Biz hayvan bakımı ile teknik yardım için AniCan personeli (CrCl, Lyon) teşekkür ederim. Bu çalışma Derneği pour la Recherche sur le Kanser tarafından, Institut National du Kanser tarafından ve burs tarafından Institut National de la Santé Et de la Recherche Médicale (INSERM Avenir Programı), Ligue Nationale Contre le Kanser, tarafından desteklenmiştir Fransa&#39;nın Ministère de l&#39;Enseignement Supérieur et de la Recherche gelen Institut National du Kanser (JG), (RMP ve DFV) gelen ve Derneği pour la Recherche sur le Kanser Ligue Nationale Contre le Cancer (JG), ( DFV).

Tüm işlemler kamu otoriteleri düzenleyici altında bir etik kurul tarafından onaylanmış (&quot;Comité d&#39;Değerlendirme Haberleşme au Merkezi Léon Bérard, à l&#39;ANIMALERIE de geçiş de l&#39;ENS, au PBES et au laboratuarı P4&quot; (CECCAPP)). Edildi Fareler &quot;PLATEFORME AniCan, Merkezi Léon Bérard&quot; (Lyon, Fransa) bir spesifik patojen free hayvan tesis muhafaza ve kurumsal düzenlemeler uygun olarak ele alınmıştır. Prosedürünün bir şematik gösterimi Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. 1. Pankreas Diseksiyon ve Dilaceration (Gün 0) Bir çok hızlı bir diseksiyon ekstraksiyon optimal verim için önemlidir ve kültür içinde hücreleri iyi bir canlılığı sağlamak için. Pankreas izolasyonu için gereken zamanı azaltmak için, tüm alet ve ekipmanlar fare ötenazi önce hazır olmalıdır. <ol><li><html> CO 2 boğulma veya servikal dislokasyon ile fare Euthanize. </li></ol> Bu adım, tüm işlemler steril diseksiyon ekipmanları ile steril bir ortamda (mikrobiyolojik güvenlik kabini, seviye II) altında yapılması gerekir. <ol start="2"><li> Fare düzeltmek ve% 70 etanol ile fare karın sprey. Herhangi bir diseksiyon makas ve forseps ile, genital bölgede bir V şeklinde kesi yapmak ve tamamen karın boşluğuna açmak için diyafram o kadar devam ediyor. </li><li> Diyafram karşı karaciğer lobları yerleştirin; vücut boşluğuna yeterince açık ise orada kalmalıdır. Sol için karın boşluğu dışında bağırsak ve kolon çekin ve rektum bulmak. Kavisli bir forseps ve diseksiyon makas, kapmak ve bölüm rektum bir çift. </li><li> Forseps aynı çifti ile, dikkatli bir şekilde sol tarafta bağırsak çekerek mide rektum tamamen bağırsak göz önüne sermek. </li></ol>Bu aşamada ent &quot;&gt;, pankreas, mide ve bağırsak başlangıcı arasında ince bir şerit olarak ayırt edilebilir. dalak ile onun ligasyonu sağlam kalır. <ol start="5"><li> Dikkatle bağırsak boyunca pankreas kesme ve sindirim sistemi geri kalanından dalak ile kurtarmak, Noyes makas ve forseps bir çift kullanarak. </li><li> Dalak ve bu bölümü (Şekil 2) bağlı olan pankreas al. </li></ol> Bu aşamada, hiçbir mezenterik yağ dokusu ve / veya diğer komşu doku (dalak, bağırsak, vb) hücresel kirlenmesini önlemek için, pankreas ile toplanmış olabilir emin olun. Prosedürün geri kalanı için, her bir tampon acinar hücreleri içinde, ekzokrin pankreas dokusunun tam ayrılma önlemek için kalsiyum iyonu kenetleyiciler Ca2 + olmadan hazırlanmış olmalıdır. <ol start="7"><li> Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde iki kez 1x pankreas durulayın. </li></ol> Bu adımda, gibi yağ dokusu batar pankreas aykırı, hala pankreas bağlı kirletici beyaz yağ dokusu görselleştirmek ve hızlı bir şekilde kaldırmak için kolayca mümkündür yüzer. Pankreas hücre kültürü tesisine taşınması gerekiyorsa, bu HBSS 1x buz üzerinde tutulmalıdır. <ol start="8"><li> HBSS 1x 5 ml içeren steril Petri kabındaki pankreas aktarın. Noyes makas ve bir neşter kullanılarak, 1-3 mm 3 (Şekil 3A), küçük parçalar halinde pankreas dilim. </li></ol> 2. Pankreas enzimatik ve mekanik ayrışmalar (Gün 0) <ol><li> , Steril bir 50 ml polipropilen tüpe aktarın. </li><li> 450 x g ve 4 de 2 dakika süre ile santrifüje ° C Aspire ve hücre parçaları ve kan hücreleri çıkarmak için supernatant atın. </li><li> Kollajenaz IA 10 ml çözelti (HBSS 1x 10 mM HEPES collagena 200 U / ml ihtiva eden eklemepankreas bölümleri SE, IA ve 0.25 mg / ml tripsin inhibitörü). 25 ml serolojik pipet kullanarak, bir 25 cm 2 balon aktarabilirsiniz. 37 20-30 dakika için inkübe ° C Bu süre (her 5 dk) sırasında, azalan büyüklükte steril pipetler (25, 10, ve 5 ml serolojik pipet) içinde, enerjik on kere geri ve ileri-pankreas parçaları hareket ettirerek mekanik bir ayrışma gerçekleştirin. </li></ol> Bu aşamada, bu sık sık pankreas bölümlerinin enzimatik ayrılma derecesini izlemek için gereklidir. <ol start="4"><li> Pankreatik doku de-ayrışmış gibi durduğu zaman (pankreas parçalarının ortadan kalkması ve solüsyonun yüksek bulanıklık göre) (Şekil 3B), soğuk 10 ml eklenerek enzimatik reaksiyonu durdurmak (HBSS 1x 5 ihtiva eden yıkama çözeltisi tamponlu % fetal sığır serumu (FBS) ve 10 mM HEPES). </li><li> , Steril bir 50 ml polipropilen boru ve centr içine aktarın450 x g&#39;de 2 dakika ve 4 ° C ve ifuge Dikkatlice aspire ve kollajenaz IA çözüm kaldırmak için süpernatant atın. </li><li> Yeniden süspanse edin ve tamponlu yıkama solüsyonu 10 ml ile pelet yıkayın. 450 x g ve 4 3 dakika boyunca santrifüj ° C Dikkatlice aspire ve supernatant atın. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın. </li></ol> 3. Filtrasyon ve tohumlama (Gün 0) acini Dağınık <ol><li> % 2.5 FBS içeren Waymouth orta 7 ml hücre pelletini,% 1 Penisilin-Streptomisin karışımı (PS), 0.25 mg / tripsin inhibitörü, ve 25 ng / yeniden birleştirici insan epidermal büyüme faktörü (EGF) ml ml. </li><li> Bu non-sindirilmiş parçaların (kanalları, kan damarları ve Langerhans adacıkları) korumak için bir filtre 100 mikron geçmesine izin süzüntü hücre karışımı. Pankreas asiner yapılar (10-15 hücre acinus) geçer. </li><li> Waymouth orta FBS ihtiva eden, PS, tripsin inh 6 mL &#39;si ile yıkayınız filtreibitor, ve EGF. </li></ol> Bu aşamadan sonra, hücreler, herhangi bir asinüs ayrışma önlemek için, çok dikkatli bir şekilde tedavi edilmesi gerekir. <ol start="4"><li> Tohum, 6-çukurlu kültür kaplarına izole asinüs (oyuk başına 2 ml) (Şekil 3C). ° C altında% 5 (v / v) CO2 atmosfer 37 Kültür bunları. </li></ol> Bu aşamadan sonra, asiner hücreler süspansiyonda kültürlendi. 4. Asiner Hücre Kültürü (Gün 1 ile 10) <ol><li> Yirmi dört saat sonra, kirletici hücreleri ve (Şekil 4) gece yapıştırılır var hücresel kalıntıları ortadan kaldırmak için, yeni bir 6-iyi bir kültür çanak içine (süspansiyon) acini aktarın. </li></ol> Hücre kültürü birkaç gün ya da deneysel koşullar hücreleri tek tabaka yetiştirilen gerektiriyorsa, bu matris iskele üzerinde transferi ve tohum acini tavsiye edilir uzatılabilir gerekiyorsa. <ol start="2"><li> Görmeden günmatris destek ding (Gün 0), ceket tipi bir 6-iyi bir kültür çanak I kollajen (5 mg / cm 2). (0.02 M asetik asit içinde 50 ug / ml, 0.2 mikron filtre) her kuyuya tip I kolajen çözeltisi 1 ml ilave edilir ve 37 ° C&#39;de (ya da gece boyunca 4 de, 1 saat boyunca, plastik üzerinde pasif olarak adsorbe izin ° C .) </li><li> Tip I kolajen çözeltisi aspire edin ve fosfat-tamponlu tuzlu su ile 1x iki kat daha iyi kaplanmış yıkayın. </li><li> Kullanmadan önce (bir mikrobiyolojik güvenlik kabini altında) en az 12 saat kuruması için de kaplı izin verin. </li><li> Türü daha önce tarif edilenle aynı koşullarda I kollajen kaplı 6 oyuklu kültür çanağı ve bunların kültür (37 ° C de% 5 altında (v / v) CO2 atmosferi) içine izole edilmiş primer asinüs (Basamak 4.1 &#39;de elde edilmiş) transferi . Hücreler, 2 gün boyunca, tip I kollajen alt tabakaya yapışır. </li><li> Gün 3, uymadığımızı cansız hücreleri ortadan kaldırmak için kültür ortamı değiştirin. Kültür Zamanla, hücreleri giderek sp olacakkollajen ihtiva eden destek üzerinde okuyun. Kültür ortamı her 3 günde bir (Şekil 5) değiştirin. </li></ol> Elde edilen izole asiner hücreler Thoma hücre sayımı odası kullanarak tam bir mekanik ayrılma sonra, sayılabilir. Izole asiner hücreler daha sonra kültüründe muhafaza edilemez unutmayın. Elde edilen asiner kültür kalitesi gibi Tripsinojen, Pankreas Transkripsiyon Faktör 1 alt birimi Alpha veya karboksipeptidaz A1 (immünsitokimya veya immünofloresan deneyleri ile) olarak asiner spesifik belirteçler ifade kontrol ederek kontrol edilebilir.

<ol>
	<li>Lardon, J., Bouwens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaplasia+in+the+pancreas.">Metaplasia in the pancreas.</a> Differentiation. 73, 278-286 (2005).</li><li>Sphyris, N., Logsdon, C. D., Harrison, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+retention+of+zymogen+granules+in+cultured+murine+pancreatic+acinar+cells+and+induction+of+acinar-ductal+transdifferentiation+in+vitro.">Improved retention of zymogen granules in cultured murine pancreatic acinar cells and induction of acinar-ductal transdifferentiation in vitro.</a> Pancreas. 30, 148-157 (2005).</li><li>Amsterdam, A., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+isolated+pancreatic+exocrine+cells.">Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 3028-3032 (1972).</li><li>Amsterdam, A., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+dispersed+pancreatic+exocrine+cells.+I.+Dissociation+technique+and+morphologic+characteristics+of+separated+cells.">Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. I. Dissociation technique and morphologic characteristics of separated cells.</a> J. Cell. Biol. 63, 1037-1056 (1974).</li><li>Amsterdam, A., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+dispersed+pancreatic+exocrine+cells.+II.+Functional+characteristics+of+separated+cells.">Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. II. Functional characteristics of separated cells.</a> J. Cell. Biol. 63, 1057-1073 (1974).</li><li>Schultz, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guinea+pig+pancreatic+acini+prepared+with+purified+collagenase.">Guinea pig pancreatic acini prepared with purified collagenase.</a> Exp. Cell Res. 130, 49-62 (1980).</li><li>Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+of+secretagogues+on+a+new+preparation+of+functionally+intact,+isolated+pancreatic+acini.">Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini.</a> Am. J. Physiol. 235, 517-524 (1978).</li><li>Logsdon, C. D., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+binding+and+biologic+effects+on+mouse+pancreatic+acini.">Epidermal growth factor binding and biologic effects on mouse pancreatic acini.</a> Gastroenterology. 85, 339-345 (1983).</li><li>Han, B., Logsdon, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholecystokinin+induction+of+mob-1+chemokine+expression+in+pancreatic+acinar+cells+requires+NF-kappaB+activation.">Cholecystokinin induction of mob-1 chemokine expression in pancreatic acinar cells requires NF-kappaB activation.</a> Am. J. Physiol. 277, 74-82 (1999).</li><li>Ji, B., Kopin, A. S., Logsdon, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+differences+between+rat+and+mouse+CCKA+receptors+determine+the+divergent+acinar+cell+response+to+the+cholecystokinin+analog+JMV-180.">Species differences between rat and mouse CCKA receptors determine the divergent acinar cell response to the cholecystokinin analog JMV-180.</a> J. Biol. Chem. 275, 19115-19120 (2000).</li><li>Ji, K. A., Yang, M. S., Jou, I., Shong, M. H., Joe, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombin+induces+expression+of+cytokine-induced+SH2+protein+(CIS)+in+rat+brain+astrocytes:+involvement+of+phospholipase+A2,+cyclooxygenase,+and+lipoxygenase.">Thrombin induces expression of cytokine-induced SH2 protein (CIS) in rat brain astrocytes: involvement of phospholipase A2, cyclooxygenase, and lipoxygenase.</a> Glia. 48, 102-111 (2004).</li><li>Gaiser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+activation+of+trypsinogen+in+transgenic+mice+induces+acute+but+not+chronic+pancreatitis.">Intracellular activation of trypsinogen in transgenic mice induces acute but not chronic pancreatitis.</a> Gut. 60, 1379-1388 (2011).</li><li>Logsdon, C. D., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+acinar+cells+in+monolayer+culture:+direct+trophic+effects+of+caerulein+in+vitro.">Pancreatic acinar cells in monolayer culture: direct trophic effects of caerulein in vitro.</a> Am. J. Physiol. 250, 440-447 (1986).</li><li>Stanger, B. Z., Dor, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+cellular+origins+of+pancreatic+cancer.">Dissecting the cellular origins of pancreatic cancer.</a> Cell Cycle. 5, 43-46 (2006).</li><li>Vincent, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tif1gamma+suppresses+murine+pancreatic+tumoral+transformation+by+a+smad4-independent+pathway.">Tif1gamma suppresses murine pancreatic tumoral transformation by a smad4-independent pathway.</a> Am. J. Pathol. 180, 2214-2221 (2012).</li><li>Vincent, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+TIF1gamma+cooperates+with+Kras+to+induce+cystic+tumors+of+the+pancreas.">Inactivation of TIF1gamma cooperates with Kras to induce cystic tumors of the pancreas.</a> PLoS Genet. 5, e1000575 (2009).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+pancreatic+alpha,+beta,+duct+and+acinar+populations+with+cell+surface+markers.">Isolation of mouse pancreatic alpha, beta, duct and acinar populations with cell surface markers.</a> Mol. Cell Endocrinol. 339, 144-150 (2011).</li><li>Case, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+intracellular+transport+and+discharge+of+exportable+proteins+in+the+pancreatic+acinar+cell+and+other+cells.">Synthesis, intracellular transport and discharge of exportable proteins in the pancreatic acinar cell and other cells.</a> Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 53, 211-354 (1978).</li><li>Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+explant+outgrowth+culture+model+for+mouse+pancreatic+acinar+cells+with+long-term+maintenance+of+secretory+phenotype.">A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype.</a> Eur. J. Cell. Biol. 90, 1052-1060 (2011).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Bu protokol, pankreas asiner hücreleri izole etmek için bir prosedür açıklanmaktadır. Bu yöntem, en az 1 saat, hayvan başına en fazla 20 x 10 6 asiner hücreleri izole etmek mümkün kılar. Hızlı ve basit bir uygulama (10 gibi pankreaslarında bağımsız paralel Deneme başına işlenebilir) sayesinde, bu protokol mevcut izolasyon yöntemleri 3-5,9-12,17 arasında iyi bir uzlaşma olarak görünür. Kritik adımları / Sorun Giderme <p class="j...

Ekzokrin pankreas dokusu üzerinde çalışan araştırma laboratuvarları için sık karşılaşılan sorun yeterince uzun uzun vadeli bir deneme sağlamak için bir süre için in vitro asiner hücrelerin yetiştirilmesi zorluğudur. Bu tür kültür sistemlerinin geliştirilmesi engelleyen bir faktör de pankreas hücrelerinin izolasyonu sırasında serbest zaman tam anlamıyla pankreas doku sindirmek, glikolitik proteolitik ve lipolitik enzimler, en yüksek içeriği nedeniyle deneysel manipülasyon için pankreas dokusunun içsel duyarlılığı. İkinci bir faktör, salgı özelliklerini yitirmesine ve bu pankreatik duktal hücreleri veya hepatosit benzeri hücreler 1. Gibi diğer olgun hücrelerin, için transdifferentiate eğilimi asiner hücreler, in vitro plastisitede dikkat çekicidir in vitro olarak, bu hücre plastisite deneysel koşullar ile değişir (örneğin, kültür ortamının bileşimi gibi) 2 </&gt; destek ve ekzokrin pankreas hücreleri 1 için uygun kültür şartları ile içine karmaşıklığı bir ölçüde tanıttı. Birçok yöntem ilk kobay pankreas asinar 3-5, hücrelerin izolasyonu ve kültürü için geliştirilmiştir. Başlangıçta, bu protokoller güçlü mekanik ayrışma ile nihai yalıtımlı, kollajenaz, kimotripsin ve bir proteaz kokteyl ile pankreas doku sindirim çıkıyor. Bu şekilde izole edilmiş pankreas hücreleri, özellikle anormal yapısal ve işlevsel özellikleri, apikal yapıları ve membran reseptörlerine önemli hasar bir kayıp gösterdi. İzole hücreler sadece 1 ya da 2 gün boyunca yaşayabilecek durumda kalır. Hazırlanması asinüs salgı 6-8 cevaben yüzeyi reseptörlerine hasar görmesini sınırlayarak, ve böylece ekzokrin salgılanması iyileştirilmesi, hücre zarı koruyarak, bunların hücre içi ve arası mimari korur dağıldı. Bir resu olarakLT, bu yöntem, in vitro olarak 7-10 gün asinar hücre canlılığı uzanan en önemli avantaj sağlar. Gap junction ile hücre bağlantısı da dahil olmak üzere hücreler arası iletişim, bakımı ekzokrin pankreas asiner hücre fenotip 13 önemli bir belirleyicisi olduğu için Ayrıca, bu yöntem şu anda 9-12 asiner hücre izolasyonu için tercih edilir. Asiner hücreler ve duktal hücrelerine kendi transdiferansiasyon en dediferansiyonunu agresif ekzokrin pankreas kanserleri 14 doğuşu için önerilen mekanizmalardan biri olduğu için, dağınık acini modeli aynı zamanda pankreas plastisite ve sonraki moleküler mekanizmaları incelemek için yeterli bir sistemdir. Ayrıca, genetik olarak değiştirilmiş hayvanların 15,16 kullanımı ve gen transfer tekniklerinin geliştirilmesi (adenoviral 2 veya lentiviral transdüksiyon, nanopartiküller, vb kullanımı), ile birlikte bu vitro birincil asiner hücre modelinde yapabilirsinizçeşitli genetik bozukluklar asiner hücre farklılaşması veya dediferansiyonunu düzenlenmesi etkiler ve pankreatit başlangıcı, prekanseröz lezyonlar, ve hücre plastisite değişiklikler sorumlu moleküler olayların daha iyi anlaşılmasını sağlamak nasıl belirlemede çok yararlı olabilir. Dağınık acini izolasyonu biz kültür pankreas asiner hücrelere Laboratuvarımızda kullandığımız yaklaşımdır. Biz burada açıklamak ve kullanılan yöntemi tartışmak. Bu asiner hücre ayrışma olmadan mekanik bozulmasına birleştiğinde pankreas doku (bir bakteri kollajenazlarla) enzimatik ayrışma içerir. En protokoller süspansiyon veya özel işleme tabi tutulan plastik yüzeylerde ya kültür acini, dahil ederken, uzun süreli hücre kültürü gerekli ise matris iskeleleri üzerine sonradan tohumlama, sadece kısa bir süre (24 saat) süspansiyon bunları büyür. Bu protokol dağınık pankreas ac hızlı izolasyonu (az 1 saat içinde) sağlarini, kültür birden fazla hafta sürdürülebilir. Bu fare pankreası başına en fazla 20 x 10 6 asiner hücrelerin izolasyonu sağlar. Sadeliği mümkün bağımsız paralel olarak 10 gibi pankreaslarında işlemek için yapar. Mevcut diğer tüm ekzokrin pankreas modelleri birçok genetik gösteren pankreas tümörleri türetilen gibi asini içi ve hücreler arası mimari ve böylece izole primer hücrelerin asiner fenotip koruyarak, bu model, transdiferansiasyon mekanizmalarının çalışma için tercih edilen bir sistem oluşturur Değişiklik hücresel dönüşüme yol açar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>0.2 &mu;m filter</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>146560</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>10 ml serological pipettes</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>357551</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>100 &mu;m filter</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1000 &mu;l filter tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>20 &mu;l filter tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-1810</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>200 &mu;l filter tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>25 ml serological pipettes</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>357535</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5 ml serological pipettes</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>50 ml polypropylene tube</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Acetic acid 100%</td>
			<td>VWR BDH Prolabo</td>
			<td>20104.298</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Collagenase IA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2676</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Curved forceps, Dumont #7</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14188</td>
			<td>To sterilize before use</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dissecting scissors, straight</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14393</td>
			<td>To sterilize before use</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Epidermal Growth Factor, human</td>
			<td>Promokine</td>
			<td>C-60180</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethanol absolute (AnalaR Normapur)</td>
			<td>VWR BDH Prolabo</td>
			<td>20821.310</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>14-801F</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Forceps, Dumont #5</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14098</td>
			<td>To sterilize before use</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hank's Balanced Salt Solution 1x </td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025050</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>HEPES 1 M (pH 6.98-7.30)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-737F</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Incubator O2/CO2</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-19M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microbiological Safety Cabinet, level II</td>
			<td>Faster</td>
			<td>SafeFast Elite 212 S</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Noyes scissors, sharp/sharp tips, German</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500228-G</td>
			<td>To sterilize before use</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin mixture</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline 10x </td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200067</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipet-Aid</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>Pipet-Aid XP</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipetman P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipetman P20</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123600</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipetman P200</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Paramount Surgimed Ltd.</td>
			<td>Disposable Scalpel Size 23</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>T25 flask, 25 cm2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707481</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin inhibitor, from Glycine Max</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6522</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Type I collagen</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Waymouth's medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31220-023</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

isolation and culture of mouse primary pancreatic acinar cells

Bu protokol, bu birden fazla olası hafta bunların kültür korumak için yapmak, kemirgen pankreas asinüs hızlı izolasyonu (en az 1 saat olarak) izin verir. En az 20 x 10 6 asiner hücrelerin, tek bir sıçangil pankreasından elde edilebilir. Bu protokol bağımsız paralel 10 gibi pankreaslarında işlemek için imkan sunuyor. Bu asiner mimarisi korur, çünkü bu model de kendi asiner farklılaşma kısmen veya tamamen kaybı ile sonuçlanan birçok genetik değişiklikler görüntülemek pankreas tümörleri, gelen kurulan hücre hatları aksine in vitro pankreas fizyolojisi eğitim için uygundur.

Şekil 1 birincil asiner hücrelerin izolasyonu için &quot;dağınık&quot; acini yöntemi şematize etmektedir. Kesinlikle protokolü esnasında yerine getirilmesi gereken kritik adımlar, tartışma kısmında tarif edilmiştir. Onun çıkarılmasını kolaylaştırmak için, pankreas ekli dalak (Şekil 2) ile birlikte karın tahsil edilmesi gerekir. Her iki ayrı organ kesmek gerekir ve yine de pankreas bağlı olabilir kalıntı yağ dokusu (Basamak 1.6...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells at JoVE.com

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Bu yayında, böylece yalıtma ve sıçangil pankreas kültür birincil pankreatik acinar hücreleri için bir hızlı ve uygun bir prosedürü açıklar. Bu yöntem taze birincil dönüştürülmemiş / Normal ekzokrin pankreas hücrelerinin fizyolojisi incelemek için değerli bir yaklaşım oluşturmaktadır.

Fare Primer Pankreas Asiner Hücreleri İzolasyon ve Kültür

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

isolation-and-culture-of-mouse-primary-pancreatic-acinar-cells

Research

JoVE Journal

Biology

35.4K Görüntüleme.  Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon.  Bu yayında, böylece yalıtma ve sıçangil pankreas kültür birincil pankreatik acinar hücreleri için bir hızlı ve uygun bir prosedürü açıklar. Bu yöntem taze birincil dönüştürülmemiş / Normal ekzokrin pankreas hücrelerinin fizyolojisi incelemek için değerli bir yaklaşım oluşturmaktadır. 

Video: Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

Birincil Fare trofoblast hücreleri ve trofoblast invazyonu Assay İzolasyonu

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Biyoloji

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Sıçan Karaciğer Hücreleri İzolasyon ve İlköğretim Kültür

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work demonstrates how the secretory capacity of these cells can be assessed by culture of isolated acini. The setup is advantageous since isolated acini, which retain many characteristics of the intact exocrine pancreas can be manipulated and monitored more readily than in the whole animal. Proper isolation of pancreatic acini is a key requirement so that the ex&#160;vivo culture will represent the in&#160;vivo nature of the acini. The protocol demonstrates how to isolate intact acini from the mouse pancreas. Subsequently, two complementary methods for evaluating pancreatic secretion are presented. The amylase secretion assay serves as a global measure, while direct imaging of pancreatic secretion allows the characterization of secretion at a sub-cellular resolution. Collectively, the techniques presented here enable a broad spectrum of experiments to study exocrine secretion.

Isolated pancreatic acini retain their in&#160;vivo morphology and activity and offer powerful ways for monitoring and manipulating secretion. This work demonstrates how acini can be isolated from the mouse pancreas, and how their secretory capacities can be assessed.

, Pankreatik acinar hücreleri ve salgı kapasitesinin değerlendirilmesi

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Yenidoğan ve Erişkin Fare Ciltlerindeki Primer Fare Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a suitable organ source. Immune rejection and coagulation are two major hurdles for the success of xenotransplantation. Vascular endothelial cell (EC) injury and dysfunction are important for the development of the inflammation and coagulation responses in xenotransplantation. Thus, isolation of porcine aortic endothelial cells (pAECs) is necessary for investigating the immune rejection and coagulation responses. Here, we have developed a simple enzymatic approach for the isolation, characterization, and expansion of highly purified pAECs from miniature pigs. First, the miniature pig was anaesthetized with ketamine, and a length of aorta was excised. Second, the endothelial surface of aorta was exposed to 0.005% collagenase IV digestive solution for 15 min. Third, the endothelial surface of the aorta was scraped in only one direction with a cell scraper (&#60;10 times), and was not compressed during the process of scraping. Finally, the isolated pAECs of Day 3, and after passage 1 and passage 2, were identified by flow cytometry with an anti-CD31 antibody. The percentages of CD31-positive cells were 97.4% &#177; 1.2%, 94.4% &#177; 1.1%, and 92.4% &#177; 1.7% (mean &#177; SD), respectively. The concentration of Collagenase IV, the digestive time, the direction, and frequency and intensity of scraping are critical for decreasing fibroblast contamination and obtaining high-purity and a large number of ECs. In conclusion, our enzymatic method is a highly-effctive method for isolating ECs from the miniature pig aorta, and the cells can be expanded in vitro to investigate the immune and coagulation responses in xenotransplantation.

An effective enzymatic method for isolation of primary porcine aortic endothelial cells (pAECs) from miniature pigs is described. The isolated primary pAECs can be used to investigate the immune and coagulation response in xenotransplantation.

Minyatür Domuzlardan Birincil Aort Endotel Hücrelerinin İzolasyon ve Kültürü

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

Birincil Fare Retina Pigment Epitel Hücrelerinin Verimli Diseksiyonu ve Kültürü

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

Yetişkin Fare Damak Tadından Birincil Oral Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

Fare primer karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical roles in maintaining the photoreceptors' function. Thus, the RPE structure and function are essential to sustain normal vision. This manuscript presents an established protocol for primary mouse RPE cell isolation. RPE isolation is a great tool to investigate the molecular mechanisms underlying RPE pathology in the different mouse models of ocular disorders. Furthermore, RPE isolation can help in comparing primary mouse RPE cells isolated from wild-type and genetically modified mice, as well as testing drugs that can accelerate the development of therapy for visual disorders. The manuscript presents a step-by-step RPE isolation protocol; the entire procedure, from enucleation to seeding, takes approximately 4 hours. The media shouldn't be changed for 5-7 days after seeding, to allow the growth of the isolated cells without disturbance. This process is followed by the characterization of morphology, pigmentation, and specific markers in the cells via immunofluorescence. Cells can be passaged a maximum of three or four times.

This manuscript describes a simplified protocol for the isolation of retinal pigmented epithelium (RPE) cells from mouse eyes in a stepwise manner. The protocol includes the enucleation and dissection of mouse eyes, followed by the isolation, seeding, and culturing of RPE cells.

Primer Fare Retinal Pigmentli Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...