Tek tek fare kalp hücrelerini antegrad paketleme tekniği ile izole etmek için basit bir Langendorff içermeyen yöntem geliştirdik. Bu yöntem, kalp hücrelerinin yavrudan yaşlı farelere izolasyon edilmesini sağlar. Langendorff bazlı retrograd perfüzyon, çeşitli deney hayvanlarında kardiyak miyositlerin izole edilmesi için altın bir standart olarak kabul edilmiştir.
Bununla birlikte, LTA'nın kanülasyonu, küçük boyutları nedeniyle farelerde teknik olarak zordur. Fare kalbi hasadı için, ötanaziyi doğruladıktan ve karnı tıraş ettikten sonra, kalbi ortaya çıkarmak için torasik boşluğu hızla açın ve kalbi pipete emmek için ucu kalbin yaklaşık boyutuna kesilmiş plastik bir transfer pipeti kullanın. Kavisli makas yerleştirmek için yeterli alan oluşturmak için pipeti kaldırın ve kalbi sırt tarafından çıkarmak için makası kullanın ve atria'ya zarar vermemek için dikkatli olun.
Hemen, kalbi yaklaşık bir dakika boyunca buz gibi CIB-EGTA içeren 30 mililitrelik bir cam kabın içine yerleştirin. Kasılmalar durduğunda, kalbi buz gibi CIB-EGTA içeren 35 mililitrelik bir kültür kabına yerleştirin ve akciğeri ve diğer görünür dokuyu çıkarın. Kabaca temizlenmiş kalbi soğutulmuş CIB-EGTA apeks tarafıyla dolu bir kalp standına yerleştirin ve standı stereoskopik bir mikroskop altına yerleştirin.
Yağ ve bağ dokularını aortu çevresinden çıkarın. Kesilen aortun uzunluğu çok uzunsa, aortu braşiofefalik arterin hemen altında kesin ve kalbi ön yüzey öne bakacak şekilde yönlendirin. Aortu kaldırmak için cımbız kullanın ve aortu atria'nın yakınında kıskaçlamak için küçük bir damar kelepçesi kullanın ve atria'yı hafifçe aşağı itin.
Daha sonra kenetlenmiş kalbi ön tarafı yukarı bakacak şekilde bir perfüzyon plakasına yerleştirin ve kalbi birkaç damla CIB-EGTA ile nemlendirin. Antegrad perfüzyon için, esnek bir uzatma tüpüne bağlı önceden ısıtilmiş CIB-EGTA içeren 20 mililitrelik bir şırıngayı ve işaretli bir enjeksiyon iğnesini infüzyon pompasına yükleyin ve pompayı dakikada 0,5 mililitre akış hızında başlatın. İğne ve pompa dolduğunda, enjeksiyon iğnesini öndeki diyagonal şeklin daha kısa tarafı olan perfüzyon plakasına yerleştirin ve iğneyi sadece kalbin tepe kısmına dokunana kadar kaydırın.
Dikkatlice, iğneyi plakadan bükmeden veya ayırmadan sol ventrikül tepe noktasının yakınındaki iğneyi ventrikül odasına yerleştirin, iğne yerleştirmenin derinliğini tahmin etmek için işareti seyredemeyin. İğne takma işlemi tamamlandığında koroner arterden kan akmaya başlamalıdır. Enjeksiyon iğnesini plakaya sabitlemek ve pompa hızını dakikada bir mililitreye çıkarmak için bant kullanın.
Kalp başarılı bir şekilde perfüzyona maruz kalırsa, kılcal damardaki tamponun akışı epikardyumun hemen altında görünmelidir. İki ila üç mililitre CIB-EGTA perfüzyondan sonra, perfüzyon tamponunu enzim karışımı ile değiştirin. Bir ila iki mililitre perfüzyon yapıldıktan sonra pompa hızını dakikada 1,5 mililitreye çıkarın.
Kalpten akan birikmiş kan içeren perfüzatı gerektiği gibi çıkarmak ve perfüzyonun toplam hacmi 10 mililitreye ulaştığında perfüzyonu durdurmak için bir pipet kullanın. Perfüzyonun sonunda, şırınnadan 10 mililitre enzim karışımını bir ısıtıcı paspas üzerindeki 60 milimetrelik bir kültür kabına aktarın ve yemeğe 20 miligram BSA ekleyin. Tozu çözmek ve enjeksiyon iğnesini ve kelepçeyi kalpten çıkarmak için kabı hafifçe döndürün.
Ventrikülleri ve aryayı kalpten çıkarın ve dokuları BSA takviyeli enzim karışımına yerleştirin. Ventrikül miyositlerini izole etmek için, epicardiumu kavramak ve ventrikülleri hafifçe küçük parçalara çekmek için iki çift cımbız kullanın. Tüm ventrikül parçaları oluşturulduğunda, hücreleri nazik pipetleme ile yaklaşık 30 kez dağıtın ve sindirilmemiş kalıntıları 100 mikronluk bir örgü hücre süzgecinden 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne filtreleyin.
Santrifüjlemeden sonra, kardiyomiyosit peletini kalsiyum ve BSA ile desteklenmiş önceden ısınmış CIB'de yeniden biriktirin ve hücreleri 37 santigrat derecede beş dakika kuluçkaya bırakın. Kuluçkanın sonunda, hücreleri tekrar santrifüj edin ve çökülen kardiyomiyositleri aşağı akış analizine kadar 37 santigrat derecede bakımları için uygun bir hücre resüspenzyon çözeltisi hacminde yeniden kullanın. Atriyal miyositleri izole etmek için, atriayı kalsiyum ve BSA ile desteklenmiş önceden ısınmış bir CIB kabına aktarın ve gösterildiği gibi aryayı parçalara ayırın.
Pipetleme yaparak dokuları bozmak ve ayrışmış hücreleri santrifüjleme ile toplamak için 10 mikrolitreye ayarlanmış 20 mikrolitre pipet kullanın. Daha sonra atriyal hücreyi uygun bir hücre resüspenzyon çözeltisi hacminde yeniden kullanın. Bu görüntüde taze izole edilmiş ventrikül miyositleri gözlenebilir.
Bu izolasyon prosedürü, izolasyondan sonraki yaklaşık beş saat içinde sekiz ila 10 haftalık farelerden çubuk şeklindeki sessiz ventrikül miyositlerinin% 70 ila 80 verimine neden olur. İki yaşından büyük farelerde taze izole edilebilir hücrelerin oranı daha düşüktür. Ventrikül ve atriyal miyositlerde kaydedilen eylem potansiyelleri Langendorff tabanlı yöntemle elde edilen hücrelerde ölçülenlere benzer.
İmmünostaining analizi, ventrikül miyositlerinin sarkoerik yapısının organizasyonunun ve kardiyak fibroblastların alt kültürden sonra miyofibroblastlara dönüşümünü değerlendirmek için kullanılabilir. Batı blot analizi, işlemden sonra atria ve ventriküllerde ilgi çekici proteinlerin spesifik ekspresyonunu belirlemek için önerilir. Enzimlerle perfüzyondan sonra, atria ve ventriküllerden elde edilen proteinler, protein ekstraksiyonu için hafif kuvvetle lizis tamponunda kolayca homojenize edilebilir.
İğne yerleştirmenin yönünü ve derinliklerini kontrol etmek önemlidir. İğneyi sol ventrikül içine sokarken, ventrikül septumını delmemeye veya valflere nüfuz etmemeye dikkat edin. Deneyin amacına bağlı olarak perfüzyonun bileşimini değiştirebilirsiniz.
Örneğin, EGTA takviyeli bir deterjan kalbin hücresiz bir iskelesini yapmak için kullanılabilir.
