Yazarın Morris hayvan Vakfı (D15CA-907) tarafından finanse edildi. Çalışma fon University of California, Davis, Equine Sağlık Merkezi ve refakatçi hayvan sağlığı merkezi tarafından desteklenmiştir (2016-24-F). Yazarlar Geena Ng onun hakkında yardım almak için rakamlar ve Nghi Nguyen video ile yardımını kabul etmek istiyorum.

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Kaliforniya Üniversitesi Davis tarafından kabul edildi (protokol numarası: 18338).
1. kan toplama
<ol><li>10 mL kan ya 21 G iğne şırınga aspirasyon tarafından kullanarak sefalik veya şah damarı çizin.</li>
	<li>Aşırı kesme stres önlemek için kan sodyum heparin (75 USP) içeren tüpler aktarmadan önce iğneyi şırıngadan çıkarın. Tüpler birkaç kez yavaşça tersine çevirin yeterli antikoagülan ve kan karıştırma sağlamak için. Pıhtı veya kırmızı hücre toplamları kanıtı için buza örnekleri yerleştirmeden önce kontrol edin.</li>
</ol>2. nötrofil yalıtım
<ol><li>Anticoagulated kan ile buz gibi Dubecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) (pH 7.4, divalent katyonlar olmadan) eşit bir güç oranında seyreltin. Seyreltilmiş kan 8 mL 25 mL % 3 dextran (üzerinden % 0,9 sodyum klorür çözümde çözünmüş Leuconostoc spp.) içeren bir 50 mL polipropilen konik tüp içine aktarın. Tüp dik toplama ve eritrositler sedimantasyon izin vermek 30 dakika oda sıcaklığında yerleştirin.</li>
	<li>Dikkatle lökosit açısından zengin plazma (Şekil 1) 5 mL 5 mL de bir 14 mL polipropilen yuvarlak alt tüp yoğunluğu degrade medyada üzerine katman. 2 çözümleri11karıştırmak değil dikkatli olun.</li>
	<li>400 x g hızlanma/yavaşlama (A/D) ayarlamak için 0 (fren yok), oda sıcaklığında 30 dakika ile de tüpler santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>5 mL kullanarak serolojik damlalıklı plazma ve periferik kan mononükleer hücre (PBMC) katmanları (Şekil 1) atlayarak granülosit hücre katmanı toplamak. Yeni damlalıklı kirlenme en aza indirmek için her zaman kullanın.</li>
	<li>4-6 mL 50 mL polipropilen konik tüp içinde polymorphnuclear (PMN) hücre tabakasının bir yer. Eritrosit toplamları az miktarda PMN katmanla birlikte Aspire beri 1 mL serolojik damlalıklı yavaşça tüp alt kısmında yerleşmiş eritrosit toplamları kaldırmak için kullanın.</li>
	<li>20 mL soğuk Ultrasaf Su ile kalan eritrositler parçalayıcı. 30-60 için birden çok kez tüpü yavaşça tersine çevirin s yeterli eşit bir buz gibi %1.8 sodyum klorür çözeltisi hacmi eklemeden önce lysing emin olmak için.</li>
	<li>112 x g 4 ° C'de 10 dakika, A/D 0 olarak ayarlanırsa, santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Bu Pelet kırmızı görüntülenirse eritrosit lizis adımı tekrarlayın. Süpernatant dikkatle ile serolojik damlalıklı atın ve yavaşça Pelet DPBS (5 mM dekstroz, 0.9 mM MgCl2, 1.9 mM CaCl2 ve %1 sığır serum albümin, pH 7.3) 100 µL içinde resuspend. Tüm resuspended hücreleri birleştirmek ve buza koyun.</li>
	<li>Bir otomatik hücre Çözümleyicisi kullanan bir hücre sayısı gerçekleştirmek ve bir hemasitometre tarafından Kont doğrulayın. Gerekirse, bir cytocentrifuge (1000 rpm, 5 min) kullanarak bir cam slayt PMNs konsantre ve nötrofil hücrelerinin toplam sayısı dışında sayısını sayarak nötrofil yüzdesini belirlemek.</li>
	<li>Strober ve ark. tarafından belirtildiği gibi bir trypan mavi dışlama test gerçekleştirerek nötrofil canlılığı belirlemek 12 başarılı yalıtım bir canlılık % 100 95 verim ve nötrofil % 95'den büyük olmalıdır.</li>
	<li>Nötrofil konsantrasyonu yüzde canlılığı ve yüzde nötrofil ile toplam hücre sayısı çarpılarak belirler. Başarılı yalıtım bir konsantrasyon nötrofil 6 x 106/mL için 1.5 ile verim.</li>
	<li>1 x 106/mL son bir konsantrasyon için nötrofil 7,3 için ayarlanır pH 5 mM dekstroz, 0.9 mM MgCl2, 1.9 mM CaCl2ve %1 sığır serum albümin içeren DPBS ile oranında seyreltin.</li>
</ol>3. Floresan Mikroskobu canlı nötrofil
<ol><li>Yer 200'e 400 μL nötrofil (1 x 106/mL) bir poli-L-lizin her kuyuya 12-şey kültür plaka kaplı. Nötrofil kuyu dibine 30 dk 37 ° C'de hücreler kuluçka tarafından bağlı kalmak izin verir.</li>
	<li>Nükleik asitler iki nükleik asit boyalar biri, bir o sağlam Membranlar ile hücrelerdeki lekeleri ve bir oda sıcaklığında 10 dakika için (bkz. Tablo reçetesi) geçirgen Membranlar ile hücrelerdeki lekeleri 1 mikron ile etiketleyin.</li>
	<li>Nötrofil 100 μg/mL lipopolysaccharide (LPS) (E. coli O55. ile etkinleştirmek B5), 100 nM phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) olumlu denetim veya DPBS olarak 37 ° C'de 180 dk için negatif kontrol eşdeğer hacmi olarak</li>
	<li>GFP kullanarak görüntüleri (uyarma: 470/22 nm, emisyon: 525/50 nm) ve Texas kırmızı kanalları (uyarma: 585/29 nm, emisyon: 628/32 nm) aşağıdaki zaman noktalarda 40 X büyütme, floresans mikroskobu Tarih: 30, 90, 120 ve 180 dk.</li>
</ol>4. NET miktar ve NET bileşenler ayirt kullanarak tespiti
<ol><li>Dikkatle 18 mm çap Poly-D-lizin kaplı kapak paket fişi 12-şey kültür plaka kuyu yerleştirin. Kuyuları uygun şekilde etiketleyin.</li>
	<li>Tohum 100-200 μL, nötrofil (1 x 106/mL) doğrudan coverslips izole ve nötrofil kapak irsaliyeleri için 30 dk 37 ° C'de hücreler kuluçka tarafından bağlı kalmak izin.</li>
	<li>Nötrofil 3.3 içinde açıklandığı gibi etkinleştirin. NET oluşumu ile 200 µΜ nötrofil pretreating tarafından inhibe Cl-amidine (15 dk, 37 ° C) daha önce Li vd tarafından açıklandığı gibi harekete geçirmek önce 13 uygun araç kontrol (DMSO) denemeye dahil emin olun.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde kapak paket fişi ile iyi forseps çıkarın. Parafin film sayfası sığ kuyular oluşturmak ve 2-3 damla % 4'lük yerleştirmek için bir test tüpü sandalyesinden katman her iyi10PFA. Kuyuları uygun şekilde etiketleyin ve yavaşça kapak paket fişi ters İngiltere'de yılın dolu kuyu yatıyordu. Hücreleri 20 dk için oda sıcaklığında düzeltilmesi için izin.</li>
	<li>Hücreleri DPBS 5 dk, 3 kez bir kuyudan diğerine taşıyarak yıkayın.</li>
	<li>İmmunolabelling kısa bir süre sonra nötrofil harekete geçirmek ve fiksasyon gerçekleştirilemez, kapak absorbans kağıda kapak paket fişi yüz-up yerleştirerek kuru hava olmaya makbuzları olanak verir. Kapak paket fişi en fazla 1 hafta yüz-up 4 ° C'de bir etiketli 12-şey kültür plaka için daha fazla çözümleme kadar saklanabilir. Hücreleri 3 kez DPBS için 1dk 4.4 sonraki adıma devam etmeden önce açıklandığı gibi aynı tekniği kullanarak yıkayın.</li>
	<li>Hücreleri permeabilize için yavaşça kapak notu baş aşağı bir damla %1 4.4 içinde NP-40 için 1dk tekniği kullanarak açıklanan yatıyordu. 3 kez DPBS içinde bir rocker üzerinde 1 dakika yıkayın.</li>
	<li>Rastgele her örnek için bir numara atamak ve bir elmas noktası işaretçisi coverslips buna göre etiketlemek için kullanın.</li>
	<li>Hazırlamak ve etiket bireysel Petri yemekler parafin film ile kaplı ve 100-200 μL %5 keçi serum (arabellek kütük parçası) film üzerine yerleştirin. Coverslips baş aşağı engelleme arabellek üzerinde yatıyordu. Bir rocker üzerinde yerleştirin ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya</li>
	<li>3 kez DPBS içinde bir rocker üzerinde 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>Birincil antikor seyreltik (1: 400 tavşan poliklonal anti-citrullinated histon H3 (citH3) % 5 keçi serumda). Hücreleri etiketli Petri yemeklerinde parafin film ile kaplı kuluçkaya. Her kapak notu baş aşağı seyreltilmiş antikor çözüm 50 ila 100 μL üzerinde yatıyordu. Bir rocker üzerinde yerleştirin ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya</li>
	<li>3 kez DPBS içinde bir rocker üzerinde 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>Seyreltik ikincil antikor %5 keçi serumda fluorophore (1: 200) için Birleşik. Hücreleri etiketli Petri yemeklerinde parafin film ile kaplı kuluçkaya. Her kapak notu baş aşağı seyreltilmiş antikor çözüm 50 ila 100 μL üzerinde yatıyordu. Bir rocker üzerinde yerleştirin ve karanlıkta 37 ° C'de 1 h kuluçkaya.</li>
	<li>3 kez DPBS içinde karanlık bir rocker üzerinde 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>Myeloperoxidase (MPO) eşzamanlı tespiti için Li vd tarafından açıklandığı gibi değiştirilmiş Çift Kişilik immunolabeling iletişim kuralı için aşağıdaki adımları izleyin 13
</li>
	<li>Hücreleri etiketli Petri yemeklerinde parafin film ile kaplı kuluçkaya. Her kapak notu baş aşağı (bir gecede, 4 ° C, karanlıkta) hafif sallanan altında serum % 10 tavşan 100-200 μL üzerinde yatıyordu.</li>
	<li>3 kez DPBS içinde karanlık bir rocker üzerinde 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>Karanlıkta bir rocker üzerinde oda sıcaklığında 2 h için anti-tavşan Fab parçaları 50 μg/mL çekimsiz keçi hücrelerde kuluçkaya.</li>
	<li>3 kez DPBS içinde karanlık bir rocker üzerinde 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>Birincil antikor (1: 200 tavşan poliklonal anti-insan MPO antikor) % 5 keçi serumda sulandırmak. Hücreleri etiketli Petri yemeklerinde parafin film ile kaplı kuluçkaya. Her kapak notu baş aşağı seyreltilmiş antikor çözüm 50 ila 100 μL üzerinde yatıyordu. Bir rocker üzerinde yerleştirin ve karanlıkta 37 ° C'de 1 h kuluçkaya.</li>
	<li>İkincil antikor %5 keçi serumda fluorophore için Birleşik sulandırmak ve 4,8 içinde açıklandığı gibi kuluçkaya</li>
	<li>3 kez DPBS içinde karanlık bir rocker üzerinde 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>Parazit kontrolleri ile her iki birincil antikorlar bağışıklık etiketleme ikinci adımda kuluçka hariç tutarak hazırlanmalıdır.</li>
	<li>DNA ile 300 leke nM 4', 6-Diamidion-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında 5 min için.</li>
	<li>3 kez karanlık bir rocker üzerinde 1 dk DPBS içinde yıkayın.</li>
	<li>Antifade mountant bir cam slayt üzerine bir damla (~ 50 μl) uygulanır. Yavaşça ters coverslip hücreleri ile montaj önce aşırı arabellek kaldırmak için bir emici kağıt üzerine coverslip kenarına dokunun. Montaj orta coverslip ve cam slayt arasındaki ince bir tabaka oluşturmalıdır. Hava kabarcıkları kaldırmak için çok yavaşça coverslip üzerinde iyi forseps ile tuşuna basın.</li>
	<li>Örnekleri 4 ° C'de karanlık gecede tedavi etmek izin Montaj orta daldırma lensler ile mikroskopik analiz için sertleşmesine. Örnekleri karanlıkta 4 ° C'de depolayın.</li>
</ol>5. nötrofil hücre dışı tuzak miktar
<ol><li>Edinme ve deneysel koşullar mikroskop resimlere analiz operator(s) kör.</li>
	<li>Bir floresan mikroskop 40 X büyütme oranında kullanarak, 10 resim Rastgele her coverslip bir deneyde ilgili kanalları altında farklı bölgelerinden al. Çekim hızı, parlaklık ve kontrast her kanal görüntüleri edinimi tutarlı tutulmasını sağlamak.</li>
	<li>Mevcut yazılım gibi ImageJ (NIH) kullanarak görüntüleri analiz. CfDNA, citH3 ve MPO (Şekil 3A, B) Co yerelleştirilmesini tabanlı ağlar tanımlamak. Ağlar ve deneysel her koşul için 10 rasgele alan nötrofil sayısı ölçmek. Yayımlanan ağlar numaraları bir oranı olarak ifade (ağlar sayısı: nötrofil sayısı) deneysel her koşul için.</li>
	<li>Hücre içi citH3 ifade tedavi etkisini değerlendirmek için nötrofil ile hücre içi citH3 ve nötrofil hücre içi citH3 ilgili kanalları ( altında 40 X büyütme, 10 rasgele alan olmadan sayısını saymak Şekil 3, kırmızı oklar). Hücre içi citH3 ifade ile hücre içi citH3 nötrofil hücre içi citH3 olmadan sayıda nötrofil sayısı oranı olarak ifade edilebilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+suicide:+why+neutrophils+die,+to+make+NETs.">Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li><li>Kaplan, M. J., Radic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+Double-edged+swords+of+innate+immunity.">Neutrophil extracellular traps: Double-edged swords of innate immunity.</a> The Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).</li><li>Czaikoski, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+Induce+Organ+Damage+during+Experimental+and+Clinical+Sepsis.">Neutrophil Extracellular Traps Induce Organ Damage during Experimental and Clinical Sepsis.</a> PLoS One. 11 (2), e0148142 (2016).</li><li>Dwivedi, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+utility+and+characterization+of+cell-free+DNA+in+patients+with+severe+sepsis.">Prognostic utility and characterization of cell-free DNA in patients with severe sepsis.</a> Critical Care. 16 (4), R151 (2012).</li><li>Mai, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+but+not+Early+Treatment+with+DNase+Reduces+Organ+Damage+and+Improves+Outcome+in+a+Murine+Model+of+Sepsis.">Delayed but not Early Treatment with DNase Reduces Organ Damage and Improves Outcome in a Murine Model of Sepsis.</a> Shock. 44 (2), 166-172 (2015).</li><li>Jeffery, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dogs+cast+NETs+too:+Canine+neutrophil+extracellular+traps+in+health+and+immune-mediated+hemolytic+anemia.">Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 168 (3-4), 262-268 (2015).</li><li>Letendre, J. A., Goggs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+plasma+cell-free+DNA+concentrations+in+dogs+with+sepsis,+trauma,+and+neoplasia.">Measurement of plasma cell-free DNA concentrations in dogs with sepsis, trauma, and neoplasia.</a> Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 27 (3), 307-314 (2017).</li><li>Jeffery, U., Gray, R. D., LeVine, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Fluorescence+Assay+for+Quantification+of+Canine+Neutrophil+Extracellular+Trap+Release.">A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li><li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+how+to+generate+and+visualize+them.">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), (2010).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability.">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, (2015).</li><li>Li, R. H. L., Ng, G., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-induced+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+canine+neutrophils+is+dependent+on+histone+H3+citrullination+by+peptidylarginine+deiminase.">Lipopolysaccharide-induced neutrophil extracellular trap formation in canine neutrophils is dependent on histone H3 citrullination by peptidylarginine deiminase.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 193, 29-37 (2017).</li><li>Masuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis+markers:+Quest+for+specific,+objective,+and+quantitative+markers.">NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers.</a> Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps.">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).</li><li>Leshner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD4+mediated+histone+hypercitrullination+induces+heterochromatin+decondensation+and+chromatin+unfolding+to+form+neutrophil+extracellular+trap-like+structures.">PAD4 mediated histone hypercitrullination induces heterochromatin decondensation and chromatin unfolding to form neutrophil extracellular trap-like structures.</a> Frontiers in Immunology. 3, 307 (2012).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+and+inactivators+of+protein+arginine+deiminase+4:+functional+and+structural+characterization.">Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization.</a> Biochemistry. 45 (39), 11727-11736 (2006).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada değişmek içinde çekirdek uyum ve cfDNA serbest bırakmak içinde yaşayan köpek nötrofil hücre permeant boya ve bir hücre impermeant boya kullanarak gözlemlemek için bir protokol mevcut. Bu tahlil en büyük avantajı bu NET oluşumu gerçek zamanlı algılama için yüksek çözünürlüklü mikroskobu canlı nötrofil hücre fiksasyon, olmadan tarafından bu nedenle, vitro NET oluşumu gözlemlemek için basit ve değerli bir araç sağlayan sağlanmıştır. Bu tahlil NET bileşenler tespiti ...

Nötrofil kısa ömürlü granülosit patojenler istila karşı ilk savunma sorumlu vardır. Nötrofiller, enfeksiyon, siteye işe mikroorganizmalar tarafından fagositoz, degranulation ve reaktif oksijen türleri (ROS)1nesil ortadan kaldırmak. Bakteri veya endotoxins huzurunda, nötrofil yayın nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar), hücre dışı kromatin oluşan histon ve elastase ve myeloperoxidase gibi taneli proteinler (MPO)2süslenmiş. NETs vazgeçilmez antimikrobiyal özellikleri olsa da, deneysel ve klinik kanıt artan hevesli NET oluşumu sepsis sırasında birden fazla organ fonksiyon bozukluğu ve ölüm3,4' e, neden olabilir gösteriyor 5 , 6.
NETs köpeklerde benzer bir patofizyolojik rol oynayabilir çünkü önlemek veya azaltmak NET oluşumu tedavi müdahaleler roman tedavi stratejileri septik hayvanlarda olarak hizmet verebilir. Bu nedenle, güvenilir bir teknik NETosis ve köpeklerde NET bileşenler ölçmek ve değerlendirmek için bir ihtiyaç vardır. NET bileşenleri boş hücre DNA (cfDNA) ve oluşturarlar dahil olmak üzere daha önce köpek nötrofil ve plazma klinik köpekler7,8,9değerlendirilir. Floresans deneyleri kullanarak, Goggs ve Letendre septik köpeklerin cfDNA yüksek düzeyde sağlıklı köpekler8' den vardır bulundu. Bu teknikler son derece objektif ve nicel olmakla birlikte, onlar NETosing nötrofil dışında nekrotik hücrelerden elde edilebilir bu yana oluşturarlar ve cfDNA NETosis işaretleri olarak non-spesifik ölçümdür. Burada floresans mikroskobu canlı NETosing nötrofil davranışları incelemek için kullanan bir tekniğini tanımlamak. Biz de subjektif ağlar ve bileşenlerinin MPO ve citH3 köpek nötrofil10gibi ölçmek için çift-immunolabeling kullanan bir değiştirilmiş Protokolü ayrıntı.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dextran from Leuconostoc spp.</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31392</td>
			<td>Molecular weight 450,000 &#8211; 650,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>17144002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1285801</td>
			<td>With divalent cations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190136</td>
			<td>Without divalent cations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli O55:B5</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S11368</td>
			<td>5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S7578</td>
			<td>1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface-Amps NP-40</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine coated coverslips</td>
			<td>neuVitro</td>
			<td>H-12-pdl</td>
			<td>12 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-citrullinated histone H3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab5103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-007-003</td>
			<td>Specificity: IgG (H+L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- Myeloperoxidase antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro canine neutrophil extracellular trap formation: dynamic and quantitative analysis by fluorescence microscopy

Patojenler istila yanıt olarak, nötrofil histon ve antimikrobiyal proteinler ile dekore edilmiş DNA hücre dışı ağları olan ekstraselüler nötrofil tuzakları (ağlar), serbest bırakın. Aşırı NET formasyonu (NETosis) ve citH3 yayın sepsis sırasında birden fazla organ fonksiyon bozukluğu ve fareler ve insanlar mortalite ile ilişkili ama köpeklerde olan etkileri bilinmemektedir. Burada, tam kan gözlem ve NETosis miktar üzerinden köpek nötrofil yalıtmak için bir teknik açıklar. Lökosit açısından zengin plazma dextran sedimantasyon tarafından oluşturulan, piyasada bulunan yoğunluk gradient ayrılık medya tarafından ayrılmış ve granülosit toplanan hücre sayımı ve Viabilite test. Canlı nötrofil içinde gerçek zamanlı NETosis gözlemlemek için hücre permeant ve hücre impermeant floresan nükleik asit lekeleri nötrofil lipopolysaccharide (LPS) veya phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) tarafından aktive eklenir. Nükleer Morfoloji ve NET oluşumu değişiklikler zamanla floresans mikroskobu tarafından gözlenir. Vitro NETosis daha fazla co-değiştirilmiş bir çift-immunolabelling iletişim kuralı kullanılarak colocalization tarafından boş hücre DNA'ın (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) ve citrullinated histon H3 (citH3) ile karakterizedir. Objektif olarak NET oluşumu ve citH3 ifade floresans mikroskobu, kullanarak ölçmek için ağlar ve citH3 pozitif hücreleri mevcut yazılım kullanarak kör bir şekilde sayılabilir. Bu teknik NETosis geçmesi köpek nötrofil vitro kapasitesini değerlendirmek için belirli bir tahlil olduğunu.

Canlı hücre görüntüleme bu iletişim kuralını kullanan, müfettişler nükleer morfoloji, plazma membran bütünlüğü ve yaşam nötrofil cfDNA varlığı gözlemleyebilirsiniz. Bir hücre impermeant nükleer boya çekirdek asitleri kırmızı hücrelerin hasarlı hücre zarı ile lekeleri. Başka bir hücre permeant boya, bozulmamış plazma membran ile canlı hücrelerde hücre içi nükleik asitler Etiketler. Kendi tedavileri ne olursa olsun tüm bozulmamış nötrofil yeşil ...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy at JoVE.com

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

Biz tam kan gelen köpek nötrofil yalıtmak ve NET canlı nötrofil floresans mikroskobu kullanılarak oluşumunda görselleştirmek için yöntemleri açıklanmaktadır. Ayrıca açıklanan NET oluşumu ve citrullinated histon H3 ölçmek için iletişim kurallarıdır ayirt mikroskobu kullanarak (citH3) ifade.

Vitro Köpek nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu: Floresans mikroskobu dinamik ve nicel analiz

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

in-vitro-canine-neutrophil-extracellular-trap-formation-dynamic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

8.6K Görüntüleme.  University of California, Davis. Biz tam kan gelen köpek nötrofil yalıtmak ve NET canlı nötrofil floresans mikroskobu kullanılarak oluşumunda görselleştirmek için yöntemleri açıklanmaktadır. Ayrıca açıklanan NET oluşumu ve citrullinated histon H3 ölçmek için iletişim kurallarıdır ayirt mikroskobu kullanarak (citH3) ifade.

Video: In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar: Onları nasıl oluşturun ve görselleştirin için

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

Takip Nötrofil Lumen Crawling, intravital video Mikroskopi Doku transendoteliyal Göç ve Kemotaksis

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation. 
Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

Ekstraselüler DNA Yayın Yüksek Verimli Ölçme ve İnsan Nötrofiller Kantitatif NET Oluşumu<em&gt; İn Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or neutralize the ingested material, or to present it as antigens and initiate adaptive immune responses. The pH of phagosomes is a critical parameter regulating fission or fusion with endomembranes and activation of proteolytic enzymes, events that allow the phagocytic vacuole to mature into a degradative organelle. In addition, translocation of H+ is required for the production of high levels of reactive oxygen species (ROS), which are essential for efficient killing and signaling to other host tissues. Many intracellular pathogens subvert phagocytic killing by limiting phagosomal acidification, highlighting the importance of pH in phagosome biology. Here we describe a ratiometric method for measuring phagosomal pH in neutrophils using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled zymosan as phagocytic targets, and live-cell imaging. The assay is based on the fluorescence properties of FITC, which is quenched by acidic pH when excited at 490 nm but not when excited at 440 nm, allowing quantification of a pH-dependent ratio, rather than absolute fluorescence, of a single dye. A detailed protocol for performing in situ dye calibration and conversion of ratio to real pH values is also provided. Single-dye ratiometric methods are generally considered superior to single wavelength or dual-dye pseudo-ratiometric protocols, as they are less sensitive to perturbations such as bleaching, focus changes, laser variations, and uneven labeling, which distort the measured signal. This method can be easily modified to measure pH in other phagocytic cell types, and zymosan can be replaced by any other amine-containing particle, from inert beads to living microorganisms. Finally, this method can be adapted to make use of other fluorescent probes sensitive to different pH ranges or other phagosomal activities, making it a generalized protocol for the functional imaging of phagosomes.

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

Oranlı metrik Floresan Mikroskopi fagosom pH ölçümü

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of lipids. The function of lipids (e.g., in host-pathogen interactions or host entry) has been reported to play a crucial role in cellular processes. Here, we show a method to determine lipid composition, with a focus on the cholesterol level of primary blood-derived neutrophils, by HPTLC in comparison to high performance liquid chromatography (HPLC). The aim was to investigate the role of lipid/cholesterol alterations in the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NET release is known as a host defense mechanism to prevent pathogens from spreading within the host. Therefore, blood-derived human neutrophils were treated with methyl-&#946;-cyclodextrin (M&#946;CD) to induce lipid alterations in the cells. Using HPTLC and HPLC, we have shown that M&#946;CD treatment of the cells leads to lipid alterations associated with a significant reduction in the cholesterol content of the cell. At the same time, M&#946;CD treatment of the neutrophils led to the formation of NETs, as shown by immunofluorescence microscopy. In summary, here we present a detailed method to study lipid alterations in neutrophils and the formation of NETs.

Lipids are known to play an important role in cellular functions. Here, we describe a method to determine the lipid composition of neutrophils, with emphasis on the cholesterol level, by using both HPTLC and HPLC to gain a better understanding of the underlying mechanisms of neutrophil extracellular trap formation.

Yöntemler lipid Nötrofiller değişiklikler ve Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar sonraki oluşumunu incelemek

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are networks of DNA, histones and neutrophil proteins. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay.

Köpek Nötrofil Ekstrasellüler Trap Release Niceleme için Basit Floresan Testi

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze membrane fusion within eukaryotic cells. The SNARE protein family consists of about 36 different members. Specific intracellular transport routes are catalyzed by specific sets of 3 or 4 SNARE proteins that thereby contribute to the specificity and fidelity of membrane trafficking. However, studying the precise function of SNARE proteins is technically challenging, because SNAREs are highly abundant and functionally redundant, with most SNAREs having multiple and overlapping functions. In this protocol, a new method for the visualization of SNARE complex formation in live cells is described. This method is based on expressing SNARE proteins C-terminally fused to fluorescent proteins and measuring their interaction by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) employing fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). By fitting the fluorescence lifetime histograms with a multicomponent decay model, FRET-FLIM allows (semi-)quantitative estimation of the fraction of the SNARE complex formation at different vesicles. This protocol has been successfully applied to visualize SNARE complex formation at the plasma membrane and at endosomal compartments in mammalian cell lines and primary immune cells, and can be readily extended to study SNARE functions at other organelles in animal, plant, and fungal cells.

This protocol describes a new method allowing for the quantitative visualization of complex formation of SNARE proteins, based on F&#246;rster resonance energy transfer, and fluorescence lifetime imaging microscopy.

Hücre içi SNARE mikroskobu Imaging Floresans ömür tarafından kaçakçılığı görüntülenmesi

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. NETs have been demonstrated to serve as an important host defense mechanism that traps and kills microorganisms. On the other hand, they have been implicated in diverse systemic autoimmune diseases. NETs are immunogenic and toxic structures that contain a pool of relevant autoantigens including anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA)-associated vasculitis (AAV) and systemic lupus erythematosus (SLE). Different forms of NETs can be induced depending on the stimulus. The amount of NETs can be quantified using different techniques including measuring DNA release in supernatants, measuring DNA-complexed with NET-molecules like myeloperoxidase (MPO) or neutrophil elastase (NE), measuring the presence of citrullinated histones by fluorescence microscopy, or flow cytometric detection of NET-components which all have different features regarding their specificity, sensitivity, objectivity, and quantity. Here is a protocol to quantify ex vivo NET formation in a highly-sensitive, high-throughput manner by using three-dimensional immunofluorescence confocal microscopy. This protocol can be applied to address various research questions about NET formation and degradation in health and disease.

This protocol describes a highly sensitive and high throughput neutrophil extracellular trap (NET) assay for the semi-automated quantification of ex vivo NET formation by immunofluorescence three-dimensional confocal microscopy. This protocol can be used to evaluate NET formation and degradation after different stimuli and can be used to study potential NET-targeted therapies.

Nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu ölçmek ve değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek tahlil

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...