Name: in vitro canine neutrophil extracellular trap formation: dynamic and quantitative analysis by fluorescence microscopy
Uploaded: 2018-08-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
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해당 작가 모리스 동물 재단 (D15CA-907)에 의해 투자 되었다. 연구 캘리포니아 대학, 데이비스, 말 건강 센터 및 동반자 동물 건강을 위한 센터에서 기금에 의해 지원 되었다 (2016-24-F). 저자는 비디오와 함께 그녀의 지원에 대 한 수치와 응이 구 엔 그녀의 지원에 대 한 지 나 Ng를 인정 하 고 싶습니다.

여기에 설명 된 모든 방법을 기관 동물 관리 및 사용, 데이비스가 주 대학에 위원회에 의해 승인 했다 (번호를 프로토콜: 18338).
1. 혈액 컬렉션
<ol><li>21g 바늘을 사용 하 여 주사기 포부에 의해 두 부 또는 jugular 정 맥에서 혈액 10 mL을 그립니다.</li>
	<li>과도 한 전단 응력을 방지 하려면 나트륨 덤플링을 (75 USP)를 포함 하는 tube(s)로 혈액을 전송 하기 전에 주사기에서 바늘을 제거 합니다. 부드럽게 반전 튜브 몇 번 응고 제와 혈액의 적절 한 혼합 되도록. 혈전 또는 얼음에 샘플을 배치 하기 전에 레드 셀 집계를 확인 합니다.</li>
</ol>2. 호 중구 절연
<ol><li>얼음 처럼 차가운 Dubecco 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS) (pH 7.4, divalent 양이온 없이)의 동등한 양으로 anticoagulated 혈액 희석. 8 mL 희석된 혈액의 포함 ( Leuconostoc 종 0.9% 염화 나트륨 용액에 녹아 있는)에서 3 %dextran 25 mL 50 mL 폴 리 프로필 렌 원뿔 관으로 전송 합니다. 튜브를 집계 및 적혈구의 침 강 30 분 동안 실내 온도에 똑바로 놓습니다.</li>
	<li>신중 하 게 14 mL 폴 리 프로필 렌 라운드 하단 튜브에 밀도 그라데이션 미디어의 5 mL 위에 백혈구 풍부한 혈장 (그림 1)의 5 mL를 계층. 2 솔루션11혼합에 아닙니다 조심 하십시오.</li>
	<li>400 x g 가속/감속을 실 온에서 30 분 동안 0 (브레이크) (A/D) 설정에서 튜브 원심</li>
	<li>5 mL를 사용 하 여 혈 청 학적인 피펫으로 플라즈마 및 주변 혈액 단 세포 (PBMC) 층 (그림 1)를 우회 하 여 granulocyte 셀 레이어를 수집 합니다. 오염을 최소화 하기 위해 새로운 피펫으로 각 시간을 사용 합니다.</li>
	<li>폴 리 프로필 렌 50 mL 원뿔 튜브에 polymorphnuclear (PMN) 세포 층의 4 ~ 6 mL를 배치 합니다. 적은 양의 적혈구 집계 PMN 레이어와 함께 발음 될 수 있습니다, 이후 1 mL 혈 청 학적인 피펫으로 사용 하 여 부드럽게 제거 적혈구 집계는 튜브의 하단에 정착.</li>
	<li>차가운 초순 물 20 mL와 나머지 적혈구 lyse 부드럽게 여러 번 30 ~ 60 대 한 튜브를 반전 차가운 1.8% 염화 나트륨 해결책의 동일한 볼륨을 추가 하기 전에 적절 한 lysing 되도록 s.</li>
	<li>4 ° C에서 10 분, 0 A/D 설정에 대 한 112 x g 에서 원심.</li>
	<li>이 펠 릿 나타나는 붉은 경우 적혈구 세포 단계를 반복 합니다. 혈 청 학적인 피펫으로와 신중 하 게 상쾌한 삭제 하 고 부드럽게 DPBS (5 mM 포도 당, 0.9 m m MgCl2, 1.9 m m CaCl2 와 1% 소 혈 청 알 부 민, pH 7.3)의 100 µ L에 펠 릿을 resuspend. 모든 resuspended 셀을 결합 하 고 얼음에.</li>
	<li>자동된 세포 분석기를 사용 하 여 셀 수를 수행 하 고는 hemocytometer에 의해 카운트를 확인. 필요한 경우, cytocentrifuge (1000 rpm, 5 분)를 사용 하 여 유리 슬라이드에 PMNs 집중 하 고 셀의 총 수에서 호 중구의 수를 계산 하 여 호 중구의 비율을 결정.</li>
	<li>Strober 그 외 여러분 에 의해 설명 된 대로 trypan 블루 제외 테스트를 수행 하 여는 호 중구의 생존 능력을 결정 12 성공적인 격리 95에서 100%는 생존을 산출 해야 한다 고 호 중구 95% 이상 이어야 한다.</li>
	<li>백분율 생존 및 호 중구 백분율 총 세포 수로 호 중구의 농도 결정 합니다. 성공적인 격리 6 x 106/mL을 1.5에서 호 중구의 농도 양보 한다.</li>
	<li>7.3으로 조정 하는 ph 5 mM 포도 당, 0.9 m m MgCl2, 1.9 m m CaCl2, 및 1% 소 혈 청 알 부 민을 포함 하는 DPBS와 호 중구 1 x 106/mL의 최종 농도에 희석.</li>
</ol>3. 라이브 호 중구의 형광 현미경
<ol><li>폴 리-L-리 신의 각 음에 호 중구 (1 x 106/mL)의 400 μ 장소 200 12-잘 문화 플레이트 코팅. 30 분 동안 37 ° C에서 세포를 배양 하 여 우물의 바닥에 준수 호 중구 수 있습니다.</li>
	<li>두 핵 산 염료 중 하나, 하나는 그대로 막 셀에 얼룩 및 투과성 멤브레인과 ( 재료의 표참조), 실 온에서 10 분에 대 한 셀에 얼룩 하나 1 μ M으로 핵 산을 라벨.</li>
	<li>100 μ g/mL lipopolysaccharide (LPS) (E. 콜라이 O55와 호 중구 활성화. B5), 100 nM phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA) 긍정적인 통제, 또는 DPBS 180 분 37 ° c.에 대해 부정적인 컨트롤의 해당 볼륨</li>
	<li>이미지는 GFP를 사용 하 여 (여기: 470/22 nm, 방출: 525/50 nm) 및 텍사스 레드 채널 (여기: 585/29 nm, 방출: 628/32 nm) 다음 시간 지점에서 40 배 확대에 형광 현미경 검사 법에: 30, 90, 120, 및 180 분.</li>
</ol>4. NET 정량화 및 NET 구성 요소를 사용 하 여 면역 형광의 탐지
<ol><li>신중 하 게 12-잘 문화 접시의 우물에 18 m m 직경 폴 리-D-리 코팅 커버 전표를 놓습니다. 우물을 적절 하 게 레이블을 지정 합니다.</li>
	<li>씨앗 100 ~ 200 μ는 coverslips에 직접 neutrophils (1 x 106/mL) 절연 고 30 분 동안 37 ° C에서 세포를 배양 하 여 커버 전표를 준수 호 중구.</li>
	<li>3.3에 설명 된 대로 호 중구 활성화 합니다. 200 µΜ와 호 중구 pretreating 여 그물 형성 억제 Cl-amidine (15 분, 37 ° C) 리 외. 여 앞에서 설명한 활성화 이전 13 확인 적절 한 차량 제어 (DMSO)는 실험에 포함 됩니다.</li>
	<li>조심 스럽게 잘 집게와 커버 슬립을 제거. 4%의 2 ~ 3 방울을 얕은 웰 스를 만드는 테스트 튜브 스탠드 위에 파라핀 필름 시트를 레이어 PFA 각 잘10. 우물을 적절 하 게 분류 하 고 부드럽게 PFA 가득 우물에 거꾸로 커버 슬립을 하다. 20 분 동안 실내 온도에 고정 수를 셀 수 있습니다.</li>
	<li>한 음에서 다음 이동 하 여 3 회에서 5 분 동안 DPBS 셀을 씻어.</li>
	<li>Immunolabelling 호 중구 활성화 및 고정 후 수행할 수 없습니다, 경우 커버 전표 덮개 미 끄 러 짐 얼굴-최대 흡 광도 종이의 조각에 배치 하 여 건조 공기를 되도록 허용 합니다. 커버 슬립 추가 분석까지 4 ° C에서 이라는 12 잘 문화 접시에 최대 1 주 얼굴-최대 저장할 수 있습니다. 워시 DPBS 4.4 다음 단계로 진행 하기 전에에서 설명 된 대로 동일한 기술을 사용 하 여 1 분 동안에 3 번 셀.</li>
	<li>세포를 permeabilize를 부드럽게 커버 슬립 거꾸로에 하다 NP-40는 기술을 사용 하 여 1 분 동안 4.4에서 설명 하는 1%의 드롭. DPBS 로커에 1 분 동안 3 번을 씻어.</li>
	<li>임의로 숫자를 할당 하는 각 샘플 하 고는 coverslips를 따라 다이아몬드 포인트 마커를 사용 하 여.</li>
	<li>준비 고 레이블 개별 접시 파라핀 영화 늘어서 (버퍼 차단) 필름에 5% 염소 혈 청의 100 ~ 200 μ를 배치 합니다. 블로킹 버퍼에는 coverslips를 거꾸로 누워. 로커에 놓고 1 시간 37 ° c.에 대 한 품 어</li>
	<li>DPBS 로커에 5 분 동안 3 번을 씻어.</li>
	<li>1 차적인 항 체 희석 (1:400 토끼 polyclonal 안티-citrullinated 히스톤 H3 (citH3) 5% 염소 혈 청에서). 셀 파라핀 영화 늘어서 레이블이 접시에 품 어. 거꾸로 희석된 항 체 솔루션의 50 ~ 100 μ에 각 커버 슬립을 하다. 로커에 놓고 1 시간 37 ° c.에 대 한 품 어</li>
	<li>DPBS 로커에 5 분 동안 3 번을 씻어.</li>
	<li>희석 이차 항 체는 5% 염소 혈 청에 fluorophore (1: 200)을 활용. 셀 파라핀 영화 늘어서 레이블이 접시에 품 어. 거꾸로 희석된 항 체 솔루션의 50 ~ 100 μ에 각 커버 슬립을 하다. 로커에 놓고 어둠 속에서 37 ° C에서 1 시간을 품 어.</li>
	<li>어둠 속에서 로커에 5 분 동안 DPBS에 3 번을 씻어.</li>
	<li>Myeloperoxidase (MPO)의 동시 검출에 대 한 리 외. 에 설명 된 대로 수정된 더블 immunolabeling 프로토콜에 대 한 다음 단계에 따라 13
</li>
	<li>셀 파라핀 영화 늘어서 레이블이 접시에 품 어. 각 커버 슬립 거꾸로에 누워 10% 토끼의 100 ~ 200 μ 부드러운 락 (하룻밤, 4 ° C, 어둠 속에서)에서 혈 청.</li>
	<li>어둠 속에서 로커에 5 분 동안 DPBS에 3 번을 씻어.</li>
	<li>셀 50 μ g/mL 결합형된 염소 안티 토끼 팹 어둠 속에서 로커에 실 온에서 2 h에 대 한 조각에 품 어.</li>
	<li>어둠 속에서 로커에 5 분 동안 DPBS에 3 번을 씻어.</li>
	<li>1 차적인 항 체 (1: 200 토끼 polyclonal 항 인간의 MPO 항 체)에 5% 염소 혈 청을 희석. 셀 파라핀 영화 늘어서 레이블이 접시에 품 어. 거꾸로 희석된 항 체 솔루션의 50 ~ 100 μ에 각 커버 슬립을 하다. 로커에 놓고 어둠 속에서 37 ° C에서 1 시간을 품 어.</li>
	<li>5% 염소 혈 청에 fluorophore를 활용 된 이차 항 체를 희석 하 고 품 어 4.8에 설명 된 대로</li>
	<li>어둠 속에서 로커에 5 분 동안 DPBS에 3 번을 씻어.</li>
	<li>간섭 제어 두 번째 면역 라벨 단계에서 어느 주 항 체를 가진 외피를 제외 하 여 준비 되어야 한다.</li>
	<li>300 DNA를 얼룩 nM의 4' 6-Diamidion-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) 실 온에서 어둠 속에서 5 분.</li>
	<li>어둠 속에서 로커에 1 분 동안 DPBS에 3 번을 씻어.</li>
	<li>유리 슬라이드에 antifade mountant의 드롭 (~ 50 μ)을 적용 합니다. 부드럽게 거꾸로 셀으로 coverslip를 탑재 하기 전에 초과 버퍼를 제거 하는 흡수 성 종이에 coverslip의 가장자리를 누릅니다. 장착 매체는 coverslip와 유리 슬라이드 사이 얇은 층을 형성 한다. 공기 방울을 제거, 매우 부드럽게 누릅니다는 coverslip에 좋은 집게와.</li>
	<li>4 ° c.에 어둠 속에서 하룻밤 치료 샘플 허용 장착 매체 집중 렌즈와 현미경 분석에 대 한 강화 해야 합니다. 어둠 속에서 4 ° C에서 샘플을 저장 합니다.</li>
</ol>5. 호 중구 Extracellular 함정 정량화
<ol><li>수집 하 고 분석 하는 실험 조건에 현미경 이미지 operator(s) 장 님.</li>
	<li>40 X 확대에 형광 현미경을 사용 하 여, 걸릴 10 이미지 임의로 해당 채널에서 실험에서 각 coverslip의 다른 지구에서. 노출 시간, 밝기 및 대비 각 채널의 이미지의 인수에 걸쳐 일관성이 유지 됩니다 확인 하십시오.</li>
	<li>사용 가능한 소프트웨어 ImageJ (NIH) 등을 사용 하 여 이미지를 분석 합니다. CfDNA, citH3, MPO (그림 3A, B)의 공동 지역화에 따라 그물을 식별 합니다. 계량 그물과 각 실험 조건에 대 한 10 임의의 필드에서 호 중구의 수 있습니다. 그물의 숫자 발표 비율로 표현 될 수 있습니다 (그물의 번호: 호 중구의 총 수) 각 실험 조건에 대 한.</li>
	<li>세포내 citH3 식에 치료 효과 평가 하려면 계산 세포내 citH3와 호 중구의 수와 각 채널 ( 에서 40 배 확대에 10 임의의 필드에서 세포내 citH3 없이 호 중구 수가 그림 3, 빨간색 화살표). 세포내 citH3 식 세포내 citH3 세포내 citH3 없이 호 중구의 수와 호 중구 수의 비로 나타낼 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+suicide:+why+neutrophils+die,+to+make+NETs.">Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li><li>Kaplan, M. J., Radic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+Double-edged+swords+of+innate+immunity.">Neutrophil extracellular traps: Double-edged swords of innate immunity.</a> The Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).</li><li>Czaikoski, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+Induce+Organ+Damage+during+Experimental+and+Clinical+Sepsis.">Neutrophil Extracellular Traps Induce Organ Damage during Experimental and Clinical Sepsis.</a> PLoS One. 11 (2), e0148142 (2016).</li><li>Dwivedi, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+utility+and+characterization+of+cell-free+DNA+in+patients+with+severe+sepsis.">Prognostic utility and characterization of cell-free DNA in patients with severe sepsis.</a> Critical Care. 16 (4), R151 (2012).</li><li>Mai, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+but+not+Early+Treatment+with+DNase+Reduces+Organ+Damage+and+Improves+Outcome+in+a+Murine+Model+of+Sepsis.">Delayed but not Early Treatment with DNase Reduces Organ Damage and Improves Outcome in a Murine Model of Sepsis.</a> Shock. 44 (2), 166-172 (2015).</li><li>Jeffery, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dogs+cast+NETs+too:+Canine+neutrophil+extracellular+traps+in+health+and+immune-mediated+hemolytic+anemia.">Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 168 (3-4), 262-268 (2015).</li><li>Letendre, J. A., Goggs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+plasma+cell-free+DNA+concentrations+in+dogs+with+sepsis,+trauma,+and+neoplasia.">Measurement of plasma cell-free DNA concentrations in dogs with sepsis, trauma, and neoplasia.</a> Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 27 (3), 307-314 (2017).</li><li>Jeffery, U., Gray, R. D., LeVine, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Fluorescence+Assay+for+Quantification+of+Canine+Neutrophil+Extracellular+Trap+Release.">A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li><li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+how+to+generate+and+visualize+them.">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), (2010).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability.">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, (2015).</li><li>Li, R. H. L., Ng, G., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-induced+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+canine+neutrophils+is+dependent+on+histone+H3+citrullination+by+peptidylarginine+deiminase.">Lipopolysaccharide-induced neutrophil extracellular trap formation in canine neutrophils is dependent on histone H3 citrullination by peptidylarginine deiminase.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 193, 29-37 (2017).</li><li>Masuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis+markers:+Quest+for+specific,+objective,+and+quantitative+markers.">NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers.</a> Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps.">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).</li><li>Leshner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD4+mediated+histone+hypercitrullination+induces+heterochromatin+decondensation+and+chromatin+unfolding+to+form+neutrophil+extracellular+trap-like+structures.">PAD4 mediated histone hypercitrullination induces heterochromatin decondensation and chromatin unfolding to form neutrophil extracellular trap-like structures.</a> Frontiers in Immunology. 3, 307 (2012).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+and+inactivators+of+protein+arginine+deiminase+4:+functional+and+structural+characterization.">Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization.</a> Biochemistry. 45 (39), 11727-11736 (2006).</li></ol>

저자는 공개 없다.

선물이 여기 생활 개 neutrophils 셀 permeant 염료와 셀 impermeant 염료를 사용 하 여에 핵 구조 및 cfDNA 출시를 프로토콜. 이 분석 결과의 주요 장점은 수 있다는 그물 형성의 실시간 탐지에 대 한 고해상도 현미경 셀 고정 없이 라이브 호 중구에 의해 따라서 관찰 하는 그물 형성 체 외에 는 간단 하 고 유용한 도구를 제공. 이 분석 결과 NET 구성 요소 검색에 대 한 항 체를 필요로 하지 않습니다, 때?...

호 중구는 짧은 granulocytes 병원 체 침입에 대 한 초기 방어에 대 한 책임. 먹어서, degranulation, 반응성 산소 종 (선생님)1세대에 의해 미생물을 제거 하는 호 중구, 감염의 사이트에 보충. 세균 또는 독, 있을 때 호 중구 릴리스 호 중구 extracellular 함정 (그물), extracellular chromatin의 구성된 장식 히스톤 elastase myeloperoxidase 같은 세분화 된 단백질 (MPO)2. 그물을가지고 있지만 필수적인 항균 속성, 패 혈 증 동안 불타 그물 형성 여러 장기 부전 및 죽음3,4, 으로 이어질 수 있습니다 제안 실험 및 임상 증거 증가 5 , 6.
그물 개에 유사한 병 태 생리 역할을 재생할 수 있습니다, 때문에 치료 개입을 방지 하거나 감소 그물 형성 정화 조 동물에 비 발한 치료 전략으로 봉사 할지도 모른다. 이러한 이유로, 평가 하 고 NETosis와 개에 있는 NET 구성 요소를 계량 하는 신뢰할 수 있는 기술에 대 한 필요가 있다. NET 구성 요소 셀 무료 DNA (cfDNA) 등 nucleosomes 개 호 중구 및 임상 개7,,89에서 플라즈마에 이전 평가 않았습니다. 형광 분석 실험을 사용 하 여, Goggs 및 Letendre 발견 정화 조 개 건강 개8보다 cfDNA의 더 높은 수준이 있다. 비록 이러한 기술은 매우 객관적이 고 정량적 인 NETosis의 표식으로 cfDNA 및 nucleosomes의 측정은 NETosing neutrophils 이외의 회 저 성 세포에서 파생 될 수 있기 때문에 일반적인입니다. 여기는 라이브 NETosing 호 중구의 행동 검사에 형광 현미경 검사 법을 활용 하는 기술에 설명 합니다. 우리는 또한 주관적으로 계량 그물과 MPO 등10개 호 중구에서 citH3 그들의 구성 요소를 더블-immunolabeling를 사용 하 여 수정 된 프로토콜을 선발.

<table><tbody><tr><td>Dextran from &lt;em&gt;Leuconostoc&lt;/em&gt; spp.</td><td>Sigma</td><td>31392</td><td>Molecular weight 450,000 &amp;ndash; 650,000</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Life Sciences</td><td>17144002</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate-Buffered Saline</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1285801</td><td>With divalent cations</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate-Buffered Saline</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190136</td><td>Without divalent cations</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; O55:B5</td><td>InvivoGen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11368</td><td>5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes</td></tr><tr><td>SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S7578</td><td>1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes</td></tr><tr><td>Surface-Amps NP-40</td><td>Pierce</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine coated coverslips</td><td>neuVitro</td><td>H-12-pdl</td><td>12 mm diameter</td></tr><tr><td>Anti-citrullinated histone H3 antibody</td><td>Abcam</td><td>Ab5103</td><td></td></tr><tr><td>Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-007-003</td><td>Specificity: IgG (H+L)</td></tr><tr><td>Anti- Myeloperoxidase antibody</td><td>Dako</td><td>A0398</td><td></td></tr><tr><td>4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>D1306</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro canine neutrophil extracellular trap formation: dynamic and quantitative analysis by fluorescence microscopy

병원 균 침입에 대 한 응답, 중 성구 호 중구 extracellular 함정 (그물), 장식 된 히스톤과 항균 단백질 DNA의 세포 외 네트워크를 릴리스 합니다. 과도 한 네트워크 형성 (NETosis) 및 패 혈 증 동안 citH3 자료 여러 기관 역 기능 및 쥐와 인간 사망 관련 된 하지만 개 그 의미를 알 수 있습니다. 여기, 우리가 개 neutrophils 관찰과 NETosis의 정량화에 대 한 전체 혈액에서 분리 하는 기술을 설명 합니다. Dextran 침전에 의해 생성 된 백혈구 풍부한 플라즈마 상용 밀도 그라데이션 분리 미디어로 구분 되 고 granulocytes 수집 세포 수 및 생존 능력 테스트. 관찰 하기 위해 라이브 호 중구에서 실시간으로 NETosis, permeant 셀 및 셀 impermeant 형광 핵 산 얼룩 호 중구 활성화 lipopolysaccharide (LPS) 또는 phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA)에 추가 됩니다. 핵 형태학 및 NET 형성 변화는 시간이 지남에 형광 현미경 검사 법에 의해 관찰 된다. 생체 외에서 NETosis 공동-colocalization의 세포 없이 DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) 및 citrullinated 히스톤 H3 (citH3) 수정된 더블-immunolabelling 프로토콜을 사용 하 여 추가 특징 이다. 그물 그물 형성 및 citH3 식 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 객관적으로 계량을 하 고 citH3 양성 세포는 사용 가능한 소프트웨어를 사용 하 여 멀게 방식에서 계량. 이 기술은 체 외에서 의 용량 개 호 중구 NETosis을 평가 하는 특정 분석 결과 이다.

라이브 셀 이미징의이 프로토콜을 사용 하 여, 조사 핵 형태학, 원형질 막 무결성과 생활 호 중구에서 cfDNA의 존재를 확인할 수 있습니다. 손상 된 세포 막에 포함 된 셀에 셀 impermeant 핵 염색 얼룩 핵 산 레드. 다른 셀 permeant 염료, 라벨 그대로 플라즈마 멤브레인과 살아있는 세포에서 세포내 핵 산. 그들의 치료에 모든 그대로 neutrophils 녹색 표시 되 고 자극 (...

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In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

우리 개 neutrophils 전체 혈액에서 분리 하 고 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 라이브 호 중구에서 그물 형성을 시각화 하는 방법을 설명 합니다. 프로토콜 네트워크 형성 및 citrullinated 히스톤 H3 계량 하는 설명 (citH3) 식 면역 형광 검사 현미경 검사 법을 사용 하 여.

생체 외에서 형광 현미경 검사 법에 의해 개 호 중구 Extracellular 함정 형성: 역동적이 고 양적 분석

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

in-vitro-canine-neutrophil-extracellular-trap-formation-dynamic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

8.7K 조회수.  University of California, Davis. 우리 개 neutrophils 전체 혈액에서 분리 하 고 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 라이브 호 중구에서 그물 형성을 시각화 하는 방법을 설명 합니다. 프로토콜 네트워크 형성 및 citrullinated 히스톤 H3 계량 하는 설명 (citH3) 식 면역 형광 검사 현미경 검사 법을 사용 하 여.

비디오: In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

호중구 세포 트랩 : 그들을 생성 및 시각화하는 방법

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

연구

면역학 및 감염병학

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are networks of DNA, histones and neutrophil proteins. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay.

개 호중구 세포 외 트랩 릴리스의 정량화를위한 ​​간단한 형광 분석

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. Immunofluorescence microscopy and image-based quantification methods remain important tools to quantitate neutrophil extracellular trap formation. However, there are key limitations to the immunofluorescence-based methods that are currently available for quantifying NETs. Manual methods of image-based NET quantification are often subjective, prone to error and tedious for users, especially non-experienced users. Also, presently available software options for quantification are either semi-automatic or require training prior to operation. Here, we demonstrate the implementation of an automated immunofluorescence-based image quantification method to evaluate NET formation called NETQUANT. The software is easy to use and has a user-friendly graphical user interface (GUI). It considers biologically relevant parameters such as an increase in the surface area and DNA:NET marker protein ratio, and nuclear deformation to define NET formation. Furthermore, this tool is built as a freely available app, and allows for single-cell resolution quantification and analysis.

Here, we present a protocol for generating neutrophil extracellular traps (NETs) and operating NETQUANT, a fully automatic software option for quantification of NETs in immunofluorescence images.

NETQUANT를 사용한 호중구 세포외 트랩의 자동 이미지 기반 정량화

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. NETs have been demonstrated to serve as an important host defense mechanism that traps and kills microorganisms. On the other hand, they have been implicated in diverse systemic autoimmune diseases. NETs are immunogenic and toxic structures that contain a pool of relevant autoantigens including anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA)-associated vasculitis (AAV) and systemic lupus erythematosus (SLE). Different forms of NETs can be induced depending on the stimulus. The amount of NETs can be quantified using different techniques including measuring DNA release in supernatants, measuring DNA-complexed with NET-molecules like myeloperoxidase (MPO) or neutrophil elastase (NE), measuring the presence of citrullinated histones by fluorescence microscopy, or flow cytometric detection of NET-components which all have different features regarding their specificity, sensitivity, objectivity, and quantity. Here is a protocol to quantify ex vivo NET formation in a highly-sensitive, high-throughput manner by using three-dimensional immunofluorescence confocal microscopy. This protocol can be applied to address various research questions about NET formation and degradation in health and disease.

This protocol describes a highly sensitive and high throughput neutrophil extracellular trap (NET) assay for the semi-automated quantification of ex vivo NET formation by immunofluorescence three-dimensional confocal microscopy. This protocol can be used to evaluate NET formation and degradation after different stimuli and can be used to study potential NET-targeted therapies.

평가 하 고 호 중구 Extracellular 함정 대형 계량 높은 처리량 분석 결과

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by neutrophils in response to systemic inflammation or pathogens. Although NETs have previously been shown to augment clot formation and inhibit fibrinolysis in humans and dogs, the role of NETs in cats with cardiogenic arterial thromboembolism (CATE), a life-threatening complication secondary to hypertrophic cardiomyopathy, is unknown. A standardized method to identify and quantify NETs in cardiogenic arterial thrombi in cats will advance our understanding of their pathological role in CATE. Here, we describe a technique to identify NETs in formaldehyde-fixed and paraffin-embedded thrombi within the aortic bifurcation, extracted during necropsy. Following deparaffinization with xylene, aortic sections underwent indirect heat-induced antigen retrieval. Sections were then blocked, permeabilized, and ex vivo NETs were identified by colocalization of cell-free DNA (cfDNA), citrullinated histone H3 (citH3), and neutrophil elastase (NE) using immunofluorescence microscopy. To optimize the immunodetection of NETs in thrombi, autofluorescence of tissue elements was limited by using an autofluorescence quenching process prior to microscopy. This technique could be a useful tool to study NETs and thrombosis in other species and offers new insights into the pathophysiology of this complex condition.

We describe a method to identify neutrophil extracellular traps (NETs) in formaldehyde-fixed and paraffin-embedded feline cardiogenic arterial thrombi using heat-induced antigen retrieval and a double immunolabeling protocol.

면역형광 현미경을 사용하여 파라핀 내장 펠린 동맥 혈전에서 호중구 세포 외 트랩의 식별

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). This study analyzes the morphological and compositional changes in NETs induced by microbial and chemical stimuli using standardized in vitro methodologies for NET induction and characterization with human cells. The procedures described here allow the analysis of NET morphology (lytic or non-lytic) and composition (DNA-protein structures and enzymatic activity), and the effect of soluble factors or cellular contact on such characteristics. Additionally, the techniques described here could be modified to evaluate the effect of exogenous soluble factors or cellular contact on NET composition.
The applied techniques include the purification of polymorphonuclear cells from human peripheral blood using a double density gradient (1.079-1.098 g/mL), guaranteeing optimal purity and viability (&#8805; 95%) as demonstrated by Wright's staining, trypan blue exclusion, and flow cytometry, including FSC versus SSC analysis and 7AAD staining. NET formation is induced with microbial (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, and Candida albicans) and chemical (phorbol myristate acetate, HOCl) stimuli, and the NETs are characterized by DNA-DAPI staining, immunostaining for the antimicrobial peptide cathelicidin (LL37), and quantification of enzymatic activity (neutrophil elastase, cathepsin G, and myeloperoxidase). The images are acquired through fluorescence microscopy and analyzed with ImageJ.

Presented here is a protocol for the induction and analysis of in vitro neutrophil extracellular traps (NETs). Quantification of DNA, cathelicidin (LL37), and enzyme activity yielded data that show the variability in the composition and morphology of NETs induced by microbial and chemical stimuli under similar controlled conditions.

미생물 및 화학적 자극에 의해 유도 된 호중구 세포 외 트랩의 형태 학적 및 조성 분석

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They mature in the bone marrow and are released into the peripheral blood, where they circulate for about 6&#8722;8 h; however, in tissue, they can survive for days. By diapedesis through the endothelium, they leave the blood stream, enter tissues, and migrate towards the site of an infection following chemotactic gradients.&#160;Neutrophils can combat invading microorganisms by phagocytosis,&#160;degranulation, and generation of neutrophil extracellular traps (NETs). This protocol will help to detect NETs in paraffin-embedded tissue. NETs are the result of a process called NETosis, which leads to the release of nuclear, granular, and cytoplasmic components either from living (vital NETosis) or dying (suicidal NETosis) neutrophils. In vitro, NETs form cloud-like structures, which occupy a space several times larger than that of the cells from which they descended. The backbone of NETs is chromatin, to which a selection of proteins and peptides originating from granules and cytoplasm are bound. Thereby, a high local concentration of toxic compounds is maintained so that NETs can capture and inactivate a variety of pathogens including bacteria, fungi, viruses, and parasites, while diffusion of the highly active NET components leading to damage in neighboring tissue is limited. Nevertheless, in recent years it has become apparent that NETs, if generated in abundance or cleared insufficiently, do have pathological potential ranging from autoimmune diseases to cancer. Thus, detection of NETs in tissue samples may have diagnostic significance, and the detection of NETs in diseased tissue can influence the treatment of patients. Since paraffin-embedded tissue samples are the standard specimen used for pathological analysis, it was sought to establish a protocol for fluorescent staining of NET components in paraffin-embedded tissue using commercially available antibodies.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are three-dimensional structures generated by stimulated neutrophil granulocytes. It has become clear in recent years that NETs are involved in a wide variety of diseases. Detection of NETs in tissue may have diagnostic relevance, so standardized protocols for labelling NET components are required.

파라핀 내장 된 조직에서 인간과 뮤린 호중구 세포 외 트랩의 면역 형광 라벨링

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...

의학

호중구 세포외 트랩을 시각화하기 위한 염색 및 이미징

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in autoimmune diseases and sterile inflammation. They are web-like structures composed of double-stranded DNA filaments, histones, and antimicrobial proteins. Once released, NETs can trap and kill extracellular pathogens in blood and tissue. Furthermore, NETs participate in homeostatic regulation by stimulating platelet adhesion and coagulation. However, the dysregulated production of NETs has also been associated with various diseases, including sepsis or autoimmune disorders, which makes them a promising target for therapeutic intervention. Apart from electron microscopy, visualizing NETs using immunofluorescence imaging is currently one of the only known methods to demonstrate NET interactions in tissue. Therefore, various staining methods to visualize NETs have been utilized. In the literature, different staining protocols are described, and we identified four key components showing high variability between protocols: (1) the types of antibodies used, (2) the usage of autofluorescence-reducing agents, (3) antigen retrieval methods, and (4) permeabilization. Therefore, in vitro immunofluorescence staining protocols were systemically adapted and improved in this work to make them applicable for different species (mouse, human) and tissues (skin, intestine, lung, liver, heart, spinal disc). After fixation and paraffin-embedding, 3 &#181;m thick sections were mounted onto slides. These samples were stained with primary antibodies for myeloperoxidase (MPO), citrullinated histone H3 (H3cit), and neutrophil elastase (NE) according to a modified staining protocol. The slides were stained with secondary antibodies and examined using a widefield fluorescence microscope. The results were analyzed according to an evaluation sheet, and differences were recorded semi-quantitatively.
Here, we present an optimized NET staining protocol suitable for different tissues. We used a novel primary antibody to stain for H3cit and reduced non-specific staining with an autofluorescence-reducing agent. Furthermore, we demonstrated that NET staining requires a constant high temperature and careful handling of samples.

저자 스포트라이트: 호중구 세포외(Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissue) 

Neutrophil extracellular traps (NETs) are associated with various diseases, and immunofluorescence is often used for their visualization. However, there are various staining protocols, and, in many cases, only one type of tissue is examined. Here, we establish a generally applicable protocol for staining NETs in mouse and human tissue.

인간 및 생쥐 조직에서 호중구 세포외 트랩의 면역형광 이미징

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...

생체 외에서 형광 현미경 검사 법에 의해 개 호 중구 Extracellular 함정 형성: 역동적이 고 양적 분석

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