Protein-Lipid Etkileşimlerini Ölçmek için Mikro Ölçekli Termoforez Kullanımı

Etiketli mikro ölçekli termoforez, çeşitli biyokimyasal etkileşimlerin ayrışma sabitlerini veya KD'lerini verimli bir şekilde elde eder. Bu protokol ve eşlik eden video, mayadaki tek çözünür SNARE proteini olan Vam7'nin fosfatidik aside yaklaşık afinitesini verir. Bu, Vam7'nin diğer proteinlerle etkileşime girmeden önce iki zarla ilişki kurma şeklidir.

Bu yöntem, düşük maliyetle, yüksek tekrarlanabilirlikle ve minimum protein maliyetiyle çeşitli biyokimyasal etkileşimler için KD'leri hızla elde eder. Bu teknik, potansiyel kurşun bileşiklerini belirlemek için kolayca elde edilebilen KD'lere izin veren birinci aşama farmasötik geliştirme için uygundur. Bir analize başlamadan önce, MST cihazının arkasındaki güç düğmesini açın ve kontrol yazılımını açın.

Bilgisayarın aygıta bağlı ve bağlı durumda olduğunu doğrulayın ve MST Önce'yi 3 saniye, MST'yi 30 saniye ve Floresan Kurtarma'yı 1 saniye sonra olarak ayarlayın. Her kılcal boru için, otomatik doldurma titrasyon oranını kullanarak hedef ligandın adını, ligand analitinin adını, hedefin konsantrasyonunu ve en yüksek titrasyon konsantrasyonunu girin. Bir dizi MST gücü seçin ve en sağlam bağlama uyumunu test etmek için her güç için değerler girin.

Etiketli MST örnekleri hazırlamak için, her ikisi de PBS'de olmak üzere bir Vam7-oktahistit çözeltisini 200 nanomolar konsantrasyona ve NTA-Atto 647 boyasını 100 nanomolar konsantrasyona seyreltin. Vam7-oktahistidin ve NTA-Atto 647 boyasını 1: 1 hacimsel oranda karıştırın ve karışımın 30 dakika boyunca ışıktan korunan oda sıcaklığında oturmasına izin verin. Kuluçkanın sonunda, boya ve protein karışımını santrifüj edin ve çözeltiyi kullanımdan birkaç saat öncesine kadar 4 santigrat derecede saklayın.

Ardından, numuneyi hazırlayın, boyalı ligand alın ve analite maruz bırakın. Numunenin mikro ölçekli termoforezi için, cihazı açın ve kılcal rafı dışarı kaydırın. Numune kılcal damarlarını birinci konumda en yüksek konsantrasyona sahip rafa yükleyin ve kontrol yazılımında Kırmızı kanalı seçin.

Ardından, rafı cihaza yükleyin. Ardından bir MST gücü aralığı seçin ve Cap Scan MST Ölçümünü başlatın ve vites değiştirme tepkisini değerlendirin. Vam7 etiketli 50 nanomolar NTA-Atto 647 alanına karşı 500 mikromolden başlayan 1:1 DiC8 PA titrasyonunun bir denemesinden elde edilen termoforetik izler burada gösterilmiştir.

İlk floresan, zaman sıçraması ve termoforez gözlemlenebilir ve KD'nin bu ölçümlerin herhangi birinden veya bir kombinasyonundan hesaplanmasına izin verilir. Bu sonuçlardan, örneğin grafikte gösterildiği gibi, zaman atlama çıkışına sahip termoforez için bir doygunluk eğrisi çizilebilir. Genel olarak, MST sonuçları, KD modelini seçerek ve protein konsantrasyonunu girerek bağlanma afinitesini belirlemek için protein konsantrasyonunu dikkate alarak, log ölçeği kullanılarak belirlenir.

Bu protokolü uygularken, çözeltinin kılcal damarın merkezinde olduğundan ve hava kabarcığı olmadığından ve kılcal damarın dışında toz veya çözelti bulunmadığından emin olun. İzotermal titrasyon kalorimetrisi veya yüzey plazmon rezonansı, elde edilen deneysel KD'yi doğrulamak için kullanılabilir. Potansiyel işbirlikçi bağlama varsa, ITC, kaynaklar göz önüne alındığında gerçekleştirilen bir sonraki mantıksal yöntem olacaktır.

Bu teknik, geleneksel biyoloji araştırmacılarının biyofiziksel tarama tekniklerini yol ilişkilerini belirlemek için araştırmalarına dahil etmelerini sağlamıştır. Bu tekniğin bir örneği, GFP etiketinin geleneksel bir pull-down testi yapmanın yeni bir yolu olduğu endojen olarak ifade edilen hedef proteine sahip hücre lizazıdır.