Heng Lin Yeap, Chris Paton, Petrina Johnson ve Clare Doig bizim koloni bakım yöntemleri gelişmesine katkılarından dolayı ve el yazması geliştirmeye yardımcı olan öneriler için üç adsız yorumcular anıyoruz. Bizim araştırma programı hibe ve dostluk tarafından AAH için Ulusal Sağlık desteklenir ve tıbbi araştırma Konseyi ve bir çeviri Wellcome Trust verin. PAR bir Avustralya hükümeti araştırma eğitim programı bursu bir alıcı var.

Sivrisinek insan denekler üzerinde kan besleme University of Melbourne insan Etik Komitesi tarafından onaylanmış (onay #: 0723847). Tüm gönüllüler sağlanan yazılı izni haberdar.
1. larva yetiştirme
Not: Sivrisinekler 26 ± 0,5 ° C ile 50-%70 bağıl nem, 12:12 h (ışık: karanlık) photoperiod bu koloni bakım protokol ile düzenlenen. Bu koşullar Ae. aegypti hayatta kalma ve gelişme44,45,46için ortalama iklim koşulları Cairns, Avustralya ve en iyi termal Aralık içinde benzer. Yüksek sıcaklık Wolbachia enfeksiyonlar sivrisinek kolonilerden kaybına neden ve kaçınılması47olmalıdır. Biz akraba evliliği en aza indirmek için başına en az 500 kişi korumak; daha küçük bir boyuta kolonileri korumak fitness [Ross vd yayınlanmamış] sonuçlara yol açabilir. Bu koşullar ve varsayarak yeterli beslenme altında 28 gün (bkz. Tablo 1) ortalama üretimi zamanı.
<ol><li>Balık yemi ~ 300 mg üzerinde substrat kasetlerine (şekil 1A) 3 L su (ters osmoz su veya yaşlı musluk suyu, musluk suyu kanalları 24 kullanılmadan önce s için bırakarak oluşturulan), içeren yumurta daldırın (ezilmiş bir tablet, Tablo malzemelerigörmek) ve bir damızlık48ikna etmek için aktif kuru maya kaç taneler.</li>
	<li>Tarama sonra bir gün bir cam pipet 4 L su (şekil 1B) içeren tepsi için yaklaşık 500 larva transferi, bir tıkırtı sayaç saymak için kullanın. İki ezilmiş balık yiyecek tabletleri her tepsisi. Gerekirse, larva (şekil 1A) yetiştirme için farklı boyutlarda kaplar kullanın ama larva yoğunluğu 0,5 larva/mL aşırı kalabalık önlemek için aşağıda tutun.</li>
	<li>Tepsiler günlük larvalar yeterli yiyecek var emin olun; yaklaşık iki gıda tabletleri tepsi için iki günde ekleyin. Gıda ad libitum sağlar, ancak 0,5 mg/larva/gün, geliştirme zaman uyumlu olarak ve vücut boyutu sağlamak için bu dönemde tutarlı olarak, aksi takdirde deneylerin sonuçlarını şaşırmış sağlamak (temsilcisi sonuçları görmek).</li>
	<li>Larva overfeeding önlemek için özen, özellikle içinde daha küçük yetiştirme kapları ile daha az yüzey alanı ve hacmi su. Su bulanık veya önemli larva ölüm ise, eski yerine koymak o ile tatlı su; Ölüm larva en iyi şekilde beslenir eğer ihmal edilebilir olmalıdır.</li>
</ol>2. yetişkin ortaya çıkması
Not: Larvaları üzerinden beş gün sonra tarama iyi beslenen Eğer YavruIar başlayacak ve çoğunluk tarafından yedi gün sonra damızlık YavruIar. Yetişkin yaklaşık iki gün pupation sonra ortaya çıkan en iyi şekilde 26 ° C'de muhafaza Eğer başlayacak ( Temsilcisi sonuçlarıgörmek). Yeterli gıda23,39,49sağlandığında larva geliştirme Wolbachia enfeksiyonları genellikle etkilenmez.
<ol><li>Yedi gün sonra damızlık dökün tepsiyi tüm içeriğini iyi bir ağ (gözenek boyutu 0.4 mm). Daha sonra kullanmak üzere filtre uygulanmış larva su ovicups içinde tutmak ("Kan besleme ve Oviposition" bölümüne bakın). Mesh ters çevir ve pupa aktarmak için su 200 mL ile plastik bir kap içine daldırma. Herhangi bir larva kalırsa ek besin içerir.</li>
	<li>Yetişkin ortaya çıkması kafesleri (şekil 1 c) % 10 Sükroz çözüm (şekil 1F) iki bardak ve nemli pamuk kuruma (şekil 1E) önlemek için iki bardak sağlayarak hazırlayın.</li>
	<li>Pupa seks tarafından sıralanır gerekiyorsa, Pupa tepecikte kapsayıcılar kafesin içine yerleştirin ve kapağı biraz yetişkin kafesin içine çıkmaya izin vermek için açık bırakın. Alternatif olarak, bir ters huni boğulma en aza indirmek için konteyner üzerinde yerleştirin. Tüm yetişkin karşı yavaş geliştiriciler seçmelerini önleme belgili tanımlık kafes gelen konteyner kaldırmadan önce ortaya çıkan emin olun.</li>
</ol>3. pupa Outcrossing için seks
<ol><li>Pupa (outcrossing içinörneğin,) seks tarafından sıralanması gerekirse, Pupa larva tepsileri üzerinden pipette ve cinsiyetler (Şekil 2) plastik kaplara (şekil 1A) 200 mL su ile her 24 h her seks için istediğiniz sayıyı kadar ayrı ulaşıldı. Kapakları üzerinde Konteyner yeri ve kapalı bırakın.</li>
	<li>Yetişkin kaplara ortaya çıkacak; onların seks kafesleri (şekil 2C) serbest bırakmadan önce onaylayın. Herhangi bir yetişkin cinsel olgunluğa ulaşmadan yanlış çıkması 24 saat içinde bir aspiratör ile sexed kaldırın. Cinsiyetler onayladıktan sonra yetişkin her 24 h kafesler bırakın.</li>
	<li>
Wolbachiaelde etmek için-bir benzer genetik arka plan doğal bir popülasyon için virüslü koloniler outcross Wolbachiaekleyerek-enfekte dişilerini laboratuvar kolonilerden kafesleri için hastalık bulaşmamış tek erkek ovitraps içinde topladığı yumurta elde 500 kişi başına öngörülen yoğunluğu Bakımı alan39.
	<ol>
<li>Outcrossing en az % 87,5 genetik olarak alan nüfus39için benzer olan koloniler üretmek en az üç ardışık nesiller için yineleyin. Kritik: cinsiyetler bu aşamada doğru olduğundan emin olun (bkz. Adım 3.1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kadın Ae. aegypti genellikle50çiftleşme saat içinde daha fazla inseminasyon için ateşe dayanıklı. Koloniler outcrossing izin için tüm erkekler eşit fırsat sağlamak kadın ve erkek için iki gün ayrı kafeslerde olgun ve kadın erkek kafesin içine Aspire edin.</li>
</ol>4. kan besleme ve Oviposition
<ol><li>
En az üç gün önce kan olgun için yeterli zaman izin vermek için besleme son dişi sonra bekleyin. Kan çıkması uzun ömürlü22,24,49olumsuz yönde Wolbachia enfeksiyonları ile sivrisinek için özellikle aşırı ölüm önlemek için iki hafta içinde dişilerin yem. Şeker su bardağı besleme oranlarını artırmak için besleme önce gün kaldırın.
	<ol>
<li>Onların önkol dişi sivrisinekler beslemek izin vermek için kafesin içine eklemek için bir gönüllü sor. Çoğu kadın repletion 5 dk içinde beslemesi ama yavaş besleyiciler karşı seçim azaltmak için önkol kadar bütün kadınlar gözle görülür tıkanmış veya 15dk için kafese bırakın; lateks eldiven el ısırıkları korumak için isteğe bağlıdır ancak önerilir.</li>
		<li>İki gün sonra kan besleme, larva yetiştirme su içeren ve zımpara (şekil 1G) (veya filtre kağıdı (şekil 1 H)) bir şerit ile kaplı iki plastik bardak dişiler yumurtalarını bırakmak için kafes içine yerleştirin. Kısmen su nemli tutmak için zımpara şerit daldırın. Su oviposition Kupası dışında onların yumurta koyarlar dişiler önlemek için diğer kaynakları kaldırın. Not: bardak musluk suyu kullanılabilir ama larva yetiştirme su oviposition51,52 teşvik eder ve dişiler yumurtalarını daha zaman uyumlu olarak bırakmak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. yumurta toplama ve Klima
<ol><li>Dişiler yumurta zımpara hemen su hattı üzerinde yatıyordu; toplamak ve hiçbir daha fazla yumurta koyulur kadar zımpara şeritler her gün değiştirin. Not Bu oviposition bir hafta kadar devam edebilir.</li>
	<li>Kısmen kuru zımpara şeritler tarafından yavaşça onları 30 kağıt havlu üzerinde kurutma s, yumurta çıkarmak değil için dikkat çekici. O zaman, şeritler sabıkası kuru kağıt havlu sarın ve yapışmalı plastik torba (şekil 1I) yerleştirin.</li>
	<li>Yumurta diseksiyon mikroskop (şekil 3) altında durumunu kontrol. Zımpara şeritler (şekil 3B) suda batık önce yumurtadan, ama eğer çok sert kurutulmuş yumurta (şekil 3 c) çökebilir çok ıslak vardır.</li>
	<li>Yumurta üç gün sonrası koleksiyonu ötesinde herhangi bir zamanda yumurtadan; Tüm gün boyunca su nesil bireylerin büyük, rasgele havuzundan örneklenir emin olmak için aynı kap içinde toplanan her koloni üzerinden tüm yumurtalar çatlar.</li>
	<li>Uzun süreli depolama için yumurta yüksek (> %80) nem, kapalı bir kapta yaklaşık 20 ° C'de tutmak Bu koşullar altında yumurta Wolbachia olmadan yüksek kapağı oranları53,54korurken birkaç ay depolanabilir.</li>
	<li>Bazı Wolbachia enfeksiyonlar, büyük ölçüde yaş49,55ile yumurta canlılığı azaltmak gibi Wolbachiagelen yumurtadan-enfekte satırları önlemek için ilgili aşırı ölüm koleksiyonunun bir hafta içinde suşları. Daha fazla yumurta gerekirse kan dişiler daha bir hafta sonra besleme.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Gün</td>
			<td colspan="3">Adım</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td colspan="3">Kapak yumurta</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="3">Count larva tepsileri içine</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td colspan="3">Larva ve pupa koloni kafesleri için transfer</td>
		</tr>
<tr>
<td>17</td>
			<td colspan="3">Kan kadın yetişkin feed</td>
		</tr>
<tr>
<td>21</td>
			<td colspan="3">Yumurta toplama başlar</td>
		</tr>
<tr>
<td>25</td>
			<td colspan="3">Yumurta toplama bitirmek</td>
		</tr>
<tr>
<td>28</td>
			<td colspan="3">Kapak yumurta</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Genel bakış Ae. aegypti koloni bakım zamanlamayı 26 ° C. Kadın kan besleme ve yumurta hatching zamanlaması esnek olsa da, Bu aşamalar uzun süreler, özellikle ölüm en aza indirmek için Wolbachiaile enfekte sivrisinekler için kaçınılmalıdır. Bu programı aşağıdaki seçim şartıyla larva en iyi şekilde beslenir hızlı veya yavaş geliştirmek veya tüm yaşam evreleri olgun olan sivrisinek karşı en aza indirir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56124/56124fig1.jpg"> Resim 1: Ae. aegypti laboratuvarda yetiştirme için kullanılan ekipman. (A)plastik kaplar yumurta kuluçkalık veya 500, hacimleri ile larva yetiştirme için kullanılan 750 ve 5000 mL (soldan sağa). (B) tepsiler larvalar genelde 500 larvalar 4 L su içinde kontrollü bir yoğunluk, yetiştirme için kullanılan. (C) 19,7 L ve konut yetişkinler için kullanılan (D) 3 L kafesleri. 25 yetişkin yoğunluğu veya litre başına daha az yeterli alan sağlamak için sağlanmalıdır. (E) 35 mL bardak su kaynağı olarak yetişkin için sağlanan nemli Pamuk yün ile. (F) 35 mL bardak şeker kaynağı olarak bir kordon veya diş fitil üzerinden sağlanan Sükroz çözümü ile. (G-H) Bardak larva yetiştirme su ve bir oviposition substrat zımpara veya filtre kağıdı ile kaplı (G ve H, sırasıyla). Zımpara şeritler ya da filtre kağıdı depolanmasında kullanılan (ben) Zip kilit çanta. Siyah noktalar zımpara üzerinde Sivrisinek yumurta vardır. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56124/56124fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56124/56124fig2.jpg"> Resim 2: Lateral (A) ve dorsal (B) görüş yetişkin Ae. aegypti (C) kendi cinsel dimorfizm gösteren ve pupa. Erkek, kadın her panelinde sağ ve sol konumlandırılır. Ne zaman en iyi şekilde fed, erkek ve dişi pupa boyutuna göre ayrılır; Dişiler daha erkek(a)daha büyük ve düz iki tarafın (B) olduğundan erkek için karşılaştırıldığında nispeten soğanlı bir cephalothorax. Erkek yetişkin öncelikle onların tüysü anten ve uzun dokunacı tarafından kolayca ayırt edici kadın tüm yetiştirme koşullarında üzerinden. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56124/56124fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56124/56124fig3.jpg"> Şekil 3. Farklı koşullar altında dört gün eski Ae. aegypti yumurta. (A)bozulmamış yumurta yüksek (> %80) nem, ama görünür herhangi bir nem olmadan tutulan zımpara şeritler üzerinde. Hatch oranları vahşi tipi Ae. aegypti için % 90'ı yukarıda düzgün muhafaza olmalıdır. Su (Erken gelişmiş tarama) sular altında önce yumurtadan (B) yumurta bir müstakil yumurta kap ve görünür larva tarafından ayırt edilir. Bu zımpara şerit çok nemli tutuldu gösterir. Çok sert kurutulmuş (C) yumurta çökebilir ve içbükey görünümlerini tarafından açıkça görülebilir. Zımpara sert olursa bu da yumurtaları çok kuru olabileceğini gösterir. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56124/56124fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Burada Wolbachiabakım için sunulan protokol sonrası-virüslü Ae. aegypti sağlamak tutarlı bir kalite sağlıklı sivrisinekler deneyler için üretilen ve açık alan bültenleri. (Bkz: başvuru57) sivrisinek miktarda üretim öncelik diğer iletişim kuralları aksine, onların zindelik, hem rahat yetiştirme koşulları uygulayarak ve arasında nesiller içinde en üst düzeye çıkarma yöntemleri odaklı akraba evliliği, seçim ve laboratuvar uyum en aza nesiller. Bu i...

Aedes aegypti sivrisinek Dang, Zika ve chikungunya1de dahil olmak üzere dünyanın en önemli arboviruses bazıları iletmek için sorumludur. 2,3,4genişletmek Ae. aegypti tropikal yaygın dağıtım devam ederken bu virüsler küresel sağlık için artan bir tehdit hale gelmektedir. Kadın Ae. aegypti tercihen insan kanı5 besleme ve böylece insanlar, özellikle kentsel alanlarda nüfusun en yoğun olduğu yakın yaşamak eğilimindedir. İnsanlar ile bu yakın ilişki yoluyla onlar da lastikleri, tencere, oluklar ve su tankları6,7de dahil olmak üzere, yapay yaşam alanları içinde üremek için adapte olması. AE. aegypti da kolayca nerede onlar herhangi bir özel gereksinimleri olmadan doğrudan alanından farklı olarak bazı diğer türler Aedes cins8toplanan sonra korunabilir laboratuvar ortamlarına uyum, 9,10. Bakım kolaylığı onları geniş alanları geniş bir laboratuvarda Okulu'nu gördü, sonuçta hastalıkları sivrisinek kontrolü amaçlayan iletmek.
Geleneksel olarak, arboviral denetim ağır sivrisinek örneğin alınma olasılığını azaltmak için böcek öldürücüler kullanımına dayanıyor. Ancak, değiştirilmiş sivrisinek nereye laboratuvarda yetiştirilen ve sonra doğal nüfus serbest yaklaşımlar artan ilgi vardır. Yayımlanan sivrisinekler11,12,13, biyolojik olarak14,15, ışınlama16, kimyasal arıtma17,18genetik olarak değiştirilmiş, ya da sivrisinek nüfus bastırmak veya bunların yerine arboviral iletim20' ye ateşe dayanıklı sivrisinekler teknikleri-19 ile birlikte.
Wolbachia olan bir biyolojik mücadele ajanı olarak arboviruses. için kullanılmakta olan bakteri Birkaç soy-in Wolbachia son zamanlarda deneysel olarak embriyonik mikroenjeksiyon21,22,23,24kullanarak Ae. aegypti tanıtıldı. Bu suşların yaymak ve onların iletim potansiyel23,25,26,27,28 azalan sivrisinek içinde çoğaltmak için arboviruses kapasitesini azaltmak . Ancak hastalık bulaşmamış tek kadın22ile enfekte erkek dostum zaman belirli suşları kısırlık neden Wolbachia enfeksiyonlar çoluk, anneden iletilir. Wolbachia-virüslü erkekler bu nedenle doğal sivrisinek nüfus, son diğer Aedes türler15,29gösterdi bastırmak için büyük miktarlarda yayınlanacak. Wolbachia da inhibe bu yana arboviral Ae. aegyptiiletimde, ancak, sivrisinekler de yerli nüfus ile yoksul vektörel çizimler yerine yayınlanacak. Deneysel olarak Wolbachia ile enfekte Ae. aegypti are şimdi serbest bırakmak içine alan birçok ülkede bu ikinci yaklaşımı14,30,31kullanarak.
Wolbachia-arboviral denetimi için tabanlı yaklaşımlar itimat Wolbachia, Sivrisinek ve çevre arasındaki etkileşimler ses bir anlayış. Wolbachia ortaya doğal olarak çok çeşitli böcekler ve sivrisinekler tanıttı suşları onların etkileri32çeşitlidir. Yeni Wolbachia enfeksiyon türü Ae. aegypti24tanıtıldı gibi sivrisinek fitness, üreme ve koşulları bir dizi altında arboviral girişim üzerindeki etkileri için her zor karakterize etmek gereklidir. Titiz deney Laboratuvarı bu nedenle alanında başarılı olmak Wolbachia suşları potansiyeli değerlendirmek için gereklidir.
Ae. aegypti açık alan bültenleri Wolbachia enfeksiyonları ile kez sivrisinek olmak serbest bölge başına, on binlerce binlerce her hafta14,30,31yetiştirilen gerektirebilir. İlk bültenleri başarısı sivrisinekler onların verimlilik33 ve çiftleşme başarı34,35en üst düzeye çıkarmak için büyük bir boyutta serbest bırakarak geliştirilebilir. Sivrisinekler de alanında, ancak uzun vadeli laboratuvar yetiştirme değişiklikler davranış ve alan performans36,37etkileyen Fizyoloji neden olabilir yaşayacaksınız koşullarına adapte edilmelidir, 38.
Biz Ae. aegypti temel ekipman kullanarak laboratuvar yetiştirme için basit bir protokol tanımlamak. Bu iletişim kuralı için her iki vahşi türü uygundur ve Wolbachia-enfekte sivrisinekler, ikincisi olan gerektirebilir özel ilgi gibi bazı Wolbachia suşları sivrisinek hayat-Tarih özellikleri39, üzerinde önemli etkileri 40. aşırı kalabalık ve vektör yetkinlik ve fitness deneyler için önemlidir ve sivrisinekler için alan serbest bırakmak41 sağlıklı olmasını sağlar tutarlı bir boyuta sivrisinekler üretmek gıda için rekabet yetiştirme durumlardan kaçınmak . Biz laboratuvar adaptasyon ve akraba evliliği seçici baskıların azaltılması ile en aza indirmek önlemler almak ve yeni nesil sağlamak büyük, rasgele havuzundan örneklenir. Ancak, laboratuvar ortamları alan koşullarından farklı ve rahat koşullarda uzun vadeli bakım yayın içine alan37,42,43 üzerine sivrisinek fitness azaltabilir . Bu nedenle kadın alan toplanan erkeklerin periyodik olarak, laboratuvar satırlarından, deneysel karşılaştırmalar için genetik olarak benzeyen, ve için hedef alan nüfus39adapte olan koloniler sonuçlanan geçeriz. Yöntemleri herhangi bir özel ekipman gerektirmez ve arka on binlerce her hafta alan sürümleri için bireylerin ölçeklendirilebilir. Protokol ayrıca fitness kuruluş doğal nüfus için mukadder böcekler için önemli bir göz sivrisinek içinde ve nesiller arasında öncelik. Protokol sivrisinekler ve relatability alanı için tutarlı bir kalite nerede önemli özellikle deneysel karşılaştırmalar için Ae. aegypti, bakım gerektiren çoğu laboratuarlar için uygundur.

<table><tbody><tr><td>Wild type &lt;em&gt;Aedes aegypti&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Collected from field locations in Queensland, Australia, see Yeap and others&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;39&lt;/sup&gt; for details</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;w&lt;/em&gt; Mel-infected &lt;em&gt;Aedes aegypti&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Provided by Monash University. Refer to Walker and others&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;23&lt;/sup&gt; for information on the strain</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;w&lt;/em&gt; AlbB-infected &lt;em&gt;Aedes aegypti&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Provided by Monash University. Refer to Xi and others&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;21&lt;/sup&gt; for information on the strain</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;w&lt;/em&gt; MelPop-infected &lt;em&gt;Aedes aegypti&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Provided by Monash University. Refer to McMeniman and others&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;22&lt;/sup&gt; for information on the strain</td></tr><tr><td>Instant dried yeast</td><td>Lowan</td><td></td><td>Stimulates egg hatching. Found in general grocery stores. Other brands may be used</td></tr><tr><td>5 L plastic tub</td><td>Quadrant</td><td>Q110950</td><td>Used for hatching and rearing larvae. Other products may be used</td></tr><tr><td>Fish Food (Tetramin Tropical Tablets)</td><td>Tetra</td><td>16152</td><td>Provided to larvae as a source of food. Web address: https://www.amazon.com/Tetra-16152-TetraMin-Tropical-10-93-Ounce/dp/B00025Z6SE</td></tr><tr><td>Plastic containers</td><td></td><td></td><td>Used for rearing larvae. Any plastic container above 500 mL should be suitable</td></tr><tr><td>Glass pipette</td><td></td><td></td><td>Used for transferring larvae and pupae between containers. Web address: https://www.aliexpress.com/item/10Pcs-Durable-Long-Glass-Experiment-Medical-Pipette-Dropper-Transfer-Pipette-Lab-Supplies-With-Red-Rubber-Cap/32704471109.html?spm=2114.40010308.4.2.py4Kez</td></tr><tr><td>Clicker counter</td><td>RS Pro</td><td>710-5212</td><td>Used to assist in the counting of larvae, pupae and eggs. Web address: http://au.rs-online.com/web/p/products/7105212/?grossPrice=Y</td></tr><tr><td>Rearing trays</td><td>Gratnells</td><td></td><td>Used for rearing larvae. Web address: http://www.gratnells.com</td></tr><tr><td>Nylon mesh</td><td></td><td></td><td>Used to transfer larvae and pupae to containers of fresh water. Other brands may be used. Web address: https://www.spotlightstores.com/fabrics-yarn/specialty-apparel-fabrics/nettings-tulles/nylon-netting/p/BP80046941001-white</td></tr><tr><td>Cages</td><td>BugDorm</td><td>DP1000</td><td>Houses adult mosquitoes. Alternative products may be used. Web address: http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html</td></tr><tr><td>35 mL plastic cup</td><td>Huhtamaki</td><td>AA272225</td><td>Used to provide water or sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used</td></tr><tr><td>35 mL plastic cup lid</td><td>Huhtamaki</td><td>GB030005</td><td>Used to provide sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used</td></tr><tr><td>Cotton wool</td><td>Cutisoft</td><td>71841-13</td><td>Moist cotton wool is provided as a source of water to adults. Other brands may be used</td></tr><tr><td>White Sugar</td><td></td><td></td><td>Provided as a source of sugar to adult mosquitoes. Found in general grocery stores</td></tr><tr><td>Rope</td><td>M Recht Accessories</td><td>C323C/W</td><td>Used to provide sucrose solution to adults. Other brands may be used. Web address: https://mrecht.com.au/haberdashery/braids-cords-and-tapes/cords/plaited-cord/cotton/</td></tr><tr><td>Plastic cup (large)</td><td></td><td></td><td>Used as an oviposition container. Any plastic cup that holds 100 mL of water should be suitable</td></tr><tr><td>Sandpaper</td><td>Norton Master Painters</td><td>CE015962</td><td>Provided as an oviposition substrate. Alternative products may be used, but we use this brand because it is relatively odorless. Lighter colors are used for contrast with eggs. Web address: https://www.bolt.com.au/115mm-36m-master-painters-bulk-roll-p80-medium-p-9396.html</td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Whatman</td><td>1001-150</td><td>Used as an alternative oviposition substrate. Other brands may be used</td></tr><tr><td>Latex gloves</td><td>SemperGuard</td><td>Z560979</td><td>Prevents mosquito bites on hands when blood feeding. Other brands may be used. Web address: http://www.sempermed.com/en/products/detail/semperguardR_latex_puderfrei_innercoated/</td></tr></tbody></table>

maintaining aedes aegypti mosquitoes infected with wolbachia

Deneysel olarak Wolbachia ile enfekte aedes aegypti sivrisinek arboviruses Dang, chikungunya ve Zika gibi yayılmasını kontrol programlarında kullanılmaktadır. Wolbachia-virüslü sivrisinekler de nüfus boyutları arasında uyumsuz matings azaltmak veya virüs iletim için ateşe dayanıklı sivrisinek ile nüfus dönüştürmek için alana piyasaya sürülmelidir. Bu stratejiler başarılı olmak laboratuvar alanından içine serbest sivrisinek yerli sivrisinek ile rekabetçi olmalı. Ancak, sivrisinekler laboratuvarda Bakımı akraba evliliği, genetik sürüklenme ve onların zindelik alanını azaltabilir ve deneylerin sonuçlarını yıkmak laboratuvar adaptasyon neden olabilir. Farklı Wolbachia enfeksiyonlar dağıtımı için uygunluğu sahada test için sivrisinek kontrollü laboratuvar ortamında birden çok nesiller boyunca korumak gereklidir. Her iki Wolbachiaiçin uygundur laboratuvarında Ae. aegypti sivrisinek korumak için basit bir protokol tanımlayan-virüslü ve vahşi-türü sivrisinekler. Yöntemler laboratuvar adaptasyon en aza indirmek ve deneyler alaka alan sivrisinekler için artırın için outcrossing uygulamak. Ayrıca, koloniler onların zindelik açık alan sürümleri için en üst düzeye çıkarmak için en uygun koşullarda korunur.

Şekil 4 Ae. aegypti larva gelişimine suboptimal beslenmenin etkisi gösterir. Ne zaman kapsayıcı gıda larva günlük başına 0,25 mg ile sağlanır veya daha az, hem kadın ve erkek için Geliştirme süresini artırır, ve daha az kaplar içinde zaman uyumlu gıda 0.5 mg ile sağlanır. Yeterli gıda larva geliştirme süresi boyunca sağlanmazsa, bu bakım planı üzerinde olumsuz bir etkisi olabilir. Yavaş gelişen bireylerin karşı seçil...

Watch this Scientific Journal Video about Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia at JoVE.com

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti sivrisinek enfekte Wolbachia ile bakımını yapma

Wolbachia ile enfekte aedes aegypti sivrisinek arboviruses iletimini bastırmak için doğal nüfus serbest edilmektedir. Biz laboratuvar adaptasyon ve seçimi en aza indirmek önlemler alarak deneyler ve alan açıklaması, arka Ae. aegypti laboratuvarda Wolbachia enfeksiyonları ile yöntemleri açıklanmaktadır.

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

maintaining-aedes-aegypti-mosquitoes-infected-with-wolbachia

Research

JoVE Journal

Biology

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

14.1K Görüntüleme.  Bio21 Institute and University of Melbourne. Wolbachia ile enfekte aedes aegypti sivrisinek arboviruses iletimini bastırmak için doğal nüfus serbest edilmektedir. Biz laboratuvar adaptasyon ve seçimi en aza indirmek önlemler alarak deneyler ve alan açıklaması, arka Ae. aegypti laboratuvarda Wolbachia enfeksiyonları ile yöntemleri açıklanmaktadır.

Video: Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

New techniques and methods are being sought to try to win the battle against mosquitoes. Recent advances in molecular techniques have led to the development of new and innovative methods of mosquito control based around the Sterile Insect Technique (SIT)1-3. A control method known as RIDL&#160;(Release of Insects carrying a Dominant Lethal)4, is based around SIT, but uses genetic methods to remove the need for radiation-sterilization5-8. A RIDL&#160;strain of Ae. aegypti was successfully tested in the field in Grand Cayman9,10; further field use is planned or in progress in other countries around the world.
Mass rearing of insects has been established in several insect species and to levels of billions a week. However, in mosquitoes, rearing has generally been performed on a much smaller scale, with most large scale rearing being performed in the 1970s and 80s. For a RIDL&#160;program it is desirable to release as few females as possible as they bite and transmit disease. In a mass rearing program&#160;there are several stages to produce the males to be released: egg production, rearing eggs until pupation, and then sorting males from females before release. These males are then used for a RIDL&#160;control program,&#160;released as either pupae or adults11,12.
To suppress a mosquito population using RIDL&#160;a large number of high quality male adults need to be reared13,14. The following describes the methods for the mass rearing of OX513A, a RIDL&#160;strain of Ae. aegypti 8, for release and covers the techniques required for the production of eggs and mass rearing RIDL&#160;males for a control program.

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

To achieve population suppression of Aedes aegypti using the RIDL&#174; (Release of Insects carrying a Dominant Lethal) system, large numbers of male mosquitoes need to be released. This requires the use of mass rearing techniques and technology to provide reliable systems to obtain the maximum number of high quality male mosquitoes.

Brezilya'da Saha Sürümleri için Genetiği Değiştirilmiş Aedes aegypti'nin Seri Üretimi

New techniques and methods are being sought to try to win the battle against mosquitoes. Recent advances in molecular techniques have led to the ...

Çevre

Maintaining Wolbachia in Cell-free Medium

In this video protocol, procedures are demonstrated to (1) purify Wolbachia symbionts out of cultured mosquito cells, (2) use a fluorescent assay to ascertain the viability of the purified Wolbachia and (3) maintain the now extracellular Wolbachia in cell-free medium.  Purified Wolbachia remain alive in the extracellular phase but do not replicate until re-inoculated into eukaryotic cells.  Extracellular Wolbachia purified in this manner will remain viable for at least a week at room temperature, and possibly longer.  Purified Wolbachia are suitable for micro-injection, DNA extraction and other applications. 


This video describes a method for purifying Wolbachia pipientis from an Anopheles gambiae cell line and then culturing the endosymbiont in cell-free medium. An assay for viability of the bacterium is demonstrated.

Hücre Orta Wolbachia bakımı

In this video protocol, procedures are demonstrated to (1) purify Wolbachia symbionts out of cultured mosquito cells, (2) use a fluorescent assay to ...

Biyoloji

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

Culex quinquefasciatus'ta Verimli Bölgeye Özgü Mutagenezi için Embriyo Mikroenjeksiyon Teknikleri

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Genetik

Small-Cage Laboratory Trials of Genetically-Engineered Anopheline Mosquitoes

Control of mosquito-borne pathogens using genetically-modified vectors has been proposed as a promising tool to complement conventional control strategies. CRISPR-based homing gene drive systems have made transgenic technologies more accessible within the scientific community. Evaluation of transgenic mosquito performance and comparisons with wild-type counterparts in small laboratory cage trials provide valuable data for the design of subsequent field cage experiments and experimental assessments to refine the strategies for disease prevention. Here, we present three different protocols used in laboratory settings to evaluate transgene spread in anopheline mosquito vectors of malaria. These include inundative releases (no gene-drive system), and gene-drive overlapping and non-overlapping generation trials. The three trials vary in a number of parameters and can be adapted to desired experimental settings. Moreover, insectary studies in small cages are part of the progressive transition of engineered insects from the laboratory to open field releases. Therefore, the protocols described here represent invaluable tools to provide empirical values that will ultimately aid field implementation of new technologies for malaria elimination.

The protocols reported here illustrate three alternative ways to assess the performance of genetically-engineered mosquitoes destined for vector control in laboratory-contained small cage trials. Each protocol is tailored to the specific modification the mosquito strain bears (gene drive or non-gene drive) and the types of parameters measured.

Genetik Olarak Tasarlanmış Anopheline Sivrisineklerinin Küçük Kafes Laboratuvar Denemeleri

Control of mosquito-borne pathogens using genetically-modified vectors has been proposed as a promising tool to complement conventional control ...

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation of RNA virus transmission using Wolbachia-transfected mosquitoes. Key strategies to control viruses include the manipulation of host reproduction via cytoplasmic incompatibility and the inhibition of viral transcripts via immune priming and competition for host-derived resources. However, the underlying mechanisms of the responses of Wolbachia-transfected mosquitoes to viral infection are poorly understood. This paper presents a protocol for the in vitro identification of Wolbachia infection at the nucleic acid and protein levels in Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23 cells to enhance the understanding of the interactions between Wolbachia and its insect vectors. Through the combined use of polymerase chain reaction (PCR), quantitative PCR, western blot, and immunological analytical methods, a standard morphologic protocol has been described for the detection of Wolbachia-infected cells that is more accurate than the use of a single method. This approach may also be applied to the detection of Wolbachia infection in other insect taxa.

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Four methods were used to detect intracellular Wolbachia, which complemented each other and improved the detection accuracy of Wolbachia infection of Aedes albopictus-derived Aa23 and Aa23-T&#160;cured of native Wolbachia infection using antibiotics.

Aedes albopictus Hücre Hatlarında Wolbachia Suşu wAlbB'nin Tespiti

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

Asya Tiger Sivrisinek içinde Photoperiodic Diapause RNA-seq Analizler Deneysel ve Biyoinformatik Protokolü,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness parameters, in particular egg production and hatch rates at the individual level, conventional methods have put a substantial burden on investigators due to high labor intensity and laboratory space requirements. Described is a simple method using 24 well tissue culture plate with agarose in each well and digital imaging of each well to determine egg numbers and hatch rates at an individual level with substantially reduced time and space requirements.

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates EAgaL Plates

Described is a time and space-saving method to count eggs and determine hatch rates of individual mosquitoes using 24 well tissue culture plates, which can substantially increase the scale and speed of fecundity and fertility assays.

24 Kuyu Doku Kültürü Plakası (EAgaL Plakaları) kullanılarak Aedes aegypti için Geliştirilmiş Doğurganlık ve Doğurganlık Tahlilleri

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness ...

Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program

The control of such human diseases as dengue, Zika, and chikungunya relies on the control of their vector, the Aedes aegypti mosquito, because there is no prevention. Control of mosquito vectors can rely on chemicals applied to the immature and adult stages, which can contribute to the mortality of non-targets and more importantly, lead to insecticide resistance in the vector. The sterile insect technique (SIT) is a method of controlling populations of pests through the release of sterilized adult males that mate with wild females to produce non-viable offspring. This paper describes the process of producing sterile males for use in an operational SIT program for the control of Aedes aegypti mosquitoes. Outlined here are the steps used in the program including rearing and maintaining a colony, separating male and female pupae, irradiating and marking adult males, and shipping Aedes aegypti males to the release site. Also discussed are procedural caveats, program limitations, and future objectives.

Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program

The sterile insect technique (SIT) is used to control specific, medically important mosquito populations that may be resistant to chemical controls. Here, we describe a method of mass rearing and preparation of sterile male mosquitoes for release in an operational SIT program targeting the Aedes aegypti mosquito.

Işınlanmış ve İşaretlenmiş Erkek Aedes aegypti Sivrisineklerinin Operasyonel Steril Böcek Tekniği Programında Salınıma Hazırlanması

The control of such human diseases as dengue, Zika, and chikungunya relies on the control of their vector, the Aedes aegypti mosquito, because there is no ...

Using the Fluorescent Dye, Rhodamine B, to Study Mating Competitiveness in Male Aedes aegypti Mosquitoes

The success of sterile or incompatible insect technique-based population suppression programs depends on the ability of released males to compete for wild-type females and induce sterility in the target population. Hence, laboratory assessment of male mating competitiveness is essential for evaluating the release strain&#8217;s fitness before field release. Conventionally, such an assay is performed by determining the proportion of viable eggs produced by the females after being simultaneously exposed to two sets of males (wild-type and release strains) for copulation. However, this process is time-consuming and laborious due to the need to first blood-feed the females for egg production and then hatch and enumerate the hatched eggs to determine egg viability.&#160;
Moreover, this method cannot discern the degree of competitiveness between two sterile or Wolbachia-infected mosquito lines as wild-type female mosquitoes will only produce non-viable eggs upon mating with both. To circumvent these limitations, this paper describes a more direct method of measuring male mosquito mating competitiveness in laboratory settings using the fluorescent dye, rhodamine B (RhB), which can be used to mark males by feeding them in sucrose solution containing RhB. After the mating assay, the presence of fluorescing sperms in the spermathecae of a female can be used to determine her mating partner. This method is cost-effective, reduces the experimental time by 90% and allows comparison of mating fitness between two sterile or Wolbachia-infected lines.&#160;

Using the Fluorescent Dye, Rhodamine B, to Study Mating Competitiveness in Male Aedes aegypti Mosquitoes

Here, we present a protocol for studying mating competitiveness of male Aedes aegypti using fluorescent dye as a marker. Female mosquitoes are exposed to both marked and unmarked males for copulation. Post mating, their spermathecae are examined under a fluorescence microscope to determine their mating partner.

Erkek Aedes aegypti Sivrisineklerinde Çiftleşme Rekabet Gücünü Incelemek için Floresan Boyası Rhodamine B'yi Kullanmak

The success of sterile or incompatible insect technique-based population suppression programs depends on the ability of released males to compete for ...

Quantifying Fitness Costs in Transgenic Aedes aegypti Mosquitoes

Transgenic mosquitoes often display fitness costs compared to their wild-type counterparts. In this regard, fitness cost studies involve collecting life parameter data from genetically modified mosquitoes and comparing them to mosquitoes lacking transgenes from the same genetic background. This manuscript illustrates how to measure common life history traits in the mosquito Aedes aegypti, including fecundity, wing size and shape, fertility, sex ratio, viability, development times, male contribution, and adult longevity. These parameters were chosen because they reflect reproductive success, are simple to measure, and are commonly reported in the literature. The representative results quantify fitness costs associated with either a gene knock-out or a single insertion of a gene drive element. Standardizing how life parameter data are collected is important because such data may be used to compare the health of transgenic mosquitoes generated across studies or to model the transgene fixation rate in a simulated wild-type mosquito population. Although this protocol is specific for transgenic Aedes aegypti, the protocol may also be used for other mosquito species or other experimental treatment conditions, with the caveat that certain biological contexts may require special adaptations.

Quantifying Fitness Costs in Transgenic Aedes aegypti Mosquitoes

The present protocol describes how to measure common life parameter data in Aedes aegypti mosquitoes, including fecundity, wing size, fertility, sex ratio, viability, development times, male contribution, and adult longevity. These measurements can be used to assess the fitness of transgenic mosquitoes.

Transgenik Aedes aegypti Sivrisineklerinde Kondisyon Maliyetlerinin Ölçülmesi

Transgenic mosquitoes often display fitness costs compared to their wild-type counterparts. In this regard, fitness cost studies involve collecting life ...