Yazarlar, bu protokolün çekimler sırasında C. Zambataro teknik yardım kabul etmek istiyorum. Biz Glenn Nathan Şok Merkezi ödülü Tıbbi Araştırma (SM), Hillblom vakıf, ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Vakfı (P30AG025708) ve PO1AG025901 destek minnetle kabul etmiş sayılırsınız. JMF Yaşlanma Araştırma Enstitüsü Buck layık T32AG000266 tarafından desteklenmiştir.

1. Adım 1 - kardiyomiyosit izolasyon <ol><li> Aşağıdaki gibi sindirim tampon hazırlayın: 10 x Sindirim Buffer (ultra-saf H 2 O yapılan) <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Final Conc. </td><td> g / L </td><td> g/500 mL </td><td> 10x çözüm g / L </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 130 mm </td><td> 7,597 </td><td> 3,3 </td><td> 75,97 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 mM </td><td> 0,4 </td><td> 0,2 </td><td> 4,0 </td></tr><tr><td> Pirüvik asit </td><td> 3 Nm </td><td> 0,33 </td><td> 0,165 </td><td> 3,30 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 25 mM </td><td> 5,96 </td><td> 2,85 </td><td> 59,6 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 0.5 mM </td><td> 0,101 </td><td> 0,05 </td><td> 1,01 </td></tr><tr><td> NaH 2PO 4monobasic </td><td> 0.33 mM </td><td> 0,04 </td><td> 0,02 </td><td> 0,40 </td></tr><tr><td> Dekstroz </td><td> 22 mm </td><td> 3,96 </td><td> 1,98 </td><td> 39,6 </td></tr></tbody></table> NaOH ile pH tampon 7.4 </li><li> 10x Sindirim Tampon kullanarak, (ultra saf H 2 O) perfüze olacak her kalp için aşağıdaki dört çözümler olun: </li></ol> Sindirim Tampon A (üç alikotları bu çözümleri olun) <ul><li> 50 ml içeren 1x Sindirim Tampon: <ul><li> McL 75 - EGTA çözüm (100 mM EGTA) </li></ul></li></ul> Sindirim Tampon B (bunlardan biri olun.) <ul><li> 25 ml içeren 1x Sindirim Tampon: <ul><li> 1.25 mcL - CaCl 2 Çözüm (1 M) </li><li> 1 mg - Proteaz </li><li> 25 mg kollajenaz (can de ** = 18,75 mg bu miktarın% 75) </li></ul></li></ul> Koleksiyon Tampon (bunlardan biri olun.) <ul><li> 2.5 mL içeren 1x Sindirim Tampon: <ul><li> 1.25 mcL - CaCl 2 Çözüm (1 M) </li><li> 0.5 mg - Proteaz </li><li> 15 mg kollajenaz (% 75 = 11,25 mg) ** </li><li> 125 mg - BSA </li></ul></li></ul> Nötralizasyon Yıkama Tamponu (bunlardan biri olun.) <ul><li> 25 ml içeren 1x Sindirim Tampon: <ul><li> 6.25 mcL - CaCl 2 Çözüm (1 M) </li><li> 250 mg BSA </li></ul></li></ul> ** Kollajenaz kaynak ve toplu bağlı olarak, enzim aktivitesi değişebilir. Bu aşırı-sindirim önlemek için bu tampona eklenen enzim miktarını optimize etmek için gerekli olabilir. <ol start="3"><li> D önceden açıklanan izolasyon sistemi kurunSindirim Buffer üç 15 ml bardak ile 1,2 etail buz üzerinde, biri 50 ml tüp Sindirim Tampon A ve (Sindirim Tampon hattı üzerinden en az 5 ml yıkanmalıdır perfüzyon için hazır 25 ml Sindirim Tampon B sistem üzerinden çalıştırmak), Koleksiyon Tampon sıcaklığı 37 ° C ve Nötralizasyon Yıkama Tamponu RT yükseltmek için bir su banyosunda ısındı. </li><li> Perfüzyon kanülü kalp kanül üst kısmının etrafında düğüm soğuk Sindirim Tampon A. ile gevşekçe bazı sütür (4-O 6-O boyutu) temizlenmeli ve perfüzyon ucuna bağlanmış olacak ve diseksiyon çanak doldurun. Bu, daha sonra aort kalp kanül kapalı kaymasını önlemek için tutmak için kullanılır. </li><li> Ölümcül oturaklı, anestezik ajan (0.25 ml sodyum pentobarbital çözüm) bir IP enjeksiyonu ile fare ve fare sağlamak, bilinçsiz ve ağrı uyaranlara yanıt vermeyen. Diyafram keserek göğüs kenarı boyunca göğüs boşluğu dikkatlice kesilerek açılır.(Şekil 2). Yukarı süperiora kesin ve (bu kesiler sırasıyla Şekil 2, B ve A belirlenir) ön göğüs kafesi yansıtacak Kritik - fare hala bu kesiler önce nefes olmalıdır. </li><li> , Plastik bir pipet kesim boyutu kullanarak, kalp pipet yavaşça emer. Göğüs boşluğunun yeterli aort aort dalı (Şekil 3) net bir şekilde belirlemek için kalp bırakmak dikkatli olmak kalp kesin. Kalbe az hasara neden olur bu yana bir pipet kullanılır. </li><li> Bırak, buz gibi Sindirim Buffer bir behere kalp ve kan uzakta durulayın. 15 sonra buz Sindirim Tampon ikinci behere 45 sn yerde kalp kısaca tekrar durulama. Ayrıca soğuk Sindirim Tampon A. ile dolu petri kalp transfer </li><li> Diseksiyonu kapsamında Sindirim Tampon çanak kalp ve aorta ve dalları dikkatlice izole. Dikkatle son bayileri sadece alt Döşemeh (Şekil 4). </li><li> Fit aort içine kanül ucu ve 4-O bir diseksiyon mikroskobu altında sahne kurulumu kullanarak 6-O sütür içinde Arter. Kanül çok düşük aort içinde oturmak ve koroner arterler (Şekil 4) yukarıda kalır değildir ki emin olun. </li><li> Sindirim Tampon A perfüzyon kurulum akan ile kurulum perfüzyon ucu ve kan çoğunluğu kalp açık bırakarak kalp ve sıvı yıkanır kadar kalp serpmek başlar. Kritik - perfüzyon sıvısının sıcaklığı mümkün olduğunca yakın 37 ° C olmalıdır kateter çıktığında. Çözüm çok sıcak veya çok soğuk ise, perfüzyon doku öldürecektir. Kalp perfüzyon kadar zaman da önemlidir. Perfüzyon başlayana kadar zaman penceresi kalp kaldırılması 5-10 dakika daha az olmalıdır. Kalp, anestezi altında kaldırılır, CO 2 affixation veya servikal dislokasyon olmamak gerekir . </li><li> Bir kez kan oldukalpten hed, Sindirim Tampon B kalp akan olduğunu Sindirim Tampon A. Sindirim Tampon B geçmek olun. Çözüm sarı bir renk tonu var başlayacaktır. Kalp şeklini kaybetme belirtileri gösterir ve sindirim çalışma olduğunun bir göstergesidir yuvarlak bakmak başlayıncaya kadar 2-3 dk bekleyin. Miyokardın perfüzyon ilerledikçe hafif görünmelidir. </li><li> 37 Koleksiyon Tampon 15 mL içeren 50 ml konik boru makası ve yer ile ventriküller Cut off ° C Koleksiyon Tampon doku yerleştirerek yavaşça, küçük parçalar halinde ventrikül kesin. Hücre-hücre yapışıklıklar çözülür ve tek bir hücre kardiyomiyosit karışımı yapmak için plastik bir pipet yardımıyla yavaşça karıştırın. </li><li> En doku çözülür, büyük doku parçaları dibine çöken (1 dakikadan daha az). 15 ml konik boru süpernatantı alın ve kaydedin. Gravite, 10 ila 20 dakika (15 üzerinden süpernatantı bir pelet çekin.min oda sıcaklığında) tercih. </li><li> Süpernatantı çıkarın ve atın. Pelet pelet Nötralizasyon Yıkama Tamponu 5 ml ekleyerek ve onları tekrar süspansiyon hücreleri hafifçe karıştırın yıkayın. Bu noktada hücreler hemen tek bir hücre analizi (2. adıma geçin) için seçilecek hazırız. </li></ol> 2. Adım 2 - tek hücre izolasyonu <ol><li> Alev ve hücreleri manipüle etmek için kullanılan bir cam kapiller tüp kullanan bir mikromanipülatör hazırlayın. Mikromanipülatör sonra taşımak ya da emme uygulanan hücreleri pick up esnek borular uzun bir parça bağlı çok ince kılcal tüp. </li><li> Hemen çekilmiş bir pipet ve tek hücre örnekleri örnek aktarılıyor malzeme önlemek için bir hava kilidi ile oluşturulan bir mikromanipülatör kullanarak (Nikon Eclipse TS100, 20x) mikroskop altında tek tek hücrelerin seçimi geçin. Hücre popülasyonu sağlıklı olduğundan emin olun(% 70 yaşayabilir) ve izolasyon süreci zarar veremez. </li><li> Bireysel olarak seçilmiş olabilir, böylece küçük bir Petri kabındaki hücreler aşağı seyreltilir. Toplama hücreleri küçük hacimli (2 mcL az) hücreleri yakalamak için emin olun. Ayırt edici normal kardiyomiyosit morfolojisi (Şekil 5) sadece sağlıklı hücreleri seçin. </li><li> Tek tek hücrelerin tek tek PCR tüpleri dibine yerleştirin ve kuru buz üzerinde hemen dondurmak. Bu hücreler, gen ekspresyon analizi için kullanılacak ° C &#39;ye kadar sonra -80 saklanır. </li></ol> 3. Adım 3A - Tek hücreli qPCR gen ekspresyonu (Advance Geliştirme Protokolü # 30 Fluidigm) 3,4 tek hücre qPCR gerçekleştirmek için tek bir hücre gen ekspresyon Biomark Nanofluidic qPCR diziler için Fluidigm Corporation tarafından geliştirilen bir uyarlanmış bir protokol kullanır. <ol><li> Özel Hedef Amplifikasyon (RT-STA) - Ters transkripsiyon hazırlanması. Olmak içincin, 1x DNA süspansiyon tamponu (10 mM Tris, pH 8.0, 0.1 mM EDTA) 100 mcM ilgi genler (125 kadar primer çiftleri başarıyla kullanmıştır) tüm primer çiftleri tekrar süspansiyon haline getirin. Birleştirin ve her bir deney için 20 mcM daha ileri ve geri primer çiftleri sulandırmak. Son olarak, RT-STA tepki olarak yükseltilecek her bir deney için 200 nM son bir konsantrasyon ile bir çözüm tüm primer çiftleri sulandırmak. Bunu yapmak için, her bir primer çifti ve 1:100 onları sulandırmak. Örneğin, 20 mcM az 30 tahlil primer çiftleri varsa, her bir çifti (30 mcL toplam) 1 mcL eklemek gerekecektir ve ardından finale 70 mcL DNA süspansiyonu tampon ile, birimin kalan makyaj 100 mcL seyreltme hacmi. </li><li> Astar çözümler hazırlanır Şimdi, RT-STA reaksiyonu ana karışımı bir araya getirin. Yeterli yükseltmek isteyen tek tek hücrelerin her biri için ana karışımı hazırlayın. <table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> McL hacmi (ortalama tepki) </td></tr><tr><td> 2x Reaksiyon karışımı CellsDirect </td><td> 5,0 </td></tr><tr><td> Üst Simge III RT Plantinum Taq mix </td><td> 0,2 </td></tr><tr><td> RT-STA Primer karışımlar (200 nM her bir deney) </td><td> 2,5 </td></tr><tr><td> Nükleazlar H 2 O (veya 1x DNA süspansiyon tampon) </td><td> 1,3 </td></tr><tr><td> Toplam </td><td> 9,0 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: RT-STA master miks </li><li> Hemen hücrelerinin, tüpün alt kısmında konumlandırılmış olduğundan emin olmak için 30 saniye için maksimum RCF donmuş hücreleri ve santrifüj kaldırmak. Tüp 9 mcL RT-STA karışımı ekleyin ve bir PCR reaksiyonu devam edin. <ol class="lalpha"><li> 50 ° C - 15 dakika </li><li> 95 ° C - 2 dakika </li><li> 18 döngüleri <ol class="lroman"><li> 15 saniye boyunca 95 ° C </li><li> 604 dakika ° C </li></ol></li><li> 4 tutun ° C </li></ol></li><li> Tüpleri PCR makineden çıkarın ve reaksiyon ExoSAP-BT 4 mcL ekleyin. ExoSAP-BT, RT-STA reaksiyon aşırı astar ve enzim kaldıracak bir PCR temizleme reaktif. PCR makine aşağıdaki reaksiyon ile tüpler çalıştırın. <ol class="lalpha"><li> 37 ° C - 15 dakika </li><li> 80 ° C - 15 dakika </li><li> 4 tutun ° C </li></ol></li><li> ExoSAP-IT tedavi tamamlandığında, DNA süspansiyon tamponu ile örnekleri 01:05 sulandırmak. Örnekleri şimdi qPCR analizi için hazırlanmıştır. Biz Fluidigm Gen ekspresyonu qPCR Diziler (48,48, 96,96 plakaları) ile birlikte bu malzeme kullanıyoruz. Ayrıca bu yaklaşım daha geleneksel qPCR enstrümantasyon (96 veya 384 iyi formatları) ile kullanmak da mümkündür. Ancak, bu araçların genellikle p testlerinin sayısını sınırlar çok daha fazla örnek giriş gerektirirtek bir hücre erformed. </li></ol> 3. Adım 3B - tek hücre Tüm transcriptome amplifikasyon ve mikroarray Ekstraksiyon ve Amplifikasyon <ol><li> Sigma&#39;nın WTA2 kiti (Cat # WTA2), pelet ve tek hücreleri hem de çift zincirli cDNA yükseltmek için kullanın. Tek hücreler Sigma&#39;nın WTA2 protokol üreticinin talimatlarına göre ilk adımı ile &quot;çıkarılan&quot; dir. Bu ilk adım sırasında 37 kütüphane sentez tamponu ile inkübasyon ° C 5 dakika tek hücre zarı ve amplifikasyonu için mesaj &quot;özler&quot; bozar. </li><li> Sigma-Aldrich WTA2 kiti kullanarak, iki turda tek hücre artırın. Üretici protokolüne göre kütüphane hazırlık adımı gerçekleştirir; WTA2 amplifikasyon 70 mcL kütüphane örnek eklemek 1 / 5 Master Mix. 25 devir için önerilen bisiklet parametreleri kullanarak örnekleri artırın. </li><li> Örnekleri Purify USIng Qiagen QIAquick PCR Arıtma Kiti (Cat # 28.104) ve &quot;Temizleme QIAquick PCR Amplifikasyon Reaksiyonlar Standart V4&quot; protokolü kullanarak Qiagen Kullanıcı Qiacube süreci. </li><li> Hız vakum kullanarak saflaştırılmış örnekleri, 5 mcL Konsantre ve 17 döngüleri (WTA2 amplifikasyon protokolü ve bisiklet parametreleri tekrarladı) amplifikasyon ikinci turda geçiriliyor. </li><li> QIAquick PCR Arıtma Kiti kullanarak örnekleri arındırmak ve üreticilerin protokole göre NanoDrop spektrofotometre ve Agilent BioAnalyzer DNA 7500 kiti kullanılarak kalite kontrol. </li></ol> Etiketleme ve NimbleGen Gen İfade Diziler <ol start="6"><li> Etiket 2 mg çift NimbleGen Bir Renk Etiketleme Kiti (Cat # 05223555001) kullanarak her bir üretici protokolüne göre amplifiye hücre örneği cDNA mahsur. </li><li> Mus musculus 12x135k, NimbleGen Gene Expression Diziler (Cat # 05543797001) göre 5 mg Cy3 etiketli örnek melezleşmeüreticinin protokolü Ording. Dizilerin örnekleri hibridizasyon sonra, slaytlar sonra yıkanır ve bir lazer tarayıcı görüntülü önce kurutulmuş olmalıdır. </li><li> Bir lazer tarayıcı kullanarak tarama Gen İfadesi Diziler. Burada, Moleküler Cihazlar GenePix 4200A ayarları ile 100POW, Tarayıcı, ve 300-350PMT kullanın. Sonra NimbleGen NimbleScan yazılımı kullanarak her bir dizi için çift dosyaları oluşturmak ve daha sonra her bir tek hücre dizisi (tipik stabil bir şekilde ifade kardiyomiyosit transkript bir tablo, bir ek olarak dahil edilir; Tablo S1) tüm transcriptome ifade analiz. </li></ol> Kalp perfüzyon iyi çalıştı, izolasyon üzerine tipik dikdörtgen morfolojisi korumak sağlıklı kalp hücrelerinin yüksek bir oranda olması gerekir. Perfüzyon devam etmedi sonra ölü hücreleri büyük bir yüzdesini (Şekil 5 görüntülerini) olacaktır. Hücrelerin doğru ya WTA2 veya RT-STA yöntemleri kullanılarak güçlendirilirn son ürünleri NanoDrop ve BioAnalyser (Şekil 6) mRNA numunelerin kalite sonraki kalite kontrol testleri geçmelidir. Mikroarray iş akışı için, bu mRNA hem NanoDrop ve Bioanalyzer tarafından test WTA amplifikasyon sonra tamamlanır. Bu analiz Temsilcisi olumlu sonuçlar Şekil 6&#39;da gösterilmiştir. WTA2 örnekleri NanoDrop spektrofotometre okuma, Bioanalyzer (BA) yonga (Şekil 6) yanı sıra Elektroferogram okuma hem de sağlam bir amplifikasyon göstermelidir. Stably tek hücre mikroarray aracılığıyla tespit edildi genlerin bir tablo (Tablo S1) bir örnek olarak yer almaktadır. QPCR süreci için, veri kalitesi, primer setleri istenilen ürünü (Şekil 7) yükseltme olduğundan emin olmak için PCR reaksiyon sonunda bir erime adım yaparak değerlendirilebilir. Eğer doğruysa, bu eriyik bir adım belirli bir erime zirve oluşturmanız gerekir. Bu noktayı açıklamak için, nanofluidic qPCR verilerin bir alt kümesidir tepe erime t İlgi haritası gösteriliremperature (Şekil 8) 8. , Non-spesifik ürünler 5 yokluğunda sağlamak için, erime sıcaklığı bir PCR ürününün kalitesini değerlendirmek mümkündür . Bu haritada her satır, 43 ayrı qPCR testlerinin (A1-A43) test bir hücre örneği (S1-S40) temsil eder. Bu şekilde, bazı deneyleri oldukça değişkendir ve muhtemelen daha az, yüksek PCR özgüllük ile daha kararlı testleri daha güvenilir olduğu açıktır. <img src="/files/ftp_upload/3302/3302fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 genel bakış, tek bir hücre izolasyonu ve gen ekspresyon analizi . Bu prosedür, fare kalp cerrahi olarak çıkarılması ve bireysel kardiyomiyositlerde izolasyonu gösterecektir. Bu yordamı tartışılan yöntemlerinin tüm transcriptome amplifikasyon (WTA) sonra qPCR veya mikroarray analizi için yöntemler içerir. WTA prosedürü sonra Sigma&#39;nın evrensel primerler bağlayıcı (B) mRNA lizis (A) ile başlarhavuzu. Bu primerler (C) ve amplifikasyon (D) faz uzantısı amplifiye malzeme mikrogram oluşturun. Bu amplifikasyon sonra (E) mikroarray prosedürü için yeterli malzeme üretmek için tekrarlanır. <img src="/files/ftp_upload/3302/3302fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 fare kalp kaldırmak için insizyon yerini temsili. (A) göğüs kafesinin yan duvar boyunca kesin, daha sonra göğüs kafesinin alt marjı (B) birlikte kesti. Hala yeterli aort kalp cannulate bırakarak kalbin üstünde ve altında damarlar Kesme kaldırılmasına olanak tanıyın. Görüntüler MJ Cook 6 uyarlanmıştır. <img src="/files/ftp_upload/3302/3302fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 fare toraks diyagramı. Noktalı çizgiler h zarar vermeden kalp göğüs boşluğu eksize insizyon (A) yerleri gösterir<html> eart doku. Görüntüler MJ Cook 6 uyarlanmıştır. <img src="/files/ftp_upload/3302/3302fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. arkus aorta ve dalları Resim. Gri çizgi aorta (A) Döşeme nerede ideal bir yer olduğunu gösterir. Kanül (B) ucu aort içinde uygun seviyeye (C) gider böylece kalp takılı kalan aort kanüle edilmiştir. Görüntüler F. Gaillard 7 uyarlanmıştır. <img src="/files/ftp_upload/3302/3302fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5 gen ekspresyon analizi için tek bir hücre seçimi. Her panel, ışık mikroskobu altında kardiyomiyositlerde tipik morfoloji gösteren görüntülü kardiyomiyositlerde gösterir. Sağlıklı kardiyomiyositlerde yeşil oklarla gösterilir. Ölü ya da ölmek üzere olan hücreler kırmızı oklarla gösterilmiştir. Bu ölü hücreler, analizde kullanılan olmamalıdır. iles/ftp_upload/3302/3302fig6.jpg &quot;alt =&quot; Şekil 6 &quot;/&gt; Şekil 6. Kalite kontrolü WTA sonuçları tek bir hücre amplifikasyonu için. (A) NanoDrop spektrofotometre okuma WTA tepki amplifiye transkript için uygun bir Resim. (B) BioAnalyzer çip okuma üç amplifiye hücreler elde edilen sonuçları göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/3302/3302fig7.jpg" alt="Şekil 7" /> Şekil 7 qPCR amplifikasyon eğrileri (Sol grafik) ve pik sıcaklık eğrileri (sağ grafik) eritebilir. (A) kaliteli bir testte ifade sonuçlar farklı amplifikasyon eğrileri rağmen tek bir erime zirve ile gösterilir. (B), son derece değişken ekspresyon analizi için ideal değildir erime zirveleri olan fakir bir astar seti, eğriler eritin. <img src="/files/ftp_upload/3302/3302fig8.jpg" alt="Şekil 8" /> Şekil 8 tek hücre qPCR tepki için kalite kontrol sonuçlarıiyonları. Bu ısı haritası, bir renk skalası olarak erime sıcaklıkları görüntülemek için oluşturuldu. Her qPCR tahlil için pik erime sıcaklığı (A1-A43) 40, tek tek hücrelerin (S1-40) gösterilir. Testleri onların erime sıcaklığına göre kümelenmiş. Her bir deney için sütun aşağı bakarak, varyasyon örnekleri arasında eriyip görmek mümkündür. Bu rakam bazı qPCR testleri, diğerleri son derece değişken ve böylece tek bir hücre analizi için uygun değildir çok özel olduğunu gösteriyor. Tablo S1 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3302/TableS1_array.csv">mikroarray veri Ek tablo</a> Bu genlerin büyük bir veri kümesi üzerinde tek kardiyomiyositlerde tespit edildiği sağlamlık göre listelenmektedir . Bu gen listesi, genellikle tek bir kardiyomiyositlerde ifade gen bir dizi için algılama hassasiyeti gösterir.

<ol>
	<li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry.">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> Am. J. Physiol. 271 (3 Pt 2), H1250-H1255 (1996).</li><li>Shioya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+isolating+healthy+heart+cells+from+mouse+models.">A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models.</a> J. Physiol. Sci. 57 (6), 327-335 (2007).</li><li>Guo, G., Huss, M., Tong, G. Q., Wang, C., Li Sun, L., Clarke, N. D., Robson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+cell+fate+decisions+revealed+by+single-cell+gene+expression+analysis+from+zygote+to+blastocyst.">Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst.</a> Dev. Cell. 18 (4), 675-685 (2010).</li><li>Narsinh, K. H., Sun, N., Sanchez-Freire, V., Lee, A. S., Almeida, P., Hu, S., Jan, T., Wilson, K. D., Leong, D., Rosenberg, J., Yao, M., Robbins, R. C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptional+profiling+reveals+heterogeneity+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells.</a> J. Clin. Invest. 121 (3), 1217-1221 (2011).</li><li>D'haene, B., Vandesompele, J., Hellemans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+and+objective+copy+number+profiling+using+real-time+quantitative+PCR.">Accurate and objective copy number profiling using real-time quantitative PCR.</a> Methods. 50 (4), 262-270 (2010).</li><li>Cook, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Anatomy+of+the+Laboratory+Mouse.">The Anatomy of the Laboratory Mouse.</a> Informatics. , (1965).</li><li>Gaillard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aorta.">Aorta.</a> Radiopaedia. , (2008).</li><li>St&#229;hlberg, A., Andersson, D., Aurelius, J., Faiz, M., Pekna, M., Kubista, M., Pekny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+cell+populations+with+single-cell+gene+expression+profiling:+correlations+and+identification+of+astrocyte+subpopulations.">Defining cell populations with single-cell gene expression profiling: correlations and identification of astrocyte subpopulations.</a> Nucleic Acids Res. 39 (4), e24-e24 (2011).</li><li>Zhong, J. F., Chen, Y., Marcus, J. S., Scherer, A., Quake, S. R., Taylor, C. R., Weiner, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+processor+for+gene+expression+profiling+of+single+human+embryonic+stem+cells.">A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells.</a> Lab Chip. 8 (1), 68-74 (2008).</li><li>Bahar, R., Hartmann, C. H., Rodriguez, K. A., Denny, A. D., Busuttil, R. A., Dollé, M. E., Calder, R. B., Chisholm, G. B., Pollock, B. H., Klein, C. A., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+cell-to-cell+variation+in+gene+expression+in+ageing+mouse+heart.">Increased cell-to-cell variation in gene expression in ageing mouse heart.</a> Nature. 441 (7096), 1011-1014 (2006).</li><li>Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature,+nurture,+or+chance:+stochastic+gene+expression+and+its+consequences.">Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences.</a> Cell. 135 (2), 216-226 (2008).</li><li>Elowitz, M., Levine, A., Siggia, E., Swain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li></ol>

<p class="jove_content"Bu makalenin&gt; Ücretsiz erişim ve bu üretim Sigma-Aldrich desteklenmektedir.</p

Bu yöntem, işlevsel bir sayısının yanı sıra gen ekspresyon çalışmaları için kardiyomiyositlerde üretme imkanı vardır. Tek hücre gen ekspresyon analizi muayene filizlenmekte olan bir alandır. Transkripsiyonel seviyeleri tek hücre düzeyinde inceleme avantajı tüm doku preparatları mümkün değildir saf bir hücre popülasyonu, muayene izin vermesidir. Ayrıca, tek bir hücre analizi, homojen 8,9 olduğu düşünülen hücre popülasyonlarının tanımlamak için, tek tek hücrelerin mRNA düzeyleri stokastik değişim incelenmesi için izin verir. Potansiyel, gen ifadesi 10,11,12 stokastik olan genlerin belirlenmesi amacıyla ek olarak, bu yöntem aynı zamanda gen ekspresyon profilleri tarafından tanımlanan nadir bir hücre popülasyonlarının belirlenmesi için olanak sağlar . Bu yöntem, bir dizi gen ekspresyon analizi heyecan verici potansiyelini kullanır sağlarken, som var.tek hücre kullanımı e uyarılar ve dikkate alınması gereken noktalar. Tek hücre analizi için birincil sınırlama, örnek varyansı, faiz metrik konusunda istatistiksel anlamlılık elde etmek için deney yeterli hücre toplanması. Ilgi dokusundan izole edilen hücrelerin sayıları bir sınırlama değildir, bir yeni nesil sıralama ya da nanofluidic diziler gibi yaklaşımlar kullanarak, yüzlerce grup başına hücre inceleyebilirsiniz. Ancak, bazı durumlarda, yeterli ilgi doku hücreleri elde zorluk olabilir. Bu bölüm hedeflenen hücre tipi toplanması için kendine özgü yoğun bir usul ile neden olabilir. Ancak, dikkatli bir planlama ve ön hazırlık, tek bir hücre koleksiyonu ile devam hala sınırlı teknik hata ile sıkı tek hücre analizi için izin verebilir. Dikkate alınması gereken sonuçlar incelendiğinde, tecrit hücreleri için bu yordamı, çok sayıda Studie kullanılmış olsa bile(mikroskopi, elektrofizyoloji, vb dahil), yalıtım kendisi potansiyel gen ekspresyonu etkisi olabilir. Biyolojik örnekler işliyorsa herhangi bir yöntem olduğu gibi, bulguların sonuçları dikkatle tek hücre, doku kendisi ve teknik değil eğilim temsilcisi sağlamak için doğrulanmış olmalıdır. In situ hibridizasyon gibi yöntemler, sağlam doku, bu sonuçları doğrulamak için yararlı olabilir. Son olarak, üretilen verilerin dikkatli bir şekilde kalite kontrolü için işaretli olduğundan emin olmak için kritik öneme sahiptir. Şekil 8&#39;de gösterilen veriler qPCR deneyleri, kendi özgünlüklerini tahlil # 13 (A13) gibi çok güçlü veya tahlil # 34 (A34) gibi teknik değişikliğe yol açabilir değişkenlik yüksek seviyesine sahip olduğunu gösteriyor.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 71378 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 60128 </td><td></td></tr><tr><td> Pirüvik asit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4562 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54457 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1020 </td><td></td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 tekbazlı </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> Dekstroz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G6721 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 72068 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O3777 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 21115 </td><td></td></tr><tr><td> Proteaz, Tip XIV. </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5147 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase, Tip I </td><td> Worthington </td><td> C9891 </td><td></td></tr><tr><td> 1x DNA Süspansiyon Buffer (10 mM Tris, pH 8.0, 0.1 mM EDTA) </td><td> TEKnova, </td><td> PN T0221 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B8667 </td><td></td></tr><tr><td> Pentobarbital Sodyum </td><td> Henry Schein Vet. Kaynağı * </td><td> Sipariş için iletişim tedarikçisi </td><td> * Veteriner veya laboratuvar hayvan profesyonel aracılığıyla temin edilmelidir </td></tr><tr><td> BT ExoSAP </td><td> Affymetrix / USB </td><td> 78201 </td><td></td></tr><tr><td> 2x RXN Mix CellsDirect </td><td> Invitrogen </td><td> 11737-030 </td><td></td></tr><tr><td> Üst Simge III RT Platinum Taq Mix </td><td> Invitrogen </td><td> 10928-042 </td><td></td></tr><tr><td> RT-STA Primer Mix </td><td> IDT </td><td> Özel </td><td></td></tr><tr><td> Nükleazlar Ücretsiz su </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> W4502 </td><td></td></tr><tr><td> WTA2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50rxn </td><td></td></tr><tr><td> Qiaquick PCR saflaştırma kiti </td><td> Qiagen </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiacube </td><td> Qiagen </td><td> 9001292 </td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop Spektrofotometre </td><td>NanoDrop </td><td> 2000c </td><td></td></tr><tr><td> BioAnalyzer DNA 7500 kiti </td><td> Agilent </td><td> 7500 kiti </td><td></td></tr><tr><td> Bir Renk Etiketleme kiti </td><td> Roche-NimbleGen </td><td> 5223555001 </td><td></td></tr><tr><td> Muş Musculus 12x135k dizi </td><td> Roche-NimbleGen </td><td> 5543797001 </td><td></td></tr><tr><td> GenePix 4200A Tarayıcı </td><td> Moleküler Cihazlar </td><td> 4200A </td><td></td></tr><tr><td> TransPlex Komple Tüm Transcriptome Amplifikasyon Kiti (WTA2 Kiti) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50RXN </td><td></td></tr></tbody></table>

single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes

Çok sayıda araştırma, kalp doku homojenatlarında gen ekspresyonu değişiklikleri incelenmiş olsa da, bu bir doku içinde hücrelerin arasında doğal bir stokastik değişim eğitim engeller. İzolasyon fare kalpleri bir kollajenaz perfüzyon yoluyla saf kardiyomiyosit popülasyonlarının tüm transcriptome gen ekspresyonu için tek bir hücre microarrays nesil veya nanofluidic dizileri kullanarak belirli hedefleri qPCR kolaylaştırır. Biz burada kalp izole kardiyomiyositlerde tek hücre gen ekspresyon profillerini incelemek için bir prosedür açıklanmaktadır. Bu paradigma, değerlendirme gen ekspresyonu (Şekil 1), geleneksel tüm doku iş akışlarını kullanarak zaman mümkün değildir (örneğin bir doku içinde hücrelerin arasında varyans için) ortalama bağımlı değildir faiz ölçütlerinin değerlendirilmesi için izin verir. Biz, microarrays i kullanımını kolaylaştırır çift zincirli cDNA tek bir hücre transcriptome getirili mikrogram sağlam amplifikasyon elde etmişndividual hücreleri. Prosedürde, kullanım kolaylığı ve yeteneği kendi tasarım özelleştirmek için seçilmiştir NimbleGen dizilerin kullanımı açıklanmaktadır. Alternatif olarak, bir ters transkriptaz - belirli hedef amplifikasyon reaksiyonu (RT-STA), nanofluidic PCR ile hedefleri yüzlerce qPCR sağlar. Bu yaklaşımların birini kullanarak, bu hücreler arasında ekspresyon farklılıklarına yanı sıra bir doku içinde nadir hücre tiplerinin ekspresyon profilleri incelenerek incelemek mümkündür. Genel olarak, tek bir hücre gen ekspresyon yaklaşımı, potansiyel olarak tüm dokularda üretilen tipik homojenatlarında hücreleri milyonlarca ifade incelerken genellikle ortalaması alınır kendine özgü ifade profillerinin belirlenmesi veri üretimi sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Tek hücreli ifade profil, tek tek hücrelerin ayrıntılı gen ekspresyon analizi sağlar. Biz kardiyomiyositlerde izolasyonu için yöntemler tanımlamak ve belirli hedeflere bütün transcriptome mikroarray veya qPCR için lizatları hazırlanıyor.

Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde Tek Hücre transkripsiyonel Profilleme

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

single-cell-transcriptional-profiling-of-adult-mouse-cardiomyocytes

Research

JoVE Journal

Biology

17.3K Görüntüleme.  Buck Institute for Research on Aging. Tek hücreli ifade profil, tek tek hücrelerin ayrıntılı gen ekspresyon analizi sağlar. Biz kardiyomiyositlerde izolasyonu için yöntemler tanımlamak ve belirli hedeflere bütün transcriptome mikroarray veya qPCR için lizatları hazırlanıyor.

Video: Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

İzolasyon ve Kültür Yenidoğan Fare kardiyomiyositlerin

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Biyoloji

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

Fare kardiyomiyositlerde İzolasyon ve Fizyolojik Analizi

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

İzolasyon ve Kültür Yetişkin Fare Hücre Sinyal için kardiyomiyositlerin ve<em&gt; In vitro</em&gt; Kalp hipertrofisi

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

Bireysel Hücre Tiplerinin transkripsiyonel Profiling için bir alet olarak lazer destekli mikrodiseksiyon (LAM)

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde İletimi

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

Trans-iç hücre embriyonik kök hücrelerin kitle enjeksiyon daha yüksek Chimerism oranları için yol açar.

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying cell composition, discrimination of functional states, and molecular pathways underlying observed tissue functions and animal behaviors. However, the isolation of intact, healthy single cells from adult mammalian tissues for subsequent downstream single cell molecular analysis can be challenging. This protocol describes the general processes and quality control checks necessary to obtain high-quality adult single cell preparations from the nervous system or skin that enabled subsequent unbiased single cell RNA sequencing and analysis. Guidelines for downstream bioinformatic analysis are also provided.

This protocol describes the general processes and quality control checks necessary for preparing healthy adult mammalian single cells for droplet-based, high throughput single cell RNA-Seq preparations. Sequencing parameters, read alignment, and downstream single-cell bioinformatic analysis are also provided.

Damlacık tek hücre barkodlama tabanlı Transcriptomics yetişkin memeli dokuların

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying ...

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A deeper understanding of the changes in gene expression that occur during repopulation could help identify therapeutic targets to promote the restoration of liver function in the setting of injuries. Nonetheless, methods to isolate specifically the repopulating hepatocytes are inhibited by a lack of cell markers, limited cell numbers, and the fragility of these cells. The development of translating ribosome affinity purification (TRAP) technology in conjunction with the Fah-/- mouse model to recapitulate repopulation in the setting of liver injury allows gene expression profiling of the repopulating hepatocytes. With TRAP, cell type-specific translating mRNA is rapidly and efficiently isolated. We developed a method that utilizes TRAP with affinity-based isolation of translating mRNA from hepatocytes that selectively express the green fluorescent protein (GFP)-tagged ribosomal protein (RP), GFP:RPL10A. TRAP circumvents the long time period required for fluorescence-activated cell sorting that could change the gene expression profile. Furthermore, since only the repopulating hepatocytes express the GFP:RPL10A fusion protein, the isolated mRNA is devoid of contamination from the surrounding injured hepatocytes and other cell types in the liver. The affinity-purified mRNA is of high quality and allows downstream PCR- or high-throughput sequencing-based analysis of gene expression.

Translating ribosome affinity purification (TRAP) enables rapid and efficient isolation of cell type-specific translating mRNA. Here, we demonstrate a method that combines hydrodynamic tail-vein injection in a mouse model of liver repopulation and TRAP to examine the expression profile of repopulating hepatocytes.

Fare Karaciğerinde Hücre Tipine Özgü Gen Ekspresyonu Profiloluşturma

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. Adult mammalian CMs are terminally differentiated cells with minimal proliferative capacity. The post-mitotic state of adult CMs not only restricts cardiomyocyte cell cycle progression but also limits the efficient culture of CMs. Moreover, the long-term culture of adult CMs is necessary for many studies, such as CM proliferation and analysis of gene expression.
The mouse and the rat are the two most preferred laboratory animals to be used for cardiomyocyte isolation. While the long-term culture of rat CMs is possible, adult mouse CMs are susceptible to death and cannot be cultured more than five days under normal conditions. Therefore, there is a critical need to optimize the cell isolation and long-term culture protocol for adult murine CMs. With this modified protocol, it is possible to successfully isolate and culture both adult mouse and rat CMs for more than 20 days. Moreover, the siRNA transfection efficiency of isolated CM is significantly increased compared to previous reports. For adult mouse CM isolation, the Langendorff perfusion method is utilized with an optimal enzyme solution and sufficient time for complete extracellular matrix dissociation. In order to obtain pure ventricular CMs, both atria were dissected and discarded before proceeding with the disassociation and plating. Cells were dispersed on a laminin coated plate, which allowed for efficient and rapid attachment. CMs were allowed to settle for 4-6 h before siRNA transfection. Culture media was refreshed every 24 h for 20 days, and subsequently, CMs were fixed and stained for cardiac-specific markers such as Troponin and markers of cell cycle such as KI67.

Here, we present a protocol for the isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes.

İzolasyon, Transfeksiyon ve Yetişkin Fare ve Sıçan Kardiyomiyositlerinin Uzun Süreli Kültürü

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Analyzing the &alpha;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. Despite the development of multiple differentiation protocols, the generation of iPSC cardiomyocytes resembling an adult-like phenotype remains challenging. One major aspect of cardiomyocytes maturation involves the formation of a well-organized sarcomere network to ensure high contraction capacity. Here, we present a super resolution-based approach for semi-quantitative analysis of the &#945;-actinin network in cardiomyocytes. Using photoactivated localization microscopy a comparison of sarcomere length and z-disc thickness of iPSC-derived cardiomyocytes and cardiac cells isolated from neonatal tissue was performed. At the same time, we demonstrate the importance of proper imaging conditions to obtain reliable data. Our results show that this method is suitable to quantitatively monitor the structural maturity of cardiac cells with high spatial resolution, enabling the detection of even subtle changes of sarcomere organization.

Analyzing the &#945;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

The formation of a proper sarcomere network is important for the maturation of iPSC-derived cardiomyocytes. We present a super resolution-based approach that allows for the quantitative evaluation of the structural maturation of stem cell derived cardiomyocytes, to improve culture conditions promoting cardiac development.

Tek Moleküllü Lokalizasyon Mikroskobu Kullanılarak İnsan iPSC Kaynaklı Kardiyomiyositlerde α-Aktinin Ağının Analizi

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. ...