Heng Lin Yeap, Chris Paton, Petrina Johnson ve Clare Doig bizim koloni bakım yöntemleri gelişmesine katkılarından dolayı ve el yazması geliştirmeye yardımcı olan öneriler için üç adsız yorumcular anıyoruz. Bizim araştırma programı hibe ve dostluk tarafından AAH için Ulusal Sağlık desteklenir ve tıbbi araştırma Konseyi ve bir çeviri Wellcome Trust verin. PAR bir Avustralya hükümeti araştırma eğitim programı bursu bir alıcı var.

Sivrisinek insan denekler üzerinde kan besleme University of Melbourne insan Etik Komitesi tarafından onaylanmış (onay #: 0723847). Tüm gönüllüler sağlanan yazılı izni haberdar.
1. larva yetiştirme
Not: Sivrisinekler 26 ± 0,5 ° C ile 50-%70 bağıl nem, 12:12 h (ışık: karanlık) photoperiod bu koloni bakım protokol ile düzenlenen. Bu koşullar Ae. aegypti hayatta kalma ve gelişme44,45,46için ortalama iklim koşulları Cairns, Avustralya ve en iyi termal Aralık içinde benzer. Yüksek sıcaklık Wolbachia enfeksiyonlar sivrisinek kolonilerden kaybına neden ve kaçınılması47olmalıdır. Biz akraba evliliği en aza indirmek için başına en az 500 kişi korumak; daha küçük bir boyuta kolonileri korumak fitness [Ross vd yayınlanmamış] sonuçlara yol açabilir. Bu koşullar ve varsayarak yeterli beslenme altında 28 gün (bkz. Tablo 1) ortalama üretimi zamanı.
<ol><li>Balık yemi ~ 300 mg üzerinde substrat kasetlerine (şekil 1A) 3 L su (ters osmoz su veya yaşlı musluk suyu, musluk suyu kanalları 24 kullanılmadan önce s için bırakarak oluşturulan), içeren yumurta daldırın (ezilmiş bir tablet, Tablo malzemelerigörmek) ve bir damızlık48ikna etmek için aktif kuru maya kaç taneler.</li>
	<li>Tarama sonra bir gün bir cam pipet 4 L su (şekil 1B) içeren tepsi için yaklaşık 500 larva transferi, bir tıkırtı sayaç saymak için kullanın. İki ezilmiş balık yiyecek tabletleri her tepsisi. Gerekirse, larva (şekil 1A) yetiştirme için farklı boyutlarda kaplar kullanın ama larva yoğunluğu 0,5 larva/mL aşırı kalabalık önlemek için aşağıda tutun.</li>
	<li>Tepsiler günlük larvalar yeterli yiyecek var emin olun; yaklaşık iki gıda tabletleri tepsi için iki günde ekleyin. Gıda ad libitum sağlar, ancak 0,5 mg/larva/gün, geliştirme zaman uyumlu olarak ve vücut boyutu sağlamak için bu dönemde tutarlı olarak, aksi takdirde deneylerin sonuçlarını şaşırmış sağlamak (temsilcisi sonuçları görmek).</li>
	<li>Larva overfeeding önlemek için özen, özellikle içinde daha küçük yetiştirme kapları ile daha az yüzey alanı ve hacmi su. Su bulanık veya önemli larva ölüm ise, eski yerine koymak o ile tatlı su; Ölüm larva en iyi şekilde beslenir eğer ihmal edilebilir olmalıdır.</li>
</ol>2. yetişkin ortaya çıkması
Not: Larvaları üzerinden beş gün sonra tarama iyi beslenen Eğer YavruIar başlayacak ve çoğunluk tarafından yedi gün sonra damızlık YavruIar. Yetişkin yaklaşık iki gün pupation sonra ortaya çıkan en iyi şekilde 26 ° C'de muhafaza Eğer başlayacak ( Temsilcisi sonuçlarıgörmek). Yeterli gıda23,39,49sağlandığında larva geliştirme Wolbachia enfeksiyonları genellikle etkilenmez.
<ol><li>Yedi gün sonra damızlık dökün tepsiyi tüm içeriğini iyi bir ağ (gözenek boyutu 0.4 mm). Daha sonra kullanmak üzere filtre uygulanmış larva su ovicups içinde tutmak ("Kan besleme ve Oviposition" bölümüne bakın). Mesh ters çevir ve pupa aktarmak için su 200 mL ile plastik bir kap içine daldırma. Herhangi bir larva kalırsa ek besin içerir.</li>
	<li>Yetişkin ortaya çıkması kafesleri (şekil 1 c) % 10 Sükroz çözüm (şekil 1F) iki bardak ve nemli pamuk kuruma (şekil 1E) önlemek için iki bardak sağlayarak hazırlayın.</li>
	<li>Pupa seks tarafından sıralanır gerekiyorsa, Pupa tepecikte kapsayıcılar kafesin içine yerleştirin ve kapağı biraz yetişkin kafesin içine çıkmaya izin vermek için açık bırakın. Alternatif olarak, bir ters huni boğulma en aza indirmek için konteyner üzerinde yerleştirin. Tüm yetişkin karşı yavaş geliştiriciler seçmelerini önleme belgili tanımlık kafes gelen konteyner kaldırmadan önce ortaya çıkan emin olun.</li>
</ol>3. pupa Outcrossing için seks
<ol><li>Pupa (outcrossing içinörneğin,) seks tarafından sıralanması gerekirse, Pupa larva tepsileri üzerinden pipette ve cinsiyetler (Şekil 2) plastik kaplara (şekil 1A) 200 mL su ile her 24 h her seks için istediğiniz sayıyı kadar ayrı ulaşıldı. Kapakları üzerinde Konteyner yeri ve kapalı bırakın.</li>
	<li>Yetişkin kaplara ortaya çıkacak; onların seks kafesleri (şekil 2C) serbest bırakmadan önce onaylayın. Herhangi bir yetişkin cinsel olgunluğa ulaşmadan yanlış çıkması 24 saat içinde bir aspiratör ile sexed kaldırın. Cinsiyetler onayladıktan sonra yetişkin her 24 h kafesler bırakın.</li>
	<li>
Wolbachiaelde etmek için-bir benzer genetik arka plan doğal bir popülasyon için virüslü koloniler outcross Wolbachiaekleyerek-enfekte dişilerini laboratuvar kolonilerden kafesleri için hastalık bulaşmamış tek erkek ovitraps içinde topladığı yumurta elde 500 kişi başına öngörülen yoğunluğu Bakımı alan39.
	<ol>
<li>Outcrossing en az % 87,5 genetik olarak alan nüfus39için benzer olan koloniler üretmek en az üç ardışık nesiller için yineleyin. Kritik: cinsiyetler bu aşamada doğru olduğundan emin olun (bkz. Adım 3.1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kadın Ae. aegypti genellikle50çiftleşme saat içinde daha fazla inseminasyon için ateşe dayanıklı. Koloniler outcrossing izin için tüm erkekler eşit fırsat sağlamak kadın ve erkek için iki gün ayrı kafeslerde olgun ve kadın erkek kafesin içine Aspire edin.</li>
</ol>4. kan besleme ve Oviposition
<ol><li>
En az üç gün önce kan olgun için yeterli zaman izin vermek için besleme son dişi sonra bekleyin. Kan çıkması uzun ömürlü22,24,49olumsuz yönde Wolbachia enfeksiyonları ile sivrisinek için özellikle aşırı ölüm önlemek için iki hafta içinde dişilerin yem. Şeker su bardağı besleme oranlarını artırmak için besleme önce gün kaldırın.
	<ol>
<li>Onların önkol dişi sivrisinekler beslemek izin vermek için kafesin içine eklemek için bir gönüllü sor. Çoğu kadın repletion 5 dk içinde beslemesi ama yavaş besleyiciler karşı seçim azaltmak için önkol kadar bütün kadınlar gözle görülür tıkanmış veya 15dk için kafese bırakın; lateks eldiven el ısırıkları korumak için isteğe bağlıdır ancak önerilir.</li>
		<li>İki gün sonra kan besleme, larva yetiştirme su içeren ve zımpara (şekil 1G) (veya filtre kağıdı (şekil 1 H)) bir şerit ile kaplı iki plastik bardak dişiler yumurtalarını bırakmak için kafes içine yerleştirin. Kısmen su nemli tutmak için zımpara şerit daldırın. Su oviposition Kupası dışında onların yumurta koyarlar dişiler önlemek için diğer kaynakları kaldırın. Not: bardak musluk suyu kullanılabilir ama larva yetiştirme su oviposition51,52 teşvik eder ve dişiler yumurtalarını daha zaman uyumlu olarak bırakmak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. yumurta toplama ve Klima
<ol><li>Dişiler yumurta zımpara hemen su hattı üzerinde yatıyordu; toplamak ve hiçbir daha fazla yumurta koyulur kadar zımpara şeritler her gün değiştirin. Not Bu oviposition bir hafta kadar devam edebilir.</li>
	<li>Kısmen kuru zımpara şeritler tarafından yavaşça onları 30 kağıt havlu üzerinde kurutma s, yumurta çıkarmak değil için dikkat çekici. O zaman, şeritler sabıkası kuru kağıt havlu sarın ve yapışmalı plastik torba (şekil 1I) yerleştirin.</li>
	<li>Yumurta diseksiyon mikroskop (şekil 3) altında durumunu kontrol. Zımpara şeritler (şekil 3B) suda batık önce yumurtadan, ama eğer çok sert kurutulmuş yumurta (şekil 3 c) çökebilir çok ıslak vardır.</li>
	<li>Yumurta üç gün sonrası koleksiyonu ötesinde herhangi bir zamanda yumurtadan; Tüm gün boyunca su nesil bireylerin büyük, rasgele havuzundan örneklenir emin olmak için aynı kap içinde toplanan her koloni üzerinden tüm yumurtalar çatlar.</li>
	<li>Uzun süreli depolama için yumurta yüksek (> %80) nem, kapalı bir kapta yaklaşık 20 ° C'de tutmak Bu koşullar altında yumurta Wolbachia olmadan yüksek kapağı oranları53,54korurken birkaç ay depolanabilir.</li>
	<li>Bazı Wolbachia enfeksiyonlar, büyük ölçüde yaş49,55ile yumurta canlılığı azaltmak gibi Wolbachiagelen yumurtadan-enfekte satırları önlemek için ilgili aşırı ölüm koleksiyonunun bir hafta içinde suşları. Daha fazla yumurta gerekirse kan dişiler daha bir hafta sonra besleme.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Gün</td>
			<td colspan="3">Adım</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td colspan="3">Kapak yumurta</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="3">Count larva tepsileri içine</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td colspan="3">Larva ve pupa koloni kafesleri için transfer</td>
		</tr>
<tr>
<td>17</td>
			<td colspan="3">Kan kadın yetişkin feed</td>
		</tr>
<tr>
<td>21</td>
			<td colspan="3">Yumurta toplama başlar</td>
		</tr>
<tr>
<td>25</td>
			<td colspan="3">Yumurta toplama bitirmek</td>
		</tr>
<tr>
<td>28</td>
			<td colspan="3">Kapak yumurta</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Genel bakış Ae. aegypti koloni bakım zamanlamayı 26 ° C. Kadın kan besleme ve yumurta hatching zamanlaması esnek olsa da, Bu aşamalar uzun süreler, özellikle ölüm en aza indirmek için Wolbachiaile enfekte sivrisinekler için kaçınılmalıdır. Bu programı aşağıdaki seçim şartıyla larva en iyi şekilde beslenir hızlı veya yavaş geliştirmek veya tüm yaşam evreleri olgun olan sivrisinek karşı en aza indirir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56124/56124fig1.jpg"> Resim 1: Ae. aegypti laboratuvarda yetiştirme için kullanılan ekipman. (A)plastik kaplar yumurta kuluçkalık veya 500, hacimleri ile larva yetiştirme için kullanılan 750 ve 5000 mL (soldan sağa). (B) tepsiler larvalar genelde 500 larvalar 4 L su içinde kontrollü bir yoğunluk, yetiştirme için kullanılan. (C) 19,7 L ve konut yetişkinler için kullanılan (D) 3 L kafesleri. 25 yetişkin yoğunluğu veya litre başına daha az yeterli alan sağlamak için sağlanmalıdır. (E) 35 mL bardak su kaynağı olarak yetişkin için sağlanan nemli Pamuk yün ile. (F) 35 mL bardak şeker kaynağı olarak bir kordon veya diş fitil üzerinden sağlanan Sükroz çözümü ile. (G-H) Bardak larva yetiştirme su ve bir oviposition substrat zımpara veya filtre kağıdı ile kaplı (G ve H, sırasıyla). Zımpara şeritler ya da filtre kağıdı depolanmasında kullanılan (ben) Zip kilit çanta. Siyah noktalar zımpara üzerinde Sivrisinek yumurta vardır. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56124/56124fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56124/56124fig2.jpg"> Resim 2: Lateral (A) ve dorsal (B) görüş yetişkin Ae. aegypti (C) kendi cinsel dimorfizm gösteren ve pupa. Erkek, kadın her panelinde sağ ve sol konumlandırılır. Ne zaman en iyi şekilde fed, erkek ve dişi pupa boyutuna göre ayrılır; Dişiler daha erkek(a)daha büyük ve düz iki tarafın (B) olduğundan erkek için karşılaştırıldığında nispeten soğanlı bir cephalothorax. Erkek yetişkin öncelikle onların tüysü anten ve uzun dokunacı tarafından kolayca ayırt edici kadın tüm yetiştirme koşullarında üzerinden. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56124/56124fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56124/56124fig3.jpg"> Şekil 3. Farklı koşullar altında dört gün eski Ae. aegypti yumurta. (A)bozulmamış yumurta yüksek (> %80) nem, ama görünür herhangi bir nem olmadan tutulan zımpara şeritler üzerinde. Hatch oranları vahşi tipi Ae. aegypti için % 90'ı yukarıda düzgün muhafaza olmalıdır. Su (Erken gelişmiş tarama) sular altında önce yumurtadan (B) yumurta bir müstakil yumurta kap ve görünür larva tarafından ayırt edilir. Bu zımpara şerit çok nemli tutuldu gösterir. Çok sert kurutulmuş (C) yumurta çökebilir ve içbükey görünümlerini tarafından açıkça görülebilir. Zımpara sert olursa bu da yumurtaları çok kuru olabileceğini gösterir. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56124/56124fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Burada Wolbachiabakım için sunulan protokol sonrası-virüslü Ae. aegypti sağlamak tutarlı bir kalite sağlıklı sivrisinekler deneyler için üretilen ve açık alan bültenleri. (Bkz: başvuru57) sivrisinek miktarda üretim öncelik diğer iletişim kuralları aksine, onların zindelik, hem rahat yetiştirme koşulları uygulayarak ve arasında nesiller içinde en üst düzeye çıkarma yöntemleri odaklı akraba evliliği, seçim ve laboratuvar uyum en aza nesiller. Bu i...

Aedes aegypti sivrisinek Dang, Zika ve chikungunya1de dahil olmak üzere dünyanın en önemli arboviruses bazıları iletmek için sorumludur. 2,3,4genişletmek Ae. aegypti tropikal yaygın dağıtım devam ederken bu virüsler küresel sağlık için artan bir tehdit hale gelmektedir. Kadın Ae. aegypti tercihen insan kanı5 besleme ve böylece insanlar, özellikle kentsel alanlarda nüfusun en yoğun olduğu yakın yaşamak eğilimindedir. İnsanlar ile bu yakın ilişki yoluyla onlar da lastikleri, tencere, oluklar ve su tankları6,7de dahil olmak üzere, yapay yaşam alanları içinde üremek için adapte olması. AE. aegypti da kolayca nerede onlar herhangi bir özel gereksinimleri olmadan doğrudan alanından farklı olarak bazı diğer türler Aedes cins8toplanan sonra korunabilir laboratuvar ortamlarına uyum, 9,10. Bakım kolaylığı onları geniş alanları geniş bir laboratuvarda Okulu'nu gördü, sonuçta hastalıkları sivrisinek kontrolü amaçlayan iletmek.
Geleneksel olarak, arboviral denetim ağır sivrisinek örneğin alınma olasılığını azaltmak için böcek öldürücüler kullanımına dayanıyor. Ancak, değiştirilmiş sivrisinek nereye laboratuvarda yetiştirilen ve sonra doğal nüfus serbest yaklaşımlar artan ilgi vardır. Yayımlanan sivrisinekler11,12,13, biyolojik olarak14,15, ışınlama16, kimyasal arıtma17,18genetik olarak değiştirilmiş, ya da sivrisinek nüfus bastırmak veya bunların yerine arboviral iletim20' ye ateşe dayanıklı sivrisinekler teknikleri-19 ile birlikte.
Wolbachia olan bir biyolojik mücadele ajanı olarak arboviruses. için kullanılmakta olan bakteri Birkaç soy-in Wolbachia son zamanlarda deneysel olarak embriyonik mikroenjeksiyon21,22,23,24kullanarak Ae. aegypti tanıtıldı. Bu suşların yaymak ve onların iletim potansiyel23,25,26,27,28 azalan sivrisinek içinde çoğaltmak için arboviruses kapasitesini azaltmak . Ancak hastalık bulaşmamış tek kadın22ile enfekte erkek dostum zaman belirli suşları kısırlık neden Wolbachia enfeksiyonlar çoluk, anneden iletilir. Wolbachia-virüslü erkekler bu nedenle doğal sivrisinek nüfus, son diğer Aedes türler15,29gösterdi bastırmak için büyük miktarlarda yayınlanacak. Wolbachia da inhibe bu yana arboviral Ae. aegyptiiletimde, ancak, sivrisinekler de yerli nüfus ile yoksul vektörel çizimler yerine yayınlanacak. Deneysel olarak Wolbachia ile enfekte Ae. aegypti are şimdi serbest bırakmak içine alan birçok ülkede bu ikinci yaklaşımı14,30,31kullanarak.
Wolbachia-arboviral denetimi için tabanlı yaklaşımlar itimat Wolbachia, Sivrisinek ve çevre arasındaki etkileşimler ses bir anlayış. Wolbachia ortaya doğal olarak çok çeşitli böcekler ve sivrisinekler tanıttı suşları onların etkileri32çeşitlidir. Yeni Wolbachia enfeksiyon türü Ae. aegypti24tanıtıldı gibi sivrisinek fitness, üreme ve koşulları bir dizi altında arboviral girişim üzerindeki etkileri için her zor karakterize etmek gereklidir. Titiz deney Laboratuvarı bu nedenle alanında başarılı olmak Wolbachia suşları potansiyeli değerlendirmek için gereklidir.
Ae. aegypti açık alan bültenleri Wolbachia enfeksiyonları ile kez sivrisinek olmak serbest bölge başına, on binlerce binlerce her hafta14,30,31yetiştirilen gerektirebilir. İlk bültenleri başarısı sivrisinekler onların verimlilik33 ve çiftleşme başarı34,35en üst düzeye çıkarmak için büyük bir boyutta serbest bırakarak geliştirilebilir. Sivrisinekler de alanında, ancak uzun vadeli laboratuvar yetiştirme değişiklikler davranış ve alan performans36,37etkileyen Fizyoloji neden olabilir yaşayacaksınız koşullarına adapte edilmelidir, 38.
Biz Ae. aegypti temel ekipman kullanarak laboratuvar yetiştirme için basit bir protokol tanımlamak. Bu iletişim kuralı için her iki vahşi türü uygundur ve Wolbachia-enfekte sivrisinekler, ikincisi olan gerektirebilir özel ilgi gibi bazı Wolbachia suşları sivrisinek hayat-Tarih özellikleri39, üzerinde önemli etkileri 40. aşırı kalabalık ve vektör yetkinlik ve fitness deneyler için önemlidir ve sivrisinekler için alan serbest bırakmak41 sağlıklı olmasını sağlar tutarlı bir boyuta sivrisinekler üretmek gıda için rekabet yetiştirme durumlardan kaçınmak . Biz laboratuvar adaptasyon ve akraba evliliği seçici baskıların azaltılması ile en aza indirmek önlemler almak ve yeni nesil sağlamak büyük, rasgele havuzundan örneklenir. Ancak, laboratuvar ortamları alan koşullarından farklı ve rahat koşullarda uzun vadeli bakım yayın içine alan37,42,43 üzerine sivrisinek fitness azaltabilir . Bu nedenle kadın alan toplanan erkeklerin periyodik olarak, laboratuvar satırlarından, deneysel karşılaştırmalar için genetik olarak benzeyen, ve için hedef alan nüfus39adapte olan koloniler sonuçlanan geçeriz. Yöntemleri herhangi bir özel ekipman gerektirmez ve arka on binlerce her hafta alan sürümleri için bireylerin ölçeklendirilebilir. Protokol ayrıca fitness kuruluş doğal nüfus için mukadder böcekler için önemli bir göz sivrisinek içinde ve nesiller arasında öncelik. Protokol sivrisinekler ve relatability alanı için tutarlı bir kalite nerede önemli özellikle deneysel karşılaştırmalar için Ae. aegypti, bakım gerektiren çoğu laboratuarlar için uygundur.

<table width="1661">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="width:287px;height:24px;">Wild type Aedes aegypti</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:1087px;">Collected from field locations in Queensland, Australia, see Yeap and others39 for details</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="width:287px;height:24px;">w Mel-infected Aedes aegypti</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Provided by Monash University. Refer to Walker and others23 for information on the strain</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="width:287px;height:24px;">w AlbB-infected Aedes aegypti</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Provided by Monash University. Refer to Xi and others21 for information on the strain</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="width:287px;height:24px;">w MelPop-infected Aedes aegypti</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Provided by Monash University. Refer to McMeniman and others22 for information on the strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:287px;height:21px;">Instant dried yeast</td>
			<td style="width:168px;">Lowan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Stimulates egg hatching. Found in general grocery stores. Other brands may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:287px;height:21px;">5 L plastic tub</td>
			<td style="width:168px;">Quadrant</td>
			<td style="width:119px;">Q110950</td>
			<td>Used for hatching and rearing larvae. Other products may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:287px;height:21px;">Fish Food (Tetramin Tropical Tablets)</td>
			<td style="width:168px;">Tetra</td>
			<td style="width:119px;">16152</td>
			<td>Provided to larvae as a source of food. Web address: https://www.amazon.com/Tetra-16152-TetraMin-Tropical-10-93-Ounce/dp/B00025Z6SE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:287px;height:21px;">Plastic containers</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used for rearing larvae. Any plastic container above 500 mL should be suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:287px;height:21px;">Glass pipette</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used for transferring larvae and pupae between containers. Web address: https://www.aliexpress.com/item/10Pcs-Durable-Long-Glass-Experiment-Medical-Pipette-Dropper-Transfer-Pipette-Lab-Supplies-With-Red-Rubber-Cap/32704471109.html?spm=2114.40010308.4.2.py4Kez</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:287px;height:21px;">Clicker counter</td>
			<td style="width:168px;">RS Pro</td>
			<td style="width:119px;">710-5212</td>
			<td>Used to assist in the counting of larvae, pupae and eggs. Web address: http://au.rs-online.com/web/p/products/7105212/?grossPrice=Y</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:287px;height:21px;">Rearing trays</td>
			<td style="width:168px;">Gratnells</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used for rearing larvae. Web address: http://www.gratnells.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:287px;height:21px;">Nylon mesh</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used to transfer larvae and pupae to containers of fresh water. Other brands may be used. Web address: https://www.spotlightstores.com/fabrics-yarn/specialty-apparel-fabrics/nettings-tulles/nylon-netting/p/BP80046941001-white</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:287px;height:21px;">Cages</td>
			<td style="width:168px;">BugDorm</td>
			<td>DP1000</td>
			<td>Houses adult mosquitoes. Alternative products may be used. Web address: http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:287px;height:21px;">35 mL plastic cup</td>
			<td style="width:168px;">Huhtamaki</td>
			<td style="width:119px;">AA272225</td>
			<td>Used to provide water or sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:287px;height:21px;">35 mL plastic cup lid</td>
			<td style="width:168px;">Huhtamaki</td>
			<td>GB030005</td>
			<td>Used to provide sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:287px;height:21px;">Cotton wool</td>
			<td style="width:168px;">Cutisoft</td>
			<td style="width:119px;">71841-13</td>
			<td>Moist cotton wool is provided as a source of water to adults. Other brands may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:287px;height:21px;">White Sugar</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Provided as a source of sugar to adult mosquitoes. Found in general grocery stores</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:287px;height:21px;">Rope</td>
			<td style="width:168px;">M Recht Accessories</td>
			<td>C323C/W</td>
			<td>Used to provide sucrose solution to adults. Other brands may be used. Web address: https://mrecht.com.au/haberdashery/braids-cords-and-tapes/cords/plaited-cord/cotton/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:287px;height:21px;">Plastic cup (large)</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used as an oviposition container. Any plastic cup that holds 100 mL of water should be suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:287px;height:21px;">Sandpaper</td>
			<td style="width:168px;">Norton Master Painters</td>
			<td>CE015962</td>
			<td>Provided as an oviposition substrate. Alternative products may be used, but we use this brand because it is relatively odorless. Lighter colors are used for contrast with eggs. Web address: https://www.bolt.com.au/115mm-36m-master-painters-bulk-roll-p80-medium-p-9396.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:287px;height:21px;">Filter paper</td>
			<td style="width:168px;">Whatman</td>
			<td style="width:119px;">1001-150</td>
			<td>Used as an alternative oviposition substrate. Other brands may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:287px;height:21px;">Latex gloves</td>
			<td style="width:168px;">SemperGuard</td>
			<td>Z560979</td>
			<td>Prevents mosquito bites on hands when blood feeding. Other brands may be used. Web address: http://www.sempermed.com/en/products/detail/semperguardR_latex_puderfrei_innercoated/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

maintaining aedes aegypti mosquitoes infected with wolbachia

Deneysel olarak Wolbachia ile enfekte aedes aegypti sivrisinek arboviruses Dang, chikungunya ve Zika gibi yayılmasını kontrol programlarında kullanılmaktadır. Wolbachia-virüslü sivrisinekler de nüfus boyutları arasında uyumsuz matings azaltmak veya virüs iletim için ateşe dayanıklı sivrisinek ile nüfus dönüştürmek için alana piyasaya sürülmelidir. Bu stratejiler başarılı olmak laboratuvar alanından içine serbest sivrisinek yerli sivrisinek ile rekabetçi olmalı. Ancak, sivrisinekler laboratuvarda Bakımı akraba evliliği, genetik sürüklenme ve onların zindelik alanını azaltabilir ve deneylerin sonuçlarını yıkmak laboratuvar adaptasyon neden olabilir. Farklı Wolbachia enfeksiyonlar dağıtımı için uygunluğu sahada test için sivrisinek kontrollü laboratuvar ortamında birden çok nesiller boyunca korumak gereklidir. Her iki Wolbachiaiçin uygundur laboratuvarında Ae. aegypti sivrisinek korumak için basit bir protokol tanımlayan-virüslü ve vahşi-türü sivrisinekler. Yöntemler laboratuvar adaptasyon en aza indirmek ve deneyler alaka alan sivrisinekler için artırın için outcrossing uygulamak. Ayrıca, koloniler onların zindelik açık alan sürümleri için en üst düzeye çıkarmak için en uygun koşullarda korunur.

Şekil 4 Ae. aegypti larva gelişimine suboptimal beslenmenin etkisi gösterir. Ne zaman kapsayıcı gıda larva günlük başına 0,25 mg ile sağlanır veya daha az, hem kadın ve erkek için Geliştirme süresini artırır, ve daha az kaplar içinde zaman uyumlu gıda 0.5 mg ile sağlanır. Yeterli gıda larva geliştirme süresi boyunca sağlanmazsa, bu bakım planı üzerinde olumsuz bir etkisi olabilir. Yavaş gelişen bireylerin karşı seçil...

Watch this Scientific Journal Video about Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia at JoVE.com

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti sivrisinek enfekte Wolbachia ile bakımını yapma

Wolbachia ile enfekte aedes aegypti sivrisinek arboviruses iletimini bastırmak için doğal nüfus serbest edilmektedir. Biz laboratuvar adaptasyon ve seçimi en aza indirmek önlemler alarak deneyler ve alan açıklaması, arka Ae. aegypti laboratuvarda Wolbachia enfeksiyonları ile yöntemleri açıklanmaktadır.

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

maintaining-aedes-aegypti-mosquitoes-infected-with-wolbachia

Research

JoVE Journal

Biology

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

14.1K Görüntüleme.  Bio21 Institute and University of Melbourne. Wolbachia ile enfekte aedes aegypti sivrisinek arboviruses iletimini bastırmak için doğal nüfus serbest edilmektedir. Biz laboratuvar adaptasyon ve seçimi en aza indirmek önlemler alarak deneyler ve alan açıklaması, arka Ae. aegypti laboratuvarda Wolbachia enfeksiyonları ile yöntemleri açıklanmaktadır.

Video: Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Wolbachia Bacterial Infection in Drosophila

My name is Voia Friedman. I am associate researcher at Princeton University. And today I'm going to tell you about a few protocols that I developed to trans infect, to I initially to isolate, to go back from the heli of infected flies, and later on help to inject the heli feed to unaffected flights.So basically, this is a very simple protocol to isolate him oly for basics. And you will use this device from, from mepo that contains a filter that goes on top of an E.So you basically needs to put you, we start from around a hundred flies. You anize the flies, you put them into the filter device, you can just use a funnel and that will add our other fit very easily on this device and wash it with 70%ethanol.You just take the, take the future away, you can throw away the ethanol, and then after three times your last wash you do with molecule water because you don't want have the bacteria from the, with traces of ethanol. Well, and then you just go to a new weapon door and, and then you spin down on a micro, real micro for two minutes And later on how you can inject that. He only feed do unaffected flies.So basically take a double stick tape and usually these double stick tapes have two side, one side is a sticker than the other. So leave the sticker side up because that's the side that you're gonna glue that flies on top of it. And basically you'll, the gas apparatus, if you have this light on top of it, you'll be no gas flow and the flies you wake up if they're on top of the slide.So you can just direct the flow, making a little hood, a little chamber using tape. Then you direct the gas over the flies. So then you put your, this light here with the tape and you, you have your flies.Stick the flies on the top of the tape, all of them the same orientation, and put their head towards the direction that you'll be bringing the needle from. Because then you can just over the, the wing, you make sure since they fly, you don't want to fly. If they woke up during the procedure, don't want them to go away.So make sure that you take a little tip and pressure against the, the, the wings of the fly on the tail. And it's okay if they wings get damaged. And when you get rid, when you take the flies up the injection, most likely they'll lose their wings anyway, so they'll survive.That can, that can be useful because you're not gonna lose the flies that, so he puts a mineral oil on the micrometer for the back of the needle, then the needle injection polar, and then the, you can just adjust the pressure to bring the material up to the tip of the needle. I, I did to inject Somewhere between 10 to 15 nanoliters, but as, as long, as long as I'm consistents. Okay, so one important detail there is a cushion of this experiment is that the, the fly, once the apply is being injected when you saw the needle needs to come as far as you can through the upper part of the abdomen.Because here, basically when the needle penetrates, you have a, a, a, a, a bigger space to go up and down. And basically if it's close, closer to the cuticle, it's less likely they're gonna penetrate vital organs in the flight. You, it is very likely unlikely that you're gonna punch a hole in your gut, for instance, if that is gonna kill the flight that you are performing the surgery.My name is Voia Friedman. I am associate researcher at Princeton University in the lab of Eric Hels. And today I would like to tell you about this protocol that you just saw, the demonstration.So this protocol was done because we wanted to prove that UBA is capable of crossing tissues. So UBA is one of the most successful intracellular paras on the face of the earth. Infects from 20 to 70%of insects and many particles.And also is, is very important in terms of human diseases because also infect nematodes that transmit diseases like river blindness or s and ssis. And so, and CCA is our obligatory endo in, in these worms. And there's a great, a very big interest in using CCA also as means to control parasitic diseases transmitter by mosquito and Danny and this and by mosquito such as malaria and dengue.So this, this, this protocol basically was developed to show that once CCA inside the abdominal cavity of a fly, they can cross tissues and reach the germ. So basically what you can see here is the oph of the drosophila ovary and go back once present in the he leaf it, it can cross a pink peronial. She that is around the ovary.And then they cross a muscle layer. And actually one of the first places that they, they go inside the ovary is the somatic stem cell image. And then they can reach the germline.And this bacteria is transmitted the same way that mitochondria is transmitted is through, is through the mother transmitted, through the mother cyop plants present in the egg. So of course they needs to be present into the germline. So that's why this protocol is developed.And this protocol is, can be very useful to basically traditionally the way that people would try to trans infect wbaa basically take wbaa and introduce a new insect species. It would be through doing micro injections into the, into the embryo. But those are much more complicated.And basically here we are just taking advantage of the o biology since they are capable to cross tissues and moving into the stem cell tissues from, they can pass to the, through to the germline. So that's make easier taking UBA from certain, from, from certain species of insects that are infected and they can be transmitted to uninfected species. Prob I think it's the injection itself.Basically you need to be careful to mobilize the fly as well as you can. We are using double sided stick tape and you need to penetrate the needle basically as close to the, as parallel to the fly as possible so you don't go to deep. And it's less likely that we're gonna kill the fly after they're performing the surgery.

Drosophila Wolbachia Bakteriyel Enfeksiyon

Biyoloji

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Transgenik Sivrisinekler Edinme A. aegypti Embriyolar Mikroenjeksiyon

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Dang Enfeksiyonlar Sivrisinekler (A. aegypti) ve Enfeksiyon Fenotip belirlenmesi için protokol

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Maintaining Wolbachia in Cell-free Medium

In this video protocol, procedures are demonstrated to (1) purify Wolbachia symbionts out of cultured mosquito cells, (2) use a fluorescent assay to ascertain the viability of the purified Wolbachia and (3) maintain the now extracellular Wolbachia in cell-free medium.  Purified Wolbachia remain alive in the extracellular phase but do not replicate until re-inoculated into eukaryotic cells.  Extracellular Wolbachia purified in this manner will remain viable for at least a week at room temperature, and possibly longer.  Purified Wolbachia are suitable for micro-injection, DNA extraction and other applications. 


This video describes a method for purifying Wolbachia pipientis from an Anopheles gambiae cell line and then culturing the endosymbiont in cell-free medium. An assay for viability of the bacterium is demonstrated.

Hücre Orta Wolbachia bakımı

In this video protocol, procedures are demonstrated to (1) purify Wolbachia symbionts out of cultured mosquito cells, (2) use a fluorescent assay to ...

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol demonstrates dissection techniques for removal of the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes. 



The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for vector pathogens like Plasmodium falciparum and the dengue virus. This video demonstrates the dissection techniques for removing the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes.

Ae midgut ve Tükürük Bezlerinin Diseksiyon. aegypti Sivrisinekler

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Building a Better Mosquito: Identifying the Genes Enabling Malaria and Dengue Fever Resistance in A. gambiae and A. aegypti Mosquitoes

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus infections.   Explanation is given for how key refractory genes, those genes conferring resistance to vector pathogens, are identified in the mosquito and how this knowledge can be used to generate transgenic mosquitoes that are unable to carry the malaria parasite or dengue virus.

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus infections. Explanation is given for how key refractory genes, those genes conferring resistance to vector pathogens, are identified in the mosquito and how this knowledge can be used to generate transgenic mosquitoes that are unable to carry the malaria parasite or dengue virus.

Bina daha iyi Sivrisinek: Sıtma ve Dang Ateşi Direnç A. gambiae ve A. aegypti Sivrisinekler etkinleştirilmesi Genler belirlenmesi

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion rate. This method can be used to obtain a better understanding of the process of diuresis in insects and is especially useful in the study of diuresis in blood-feeding arthropods that are able to take up huge amounts of liquid in a single blood meal. 
This RNAi-mediated gene knockdown combined with an in vivo diuresis assay was developed by the Hansen lab to study the effects of RNAi-mediated knockdown of aquaporin genes on Aedes aegypti mosquito diuresis1. 
The protocol is setup in two parts: the first demonstration illustrates how to construct a simple mosquito injection device and how to prepare and inject dsRNA into the thorax of mosquitoes for RNAi-mediated gene knockdown. The second demonstration illustrates how to determine excretion rates in mosquitoes using an in vivo bioassay.

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

In this protocol we combine RNAi-mediated gene silencing with an in vivo diuresis assay to study the effects knockdown of genes of interest has on mosquito fluid excretion.

RNAi-aracılı Gene Nakavt ve<em&gt; In Vivo</emYetişkin Kadınlar&gt; diürez Testi<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Sivrisinekler

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Using two methods to estimate gene expression in the major gustatory appendages of Aedes aegypti, we have identified the set of genes putatively underlying the neuronal responses to bitter and repulsive compounds, as determined by electrophysiological examination.

Fizyolojik Kayıtlar ve Sarı-ateş Sivrisinek Tat Çıkıntılara RNA Sıralama<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect fat body tissue is usually distributed throughout the insect body. However, it is often concentrated in the abdomen and attached to the abdominal body wall.
The mosquito fat body is the sole source of yolk proteins, which are critical for egg production. Therefore, the in vitro culture of mosquito fat body tissues represents an important system for the study of mosquito physiology, metabolism, and, ultimately, egg production. The fat body culture process begins with the preparation of solutions and reagents, including amino acid stock solutions, Aedes physiological saline salt stock solution (APS), calcium stock solution, and fat body culture medium. The process continues with fat body dissection, followed by an experimental treatment. After treatment, a variety of different analyses can be performed, including RNA sequencing (RNA-Seq), qPCR, Western blots, proteomics, and metabolomics.
In our example experiment, we demonstrate the protocol through the excision and culture of fat bodies from the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, a principal vector of arboviruses including dengue, chikungunya, and Zika. RNA from fat bodies cultured under a physiological condition known to upregulate yolk proteins versus the control were subject to RNA-Seq analysis to demonstrate the potential utility of this procedure for investigations of gene expression.

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The fat body is the central metabolic organ in insects. We present a live organ culture system that enables the user to study the responses of isolated fat body tissue to various stimuli.

Yağ vücut Organ kültür sistemi içinde Aedes Aegypti, bir vektör Zika virüs

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness parameters, in particular egg production and hatch rates at the individual level, conventional methods have put a substantial burden on investigators due to high labor intensity and laboratory space requirements. Described is a simple method using 24 well tissue culture plate with agarose in each well and digital imaging of each well to determine egg numbers and hatch rates at an individual level with substantially reduced time and space requirements.

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates EAgaL Plates

Described is a time and space-saving method to count eggs and determine hatch rates of individual mosquitoes using 24 well tissue culture plates, which can substantially increase the scale and speed of fecundity and fertility assays.

24 Kuyu Doku Kültürü Plakası (EAgaL Plakaları) kullanılarak Aedes aegypti için Geliştirilmiş Doğurganlık ve Doğurganlık Tahlilleri

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness ...

Aedes aegypti sivrisinek enfekte Wolbachia ile bakımını yapma

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler