NIH P01 HL112730 (bez, JVE), NIH R01 HL132075 (bez, JVE), Barbra Streisand kadın kalp Merkezi (bez, JVE), Dorothy ve E. Phillip Lyon sandalye moleküler Kardiyoloji (bez), Erika Glazer donatılmış sandalye kadın kalp sağlığı (JVE) ve Çek bilim Kurumsal Destek RVO: 68081715 (MS).

Tüm hayvan çalışmaları kurumsal kılavuzlarınıza uygun olarak gerçekleştirilen ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Cedars-Sinai Tıp Merkezi tarafından onaylanmış.
1. Langendorff perfüzyon fare kalp
<ol><li>
Langendorff perfüzyon fare kalp iskemi reperfüzyon ile
	<ol>
<li>Mayi Fentobarbital sodyum yönetmek 70 mg/kg yetişkin fare (8-hafta-yaşlı, Erkek, C57BL6/j). Derin anestezi çimdik baştan aşağı çekilmesi eksikliğinden onaylayın.</li>
		<li>Anticoagulate mayi heparin 500 ile U/kg.</li>
		<li>Göğüs sternal kesi ile açın. Diyafram açın ve anterior aksiler eksen için nodern sınırı boyunca kesilmiş. Sonra anterior aksiler eksen tamamen göğüs kafesi açmak için forelimb kadar kesti. Sonra kalbin görüntülenmesi, artan aort forseps ile kelepçe ve hızla kalp tüketim. Kan kaybı nedeniyle ölümdür. Kalp soğuk Krebs yerleştirin (NaCl 6.9 g/L, KCl 0.35 g/L, NaHCO3 2.1 g/M, KH2PO4 0,16 g/L, MgSO4 0.141 g/L, glikoz 2 g/M ve CaCl2 0.373 g/L).</li>
		<li>Bir künt uçlu iğne ile aort cannulate ve kalp retrogradely Krebs çözüm sürekli baskı modunda ile sıvı.</li>
		<li>15 dk sonra bir istikrar süre 30 dk 30 dakika reperfüzyon takip için küresel bir akış olmayan iskemi kalp tabi.</li>
		<li>Kalpler 15 dk temel perfüzyon sonra sonra 30 dk iskemi veya 30 dk reperfüzyon sonra hasat. Kulakçık trim ve ek-doku sıvı azot kıpırdama.</li>
		<li>-80 ° C'de kullanmak kadar saklamak</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. doku homojenizasyon, Solubilization ve sukroz yoğunluk Gradient sedimantasyon
<ol><li>
Degrade hazırlık
	<ol>
<li>100 mL sukroz, 4 mL NaCl 2, 5 M karıştırma 2 çözümleri (% 15 ve % 50) hazırlamak; 0.8 mL MgCl2 1,25 M; 1 mL Tris-HCl 1 M, pH 7.5; 15 g veya sukroz 50 g (% 15 ve % 50, anılan sıraya göre); Ultrasaf Su 100 mL ulaşmak için; ve Ksilen cyanol % 15 çözüm renk (0,02 mg/mL)</li>
		<li>Her çözüm (0,22 µm filtreleri) filtre</li>
		<li>Degrade kullanılmak üzere gün 40 mL her sükroz çözeltisi hazırlamak ve sikloheksimit son 100 µg/mL konsantrasyonu elde etmek için her çözüm<ol>
<li>% 15 ve % 50 sükroz çözüm arasında bir karışım hazırlamak için bir degrade makinesi kullanın</li>
			<li>% 15 sükroz degrade sol bölmesinin 5 mL ile doldurmak</li>
			<li>Sağ bölmenin % 50 sükroz gradyan ile doldurmak</li>
			<li>Musluğu açın ve iki küçük bölmeler manyetik karıştırıcı ile karıştırın pompa geçiş</li>
			<li>Kullanım bir tüp karışık sükroz çözüm ince duvarlı bir ultra-Santrifüjü tüp akışı için izin vermek için ikinci dokunun bağlı. Son hacim yaklaşık 10 mL olacak.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Degradeler 4 ° C'de tutmak (gerekirse bir gecede, ama uzun olmayan)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Homojenizasyon kalp doku
	<ol>
<li>Taze veya dondurulmuş kalp ile filtre uygulanmış lizis arabelleği (sukroz degrade ayırma için değiştirilmiş) bir polytron homojenize 100 mM KCl, 20 mM Tris pH 7.5, 5 mM MgCl2, %0,4 içeren NP-40. Sikloheksimit 100 µg/polysome yapısı, 0.1 U RNase inhibitörü ve proteaz inhibitörü kokteyl (50 mL için 1 tablet) korumak için mL içerir.</li>
		<li>Lysate kuluçkaya üzerinde buz 15dk.</li>
		<li>18.000 x g 4 ° C'de çözünmez malzeme çıkarmak ve süpernatant toplamak için 15 dakika, santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>(Bkz: Şekil 2) protein tayini, RNA izolasyon ve RNA bütünlük analizi için 50 µL saklıdır.</li>
		<li>Süpernatant (500-100 µL) degradeler üzerine katman ve lizis arabellek tüplerini denge.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sedimantasyon ve kesirler toplanması
	<ol>
<li>Ultrasantrifüj sallanan bir kova Open End 4 ° C'de 37.000 devirde 120 min için gerçekleştirin. Üreticiye göre bu 228,000 x g maksimal RADIUS de karşılık gelir.</li>
		<li>Her degrade 254 absorbans sürekli izlenmesi ile microcentrifuge tüpler 17 kesir (yaklaşık 600 µL Kesir) olarak toplamak nm (OD254).</li>
		<li>Kesir Toplayıcı aşağıdaki gibi programı:<ol>
<li>Toplama (tüp geçişin daha önce bulunan sıvı karşılık gelen) ilk 3 dk atmak</li>
			<li>4-19 dk 17 kesirler 1 mL/dk hızında kesirler toplamak.</li>
		</ol>
</li>
		<li>En kısa zamanda her toplanır kesirler buza koyun. Eğer onlar hemen işlenmeyen örnekleri-80 ° C'de dondurmak. Bu toplanır gibi tipik bir UV densitometric izleme geçişin Şekil 1' de gösterilmiştir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. yalıtım ve mRNA'ların Polysome ve Nontranslating kesirler Analizi
<ol><li>
MRNA çıkarımı
	<ol>
<li>Toplandıktan sonra flaş donmuş olsaydı on Ice, kesirler tezcan</li>
		<li>Her kesir 200 µL için taze bir tüp transferi Not: Bu adımda iki veya daha fazla ardışık kesirler birlikte havuza alınmış. Dikkatli bir şekilde polysome ve polysome kesirler karışmak yok böylece OD254 grafik analiz sonra yapılmalıdır.</li>
		<li>10 ekleyin luciferase RNA normalleştirme amaç için her örnek için iç kontrol olarak ng. Not: Luciferase astar bir iç kontrol sonuçları normalleştirmek için kullanılmalıdır.</li>
		<li>RNA ayıklama reaktif (fenol ve guanidin isothiocyanate monophasic çözüm; bkz: Malzemeler tablo) 700 µL her tüp için ekleyin. Mix iyi ve RT (Oda sıcaklığında), 5 min için tüpler kuluçkaya.</li>
		<li>140 µL kloroform ve girdap 15 s. Incubate 2-3 dk RT. az için add ögesi</li>
		<li>Örnekleri, 12.000 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi</li>
		<li>Dikkatle üst sulu faz için yeni bir tüp aktarın.</li>
		<li>Kesirler RNA içeriği yüksek olmadığından, glikojen 10 µg her tüp için taşıyıcı olarak ekleyin.</li>
		<li>350 µL isopropanol her tüp için ekleyin. Mix iyi ve verimi artırmak 1 h için-20 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Santrifüj, 12.000 x g 4 ° C'de 15 dakika</li>
		<li>Süpernatant atmak ve RNA Pelet yıkamak için %75 700 µL etanol ekleyin.</li>
		<li>Santrifüj 7,500 x g 4 ° C'de, 5 min için</li>
		<li>Etanol kaldırmak ve 10-15 dk için kuru Pelet hava girsin. Not: aşırı RNA Pelet kurutma suda tam onun solubilization engeller.</li>
		<li>RNA Pelet RNase free ultrasaf H2o 50 μL içinde resuspend</li>
		<li>Örnekleri 55 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya</li>
		<li>Her örneğinin 2 μL ayıklanan RNA miktarı ve kalitesini ölçmek ve kalan-80 ° C'de depolamak için kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ters transkripsiyon ve qPCR
	<ol>
<li>Ters transkripsiyon cDNA sentezi 4 μL kullanın (bkz. Tablo reçetesi) 20 μL tepki için kit. Supermix örnek sayısına göre hazırlayın. Her tüp için gerekli ses aktarım ve giriş RNA 5 μL her tüp için ekleyin. Bu birimin Taq polimeraz çalışma koşulları aralığı için alakalı olacak şekilde düzeltilebilir.</li>
		<li>Üretici tarafından önerilen aşağıdaki programı ile termal cycler tüplerde kuluçkaya: 5 dk 25 ° c, 20 dk 46 ° C'de 20 dk için Ters transkripsiyon ve transkriptaz inactivation 95 ° C'de 1 dk</li>
		<li>QPCR astar her çift için en iyi duruma getirilmiş programı çalıştırın. Not: kesirler içinde belirli mRNA'ların olup olmadığını belirlemek için her kısmını (izole RNA) eşit birimden Ters transkripsiyon için kullanılmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analiz sonuçları
	<ol>
<li>Delta Ct değerleri hesaplamak için baktılar gen ve luciferase Ct değerini kullanın</li>
		<li>Her kesir delta Ct değeri farklı fraksiyonları (Tablo 1) arasında mRNA dağılımını görselleştirmenizi bütün fraksiyonları bulunan mRNA toplamının yüzdesi olarak ifade</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. yalıtım ve Analizi miRNAs Polysome kesirler ve Nontranslating kesirler
<ol><li>
MRNA ve miRNA çıkarma Not: Bu protokol birkaç değişiklikle üreticisinin yönergelerini takip eder.<ol>
<li>Glikojen ve spike denetimi çözülme. Buz üstünde tutun.</li>
		<li>MiRNA ayıklama reaktif 700 µL havuza alınan örnek 200 µL için ekleyin.</li>
		<li>1 µg/µL glikojen ekleyin ve pipet kullanarak lunaparkçı. Oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.</li>
		<li>3.5 µL 1.6 x 108 spike içinde denetimi ekleyin ve karıştırın.</li>
		<li>Kloroform ve girdap 200 µL eklemek için en az 15 sn.</li>
		<li>3 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>4 ° C'de 15 dakika 12.000 x g , santrifüj</li>
		<li>Bir pipet kullanarak, süpernatant yeni bir 1,5 mL tüp aktarın. Orta ve alt aşamaları atmak.</li>
		<li>1.5 x hacmi % 100 etanol süpernatant için ekleyin ve karıştırın.</li>
		<li>Bu karışımdan 700 µL miRNA ayıklama sütuna aktarmak ve 15 tam hızda santrifüj kapasitesi s RT ve atma akışı-aracılığıyla; kalan herhangi bir örnek ile bu işlemi tekrarlayın.</li>
		<li>Arabellek 1 700 µL sütununu ekleyin ve 15 tam hızda santrifüj kapasitesi RT; s akışı aracılığıyla atın.</li>
		<li>Arabellek 2 500 µL sütununu ekleyin ve 15 tam hızda santrifüj kapasitesi RT; s akışı aracılığıyla atın.</li>
		<li>500 µL % 80 etanol sütununu ekleyin ve RT 2 min için tam hızda santrifüj kapasitesi; akışı aracılığıyla atın.</li>
		<li>Yeni 2 kapağını mL Tüp, kapağı açın ve bu RT tam hızda 5 dk santrifüj kapasitesi sütun transfer; akışı aracılığıyla atın.</li>
		<li>O tam eluate buz üzerinde hız 1 dk az dik tutmak için ya da ilerideki analizleri için-80 ° C'de depolamak sütun ve santrifüj 16 µL RNAse free su ekleyin. Not: Her örneğinin iki microliters OD analizi için kullanılabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ters transkripsiyon
	<ol>
<li>Buzda hazırlayın. Her 20 µL RT-PCR reaksiyon için 4 µL miRNA RT arabelleği, nükleik asitlerin 2 µL, toplam RNA, enzim 2 µL ve su RNAse free 3 µL 9 µL ekleyin; Bunu karıştırıp kısaca aşağı sıralayacağız.</li>
		<li>Termal Cycler aşağıdaki gibi ayarlayın: 60 dk 37 ° C; 95 ° C 5 min için; 4 ° C tutun.</li>
		<li>Termal cycler tüpler kaldırın ve 200 µL RNAse free su ekleyin. -20 ° C'de depolayın veya gerçek zamanlı PCR için devam edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gerçek zamanlı PCR Not: Bu protokol 96 iyi plaka biçimi izler. Buz reaksiyon karışımına hazır olun.<ol>
<li>PCR reaksiyon karışım hazırlamak ve cDNA (dan miRNAs yukarıdaki) iletişim kuralı tarafından kabul aralığı göre ekleyin. Toplu iş iş işlemde birden çok tepkiler hazırlanabilir.</li>
		<li>Toplam 25 µL PCR karışımı + cDNA her kuyuya ekleyin.</li>
		<li>Bir optik plaka mühür kullanarak plaka mühür.</li>
		<li>1 dk 1000 x g oda sıcaklığında az plaka santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Gerçek zamanlı cycler programı aşağıdaki gibi: İlk harekete geçirmek adım 15dk için 95 ° c; 3-adım Bisiklete binme: 15 94 ° C'de denatürasyon s; 30 55 ° C'de tavlama s; uzantısı için 30 70 ° C'de s (floresan veri toplama gerçekleştirmek); 40 döngüleri eklemek; Erime-eğri cycler varsayılan göre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Karşılaştırmalı Analizi
	<ol>
<li>Normalleştirme örneği (bkz. Tablo 2):<ol>
<li>SCM en küçük değerini bulmak.</li>
			<li>Bu en az tüm SCM değerleri normalize.</li>
			<li>Bu değer miRNAs faiz (MOI) ve referans gen (REF) Ct değerlerinden çıkarma.</li>
			<li>2-ΔCt formülü kullanarak verileri analiz.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. proteomik analizi
<ol><li>
Proteinlerin çıkarma polysome kesirler
	<ol>
<li>Toplanan sükroz kesirler üç final kesirler birleştirin. Kesirler ağır (yüksek verimlilik polizomlar havuza alınan kesirler 4, 5, 6 ve 7 sükroz en yüksek konsantrasyon ile; Degrade tüp alt), mark ışık (düşük verimlilik polizomlar havuza alınan kesir 8, 9, 10 ve 11; ortasına Degrade tüp) ve (sukroz 12, 13, 14 ve 15 En düşük konsantrasyon ile havuza alınan kesirler; Degrade tüp üst) sigara çeviri . Protein tahlil havuza alınan kesirler gerçekleştirin.</li>
		<li>Trichloroacetic asit (TCA) stokunun % 100 hazırlamak ve karanlıkta 4 ° C'de saklayın. Örnek 0.5 mL %100 60 µL ile karıştırın TCA ve gece karanlıkta-20 ° C'de kuluçkaya. Not: 1,5 mL düşük protein saklama tüpler ( Tablo malzemelerigörmek) kullanın.</li>
		<li>Gecede kuluçka sonra buz ve santrifüj 15.000 x g, 30 dk. atma süpernatant için 4 ° C, örnek çözülme. Not: Toplam protein örnek 100 µg tüp alt kısmında görünür protein Pelet verir.</li>
		<li>Önceden aseton-20 ° C-dondurucu soğuk. Protein Pelet ve santrifüj 15.000 x g, 15 dk. atma süpernatant için 4 ° C de soğuk aseton 0.5 mL ekleyin. Bu iki kez tekrarlayın.</li>
		<li>Hava kuru Pelet. Pelet 50 mM Tris-HCl tampon (pH 8) 360 µL içinde resuspend. Not: gerekirse, Pelet resuspend için bir darbe sonicator kullanın.</li>
		<li>0.1 M dithiothreitol 40 µL ekleyin (son konsantrasyonu 10 mM) ve 55 ° c için 45 dk. Ekle 50 µL 0.15 M iodoacetamide, shaker üzerinde kuluçkaya (son konsantrasyonu 17 mM) ve shaker için 30 dk içinde karanlık oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>Tripsin çözüm hazırlamak: tripsin 20 µg 50 mM Amonyum Bikarbonat 100 µL içinde resuspend. Tripsin çözüm ilgili birim için örnek 1:50 at (w/w) eklemek tripsin: protein oranı, bu pH 8 olduğundan emin olun ve shaker 37 ° c üzerinde kuluçkaya gecede. Not: 1 M Amonyum Bikarbonat pH 8'e getirmek için ekleyin.</li>
		<li>Tripsin sindirim sonra serin örnek, tezgah santrifüj, kısaca santrifüje eklemek %10 formik asit tripsin etkinlik gidermek ve örnek desalting ile devam etmek için pH 2-3. Not: μ-elüsyon plaka örnek desalting için kullanın.</li>
		<li>Durumda jelleştirici kuyuları ile üç kez Klima tarafından %0,1 formik asit 200 µL tarafından üç kez takip vakum kullanma metanol 200 µL 96 iyi plaka. Örnek yüklemek ve üç kez 200 µL %0,1 formik asit kullanarak bir örnek yıkama gerçekleştirin. Örnek 100 µL % 50 acetonitrile/0.1% formik asit ile iki kez düşük protein saklama 0.5 mL tüp içine elute. Not: örnek Elute yavaş yavaş ilk başta yerçekimi kullanarak düşük vakum tarafından izledi.</li>
		<li>Dar kurutma başlığını kullanarak kuruluk için örnek eluate buharlaşır ve ya doğrudan kütle spektrometresi analiz veya mağaza taşımak-80 ° c kadar kullan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kütle spektrometresi Analizi
	<ol>
<li>Her Pelet (tryptic peptidler oluşan) 50-100 µL sulandırmak ve 1 µL kütle spektrometre enjekte. Not: Sulandırma ve enjeksiyon birimleri LC/MS/MS sinyal maksimum yoğunluk elde etmek için en iyi duruma getirme. Bizim durumumuzda, yüksek sinyal (Toplam iyon geçerli; İçinde TIC) aralığındaki 1E8 2E9 için kalp taraması yapıldı.</li>
		<li>Bir tuzak sütun C18 kullanın (300 µm kimlik x 5 mm, 5 µm, 100Å) tarafından takip peptid ayrılık C18 sütun (75 µm kimlik x 250 mm, 2 µm, 100Å) kullanarak bir akış hızı ayarı, 300 nL/dak Set nano-kaynak kapiller sıcaklık ile 275 ° C ve sprey voltajı 2 kV.</li>
		<li>5-%35 B 90 dk, 3 dk için 35-%95 B %95 B 7 dk. ve %5 B 25 dk (A: %0,1 formik asit/su ve B: %0,1 formik asit Asetonitril) için denge holding doğrusal degrade uygulayın. MS2 spectra CID modunu kullanarak her MS1 inceden inceye gözden geçirmek--dan 15 en yüksek yoğunluk iyonları için kazanmak. 3 kütle spektrometresi çoğaltır analiz her örnek için kullanın. Not: En iyi duruma getirme ve deneysel koşullar ve örneklerinizi belirli kütle spektrometresi cihazda için uygun olan parametreleri kullanın. Koşulları/5.2 bölümünde açıklanan parametreleri. kullanılan ve bizim laboratuvar olarak en iyi duruma getirilmiş.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protein tanımlama/Nefelometri
	<ol>
<li>Kütle spektrometresi analiz sonra ham spectra dosyaları MSConvert yazılım (http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html) kullanarak uyumlu mzXML dosyalarına dönüştürün.</li>
		<li>Sun dönüştürülen dosyaları SEQUEST arama motoruna arama ölçütleri ile Örneğin, UniProtKB/İsviçre-Prot fare veritabanı (en kanonik gözden güncel); tripsin kullanarak yarı enzim Özet (KR sonra /-); 2 nefrette özledim; öncü Kütle aralığı: 400-4.500 amu; statik değiştirme: carbamidomethyl (C) 57.021465 amu; peptid kitle tolerans: 50 ppm; parçası kitle türü: monoisotopic. Not: Diğer protein veritabanı arama motorları ve veri boru hatları kullanılabilir. Bir veritabanı veritabanları fare ve insan için daha az tam olan Örneğin fare için kullanıyorsanız fare (ve/veya insan karşı) aramanız gerekebilir Proteom kapsama artırmak için veritabanları. Bu durumda, fazlalık protein adlarındaki kaldırılması gerekir.</li>
		<li>Bir sonrası arama çözümlemesi gerçekleştirin. Verileri görüntülemek için filtreleri ayarlayın. Örneğin, bir minimum protein olasılık (protein eşik) %95 veya % 99, sadece kendisi için bir istatistiksel analiz örnek mevcut olan %95 veya % 99 olasılık anlamına gelir proteinler-ecek var olmak göstermek Yani, olarak ayarlayın. Peptid eşik (örn., %95), için filtre ayarlamak Yani, bir spektrum bir peptid tanımlar olup olmadığını belirlemede kullanılacak en düşük bir olasılık. Bir protein mevcut olup olmadığını belirlemek peptitleri en az sayısını seçin (2 peptidler olarak en az protein tanımlama için önerilir).</li>
		<li>Kalite/miktar için saptanan proteinler değerlendirin. Proteotypic peptidler miktar için kullanıldığından emin olun. İzoformu tanımlanmazsa üsleri belirli izoformu benzersiz bir amino asit dizisi oluşan bir tryptic peptid gözlenmesi üzerinde olduğundan emin olun. Herhangi bir "benzer" veya varsayımsal proteinler karşılaştırma görmek için geçmesi gözlenen peptidler karşılık gelen için bilinen bir protein.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pourpirali, S., Valacca, C., Merlo, P., Rizza, S., D&#8217;Amico, S., Cecconi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+pseudohypoxia+targets+ambra1+mrna+to+p-bodies+for+translational+repression.">Prolonged pseudohypoxia targets ambra1 mrna to p-bodies for translational repression.</a> PLoS ONE. 10, e0129750 (2015).</li><li>Andres, A. M., Tucker, K. C., Thomas, A., Taylor, D. J., Sengstock, D., Jahania, S. M., Dabir, R., Pourpirali, S., Brown, J. A., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W., Mentzer, R. M., Gottlieb, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+and+mitochondrial+biogenesis+in+atrial+tissue+of+patients+undergoing+heart+surgery+with+cardiopulmonary+bypass.">Mitophagy and mitochondrial biogenesis in atrial tissue of patients undergoing heart surgery with cardiopulmonary bypass.</a> JCI Insight. 2, e89303 (2017).</li><li>Kislinger, T., Cox, B., Kannan, A., Chung, C., Hu, P., Ignatchenko, A., Scott, M. S., Gramolini, A. O., Morris, Q., Hallett, M. T., Rossant, J., Hughes, T. R., Frey, B., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+survey+of+organ+and+organelle+protein+expression+in+mouse:+Combined+proteomic+and+transcriptomic+profiling.">Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: Combined proteomic and transcriptomic profiling.</a> Cell. 125, 173-186 (2006).</li><li>Kren, B. T., Wong, P. Y., Shiota, A., Zhang, X., Zeng, Y., Steer, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+trafficking+of+transcripts+and+micrornas+in+regenerating+liver+after+partial+hepatectomy.">Polysome trafficking of transcripts and micrornas in regenerating liver after partial hepatectomy.</a> American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, G1181-G1192 (2009).</li><li>Gottlieb, R. A., Pourpirali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lost+in+translation:+Mirnas+and+mrnas+in+ischemic+preconditioning+and+ischemia/reperfusion+injury.">Lost in translation: Mirnas and mrnas in ischemic preconditioning and ischemia/reperfusion injury.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 95, 70-77 (2016).</li><li>Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+initiation+during+stress+conditions+by+polysome+profiling.">Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li><li>Lorsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+enzymology.+Laboratory+methods+in+enzymology:+Rna.+Preface.">Methods in enzymology. Laboratory methods in enzymology: Rna. Preface.</a> Methods in Enzymology. 530, xxi (2013).</li><li>Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+polysomal+fractions+from+mouse+brain+synaptoneurosomes+and+analysis+of+polysomal-bound+mrnas.">Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mrnas.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).</li><li>He, S. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+of+mammalian+cells.">Polysome analysis of mammalian cells.</a> Methods in Enzymology. 530, 183-192 (2013).</li><li>Molotski, N., Soen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+association+of+micrornas+with+polysomes+reflects+distinct+strengths+of+interactions+with+their+mrna+targets.">Differential association of micrornas with polysomes reflects distinct strengths of interactions with their mrna targets.</a> RNA. 18, 1612-1623 (2012).</li><li>Maroney, P. A., Yu, Y., Fisher, J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+micrornas+are+associated+with+translating+messenger+rnas+in+human+cells.">Evidence that micrornas are associated with translating messenger rnas in human cells.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1102-1107 (2006).</li><li>Paul, P., Chakraborty, A., Sarkar, D., Langthasa, M., Rahman, M., Bari, M., Singha, R. S., Malakar, A. K., Chakraborty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+mirnas+and+human+diseases.">Interplay between mirnas and human diseases.</a> Journal of Cellular Physiology. 233, 2007-2018 (2018).</li><li>Rupaimoole, R., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microrna+therapeutics:+Towards+a+new+era+for+the+management+of+cancer+and+other+diseases.">Microrna therapeutics: Towards a new era for the management of cancer and other diseases.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16, 203-222 (2017).</li><li>Nelson, P. T., Hatzigeorgiou, A. G., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mirnp:Mrna+association+in+polyribosomes+in+a+human+neuronal+cell+line.">Mirnp:Mrna association in polyribosomes in a human neuronal cell line.</a> RNA. 10, 387-394 (2004).</li><li>Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+let-7a+mirna+blocks+protein+production+on+actively+translating+polyribosomes.">Human let-7a mirna blocks protein production on actively translating polyribosomes.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1108-1114 (2006).</li><li>Kim, J., Krichevsky, A., Grad, Y., Hayes, G. D., Kosik, K. S., Church, G. M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+many+micrornas+that+copurify+with+polyribosomes+in+mammalian+neurons.">Identification of many micrornas that copurify with polyribosomes in mammalian neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 360-365 (2004).</li><li>Androsavich, J. R., Chau, B. N., Bhat, B., Linsley, P. S., Walter, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-linked+microrna-21+exhibits+drastically+reduced+mrna+binding+and+silencing+activity+in+healthy+mouse+liver.">Disease-linked microrna-21 exhibits drastically reduced mrna binding and silencing activity in healthy mouse liver.</a> RNA. 18, 1510-1526 (2012).</li><li>Kraushar, M. L., Thompson, K., Wijeratne, H. R., Viljetic, B., Sakers, K., Marson, J. W., Kontoyiannis, D. L., Buyske, S., Hart, R. P., Rasin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+defined+neocortical+translation+and+polysome+assembly+are+determined+by+the+rna-binding+protein+hu+antigen+r.">Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the rna-binding protein hu antigen r.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , E3815-E3824 (2014).</li><li>McClatchy, D. B., Ma, Y., Liu, C., Stein, B. D., Martinez-Bartolome, S., Vasquez, D., Hellberg, K., Shaw, R. J., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+azidohomoalanine+labeling+in+mammals+(palm)+detects+changes+in+liver-specific+lkb1+knockout+mice.">Pulsed azidohomoalanine labeling in mammals (palm) detects changes in liver-specific lkb1 knockout mice.</a> Journal of Proteome Research. 14, 4815-4822 (2015).</li><li>Schiapparelli, L. M., McClatchy, D. B., Liu, H. H., Sharma, P., Yates, J. R., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+detection+of+biotinylated+proteins+by+mass+spectrometry.">Direct detection of biotinylated proteins by mass spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 13, 3966-3978 (2014).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6, 359-362 (2009).</li><li>Rajalingam, D., Loftis, C., Xu, J. J., Kumar, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trichloroacetic+acid-induced+protein+precipitation+involves+the+reversible+association+of+a+stable+partially+structured+intermediate.">Trichloroacetic acid-induced protein precipitation involves the reversible association of a stable partially structured intermediate.</a> Protein Science. 18, 980-993 (2009).</li><li>Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+protein+precipitation+methods+for+various+rat+brain+structures+prior+to+proteomic+analysis.">Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis.</a> Electrophoresis. 31, 3573-3579 (2010).</li><li>Sashital, D. G., Greeman, C. A., Lyumkis, D., Potter, C. S., Carragher, B., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+quantitative+mass+spectrometry+and+electron+microscopy+analysis+of+ribosomal+30s+subunit+assembly+in+e.+Coli.">A combined quantitative mass spectrometry and electron microscopy analysis of ribosomal 30s subunit assembly in e. Coli.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Liang, S., Bellato, H. M., Lorent, J., Lupinacci, F. C. S., Oertlin, C., van Hoef, V., Andrade, V. P., Roff&#233;, M., Masvidal, L., Hajj, G. N. M., Larsson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome-profiling+in+small+tissue+samples.">Polysome-profiling in small tissue samples.</a> Nucleic Acids Research. 46, e3 (2018).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Polysome profil analiz protein çeviri çalışması için belirli bir mRNA veya tüm transcriptome6,7translasyonel durumu analiz ederek sağlar. Yerel synaptosomes8gibi okudu gerektiğinde de çok yardımcı olur. Geleneksel olarak, bu yöntem mono - ve polyribosomes ve ilişkili mRNA'ların hangi ile genomik birleştiğinde olabilir sükroz degrade veya istediğiniz sonuçları6,9</sup...

Kalp hasar iskemi (ı) ve reperfüzyon (R) dinamik bir şekilde yanıt verir. Ancak, tepki sırasında protein sentezi akut değişiklikler içine küçük fikir yoktur. Bu sorunu çözmek için biz yansıtmaktadır ribozomlar ve polizomlar, sitozol translasyonel düzenleyici faktörler yeniden dağıtılması protein bolca değişiklikleri tanımlamak için1 profil oluşturma polysome köklü yöntemi kullandı ve Yeni sentezlenmiş protein (NSP) artırın. Ben ortamda / R, yeni protein sentezi artış oluşur bir süre içinde yeni mRNA'ların2; transkripsiyon ile tutarsız Ayrıca, uyumsuzluk mRNA ifade düzeyleri ile protein bereket bildirilen3olmuştur. Bu nedenlerden dolayı biz protein çeviri tarafından yansıtıldığı gibi dinamik Proteom değişiklikleri analiz etmek seçti. Bunu yapmak için mRNA polysome kesirler ölçmek ve polysome kesirler protein bileşiminde analiz. Çünkü mikroRNA (miRs) mRNA'ların çeviri için kullanılabilirliğini düzenleyen ve protein çeviri4,5verimliliği ile engelleyebilir, son olarak, biz miRs polysome kesirler dağıtımını odaklanan muayene Ben Yanıt / R.
Sürekli perfüzyon, sonra 30 dk küresel akış olmayan iskemi ve iskemi reperfüzyon 30 min tarafından takip 30 dk sonra bazal koşullar altında hasat doku ve izole fare Langendorff perfüzyon model kullanmayı seçtiniz. Daha sonra kalp doku çözündürüldükten ve polizomlar sükroz degrade üzerinde ayrılmış proteomik analizi ve seçmeli olarak algılanması mRNA'ların ve miRNAs PCR ve Mikroarray, sırasıyla izledi. Bu yöntemlerin bileşimini eşzamanlı olarak algılanması mRNA, miRNA ve NSP'ler yanı sıra, düzenleyici proteinler, miRNA ve mRNA dağıtılması arasında nontranslating kesirler Etkinleştirme dinamik Proteom anlamak için güçlü bir yaklaşım temsil eder, düşük verimli polizomlar ve yüksek verimli polizomlar (bkz. Şekil 1). Dinamik yönetmelik bu sürecin içine anlayışlar daha fazla çözümleme eIF2α veya mTOR gibi anahtar düzenleyici faktörler fosforilasyon tarafından uzatılacak. Şimdi tek tek adımları ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

<table><tbody><tr><td>Pentobarbital</td><td>Vortech Phamaceuticals</td><td>9373</td><td>for euthansia</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sagent</td><td>103424</td><td>used in langendorff preparation</td></tr><tr><td>forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>91110-10</td><td>used to hang the heart</td></tr><tr><td>Langendorff system</td><td>Radnoti + home made</td><td>n/a</td><td>A &#039;four heart&#039; system consisting of custom blown glass, tubing and water baths</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-5KG</td><td>Krebs buffer and Sucrose gradient</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>Krebs buffer and Lysis buffer</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;42&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P-5504</td><td>Krebs buffer</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M7774-500G</td><td>Krebs buffer</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td>Krebs buffer</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C1016-500G</td><td>Krebs buffer</td></tr><tr><td>Sucrose powder</td><td>Sigma</td><td>S0389-1KG</td><td>Sucrose gradient</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>208337</td><td>Sucrose gradient and Lysis buffer</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td>Sucrose gradient and Lysis buffer</td></tr><tr><td>Xylene Cyanole</td><td>Sigma</td><td>X-4126</td><td>Sucrose gradient</td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma-aldrich</td><td>239763</td><td>Sucrose gradient and Lysis buffer</td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Life Technologies</td><td>C00019</td><td>RNAse inhibitor for Lysis buffer</td></tr><tr><td>Igepal CA-360 (NP40)</td><td>Sigma</td><td>I3021</td><td>Lysis buffer</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail tablets, EDTA free</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 mm x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman</td><td>LE-80K</td><td>Ultracentrifugation of the gradients</td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Beckman</td><td>SW41</td><td>Ultracentrifugation of the gradients</td></tr><tr><td>Biologic LP (pump)</td><td>Biorad</td><td>731-8300</td><td>Fractionation of the gradients</td></tr><tr><td>BioFrac</td><td>Biorad</td><td>741-0002</td><td>Fractionation of the gradients</td></tr><tr><td>Eppendorf RNA/DNA LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL tube</td><td>Sigma</td><td>Z666513-100EA</td><td>Gradient fraction and RNA extraction</td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Life technologies</td><td>AM9738</td><td>RNA extraction</td></tr><tr><td>Luciferase Control RNA</td><td>Promega</td><td>L4561</td><td>RNA extraction</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C606-4</td><td>RNA extraction</td></tr><tr><td>Glycogen, RNA grade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0551</td><td>RNA extraction</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td>RNA extraction</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>E7023-1L</td><td>RNA extraction</td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit</td><td>BioRad</td><td>170-8891</td><td>Reverse transcription</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>175-5122</td><td>Quantative PCR</td></tr><tr><td>miRNeasy Micro Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>217084</td><td>Kit for total RNA isolation</td></tr><tr><td>miScript II RT Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td>Kit for miRNA reverse transcription</td></tr><tr><td>miScript Sybr Green PCR Kit (200)</td><td>Qiagen</td><td>218073</td><td>Kit for real-time PCR expression analysis of miRNAs</td></tr><tr><td>Centrifuge 5424R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>For centrifugation of 1.5 mL or 2.0 mL tubes at different temperatures. Max speed - 21130 x g</td></tr><tr><td>Centrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>For real-time PCR plate centrifugation at different temperatures. Max speed - 2039 x g</td></tr><tr><td>My Cycler Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>For reverse transcription</td></tr><tr><td>CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>For real-time PCR analysis</td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control</td><td>Qiagen</td><td>219610</td><td>For quality control of RNA isolation</td></tr><tr><td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9641</td><td>For real-time PCR analysis</td></tr><tr><td>Microseal &#039;B&#039; PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td>For real-time PCR plate sealing</td></tr><tr><td>Research plus Single-Channel Pipette, Gray; 0.5-10 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>UX-24505-02</td><td>For pipetting</td></tr><tr><td>PIPETMAN Classic Pipets, P20</td><td>Gilson</td><td>F123600G</td><td>For pipetting</td></tr><tr><td>PIPETMAN Classic Pipets, P200</td><td>Gilson</td><td>F144565</td><td>For pipetting</td></tr><tr><td>Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 &amp;micro;L</td><td>Gilson</td><td>17011782</td><td>For pipetting</td></tr><tr><td>Glycogen, RNA grade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0551</td><td>Improves total RNA isolation efficiency</td></tr><tr><td>Posi-Click 1.7 mL Tubes, natural color</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td>RNA isolation and storage; reagent mix</td></tr><tr><td>Thermal Cycling Tubes -0.2 mL Individual Caps, Standard 0.2 mL tubes with optically</td><td>Denville</td><td>C18098-4 (1000910)</td><td>Reverse transcription reaction</td></tr><tr><td>Sharp 10 Precision barrier Tips</td><td>Denville</td><td>P1096-FR</td><td>For pipetting</td></tr><tr><td>Sharp 20 Precision barrier Tips</td><td>Denville</td><td>P1121</td><td>For pipetting</td></tr><tr><td>Sharp 200 Precision barrier Tips</td><td>Denville</td><td>P1122</td><td>For pipetting</td></tr><tr><td>Tips LTS 1 mL Filter</td><td>Rainin</td><td>RT-L1000F</td><td>For pipetting</td></tr><tr><td>miScript Primer Assay (200)</td><td>Qiagen</td><td>(it changes according to the miRNA)</td><td>For real-time PCR analysis</td></tr><tr><td>Gradient Master ver 5.3 Model 108</td><td>BioComp Instruments</td><td></td><td>For preparation of sucrose gradients</td></tr><tr><td>trichloroacetic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>acetone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>Tris hydrochloride</td><td>Amresco</td><td>M108</td><td></td></tr><tr><td>dithiothreitol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>iodoacetamide</td><td>Gbiosciences</td><td>RC-150</td><td></td></tr><tr><td>sequencing grade modified trypsine, porcine</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>ammonium bicarbonate</td><td>BDH</td><td>BDH9206</td><td></td></tr><tr><td>formic acid, Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemical</td><td>A117</td><td></td></tr><tr><td>methanol, Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemical</td><td>A454</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrile, Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemical</td><td>A996</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind tubes 0.5 mL</td><td>Eppendorf AG</td><td>22431064</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind tubes 1.5 mL</td><td>Eppendorf AG</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>HLB &amp;micro;Elution plate 30 &amp;micro;m</td><td>Oasis</td><td>186001828BA</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac concentrator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Savant SPD2010</td><td></td></tr><tr><td>sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Oasis180</td><td></td></tr><tr><td>centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall Legend micro 21R</td><td></td></tr><tr><td>LC trap column PepMap 100 C18</td><td>Thermo Scientific</td><td>160454</td><td></td></tr><tr><td>LC separation column PepMap RSLC C18</td><td>Thermo Scientific</td><td>164536</td><td></td></tr><tr><td>mass spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orbitrap Elite ion trap mass spectrometer</td><td></td></tr><tr><td>MSConvert software</td><td>ProteoWizard Toolkit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorcerer-SEQUEST software</td><td>Sage-N Research, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dynamic proteomic and mirna analysis of polysomes from isolated mouse heart after langendorff perfusion

Dinamik değişiklikleri protein çeviri çalışmaları özel yöntemler gerektirir. Burada biz yeni sentezlenmiş protein iskemi ve polysome profil oluşturma ile birleştiğinde izole periosteum fare kalp kullanarak reperfüzyon karşısında değişiklikler incelenmiştir. Daha fazla protein çeviri dinamik değişiklikleri anlamak için biz sitozolik ribozomlara (polyribosomes veya polizomlar) ile doluydu ve aynı zamanda mitokondrial polizomlar kurtarıldı ve mRNA ve protein dağıtım karşılaştırıldığında mRNA'ların karakterize yüksek verimli kesirler (çok sayıda ribozom mRNA için bağlı), düşük-verimlilik (daha az ribozom bağlı) mitokondriyal polizomlar ve tercüme kesirler de dahil. miRNAs Ayrıca, böylece çeviri verimliliğini azaltmak tercüme ediliyor mRNA ile ilişkilendirebilirsiniz, arasında kesirler miRNAs dağılımı incelenmiştir. MRNA'ların, miRNAs ve proteinler dağıtım 30 dk küresel akış olmayan iskemi ve reperfüzyon 30 dk sonra sonunda periosteum bazal koşullar altında incelenmiştir. Burada bu çözümlemeyi gerçekleştirmek için kullanılan yöntemleri mevcut — özellikle protein çekme--dan sükroz degrade, bu duruma getirilmesi için yaklaşım önce tarif edilmiştir değil — ve temsilcisi bazı sonuçlar sağlar.

mRNA Analizi mRNA sonuçları bir dağıtım her kesir (Şekil 3A); belirli bir mRNA olarak ifade miktar için polyribosomal çeviri kesirler birleştirmek ve mRNA bereket nontranslating kesirler çeviri içinde oranında sunulması sigara çevirme kesir (Şekil 3B), karşılaştırın. Ek bilgi yüksek verim polysome kesirler ayrı olarak düşük verimli polysome kesirler (ve ayrı nontranslating kesirler) inceleyer...

Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion at JoVE.com

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Burada izole periosteum fare kalp üzerinde profil oluşturma polysome gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Biz kalp perfüzyon, profil oluşturma polysome ve polysome kesirler ile ilgili mRNA'ların, miRNAs ve polysome Proteom analizi için yöntemler açıklanmaktadır.

Dinamik proteomik ve miRNA analiz polizomlar izole fare kalp sonra Langendorff perfüzyon üzerinden

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

dynamic-proteomic-mirna-analysis-polysomes-from-isolated-mouse-heart

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.5K Görüntüleme.  Cedars-Sinai Medical Center. Burada izole periosteum fare kalp üzerinde profil oluşturma polysome gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Biz kalp perfüzyon, profil oluşturma polysome ve polysome kesirler ile ilgili mRNA'ların, miRNAs ve polysome Proteom analizi için yöntemler açıklanmaktadır.

Video: Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of cardiovascular disease. Although molecular biology is necessary in identifying key changes in the signaling pathway, it is not a surrogate for functional significance. While physiology can provide answers to the question of function, combining physiology with biochemical assessment of metabolites in the intact, beating heart allows for a complete picture of cardiac function and energetics. For years, our laboratory has utilized isolated heart perfusions combined with nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy to accomplish this task. Left ventricular function is assessed by Langendorff-mode isolated heart perfusions while cardiac energetics is measured by performing 31P magnetic resonance spectroscopy of the perfused hearts. With these techniques, indices of cardiac function in combination with levels of phosphocreatine and ATP can be measured simultaneously in beating hearts. Furthermore, these parameters can be monitored while physiologic or pathologic stressors are instituted. For example, ischemia/reperfusion or high workload challenge protocols can be adopted. The use of aortic banding or other models of cardiac pathology are apt as well. Regardless of the variants within the protocol, the functional and energetic significance of molecular modifications of transgenic mouse models can be adequately described, leading to new insights into the associated enzymatic and metabolic pathways. Therefore, 31P NMR spectroscopy in the isolated perfused heart is a valuable research technique in animal models of cardiovascular disease.

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Langendorff-mode isolated heart perfusion, in conjunction with 31P NMR spectroscopy, combines the fields of biochemistry and physiology into one experiment. The protocol allows for the dynamic measurement of high energy phosphate content and turnover in the heart while concurrently monitoring physiologic function. When performed correctly, this is a valuable technique in the assessment of cardiac energetics.

Kalp Fonksiyonu ve Enerji Kullanımı İzole Fare Kalpler Değerlendirilmesi 31 P NMR Spektroskopisi

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of ...

Tıp

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To date, miRNAs have been implicated in a large number of biological and disease processes, which has signified the need for the reliable detection methods of miRNA transcripts. Here, we describe a detailed protocol for digoxigenin-labeled (DIG) Locked Nucleic Acid (LNA) probe-based miRNA detection, combined with protein immunostaining on mouse heart sections. First, we performed an in situ hybridization technique using the probe to identify miRNA-182 expression in heart sections from control and cardiac hypertrophy mice. Next, we performed immunostaining for cardiac Troponin T (cTnT) protein, on the same sections, to co-localize miRNA-182 with the cardiomyocyte cells. Using this protocol, we were able to detect miRNA-182 through an alkaline phosphatase based colorimetric assay, and cTnT through fluorescent staining. This protocol can be used to detect the expression of any miRNA of interest through DIG-labeled LNA probes, and relevant protein expression on mouse heart tissue sections.

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are short and highly homologous RNA sequences, serving as post-transcriptional regulators of messenger RNAs (mRNAs). Current miRNA detection methods vary in sensitivity and specificity. We describe a protocol that combines in situ hybridization and immunostaining for concurrent detection of miRNA and protein molecules on mouse heart tissue sections.

Doku özgü miRNA ifade profil oluşturma In Situ hibridizasyon fareyle kalp bölümleri içinde

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Genetik

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due to the high percentage of binucleated cells,1 the predominantly heterochromatic state of the DNA, and the non-dividing nature of the cardiomyocyte which renders adult nuclei in a permanent state of interphase.2 Transcriptional regulation during development and disease have been well studied in this organ,3-5 but what remains relatively unexplored is the role played by the nuclear proteins responsible for DNA packaging and expression, and how these proteins control changes in transcriptional programs that occur during disease.6 In the developed world, heart disease is the number one cause of mortality for both men and women.7 Insight on how nuclear proteins cooperate to regulate the progression of this disease is critical for advancing the current treatment options.
Mass spectrometry is the ideal tool for addressing these questions as it allows for an unbiased annotation of the nuclear proteome and relative quantification for how the abundance of these proteins changes with disease. While there have been several proteomic studies for mammalian nuclear protein complexes,8-13 until recently14 there has been only one study examining the cardiac nuclear proteome, and it considered the entire nucleus, rather than exploring the proteome at the level of nuclear sub compartments.15 In large part, this shortage of work is due to the difficulty of isolating cardiac nuclei. Cardiac nuclei occur within a rigid and dense actin-myosin apparatus to which they are connected via multiple extensions from the endoplasmic reticulum, to the extent that myocyte contraction alters their overall shape.16 Additionally, cardiomyocytes are 40% mitochondria by volume17 which necessitates enrichment of the nucleus apart from the other organelles. Here we describe a protocol for cardiac nuclear enrichment and further fractionation into biologically-relevant compartments. Furthermore, we detail methods for label-free quantitative mass spectrometric dissection of these fractions-techniques amenable to in vivo experimentation in various animal models and organ systems where metabolic labeling is not feasible.

Advances in mass spectrometry have allowed the high throughput analysis of protein expression and modification in a host of tissues. Combined with subcellular fractionation and disease models, quantitative mass spectrometry and bioinformatics can reveal new properties in biological systems. The method described herein analyzes chromatin-associated proteins in the setting of heart disease and is readily applicable to other in vivo models of human disease.

Hastalığında Kromatin Proteomlar Kantitatif Analiz

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde Tek Hücre transkripsiyonel Profilleme

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Biyoloji

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

Fare kardiyomiyositlerde İzolasyon ve Fizyolojik Analizi

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell types. This balance is tightly controlled by gene expression that is fine-tuned at multiple levels, including transcription, post-transcription and translation. In this regard, a growing body of evidence highlights a critical role of translational regulation in coordinating neural stem cell fate decisions. Polysome fractionation is a powerful tool for the assessment of mRNA translational status at both global and individual gene levels. Here, we present an in-house polysome profiling pipeline to assess translational efficiency in cells from the developing mouse cerebral cortex. We describe the protocols for sucrose gradient preparation, tissue lysis, ultracentrifugation and fractionation-based analysis of mRNA translational status.

The development of the mammalian brain requires proper control of gene expression at the level of translation. Here, we describe a polysome profiling system with an easy-to-assemble sucrose gradient-making and fractionation platform to assess the translational status of mRNAs in the developing brain.

Polisome Profilleme Kullanarak Gelişen Fare Beyninde Çeviri Analizi

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...

Nörobilim

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

Gelişmekte Embriyonik Fare Kalp Vana Bölgesi&#39;nde Protein İzolasyonu

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Preparation of a Non-Cardiomyocyte Cell Suspension for Single-Cell RNA Sequencing from a Post-Myocardial Infarction Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is one of the most common cardiovascular diseases, with increasing mortality worldwide. Non-cardiomyocytes account for more than half of the total cardiac cell population, and they contribute to adaptive compensations upon myocardial injury, including inflammatory responses, tissue repair, and scar formation. To study the post-MI cardiac microenvironment, single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) is widely used to identify different cardiac cell types and intercellular communications. Among the procedures of scRNA-seq sample preparation, preparing the cell suspension is one of the most critical steps, because the cell viability can affect the quality of the scRNA-seq results. Therefore, we designed an experimental protocol for preparing a non-cardiomyocyte cell suspension from post-MI mouse hearts with an extra focus on improving the cell viability by choosing mild digestive enzymes, controlling the digestion time, and applying fluorescence-activated cell sorting (FACS). Finally, we isolated CD45+ cells from the non-cardiomyocyte cell suspension obtained through this protocol, and then we performed scRNA-seq.

Here, we describe a protocol to isolate a sufficient amount of single non-cardiomyocytes with high viability from a post-myocardial infarction (MI) mouse heart. This can be used for subsequent single-cell sequencing, flow cytometry analysis, and primary cell culture.

Miyokard Enfarktüsü Sonrası Yetişkin Fare Kalbinden Tek Hücreli RNA Dizilimi için Kardiyomiyosit Olmayan Hücre Süspansiyonunun Hazırlanması

Myocardial infarction (MI) is one of the most common cardiovascular diseases, with increasing mortality worldwide. Non-cardiomyocytes account for more ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

Yetişkin Fare Kalbinden Atriyal Miyositler, Ventrikül Miyositleri ve Miyosit Olmayanların Eşzamanlı İzolasyonu ve Kültürü

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...

An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mice

In basic research using mouse heart, isolating viable individual cardiomyocytes is a crucial technical step to overcome. Traditionally, isolating cardiomyocytes from rabbits, guinea pigs or rats has been performed via retrograde perfusion of the heart with enzymes using a Langendorff apparatus. However, a high degree of skill is required when this method is used with a small mouse heart. An antegrade perfusion method that does not use a Langendorff apparatus was recently reported for the isolation of mouse cardiomyocytes. We herein report a complete protocol for the improved antegrade perfusion of the excised heart to isolate individual heart cells from adult mice (8 - 108 weeks old). Antegrade perfusion is performed by injecting perfusate near the apex of the left ventricle of the excised heart, the aorta of which was clamped, using an infusion pump. All procedures are carried out on a pre-warmed heater mat under a microscope, which allows for the injection and perfusion processes to be monitored. The results suggest that ventricular and atrial myocytes, and fibroblasts can be well isolated from a single adult mouse simultaneously.

We developed a simple method for isolating high quality individual mouse heart cells by the antegrade perfusion technique. This method is Langendorff-free and useful for isolating ventricular and atrial myocytes or interstitial cells, such as cardiac fibroblasts or progenitors.

Dinamik proteomik ve miRNA analiz polizomlar izole fare kalp sonra Langendorff perfüzyon üzerinden

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Kalp Fonksiyonu ve Enerji Kullanımı İzole Fare Kalpler Değerlendirilmesi³¹ P NMR Spektroskopisi