Michelle Moon (Vanderbilt Üniversitesi) fotoğrafçılık hakkında yardım almak için teşekkür etmek istiyorum. PA ve SSLB Vanderbilt Üniversitesi sağlanan destek DGE-1445197 tarafından desteklenir.

1. bitki kültürü
<ol><li>Tohum ticari herhangi bir satıcıdan satın almanız veya alanında olgun bitkilerden toplamak. Not: Bu protokolü çoğu piyasada bulunan süt kardeş türler (Örneğin, Asclepias incarnata, A. syriaca, A. curassavica, Gomphocarpus physocarpus) için uygundur. Bazı tohum soğuk tabakalı olması gerekebilir ve tohum tedarikçiden talimatları kontrol edilmelidir.</li>
	<li>
İyi bir germinating toprak içinde (% 60-70 iyi torf yosun, perlit, vermikülit, kireçtaşı) bitki tohumları.
	<ol>
<li>Standart fide tepsisi ile çimlenme mix toprak doldurmak; toprak kuyuları üst ulaşır sağlanması. Her şey, toprak hakkında 3 cm derin bir delik oluşturmak için bir girinti olun.</li>
		<li>Öyle ki toprak tohum kapsar ve doymuş bir tohum her delik ve su ile sulama olabilir çok iyi yerleştirin.</li>
		<li>Bir sera içinde tohumları büyümeye (aşağıda, 1.5 koşullara bakınız). Düzenli olarak her gün her diğer-gün için su; makul ses seviyelerinde için toprak nemi korumak için yeterli.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ne zaman fide onların ilk koymak-in tam yapraklar büyüdü, bir genel çömlekçilik içinde yeniden pot fidan (50-%60 torf yosun, ağaç kabuğu ve kireç taşı) mix (Şekil 1A).
	<ol>
<li>Kupası kafesleri ile sıkı bir mühür ile uygun 4-inç yuvarlak tencere kullanın. Jant altında yaklaşık 5 cm kadar genel Çömlekçilik toprak ile doldurun.</li>
		<li>Toprak derin bir delik oluşturmak potun alt ulaşmak yeterli.</li>
		<li>El ile yavaşça onun kuyudan olgun fide kepçe ve yerleştirin delik 4 inç tencerede içten içe. Fide toprak ile kapak. Su çok iyi.</li>
		<li>Bitkiler sera ve su düzenli olarak her gün için her geçen gün büyümek; Orta toprak nemi korumak için yeterli.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sera koşulları.
	<ol>
<li>18-28 ° C ve üreticinin yönergelerini kullanarak 16-22 ° C arasında gece sıcaklıklar arasında gündüz sıcaklığı korumak için sera termostatlar ayarlayın.</li>
		<li>Ne zaman gün kısadır kış aylarında gün ışığı 600 W yüksek basınçlı sodyum ampuller (12 h, 8 am – 20: 00) ile ek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
İstenmeyen zararlıları (Örneğin, thrips, yaprak bitleri) yaprak organik sabun çözüm ile ancak kontrol, bu ürünleri kullanırken dikkatli olun.
	<ol>
<li>Sabun çözüm üreticinin tavsiye göre yapmak ve püskürtülen ilaç şişe kullanarak uygulayın.</li>
		<li>Sabun bitkiler üzerinde 4-24 h. yavaşça durulama için sabun 4-24 h sonrası uygulama kaldırmak ve onlarla durulama su ile bitkiler su laboratuvar yaprak biti kültürlerle kullanmadan ikinci bir saat önce bırakın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kültür en az 3-4 setleri tam yaprak büyüdü ve en az 10 cm boyunda (Şekil 1B) bitkiler üzerinde ortalama yaprak biti nüfus.</li>
</ol>2. yaprak biti kültürler
<ol><li>
Laboratuvar yaprak biti nüfus varolan bir laboratuar isoclonal popülasyon başlatın veya aşağıdaki yönergeleri takip alan toplanan yaprak biti--dan başlamak.
	<ol>
<li>Bir laboratuvar nüfus varolan bir laboratuar isoclonal nüfus başlatırken, yaprak bitleri 2.3.1–2.3.3 içinde açıklandığı gibi aktarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ne zaman yeni isoclonal, alanda toplanan yaprak biti nüfus başlayarak ve bir tek, üreyen, Yetişkin yaprak biti adım 1,6 olarak belirtildiği gibi uygun ana bitki yerleştirin. Not: Nüfus Başlatan üzerinden (gece) kanatlı veya unwinged (apterous) Yetişkin.<ol>
<li>El ile istenmeyen zararlıları önce laboratuvar yaprak bitleri ile kullanmak için sera bitkilerden inceleyin. Herhangi bir bitki istenmeyen yaprak bitleri ile dondur. İsterseniz, bir etanol vakum flask thrips veya diğer zararlıları kaldırmak için kullanın. Not: tedavi edilmiştir bitkiler 1.5.2 adımda anlatıldığı gibi kullanmadan önce sabun ile yıkayın emin olun.</li>
		<li>Bir tek yetişkin yaprak biti bir fırça veya kimliği 3/16" x 1/4" OD plastik boru, 1.000 µL pipet ucu ve 2,00 µL pipet ucu (Şekil 2A) ile oluşturulan bir ağız pipet kullanarak güvenli biçimde aktarma.</li>
		<li>Güvenli bir şekilde bitki yaprak bitleri ile ben, cut off top ile plastik bir kap ile oluşturulan bir fincan kafes iyi bir mesh ile kaplı ve bant ile (Şekil 2B) güvenli kapak.</li>
		<li>Bitkilerin yaprak biti kaynayan bir tepsisine yerleştirin ve kontrollü bir çevre odası (16 L: 8D, 22 ° C, % 70 nem) tutun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hisse senedi nüfusu korumak için taze, yeni bitkiler için haftalık (2.2.1–2.2.3) yaprak bitleri aktarın.
	<ol>
<li>1-3 2nd güvenli biçimde aktarma veya 3rd biçim perileri ve ağzını pipet (Şekil 2A, 3) kullanarak 1 Yetişkin yaşlı yaprak biti. Not: Hisse senetleri unwinged bireyler aktararak en iyi korunur.</li>
		<li>Güvenli bir şekilde yaprak biti musallat bitkiler, cut off top ile plastik bir kap ile oluşturulan bir fincan kafes iyi bir mesh ile kaplı ve bant ile güvenli kapak.</li>
		<li>Bitkiler bir tepsisine yerleştirin ve bir çevre odası (16 L: 8D, 22 ° C, % 70 nem) yaprak bitleri tutun.</li>
		<li>Alternatif olarak, istenen ve ana bitki iyi kalitesi ise, yalnızca bir üreyen yetişkin bırakarak nüfus azaltmak için bir etanol vakum flask kullanıyorsanız ve 2-3 2 veya 3 perileri biçim.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kullanımı için aynı yaş nüfus deneylerde oluşturmak için yeni bir ana bitki üzerine hisse senedi popülasyondan en fazla 5 Yetişkin (tercihen unwinged) yerleştirin.
	<ol>
<li>Yetişkin 24 saat sonra kaldırın.</li>
		<li>F1 çoluk çocuk yetişkinlik için olgunlaştı bir kez yaklaşık 5-7 gün sonra yeni bir ana bitki üzerinde 5 unwinged F1 yetişkin yer. Yetişkin 24 saat sonra kaldırın.</li>
		<li>Bir kez F2 nüfus yetişkinliğe olgunlaştı, bu nüfus deneylerde kullanılmak üzere hazırdır. Not: Bu işlem deneysel Nüfus kabaca aynı yaş ve kabaca aynı yaş anneleri doğarlar sağlanır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Microsatellite Genotipleme (Bölüm 3 & 4 aşağıda açıklanmıştır) kullanarak alan yakaladı isoclonal satırları arasında genotypic farklar onaylayın.</li>
</ol>3. DNA ekstraksiyon
<ol><li>
Hazırlık
	<ol>
<li>1 L lizis arabellek (0.1 M NaCl, 0.2 M sukroz, 0.1 M Tris (pH 9.1), 0,05 M EDTA, % 0.05 SDS) hazırlamak için steril tekniklerini kullanın.</li>
		<li>Isıtma blok sıcak veya su banyosu ile 65 ° c</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Doku homojenizasyon ve lizis
	<ol>
<li>Yaprak biti alt kısmındaki bir steril, 1.5 mL microcentrifuge tüpü yerleştirin.</li>
		<li>Yaprak biti ile tüp steril havaneli yerleştirin ve sıvı azot tüpü dibine sokmak. Not: yaprak biti havaneli ve tüp tarafı arasında konumlandırıldığında en uygun doku parçalanma sonucu elde edilir.</li>
		<li>Yaprak biti başlangıçta hücreleri parçalayıcı için havaneli ile eziyet.</li>
		<li>Bir tek yetişkin yaprak biti için 200 µL lizis arabelleği (2 x 100 µL aliquots split) kullanın. Eziyet ve örnek gözle görülür dağıldı kadar ezilmiş yaprak biti resuspend ilk aliquot ekleyin, sonra ikinci aliquot havaneli yıkamak için kullanın.</li>
		<li>Ezilmiş yaprak biti 30 dk su banyosu veya sıcak bir blok içinde 65 ° C'de lizis arabellekte kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DNA yağış
	<ol>
<li>Tüp sıcakken 8 M KOAc 14 µL ekleyin. Karıştırmak için tüp tersine çevirin. Örnek buz 30 dk için mağaza. Not: Protokol burada duraklatıldı ve örnekleri-20 ° c 24 s kadar saklanabilir.</li>
		<li>13.000 x g 15 dakika oda sıcaklığında, santrifüj kapasitesi. Süpernatant yeni 1,5 mL tüp bir pipet ile aktarın. Herhangi bir pelleted enkaz kaldırmak değil dikkatli olun.</li>
		<li>DNA Pelet görselleştirme geliştirmek 2 µL glikojen (20 µg/mL) süpernatant için ekleyin. Örnek boyutu yeterince büyük ise, bu adımı atlayın.</li>
		<li>Soğuk % 100 moleküler düzeyde etanol 200 µL süpernatant için ekleyin. Mix ve en az 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya tüpler tersine çevirin. Not: Protokol burada duraklatıldı ve örnekleri-20 ° c 24 s kadar saklanabilir.</li>
		<li>13.000 x g 15 dakika oda sıcaklığında, santrifüj kapasitesi. Etanol pipetting tarafından kaldırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DNA yıkama ve elüsyon
	<ol>
<li>Soğuk % 70 moleküler düzeyde etanol 200 µL ekleyin. Sonra resuspend ve Pelet yıkamak için tüp hafifçe vur.</li>
		<li>5 min için 13.000 x g , santrifüj. Pelet görüntülenmesi, süre dikkatle etanol pipetting tarafından kaldırın ve soğuk % 100 moleküler düzeyde etanol 200 µL ekleyin.</li>
		<li>5 min için 13.000 x g , santrifüj. Pelet görüntülenmesi sırasında dikkatli bir şekilde etanol pipetting tarafından çıkarın. Not: Tekrar 100-70-100 etanol yıkama gerekirse.</li>
		<li>Hava Kuru granül için 5-10 dk boru döşeme ile doku kağıt üzerinde yatay olarak açık.</li>
		<li>DNA Pelet düşük TE (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA) 80 µL içinde resuspend.</li>
		<li>Bir spektrofotometre kullanarak resuspended DNA ölçmek.</li>
		<li>4 ° C'de mağaza</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Microsatellite PCR ve sıralamanın yaprak biti Genotipleme için
<ol><li>Microsatellite (Tablo 120) sıralama için uygun F ve R astar sipariş. Not: Geriye doğru astar dizileri microsatellite sıralama için çoğaltılmış örnekler için izin vermek için 5'-6-FAM veya 5'-5-HEX floresan etiketleri ile değiştirilmesi gerekir.</li>
	<li>
PCR tek yaprak biti DNA örnekleri (Bölüm 3'te açıklanan) ve fluorescently etiketli microsatellite astar ile gerçekleştirin.
	<ol>
<li>PCR reaksiyonları üreticinin iletişim kuralı (0.2 µM F/R astar, 2.5 mM MgCl2, 50-200 ng DNA şablon) göre karıştırın.</li>
		<li>Aşağıdaki thermocycler ayarları kullanın: ilk denatürasyon 4 dk, 94 ° C'de 35 94 ° C devredir 30 s, 58 ° C için 35 s, 72 ° C 45 için s ve bir final uzama adım 10 dk 72 ° C'de.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR örnekleri sıralı örneklerin sayısını azaltmak ve genotipleme tesisinde microsatellite örnekleri sıra farklı floresan etiketlerle birleştirmek.</li>
	<li>Microsatellite analiz yazılımı kullanarak .fsa ham örnek dosyaları analiz.</li>
</ol>5. RNA çıkarma
<ol><li>Yaprak bitleri örnekleri 1,5 ml RNase RNA çıkarılması için toplamak / DNaz ücretsiz tüpler ve sıvı azot hemen donma. Not: aşağıdaki adımları hemen gerçekleştirilmez, örnekleri-80 ° C'de saklanabilir</li>
	<li>
Doku homojenizasyon
	<ol>
<li>Yaprak biti ile tüp steril havaneli ile sıvı azot örnek dur cızırtılı kadar 10-15 saniye, dondur. Yaprak biti de havaneli ile 3.2 adımda anlatıldığı gibi ezmek. Not: yaprak biti havaneli ve tüp tarafı arasında konumlandırıldığında en uygun doku parçalanma sonucu elde edilir.</li>
		<li>Duman başlık, guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform ayıklama reaktif 800 µL örnek (1 – 5 Yetişkin yaprak biti) ekleyin. Örnekleri havaneli ve havaneli atmayın lunaparkçı.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Faz ayrımı Not: Tüm adımları bir duman mahallede gerçekleştirilmesi gerekiyor.<ol>
<li>Homojenize örnekleri, oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Kloroform 160 µL örneğine ekleyin. Shake şiddetle elle 15 s.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 2-3 dakika için kuluçkaya. Santrifüj, 12.000 x g 4 ° C'de 15 dakika Not: Santrifüjü, karışım ayıran 3 katmanlara: alt, kırmızı fenol kloroform faz, bir interfaz ve renksiz bir üst sulu faz. RNA sulu aşamasında sadece kalır. Sulu hacmi ~ 480 µL olacak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA yağış
	<ol>
<li>Bir duman başlık, sulu faz için taze, RNase free tube aktarın. Ara faz rahatsız etmeyin.</li>
		<li>RNA isopropanol 400 µL ekleyerek çökelti ve örnek-20 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya. Not: Protokol burada duraklatıldı ve örnekleri-20 ° c 24 s kadar saklanabilir.</li>
		<li>Örnek için 12.000 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA yıkama ve elüsyon
	<ol>
<li>Süpernatant kaldır; RNA Pelet gözlemek.</li>
		<li>RNA pelet 1 mL % 75 etanol DEPC tedavi su ile yıkayın. Tarafından yavaş vortexing karıştırın. Santrifüj 7,500 x g 4 ° C'de, 5 min için</li>
		<li>Adımları 5.5.1–5.5.2 fenol kirletici kaldırmak için yineleyin.</li>
		<li>Süpernatant kaldırmak ve hava kuru Pelet 5-10 dk boru döşeme ile steril bir bankta yatay olarak açık. Tamamen kurumasını RNA Pelet izin vermeyin.</li>
		<li>RNA Pelet 30 µL RNase free veya DEPC tedavi su içinde çözülür. Yavaşça yukarı ve aşağı karıştırmak için pipet. 55-60 ° C'de 10-15 dk için kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. RNAseq De Novo Transcriptome derleme, ek açıklama ve fark ifade Analizi
<ol><li>
RNA örnek konsantrasyon ve Kapiler elektroforetik sistem çip tabanlı kullanarak kalitesini analiz. Not: Tercih yönteminin seçimi RNA konsantrasyon ve kalite daha doğru ve hassas bir ölçüsü sağlar çünkü bir Spektrofotometre ile analiz daha bir kapiler Elektroforez çip tabanlı sistemdir.<ol>
<li>Uygun kalitesini (≥ 250 ng, toplam RIN (RNA bütünlük numarası) ≥ 5) olduğu, RNA sıralama gerçekleştirin. Not: Bu sıralama veri-ecek var olmak kullanılmış her iki ifade profil oluşturma ve de novo transcriptome derlemesi için çünkü önemlisi, derinlik içinde daha yüksek bir kalite transcriptome neden olur devamı. Illumina sıralaması teknolojisiyle, 100-200 milyon 100 bp, oldukça kapsamlı bir derleme için eşleştirilmiş son okuma önerilen bir başlangıç noktası olur. Toplam mRNA Kütüphane hazırlık ve RNA sıralama sıralama aracı tarafından yapıldı.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hızlı QC22kullanarak okuma kalitesini kontrol edin.</li>
	<li>Tüm örnek okuma birleştirmek ve Trinity23,24 (Trimmomatic kalitesi etkin filtreleme) kullanarak transcriptome de novo araya.</li>
	<li>
Derleme rafine
	<ol>
<li>Transdecoder25 en az 100 amino asit uzunluğunda açık okuma çerçevesi (ORFs) tanımlamak için kullanın.</li>
		<li>Pfam26 ve BLASTP28 ve HMMER29, sırasıyla kullanarak UniProt27 veritabanları karşı çevrilen ORFs arar Homoloji gerçekleştirin.</li>
		<li>Bakteriyel transkript (bakteriyel bir gen 300'ün üzerinde bir bit puan ve en az amino asit dizisi kimlik % 50 ile çevrilmiş herhangi bir sıra olan en iyi patlama vurmak oldu) kaldırın.</li>
		<li>En az % 99 özdeş, CD-HIT30kullanılarak amino asit düzeyinde olan eksiksiz, tercüme ORFs daraltın.</li>
		<li>En az % 95 aynı CD-HIT30kullanarak nükleotit düzeyinde kalan, eksik ORFs daraltın.</li>
		<li>Kalan nükleotit dizileri ile benzersiz, species-specific tanımlayıcıları (Örneğin, APHNE 0001) atayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>BUSCO (http://busco.ezlab.org/) ve Arthropoda gen veri kümesi31kullanarak rafine derleme completeness değerlendirmek.</li>
	<li>
Transcriptome ek açıklama
	<ol>
<li>İlk olarak, HMMER karşı Pfam veritabanı26,29kullanarak rafine transcriptome açıklama ekleyin.</li>
		<li>İkinci olarak, BLASTP karşı UniProt veritabanı27,28kullanarak transcriptome açıklama ekleyin.</li>
		<li>Üçüncü olarak, seçili böcekler yayımlanmış, ek açıklama eklenen genleri ile kodlama dizisi karşı BLASTP kullanarak transcriptome açıklama ekleyin.</li>
		<li>Son, bezelye yaprak biti protein yalnızca veritabanı karşı BLASTP kullanarak transcriptome açıklama ekleyin.</li>
		<li>Trinotate UniProt katılımların git ek açıklamaları oluşturmak için kullanın.</li>
		<li>SQLite veritabanına tüm ek açıklama sonuçlarını düzenlemek ve bir ek açıklama raporu oluşturmak için Trinotate kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fark ifade Analizi Not: rafine transcriptome referans olarak kullanarak, hizalama ve ayrı ayrı her kitaplık ölçmek.<ol>
<li>Kullanım Trimmomatic kalite-filtre ve trim için orijinal dosyalar32okuyun. Not: Trinity derleme sonra bu adımı gerçekleştirmek gerekiyorsa, bir o adımı Trimmomatic çıktısı kullanın.</li>
		<li>Yerel hizalamaları Bowtie233kullanarak her örnek için gerçekleştirin.</li>
		<li>Okuma sayıları kullanarak tek tek SAMtools34her örnekten ayıklayın.</li>
		<li>Örnek ilgi DESeq2 varsayılan parametreleriyle kullanma arasındaki fark ifade hesaplamak ve parametrik bir35uygun.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. qPCR doğrulama Differentially ifade gen
Not: kullanıcılar kendi RNAseq deneyler differentially ifade genler ilgileniyorsanız aşağıdaki protokol desenleri farklı ifade doğrulamak için kullanılabilir.
<ol><li>RNA örnekleri (5 adım) açıklandığı gibi oluşturun.</li>
	<li>RNA çekimi için kalite kontrol ve konsantrasyonu elde etmek için bir spektrofotometre kullanarak quantitate.</li>
	<li>Üreticinin tavsiye başı olarak piyasada bulunan bir seti kullanarak cDNA örnekleri sentez.</li>
	<li>
Genler doğru iki kat PCR güçlendirme sağlamak ilgi için astar verimliliği belirlemek.
	<ol>
<li>Özgün RNA konsantrasyonları üzerinde bağlı olarak, seri dilutions gerçekleştirmek (101) 3 cDNA konsantrasyonları elde etmek için.</li>
		<li>Kantitatif PCR ana karışımını kullanarak, mix onaylatılacak qPCR tepkiler göre üç astar konsantrasyonları üreticinin iletişim kuralı'nı (Örneğin, 100 nM, 200 nM, 300 nM) ile üç seri olarak seyreltilmiş cDNA konsantrasyonları (Örneğin, 0.1 ng/µL, 10 NG/µL, 100 ng/µL).</li>
		<li>Her hedef gen için Ortalama Ct değerlerini her örnek için bağımlı değişkenler ve günlük (cDNA konsantrasyon) bağımsız değişkenler (üç puan toplam) olarak kullanılarak oluşturulan çizgisinin eğimini (m) hesaplar.</li>
		<li>Burada m 7.4.3 içinde hesaplanan yamaç ise astar verimliliği (E) hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın: E 10^(-1/m) = Not: Astar verimliliği % 90-110 arasında analizleri için uygundur. Bu işlem tüm genler hesaplamalara dahil eşit amplifikasyon sağlar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Faiz36genler için ifade fark ölçmek için bir temizlik gen ile ΔΔCt yöntemini kullanın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brisson, J. A., Stern, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pea+aphid,+Acyrthosiphon+pisum.:+an+emerging+genomic+model+system+for+ecological,+developmental+and+evolutionary+studies.">The pea aphid, Acyrthosiphon pisum.: an emerging genomic model system for ecological, developmental and evolutionary studies.</a> BioEssays. 28, 747-755 (2006).</li><li>Dixon, A. F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Aphid Ecology: An Optimization Approach. , (1985).</li><li>Consortium, T. I. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Sequence+of+the+Pea+Aphid+Acyrthosiphon+pisum.">Genome Sequence of the Pea Aphid Acyrthosiphon pisum.</a> PLoS Biology. , 1000313 (2010).</li><li>Srinivasan, D. G., Brisson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aphids:+A+Model+for+Polyphenism+and+Epigenetics.">Aphids: A Model for Polyphenism and Epigenetics.</a> Genetics Research International. 2012, 1-12 (2012).</li><li>Wenger, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+genome+sequence+of+the+soybean+aphid,+Aphis+glycines.">Whole genome sequence of the soybean aphid, Aphis glycines.</a> Insect Biochememistry and Molecular Biology. , 1-10 (2017).</li><li>Li, Z. -. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+adaption+analysis+of+the+cotton+aphid+(Aphis+gossypii)+in+different+phenotypes+by+transcriptome+comparison.">Ecological adaption analysis of the cotton aphid (Aphis gossypii) in different phenotypes by transcriptome comparison.</a> PLoS ONE. 8, 83180 (2013).</li><li>Wang, D., Liu, Q., Jones, H. D., Bruce, T., Xia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transcriptomic+analyses+revealed+divergences+of+two+agriculturally+important+aphid+species.">Comparative transcriptomic analyses revealed divergences of two agriculturally important aphid species.</a> BMC Genomics. 15 (1), 1023-1024 (2014).</li><li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+characterization+of+the+pine+aphid+Cinara+pinitabulaeformis+Zhang+et+Zhang+transcriptome+and+analysis+of+genes+relevant+to+pesticides.">De novo characterization of the pine aphid Cinara pinitabulaeformis Zhang et Zhang transcriptome and analysis of genes relevant to pesticides.</a> PLoS ONE. 12, 0178496-0178517 (2017).</li><li>Birnbaum, S. S. L., Rinker, D. C., Gerardo, N. M., Abbot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profile+and+differential+fitness+in+a+specialist+milkweed+insect+across+host+plants+varying+in+toxicity.">Transcriptional profile and differential fitness in a specialist milkweed insect across host plants varying in toxicity.</a> Molecular Ecology. , (2017).</li><li>Dixon, A. F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect Herbivore-Host Dynamics. , (2005).</li><li>Goggin, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-aphid+interactions:+molecular+and+ecological+perspectives.">Plant-aphid interactions: molecular and ecological perspectives.</a> Current Opinion in Plant Biology. 10, 399-408 (2007).</li><li>Will, T., Furch, A., Zimmermann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+phloem-feeding+insects+face+the+challenge+of+phloem-located+defenses.">How phloem-feeding insects face the challenge of phloem-located defenses.</a> Frontiers in Plant Science. 4, 1-12 (2013).</li><li>Webster, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+olfaction+in+aphid+host+location.">The role of olfaction in aphid host location.</a> Physiological Entomology. 37, 10-18 (2012).</li><li>Agrawal, A. A., Petschenka, G., Bingham, R. A., Weber, M. G., Rasmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+cardenolides:+chemical+ecology+and+coevolution+of+specialized+plant-herbivore+interactions.">Toxic cardenolides: chemical ecology and coevolution of specialized plant-herbivore interactions.</a> New Phytologist. 194, 28-45 (2012).</li><li>Dobler, S., Petschenka, G., Pankoke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coping+with+toxic+plant+compounds-+the+insect's+perspective+on+iridoid+glycosides+and+cardenolides.">Coping with toxic plant compounds- the insect's perspective on iridoid glycosides and cardenolides.</a> Phytochemistry. 72, 1593-1604 (2011).</li><li>Opitz, S. E. W., M&#252;ller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+chemistry+and+insect+sequestration.">Plant chemistry and insect sequestration.</a> Chemoecology. 19, 117-154 (2009).</li><li>Birnbaum, S. S. L., Abbot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+adaptations+toward+plant+toxins+in+milkweed-herbivores+systems+-+a+review.">Insect adaptations toward plant toxins in milkweed-herbivores systems - a review.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 58, 579-610 (2018).</li><li>Rothschild, M., von Euw, J., Reichstein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+glycosides+in+the+oleander+aphid,+Aphis+nerii.">Cardiac glycosides in the oleander aphid, Aphis nerii.</a> Journal of Insect Physiology. 16, 1141-1145 (1970).</li><li>Harrison, J. S., Mondor, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+invasive+aphid+'superclone':+extremely+low+genetic+diversity+in+oleander+aphid+(Aphis+nerii)+populations+in+the+southern+United+States.">Evidence for an invasive aphid 'superclone': extremely low genetic diversity in oleander aphid (Aphis nerii) populations in the southern United States.</a> PLoS ONE. 6, 17524 (2011).</li><li>Mooney, K. A., Halitschke, R., Kessler, A., Agrawal, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+trade-offs+in+plants+mediate+the+strength+of+trophic+cascades.">Evolutionary trade-offs in plants mediate the strength of trophic cascades.</a> Science. 327, 1642-1644 (2010).</li><li>Grabherr, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+transcriptome+assembly+from+RNA-Seq+data+without+a+reference+genome.">Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome.</a> Nature Biotechnology. 29, 644-652 (2011).</li><li>Haas, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+transcript+sequence+reconstruction+from+RNA-seq+using+the+Trinity+platform+for+reference+generation+and+analysis.">De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis.</a> Nature Protocols. 8, 1494-1512 (2013).</li><li>Finn, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pfam+protein+families+database:+towards+a+more+sustainable+future.">The Pfam protein families database: towards a more sustainable future.</a> Nucleic Acids Research. 44, 279-285 (2016).</li><li>The UniProt Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UniProt:+the+universal+protein+knowledgebase.">UniProt: the universal protein knowledgebase.</a> Nucleic Acids Research. 45, 158-169 (2017).</li><li>Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NCBI+BLAST:+a+better+web+interface.">NCBI BLAST: a better web interface.</a> Nucleic Acids Research. 1 (36), 5-9 (2008).</li><li>Fu, L., Niu, B., Zhu, Z., Wu, S., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD-HIT:+accelerated+for+clustering+the+next+generation+sequencing+data.">CD-HIT: accelerated for clustering the next generation sequencing data.</a> Bioinformatics. 28 (23), 3150-3152 (2012).</li><li>Sim&#227;o, F. A., Waterhouse, R. M., Ioannidis, P., Kriventseva, E. V., Zdobnov, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BUSCO:+assessing+genome+assembly+and+annotation+completeness+with+single-copy+orthologs.">BUSCO: assessing genome assembly and annotation completeness with single-copy orthologs.</a> Bioinformatics. 31, 3210-3212 (2015).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9, 357-359 (2012).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15, 31 (2014).</li><li>Rieu, I., Powers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantitative+RT-PCR:+design,+calculations,+and+statistics.">Real-time quantitative RT-PCR: design, calculations, and statistics.</a> Plant Cell. 21, 1031-1033 (2009).</li><li>Malcolm, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+defence+in+chewing+and+sucking+insect+herbivores:+plant-derived+cardenolides+in+the+monarch+butterfly+and+oleander+aphid.">Chemical defence in chewing and sucking insect herbivores: plant-derived cardenolides in the monarch butterfly and oleander aphid.</a> Chemoecology. 1, 12-21 (1990).</li><li>Agrawal, A. A., Underwood, N., Stinchcombe, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraspecific+variation+in+the+strength+of+density+dependence+in+aphid+populations.">Intraspecific variation in the strength of density dependence in aphid populations.</a> Ecological Entomology. 29, 521-526 (2004).</li><li>Zehnder, C. B., Hunter, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+maternal+effects+and+current+environment+on+vital+rates+of+Aphis+nerii,+the+milkweed-oleander+aphid.">A comparison of maternal effects and current environment on vital rates of Aphis nerii, the milkweed-oleander aphid.</a> Ecological Entomology. 32, 172-180 (2007).</li><li>Hartbauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+defense+of+Aphis+nerii+and+Uroleucon+hypochoeridis+(Homoptera,+Aphididae)+against+natural+enemies.">Collective defense of Aphis nerii and Uroleucon hypochoeridis (Homoptera, Aphididae) against natural enemies.</a> PLoS ONE. 5, 10417 (2010).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu uzun aposematic A. nerii desen ve bitki savunma ve özellikle kimyasal haciz18,37direnç mekanizmaları sağlayabilir tanınmış oldu. Genomik kaynak A. nerii10 A. nerii bir model olarak kullanmak ekolojik ve fonksiyonel genomik çalışmalar için yeni fırsatlar sunan, son zamanlarda ortaya çıkmıştır. Yaprak biti ve bitki kültürü ve bu türler üzerinde yapılacak çalışmalar muhtemelen genomik ve...

Yaprak biti dünya çapında çeşitli bitki aileler kolonize küçük, hemimetabolous böcekler var. Özellikle onların karmaşık döngüsel eşeysiz üreme ve ayrı polyphenisms ve onların zorunlu beslenme symbioses eksik besin kaynağı bakteriyel veya Maya endosymbionts ile ilgili ömürleri en çeşitli özellikler için kendine özgü onların yiyecek bitki sap1. Çoğu yaprak biti ana bitki uzmanları olmakla birlikte, bazı kültürlü türler önemli ürün zararlıları inflicting önemli ekonomik zarar bitkileri de bir doğrudan, ya da patojenler ve virüs yolu ile2vektör. Böceğin ilgili adresleme sorular için genomik kaynakları sağlanan çünkü ilk yaprak biti genom bezelye yaprak biti Acyrthosiphon pisum3, 2010, yılında yayınlanması yaprak biti biyoloji çalışma önemli bir kilometre taşı olarak işaretlenmiş uyarlamalar otçul tarzları bir daha iyi kontrol stratejileri4' e neden olabilir de dahil olmak üzere için. O zamandan beri ek genomik kaynaklar yayın halka açık tüm genom kaynak için başka bir üç yaprak biti türler (Myzus ve soya yaprak biti Aphis glycines5için bir ek açıklama eklenen genom birikmiş var Cerasi (siyah kiraz yaprak biti), Myzus persicae (şeftali-patates yaprak biti), Rhopalosiphum PADI (kuş kiraz-yulaf yaprak biti)6. Değerli de novo transcriptomic kaynakları birkaç diğer yaprak biti türler için de mevcuttur (e.g.,Aphis gossypii (pamuk yaprak biti)7, Sitobion avenae (tahıl yaprak biti)8, Cinara pinitabulaeformis (çam yaprak biti)9, Aphis nerii (süt kardeş-zakkum yaprak biti)10).
Yaprak biti da bitkiler11tarihinde bitki böcek etkileşimleri ve hayatı ekolojisi anlayışımız kalıcı katkılarda yaptık. Bir alan nerede yaprak biti özellikle önemli katkılar yapmış anlayışımız ana bitki etkileşimleri Kimya ekolojisi olduğunu. Üstesinden bitki savunma ve bazı bile bitki savunma kendi için Co-e yeğlemek için otçul böceklerin ifade çeşitli uyarlamalar12,13,14yarar. Örneğin, süt kardeş-zakkum yaprak biti, Aphis nerii, bu süt kardeş Aile (Apocynaceae) bitkiler üzerinde colonizes ılıman ve tropikal bölgeler içinde dünya çapında bulundu bir parlak sarı, invaziv yaprak biti olur. Apocynaceae ailesindeki santralleri sütlü lateks ve kardiyak glikosidler katyon taşıyıcı Na, K-ATPaz bağlamak ve etkili caydırmak için kültürlü otobur15, cardenolides bilinen dahil olmak üzere çeşitli kimyasal savunma geliştiğini 16. süt kardeş uzmanları cardenolides direnç çeşitli modları hızlı ve bazı seçerek veya pasif birikir veya değiştirmek onların dokularda cardenolides avlanma caydırmak için bir araç olarak veya diğer yararları17. Her ne kadar işlevsel faydaları ve mekanizmaları belirsiz10,18kalır A. nerii cardenolides bu şekilde çekilmek düşünülmektedir.
Genomik kaynakları el altında göz önüne alındığında, A. nerii mükemmel deneysel modeli moleküler ve genetik mekanizmaları toksik ana bitkiler ve onların uzman arasında kemoterapi ekolojik etkileşimleri dahil incelenmesi için otobur sağlar. Cardenolides19, tutma o zamandan beri üzerinde duruldu A. nerii en erken çalışmaların bazıları ise A. nerii çalışmaların geniş bir dizi evrimsel ve ekolojik soru anlayışlar hazırladık, fazlalaştı, invaziv böcekler20 ve otobur yoğunluğu21alttan üste ve üstten alta regülasyonu arasındaki etkileşimi genetik yapısı dahil olmak üzere. A. nerii böylece böcek-bitki etkileşimleri çalışmaların özellikle geniş bir dizi için deneysel bir model olarak iyi bir aday var. A. nerii ile herhangi bir çalışma başarısı için yaprak biti dikkatli kültürü kültür yaprak biti bağlı hangi bitkilerin içeren nüfus, hem de yüksek kalite - omic verileri verimli bir nesil çok önemlidir. Amacımız okuyucu iki rehber olmaktır. Aşağıda özetlenen üretimi ve sera ve laboratuvar, DNA ve RNA çekimi, microsatellite analiz, de novo transcriptome montaj ve ek açıklama, transcriptome bitki ve yaprak biti kültürler için yöntem vardır fark ifade analizi ve qPCR doğrulanması differentially genler dile getirdi. Süre bu yöntemler yazılı A. nerii, genel kültür, ayıklama için ve analiz yöntemleri yaprak biti türlerin çeşitli için genişletebilirsiniz.

<table><tbody><tr><td>Sun Gro Fafard Germination Mix</td><td>Hummert International</td><td>10-0952-2</td><td></td></tr><tr><td>Sun Gro Fafard 3B/ Metro Mix</td><td>Hummert International</td><td>10-0951-2</td><td></td></tr><tr><td>2&quot; x 4&quot; Round Standard Pot</td><td>Anderson Pots</td><td>1503</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq DNA Polymerase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EP0701</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript&amp;reg; III First-Strand Synthesis kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4367659</td><td></td></tr></tbody></table>

maintaining biological cultures and measuring gene expression in aphis nerii: a non-model system for plant-insect interactions

Yaprak biti biyolojik soru onların ana tesisleri ile böceğin etkileşimleri çevreleyen sorulara symbioses evrimi ve polyphenisms gelişimi arasında değişen çeşitli için mükemmel deneysel modellerdir. Genomik kaynaklar birkaç yaprak biti türler için kullanılabilir ve yeni nesil nasıl yapılacağını gelişmeler ile transcriptomic çalışmalar genleri eksikliği olmayan model organizmalar için genişletilmiş. Ayrıca, yaprak biti kültür alanında toplanan ve kullanılmak üzere ekolojik ve genetik çalışmalar arasında köprü organizmalar ve moleküler deneyler laboratuvarda yetiştirilen. Son olarak, pek çok yaprak biti onların tercih edilen ana bitkiler üzerinde laboratuvarda sürekli, parthenogenic genotip eşeysiz üreyen karşılaştırmaların yapılmasına olanak ömürleri içinde muhafaza edilebilir. Aphis nerii, süt kardeş-zakkum yaprak biti, böyle bir model organizma ve moleküler deneyler kullanarak zehirli bitkiler ile böcek etkileşimleri çalışmaya sağlar. Yöntemleri üretimi ve sera ve laboratuvar, DNA ve RNA çekimi, microsatellite analiz, de novo transcriptome montaj ve ek açıklama, transcriptome fark ifade bitki ve yaprak biti kültürler için analiz ve qPCR doğrulama differentially ifade genlerin özetlenen ve burada tartışılan.

Bitki kültürler: Tohum mevsime bağlı olarak yaklaşık 2-4 hafta sürer, büyük büyümeye olacak kadar (Şekil 1A) yeniden saksı. Yeniden saksı fidan yaprak biti kültürler (Şekil 1B) için en uygun bir boyuta büyümek için başka bir 2-4 hafta sürer.
Yaprak biti kültürler: Yetişkin ...

Watch this Scientific Journal Video about Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions at JoVE.com

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

Yaprak biti Aphis nerii son derece savundu bitkilerde dogbane aile (Apocyanaceae) üzerinde colonizes ve bitki böcek etkileşimleri eğitim için sayısız fırsat sağlar. Burada, kültür ve üretimi ve moleküler Analizi bir dizi protokol bitki ve yaprak biti bakımı için mevcut ve A. neriiiçin - omic veri.

Biyolojik kültür ve gen ifadesinde ölçme Aphis neriiBakımı: bitki böcek etkileşimleri için bir sigara-model sistemi

Aphids are excellent experimental models for a variety of biological questions ranging from the evolution of symbioses and the development of polyphenisms ...

maintaining-biological-cultures-measuring-gene-expression-aphis-nerii

Research

JoVE Journal

Genetics

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

7.5K Görüntüleme.  Vanderbilt University. Yaprak biti Aphis nerii son derece savundu bitkilerde dogbane aile (Apocyanaceae) üzerinde colonizes ve bitki böcek etkileşimleri eğitim için sayısız fırsat sağlar. Burada, kültür ve üretimi ve moleküler Analizi bir dizi protokol bitki ve yaprak biti bakımı için mevcut ve A. neriiiçin - omic veri.

Video: Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Dünya Tarım Pest Böcek Embriyo Mikroenjeksiyon yoluyla Nükleik Asitler teslim edilmesi,<em&gt; Ceratitis capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Genetik

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental studies. Like other aphids, A. pisum propagate rapidly via parthenogenetic viviparous reproduction, where the embryos develop within egg chambers in an assembly-line fashion in the ovariole. Previously we have established a robust platform of whole-mount in situ hybridization allowing detection of mRNA expression in the aphid embryos. For analyzing the expression of protein, though, established protocols for immunostaining the ovarioles of asexual viviparous aphids did not produce satisfactory results. Here we report conditions optimized for increasing tissue permeability and decreasing background staining, both of which were problems when applying established approaches. Optimizations include: (1) incubation of proteinase K (1 &#181;g/ml, 10 min), which was found essential for antibody penetration in mid- and late-stage aphid embryos; (2) replacement of normal goat serum/bovine serum albumin with a blocking reagent supplied by a Digoxigenin (DIG)-based buffer set and (3) application of methanol rather hydrogen peroxide (H2O2) for bleaching endogenous peroxidase; which significantly reduced the background staining in the aphid tissues. These critical conditions optimized for immunostaining will allow effective detection of gene products in the embryos of A. pisum and other aphids.

A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.

Bezelye Afit Embriyolar immün için kritik Koşulların Belirlenmesi: Doku geçirgenliğini arttırarak ve Arka Plan Boyama azaltılması

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

Gelişim Biyolojisi

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and tomato. The susceptibility of M. sexta larvae to a variety of entomopathogenic bacterial species1-5, as well as the wealth of information available regarding the insect's immune system6-8, and the pending genome sequence9 make it a good model organism for use in studying host-microbe interactions during pathogenesis. In addition, M. sexta larvae are relatively large and easy to manipulate and maintain in the laboratory relative to other susceptible insect species. Their large size also facilitates efficient tissue/hemolymph extraction for analysis of the host response to infection.
The method presented here describes the direct injection of bacteria into the hemocoel (blood cavity) of M. sexta larvae. This approach can be used to analyze and compare the virulence characteristics of various bacterial species, strains, or mutants by simply monitoring the time to insect death after injection. This method was developed to study the pathogenicity of Xenorhabdus and Photorhabdus species, which typically associate with nematode vectors as a means to gain entry into the insect. Entomopathogenic nematodes typically infect larvae via natural digestive or respiratory openings, and release their symbiotic bacterial contents into the insect hemolymph (blood) shortly thereafter10. The injection method described here bypasses the need for a nematode vector, thus uncoupling the effects of bacteria and nematode on the insect. This method allows for accurate enumeration of infectious material (cells or protein) within the inoculum, which is not possible using other existing methods for analyzing entomopathogenesis, including nicking11 and oral toxicity assays12. Also, oral toxicity assays address the virulence of secreted toxins introduced into the digestive system of larvae, whereas the direct injection method addresses the virulence of whole-cell inocula.
The utility of the direct injection method as described here is to analyze bacterial pathogenesis by monitoring insect mortality. However, this method can easily be expanded for use in studying the effects of infection on the M. sexta immune system. The insect responds to infection via both humoral and cellular responses. The humoral response includes recognition of bacterial-associated patterns and subsequent production of various antimicrobial peptides7; the expression of genes encoding these peptides can be monitored subsequent to direct infection via RNA extraction and quantitative PCR13. The cellular response to infection involves nodulation, encapsulation, and phagocytosis of infectious agents by hemocytes6. To analyze these responses, injected insects can be dissected and visualized by microscopy13, 14.

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

The method described here utilizes direct injection of entomopathogenic bacteria into the hemocoel of Manduca sexta insect larvae. M. sexta is a commercially available and well-studied insect. Thus, this method represents a simple approach to analyzing host-bacterial interactions from the perspective of one or both partners.

Ve Yetiştirme ve Enjeksiyon<em&gt; Manduca Sexta</emBakteriyel virülans Değerlendirememesi&gt; Larva

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Mass-Rearing and Molecular Studies in Tortricidae Pest Insects

Tortricidae (Lepidoptera), commonly known as tortrix or leafroller moths, comprises many agricultural and forestry pests, which cause serious agricultural losses. To understand the biology of such pest moths, fundamental techniques have been in high demand. Here, methods for mass-rearing, observations, and molecular studies are developed using two tea tortrix, Homona magnanima and Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae). Insects were mass-reared with sliced artificial diet and maintained by inbreeding for over 100 generations by considering their biological characteristics. Insects have various sex dimorphisms; hence it is difficult to distinguish the sex during the developing stages, which have prevented subsequent assays. The present work highlighted that the sex of tortricids larvae could be determined by observing testes or lactic-acetic orcein staining to visualize the female-specific W chromosome. Moreover, using the sex determination methods, the present study enabled nucleic acid extractions from sex determined embryos and application toward high throughput sequencing. These tips are applicable for other pest insects and will facilitate further morphological and genetic studies.

The present protocol describes the rearing method of tortricid pest insects in the laboratories. The procedures to distinguish insects' sex and extract nucleic acids for high throughput sequencing are established using two tortricid pests.

Tortricidae Zararlı Böceklerinde Kütle Yetiştirme ve Moleküler Çalışmalar

Tortricidae (Lepidoptera), commonly known as tortrix or leafroller moths, comprises many agricultural and forestry pests, which cause serious agricultural ...

Çevre

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera)

This video demonstrates novel techniques of RNA interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees using double-stranded RNA (dsRNA) injections. It also presents a protocol of proboscis extension response (PER) assay for measuring gustatory perception.	
	RNAi-mediated gene knockdown is an effective technique downregulating target gene expression. This technique is usually used for single gene manipulation, but it has limitations to detect interactions and joint effects between genes. In the first part of this video, we present two strategies to simultaneously knock down two genes (called double gene knockdown). We show both strategies are able to effectively suppress two genes, vitellogenin (vg) and ultraspiracle (usp), which are in a regulatory feedback loop. This double gene knockdown approach can be used to dissect interrelationships between genes and can be readily applied in different insect species.	
	The second part of this video is a demonstration of proboscis extension response (PER) assay in honey bees after the treatment of double gene knockdown. The PER assay is a standard test for measuring gustatory perception in honey bees, which is a key predictor for how fast a honey bee's behavioral maturation is. Greater gustatory perception of nest bees indicates increased behavioral development which is often associated with an earlier age at onset of foraging and foraging specialization in pollen. In addition, PER assay can be applied to identify metabolic states of satiation or hunger in honey bees. Finally, PER assay combined with pairing different odor stimuli for conditioning the bees is also widely used for learning and memory studies in honey bees.

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees Apis mellifera

In this protocol, we describe two strategies that simultaneously suppress two genes (double gene knockdown) in honey bees. Then we present how to use the proboscis extension response (PER) assay to study the effect of double gene knockdown on honey bee gustatory perception.

Bal Arısı RNAi-aracılı Çift Gen demonte ve tat Algı Ölçüm (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

This video demonstrates novel techniques of RNA  interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees  using double-stranded RNA ...

Nörobilim

Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic of their life cycle is the mutualistic association with the bacteria Photorhabdus and Xenorhabdus, respectively. The nematode parasites are able to locate and enter suitable insect hosts, subvert the insect immune response, and multiply efficiently to produce the next generation that will actively hunt new insect prey to infect. Due to the properties of their life cycle, entomopathogenic nematodes are popular biological control agents, which are used in combination with insecticides to control destructive agricultural insect pests. Simultaneously, these parasitic nematodes represent a research tool to analyze nematode pathogenicity and host anti-nematode responses. This research is aided by the recent development of genetic techniques and transcriptomic approaches for understanding the role of nematode secreted molecules during infection. Here, a detailed protocol on maintaining entomopathogenic nematodes and using a gene knockdown procedure is provided. These methodologies further promote the functional characterization of entomopathogenic nematode infection factors.

Entomopathogenic nematodes live in symbiosis with bacteria and together they successfully infect insects by undermining their innate immune system. To promote research on the genetic basis of nematode infection, methods for maintaining and genetically manipulating entomopathogenic nematodes are described.

Entomopatojenik Nematodların Kültürlenmesi ve Genetik Olarak Manipüle Edilmesi

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and the determination of the biochemical function of proteins at the sub-organismal level. Although baculovirus expression systems are increasingly used for protein production in numerous biotechnological, pharmaceutical, and industrial applications, nonlytic systems that do not involve viral infection have clear benefits but are often overlooked and underutilized. Here, we describe a method for generating nonlytic expression vectors and transient recombinant protein expression. This protocol allows for the efficient cellular localization of recombinant proteins and can be used to rapidly discern protein trafficking within the cell. We show the expression of four&#160;recombinant proteins in a commercially available insect cell line, including two aquaporin proteins from the insect Bemisia tabaci, as well as subcellular marker proteins specific for the cell plasma membrane and for intracellular lysosomes. All recombinant proteins were produced as chimeras with fluorescent protein markers at their carboxyl termini, which allows for the direct detection of the recombinant proteins. The double transfection of cells with plasmids harboring constructs for the genes of interest and a known subcellular marker allows for live cell imaging and improved validation of cellular protein localization.

Nonlytic insect cell expression systems are underutilized for production, cellular trafficking/localization, and recombinant protein functional analysis. Here, we describe methods to generate expression vectors and subsequent transient protein expression in commercially available lepidopteran cell lines. The co-localization of Bemisia tabaci aquaporins with subcellular fluorescent marker proteins is also presented.

Kültürlü Böcek Hücrelerinde Geçici İfade ve Rekombinant Proteinlerin Hücresel Yerelleştirme

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Biyoloji

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, chikungunya and Zika. Wolbachia-infected mosquitoes can be released into the field to either reduce population sizes through incompatible matings or to transform populations with mosquitoes that are refractory to virus transmission. For these strategies to succeed, the mosquitoes released into the field from the laboratory must be competitive with native mosquitoes. However, maintaining mosquitoes in the laboratory can result in inbreeding, genetic drift and laboratory adaptation which can reduce their fitness in the field and may confound the results of experiments. To test the suitability of different Wolbachia infections for deployment in the field, it is necessary to maintain mosquitoes in a controlled laboratory environment across multiple generations. We describe a simple protocol for maintaining Ae. aegypti mosquitoes in the laboratory, which is suitable for both Wolbachia-infected and wild-type mosquitoes. The methods minimize laboratory adaptation and implement outcrossing to increase the relevance of experiments to field mosquitoes. Additionally, colonies are maintained under optimal conditions to maximize their fitness for open field releases.

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia are being released into natural populations to suppress the transmission of arboviruses. We describe methods to rear Ae. aegypti with Wolbachia infections in the laboratory for experiments and field release, taking precautions to minimize laboratory adaptation and selection.

Aedes aegypti sivrisinek enfekte Wolbachia ile bakımını yapma

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

Nasonia vitripennis'te RNAi ve CRISPR Gen Düzenleme için Pupal ve Yetişkin Enjeksiyonları

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

Biyolojik kültür ve gen ifadesinde ölçme Aphis neriiBakımı: bitki böcek etkileşimleri için bir sigara-model sistemi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Dünya Tarım Pest Böcek Embriyo Mikroenjeksiyon yoluyla Nükleik Asitler teslim edilmesi,

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı,