions of DNA elements ...

Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers

SNX-BAR proteins are an evolutionarily conserved class of membrane remodeling proteins that play key roles in sorting and trafficking of protein and lipids during endocytosis, sorting within the endosomal system, and autophagy. Central to SNX-BAR protein function is the ability to form homodimers or heterodimers that bind membranes using highly conserved phox-homology (PX) and BAR (Bin/Amphiphysin/Rvs) domains. In addition, oligomerization of SNX-BAR dimers on membranes can elicit the formation of membrane tubules and vesicles and this activity is thought to reflect their functions as coat proteins for endosome-derived transport carriers. Researchers have long utilized in vitro binding studies using recombinant SNX-BAR proteins on synthetic liposomes or giant unilamellar vesicles (GUVs) to reveal the precise makeup of lipids needed to drive membrane remodeling, thus revealing their mechanism of action. However, due to technical challenges with dual expression systems, toxicity of SNX-BAR protein expression in bacteria, and poor solubility of individual SNX-BAR proteins, most studies to date have examined SNX-BAR homodimers, including non-physiological dimers that form during expression in bacteria. Recently, we have optimized a protocol to overcome the major shortcomings of a typical bacterial expression system. Using this workflow, we demonstrate how to successfully express and purify large amounts of SNX-BAR heterodimers and how to reconstitute them on synthetic liposomes for binding and tubulation assays.

Here, we present a workflow for the expression, purification and liposome binding of SNX-BAR heterodimers in yeast.

Expresión, purificación y encuadernación liposoma de los heterodímeros SNX-BAR de levadura en ciernes

SNX-BAR proteins are an evolutionarily conserved class of membrane remodeling proteins that play key roles in sorting and trafficking of protein and ...