Gösterilen pankreas dokusu ayrışma protokolü basittir ve katı tümörler de dahil olmak üzere malignite süreci sırasında farklı aşamalarda canlı tek hücreleri pankreas dokusundan izole etmek için bir araç sağlar. Sağlam ve canlı asiner hücrelerin geri kazanılması büyük bir zorluktur. Protokol, normal pankreata, pre-malign lezyonlara sahip pankreas veya çok sayıda stromal ve immün hücre içeren pankreas tümörlerinden canlı tek hücreleri kurtarabilir.
İnsan pankreas tümörlerini veya iltihaplı pankreasını incelemek için bu protokolün kullanılması, yeni biyobelirteçler ve tedaviler bulmak için bu hastalıkların araştırılmasına yardımcı olabilir. Yöntemin kullanımı kolaydır ve minimum uygulama ile istenen sonuçları sağlayabilir. Bu video, protokolün küçük ayrıntılarını görüntülemenize yardımcı olacaktır.
Diseksiyona başlamadan önce tüm alet ve ekipmanları buz üzerinde hazır tutunuz. Ötenazi fareyi sabitledikten sonra, karnına% 70 etanol püskürtün. Makas ve forseps kullanarak, hayvanın genital bölgesinde 2,5 santimetrelik V şeklinde bir kesi yapın ve karın boşluğunu tamamen açmak için yukarı doğru ilerleyin.
Farenin sol tarafındaki mideyi ve dalağın yakınındaki pankreası bulun. İki forseps kullanarak pankreası mide ve duodenumdan yırtılmadan ayırın. Pankreası ince bağırsak, jejunum ve ileumdan ayırın ve ayırın.
Pankreası sağ tarafa hareket ettirin ve pankreas ile göğüs boşluğu arasındaki kalan bağlantıları forseps ile ayırarak pankreası ve bağlı dalağı tamamen ayırın. Dikkatlice, pankreası mezenterik yağ veya diğer bitişik dokular olmadan çıkarın ve buz üzerinde bir Petri kabında incelenmek üzere yayın. Metinde bahsedilen bileşimi takiben, ayrışma tamponları 1 ve 2'yi hazırlayın, tamponu yıkayın ve enzim aktivitesini durduran çözeltiyi önceden yıkayın.
Pankreası buz üzerinde 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve% 10 fetal sığır serumu veya FBS ve Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi veya HBSS ile durulayın. Yağ yüzer ve pankreas batar. Bu, hala pankreasa bağlı olan kirletici beyaz yağ dokusunu görselleştirmenin ve hızlı bir şekilde çıkarmanın kolay bir yoludur.
Daha sonra, fare pankreas dokusunu beş mililitre HBSS içeren steril bir Petri kabında kesene kadar buz üzerinde aktarın ve saklayın. Noyes makası ve neşter kullanarak pankreası bir ila üç milimetreküplük küçük parçalar halinde kesin. Dokuları bir santrifüj tüpüne aktardıktan sonra, beş dakika boyunca 350G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.
Hücre parçalarını ve kan hücrelerini çıkarmak için süpernatanı aspire edin ve atın. % 0.02 tripsin-C ve% 0.05 EDTA içeren ayrışma tamponu 1'deki parçaları çalkalama ile 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca yeniden askıya alın. Hemen% 10 FBS ve Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium veya DMEM ile yıkayın ve 350G ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin.
Peleti 10 mililitre yıkama tamponunda yeniden süspanse ederek ve bir sonraki ayrışma adımından önce beş dakika boyunca daha önce olduğu gibi santrifüjleyerek tekrar yıkayın. Pankreası ayrışma tamponu 2'de 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca dakikada 180 dönüşte çalkalama ile inkübe edin. 15 dakika sonra, steril serolojik pipetler kullanarak pankreas parçalarını 10 kez kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleyerek mekanik ayrışma gerçekleştirin.
25, 10 ila 5 mililitreden başlayarak azalan pipetler kullanarak tekrarlayın. Numuneyi 37 santigrat dereceye getirmek için inkübe edin. Süspansiyondaki tek hücre miktarına göre ayrışmayı izlemek için ışık mikroskobu kullanın.
Tripan mavisi kullanarak hücre canlılığını izleyin. İnkübasyona devam edin ve her beş dakikada bir numune alarak ayrışmayı kontrol edin. Hücrelerin %90'ı tek hücrelere ayrılana kadar inkübe edin.
Pankreas dokusu, pankreas parçalarının kaybolması ve çözeltinin artan bulanıklığı ile gösterilen iyice ayrıştıktan sonra, enzim aktivitesi durdurma çözeltisi ile dört santigrat derecede beş dakika boyunca iki kez yıkayarak enzimatik reaksiyonu durdurun. Bu adımdan itibaren hücre süspansiyonunu buz üzerinde tutun. Hücre süspansiyonunu 70 mikronluk bir naylon ağdan geçirin.
Daha küçük bir naylon ağ boyutu, hücre canlılığını azaltabilir. Mikroskop altında hücre canlılığını kontrol edin. Hücreleri saymadan önce peleti 5 ila 10 mililitre buz gibi soğuk tamponlu yıkama solüsyonuyla yeniden süspanse edin ve yıkayın.
Birkaç kırmızı kan hücresi gözlenirse, hücrelere oda sıcaklığında iki dakika boyunca kırmızı kan hücresi lizis tamponu uygulayın. Topaklanmaların gözlendiği durumlarda, numuneler daha önce tarif edildiği gibi tripsin ile tekrar muamele edilmelidir. Canlılık %80'den azsa, canlı hücreler manyetik olarak aktive edilen hücre ayırma veya MACS MS sütunlu MACS ölü hücre temizleme kiti kullanılarak izole edilmelidir.
İzole edilen pankreas dokusunun kırmızı rengi, asiner hücrelerde tdTomato ekspresyonundan kaynaklanmıştır. Ayrışmanın erken bir aşamasında, az sayıda izole hücre ve çok sayıda küme vardı. Daha sonra, canlı hücre sayısını azaltmaktan kaçınarak izole canlı hücreler elde edildi.
Daha uzun inkübasyon, hücrelerin canlılığını azalttı. tdTomato pozitif hücreleri, floresanla aktive edilen hücre sıralaması kullanılarak tahmin edildi. Nazik Ayrışma Protokolü, istenen hücre tiplerinin hücre sıralamasının takip edilmesine izin veren yüksek canlılık ile çoklu hücre tiplerinin geri kazanılmasını destekledi.
Canlı hücreden ölü hücreye sayım bir hematiometre kullanılarak yapıldı. Donmuş pankreas kesitlerinin floresan görüntüleri, tdTomato pozitif asiner hücrelerini gösterdi. Tek hücreli RNA dizilimi, tüm zaman noktalarından rezeke edilen her dokuda floresanla aktive edilen hücre sıralamasında tespit edilen tüm hücre tiplerinin tespitini doğruladı.
Asiner hücrelerde karboksipeptidaz1 veya CPA1 ekspresyonu incelenmiştir, bu da diğer hücre tiplerinin transkriptomu ile minimum kontaminasyonu gösterir. Daha uzun inkübasyon sürelerinin hücrelerin canlılığını azalttığına dikkat etmek önemlidir, bu nedenle numuneyi izlemek ve mikroskop altında birkaç dakikada bir dokunun ayrışmasını ve hücre canlılığını gözlemlemek önemlidir. Hücre izolasyon protokolü, tek hücreli RNA dizilimi, hücrelerin kültürlenmesi veya organoidler için bir başlangıç materyali olarak kullanılabilir.
Bu teknik, pankreas kanserinin nasıl geliştiğini keşfetmeye ve iltihaplı veya kanserli dokuya sızan hücreler arasındaki etkileşimleri araştırmaya olanak tanır.
