Bu eser desteklenmiştir Michael R. Betts için R01AI118694 NIH grant tarafından alt Ödülü 566950 Yuri Sykulev içerir. Sidney Kimmel Kanser Merkezi Bioimaging paylaşılan kaynak mükemmel desteklerinden dolayı teşekkür ediyoruz.

Bu çalışma Helsinki Bildirgesi uygun olarak yapılmıştır. Tüm katılımcılar Yazılı onam alındı ve kan ve lenf nodu (IRB #809316, IRB # 815056) Pennsylvania Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulunun onayı ile satın alınan. Tüm insan denekler yetişkindi. Kordon kan örnekleri nazikçe işçi ve kadın Doğum bölümü & Thomas Jefferson Üniversitesi'nde kadın hastalıkları teslim tarafından temin edilmiştir. Tüm örneklerini de-tespit edildi.
1. yalıtım CD4+ T hücreleri bir görüntü analizi için
<ol><li>
107 dondurulmuş periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) veya lenf nodu mononükleer hücreler (LNMCs) toplanan örnekleri içeren 1 mL aliquot çözülme. Steril bir başlık, penisilin/streptomisin ve glutamin ile RPMI 9 mL çözdürülen hücreleri ekleyin.
	<ol>
<li>Centrifugate 300 x g 4 ° C'de 10 dakika için hücreleri süpernatant Aspire edin ve 5 mL ilave RPMI % 10 içeren hücrelerde resuspend FBS (tam orta). CO2 kuluçka 37 ° C'de gecede hücrelerde kuluçkaya</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ertesi gün, CD4 arındırmak+ T hücreleri tarafından olumsuz immunomagnetic üreticinin yönerge göre piyasada bulunan bir seti kullanarak sıralama.</li>
	<li>Taze arıtılmış CD4 sayısı ölçmek için+ T hücreleri, hücre süspansiyon 5 µL bir trypan mavi çözüm eşit bir hacmi ile karıştırın. Bir hemasitometre hücre trypan ile yük mavi karışımı ve hemasitometre 5 bölümlerini içinde canlı hücreleri saymak.</li>
	<li>Hücre sayı ortalamasını almak ve özgün hücre süspansiyon hücre sayısı belirlemek: hücreler/1 mL sayısı = x 2 x 104ortalama sayısı. İzole hücre toplam sayısı çok küçük ise, hücre sayım olmadan olduğu gibi kullanın.</li>
	<li>Hücreleri vasıl 300 x g 10 dk santrifüj kapasitesi ve onları arabellekte bir tahlil (20 mM HEPES, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2 mM Na2HPO4, 5 mM D-glikoz, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2ve % 1 insan serum albümin) 105 resuspend < /C13 > hücreler/50 µL veya daha az ve hücreleri (için 1-2 h) 4 ° C'de deneylerde kullanıma hazır kadar tutun.</li>
	<li>Tüm biyolojik atık ilgili kurumsal yönergelere uygun bir biçimde atın.</li>
	<li>Denetimi hücre nüfus isterseniz, kordon kanı PBMC aktif CD8 T hücrelerden hazırlamak, 5 mL anti-CD3 ve anti-CD28 antikorları 10 µg/mL ve 1 µg/mL karışımı ile kaplı bir T25 kültür şişesi tam orta de 107 hücreleri yer , sırasıyla.</li>
	<li>Ertesi gün, aktif kordon kanı hücreleri balonun kaldırmak için onları yıkamak ile taze 1 x tamamlamak orta ve rekombinant IL-2 huzurunda hücreleri genişletin (100 U/mL) 2 hafta boyunca.</li>
	<li>Kordon kanı CD8 arındırmak+ T hücreleri üreticinin yönerge göre piyasada bulunan kit kullanarak negatif immunomagnetic sıralayarak. Hücreleri saymak ve tahlil arabellek medyaya LN ve PB CD8 için 1.3-1.6 adımlarda açıklandığı gibi döviz+ T hücreleri.</li>
</ol>2. düzlemsel Lipid Bilayers hazırlanması için bileşenler
<ol><li>Başka bir yerde5açıklandığı gibi lipozomlar 3 tür hazırlamak: (a) 0.4 mM DOPC (1,2-dioleoyl -sn- glycero-3-phosphocholine) lipozomlar, (b) 0.4 mM DOPC lipozomlar 33 mol % köpekler-NTA içeren (1,2-dioleoyl -sn- glycero - 3-[(N-(5- amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic asit) succinyl] (amonyum tuz)) lipidler, 4 mol % Biotinyl-Cap-PE içeren (c) 0.4 mM DOPC lipozomlar (1,2-dioleoyl -sn- glycero-3-phosphoethanolamine - N-(kap biotinyl) (sodyum tuzu)).</li>
	<li>
%5 kazein çözüm yukarıda açıklanan5olarak hazırlayın.
	<ol>
<li>5 g kazein tozu Ultrasaf Su 100 ml dağıtılması ve 10 M sodyum hidroksit 350 µL ekleyin. Her şey üzerinde düzenli bir manyetik karıştırıcı, oda sıcaklığında 2 h için kullanılabilir ölçeğine göre yavaş hızda karıştırın ve sonra 4 ° C'de gece 7.3 ve ultracentrifuge 100.000 x g 4 ° C'de 2 h için çözüm pH ayarlama Süpernatant 0,22 µm steril filtre ile filtre ve çözüm aliquots-80 ° C'de depolayın Dikkat: Sodyum hidroksit çözüm kimyasal yanıklara neden ve gözlerle temas üzerine kalıcı körlüğe neden olabilir. Lastik eldiven, Emanet giyim ve göz koruması bu kimyasal ya da çözümleri işlerken kullanır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Etiket anti-CD3 antikor ile mono-bionylated antikor molekülleri ile yukarıda açıklanan yaklaşım8üretmek için biotin.
	<ol>
<li>Dimetil sülfoksit (DMSO) 0.1 mg/mL, Biotin-PEO4-NHS çözeltilerine hazırlayın. Antikor fosfat tamponlu tuz (PBS) 100 mM sodyum bikarbonat içeren 0.5 ml 1 mg Biotin-PEO4-NHS çözüm 3.7 µL ekleyin.</li>
		<li>Karışımı oda sıcaklığında 2 h için kuluçkaya. Alexa Fluor 488 NHS ester adlı 10 mg/mL DMSO çözeltisi hazırlamak. Alexa Fluor 488 NHS ester çözüm Biotin-PEO4-NHS tarafından 10 kat molar aşırı etiketli antikor ekleyin.</li>
		<li>Karışımı yavaş karıştırma üzerinde düzenli bir manyetik karıştırıcı ile Oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya. İlişkisiz boya boyutu-dışlama Kromatografi kullanarak ayırın.</li>
		<li>280, antikor çözümün optik yoğunluk ölçerek antikor konsantrasyonu belirlemek nm (bir280). 577, etiketli antikorlar optik yoğunluğunu ölçmek nm (bir577).</li>
		<li>Boya antikor oranı aşağıdaki denklemi kullanarak belirleyin: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58143/58143eq1.jpg"> Not: ek ayrıntılar üreticinin iletişim kuralı'nda bulabilirsiniz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rekombinant çözünür ICAM-1 protein3,4,9,10daha önce açıklandığı gibi bir Drosophila ifade sisteminde hızlı.
	<ol>
<li>Klon cDNA kodlama ile ICAM-1 ectodomain içine Drosophila ifade vektör DEVRESEL_ÖDEME/V5-O'nun bir His ile eklenmiş bir Rekombinant protein üretmek için bir indüklenebilir metallothionein organizatörü ile6 etiketi C-terminal ucunda.</li>
		<li>S2 hücreleri elde edilen ICAM-1 içeren plazmid ve G418 ifade vektör Co transfect. Kararlı transfectants % 10 fetal buzağı serum (FCS) ve 0,5 mg/mL G418 ile 3 hafta boyunca takıma Schneider'ın Drosophila medya kullanarak seçin. Serum içermeyen böcek orta hücrelerde genişletin ve bir protein ifade ile 0,5 mM CuSO4 3 d için teşvik.</li>
		<li>Kültür süpernatant 10 x konsantre ve PBS üzerinden karşı teğet akışı yoğunlaştırıcı yukarıda açıklanan11olarak diyaliz.</li>
		<li>Süpernatant konsantre kültür Sepharose ile kovalent immobilize bir anti-ICAM-1 monoklonal antikor içeren bir sütun için geçerli ve ilişkili ICAM-1 50 mM glisin arabelleği, pH 3.0 ile elute. Hemen eluted ICAM-1 protein 2 M Tris arabelleği, pH 8.0 ile etkisiz hale getirin.</li>
		<li>PBS, pH 8.0 karşı eluted malzeme diyaliz ve bir sütun içeren Ni-NTA özel diyaliz malzeme ekleyin. Çözünür ICAM-1 200 mM imidazole, pH 8.0 ile elute. PBS arabellek, pH 8.0 karşı eluted malzeme diyaliz.</li>
		<li>Arıtılmış ICAM-1 Cy5 NHS ester göre üreticinin yönerge ile etiketleyin. Not: En iyi son boya protein oranı 1: 1'dir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fab üretmek papain sindirim tarafından bir anti-CD107a antikor parçaları ve Fab arındırmak parçaları3daha önce açıklandığı gibi İyon Kromatografi tarafından. Etiket Alexa Fluor 568 NHS ester göre üreticinin yönerge ile Fab parçaları.</li>
</ol>3. düzlemsel Lipid Cam destekli Bilayers oluşumu
<ol><li>Bir taze asidik piranha çözüm 140 mL konsantre sülfürik asit ve % 30 hidrojen peroksit 60 mL karıştırarak hazırlayın. Cam coverslips akışı slaytlar için onları 30 dk. tutun asit piranha çözümde cam coverslip Polipropilen makas tipi forseps ile ıslatarak yıkayın. Dikkat: Son derece güçlü bir oksitleyici Piranha çözümdür. Aşınma koruyucu gözlük ya da gözlük ya da kalın lastik eldiven ile birlikte tam yüz bir kalkan çözüm işleme sırasında her zaman unutmayın. Piranha çözüm bir duman başlık altında sadece çalışmak. Patlayabilir o olabilir gibi Isıtma, taşıma veya herhangi bir anında kullanım, sallıyorum kaçının. Piranha atık kurşun içeren çukur bir cam şişe içine toplamak. Kurumsal Güvenlik Komitesi uygun atık kullanımı hakkında başvurun.</li>
	<li>
Yıkanmış coverslips 7 durulama taze su içeren şişeler sırayla aktarmadan tarafından Ultrasaf Su ile x. Su kalan izin vermek bir yana coverslips ıslak kuru cam geride bırakarak temiz cam kapalı rulo seti.
	<ol>
<li>Alternatif olarak, bir vakum pompa bağlı bir pipet ucu dikkatle kalan su damlacıkları coverslips kaldırmak için kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Steril başlık, lipozom mix bilayers yapmak için üretmek için çeşitli lipitler dilutions gerçekleştirin. İlk olarak, DOPC lipozomlar 37 µL ve Biotinyl-Cap-PE lipozomlar 3 µL birleştirir. İkinci olarak, DOPC lipozomlar 14 µL ve köpekler-NTA lipozomlar 15 µL karıştırın. Üçüncü olarak, ilk Mix 1 µL son lipozom karışımı imal etmek ikinci mix 29 µL için ekleyin.</li>
	<li>
Steril başlık, bir çalışma alanı tarafından kuru coverslips yakın ile ayarlayın. Aliquot 2 µL son lipozom karışımı (bkz. Adım 3.3) tam olarak kendinden yapışkanlı slayt kanal merkezinde. Hemen ve çok hassas bir temiz ve kuru coverslip slayt ile hizalayın ve slayt yapışkan tarafındaki coverslip yavaşça indirin.
	<ol>
<li>Birden fazla slayt hazırlama, iş bir slayt üzerinde teker teker beri lipozom karışımı hızla buharlaşır. Slayt çevirin ve polipropilen makas tipi forseps dış halkasındaki kaydıraklı, slip kaçağı önlemek için slayda sıkıca bağlı olduğundan emin yapma coverslip periferik kişiye hafif bir basınç uygulamak için kullanın. Not: kırılma veya coverslip çatlama önlemek için slayt kanalları karşı basın değil.</li>
		<li>Slayt üzerinde yeniden açın ve derleme dış slayt tarafındaki bilayer çevresinde kalıcı bir kalem ile çizim 4 nokta tarafından bir damla coverslip ve kanal slayt arasında gibi görünüyor kurulan bilayer konumunu işaretleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kanal içine ilk enjeksiyon bir sıvı önce kanalın bir bağlantı noktası giriş bağlantı noktası diğer çıkış bağlantı noktası olarak atayın ve bu atama deneme boyunca korumak.</li>
	<li>Kabarcıklar oluşturan önlemek için doğrudan kanal giriş liman damlalıklı ucu ucunu bağlayın. Yavaş yavaş slayt kanalları sıcak 50 µL ile doldurun (en azından oda sıcaklığı) tahlil arabellek (bkz. Adım 1.5 arabellek oluşturma için).</li>
	<li>0, 5 M nickel(II) klorür çözüm hazırlamak. 2 mL aliquot su banyosu için 30 dk 37 ° C'de çözümde kazein, çözülme ve bir nikel klorür çözüme 200 µM son bir konsantrasyon ile ek.</li>
	<li>Bilayers ilk kanal giriş limanında kazein çözeltinin 100 µL enjekte ve sonra hemen dışarı slayt çıkış noktasındaki 100 µL pipetting tarafından kaldırarak yıkayın. Aynı çözüm ile bilayers 100 µL kazein çözümün her kanal giriş portuna enjekte ve slayt için 45 dakika oda sıcaklığında kuluçka engelleyin.</li>
	<li>Aliquots Cy5-ICAM-1-O'nun6 ve streptavidin proteinlerin çözülme. 2 µg/mL her son konsantrasyonu, tahlil arabellekte proteinleri birleştirir. Belgili tanımlık eriyik için 20.000 x g ve herhangi bir toplamları kaldırmak için 4 ° C'de 30 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Engelleme çözüm geri kalanı pipetting tarafından slayt kanal çıkış bağlantı noktasından çıkarın. 100 µL ICAM-1 ve streptavidin giriş portuna içeren çözüm enjekte.</li>
	<li>Slayt 45 dakika oda sıcaklığında için kuluçkaya. Herhangi bir aşırı protein çözüm çıkış bağlantı noktasından çıkarın. Bilayer 2 yıkama x ilk kanal giriş limanında tahlil tamponunun 100 µL enjekte ve sonra hemen çıkış bağlantı noktası dışında 100 µL kaldırarak.</li>
	<li>Alexa-Fluor-488-etiketli bir anti-CD3 antikor tahlil arabelleği için 2 µg/mL nihai bir konsantrasyon ile sulandırmak. Antikor çözeltinin 100 µL slayt giriş portuna enjekte ve oda sıcaklığında 45 dk için kuluçkaya. Herhangi bir aşırı protein çözüm çıkış bağlantı noktasından çıkarın. Bilayer 2 yıkama x 100 µL olduğu gibi adım 3.11 tahlil arabelleği ile.</li>
</ol>4. düzlemsel Bilayer ile T hücreleri etkileşim görüntüleme
<ol><li>
Sahne ve confocal veya toplam iç yansıma (TIRF) Floresan mikroskop amacı sıcaklığı 37 ° C'de equilibrated kadar onceden Bilayer(s) slaytla ısıtmalı sahnede ayarlayın. Sahne mürekkep işaretleri göre uygun bir konuma taşımak ve floresan Cy etiketli ICAM-1 moleküllerin istihdam bilayer odaklan.
	<ol>
<li>61 X amaç confocal mikroskop için veya 100 X amaç TIRF mikroskopla uygun filtre ayarlarını kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Granül için görüntüleme TIRF mikroskobu tarafından serbest, Alexa-Fluor-568-etiketli anti-CD107a eklemek için 4 µg/mL giriş noktalarına hücreleri enjekte önce son bir konsantrasyon, hücre süspansiyon parçaları antikor Fab.
	<ol>
<li>Hazırlanan CD4 resuspend+ T hücreleri izole LN veya PB veya kordon kan ve hücre süspansiyon 50 µL bilayer içeren slayt kanalı giriş bağlantı noktası enjekte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alanları istediğiniz sayıda ve kayıt görüntüleri her alanının 1 x 30 dk için her 2 dk sonra enjeksiyon seçin.</li>
	<li>Alan parlak, yansıyan ışık ve floresan kanal (Alexa 488 ve Cy5) görüntüleri elde etmek için confocal mikroskop yararlanmak. Alexa-Fluor-488 ve Alexa-Fluor-568 floresans ve widefield Cy5 floresan, hem de TIRF mikroskop üzerinde parlak alan görüntüleme için TIRF modunu kullanın.</li>
</ol>5. görüntü analizi
<ol><li>Uygun yazılımı kullanarak alınan görüntüleri analiz. Hücre morfolojisi iletilen ışık görüntü, kümelenmiş ve gözle görülür hasar dışlama veya analiz apoptotik hücreler içinde gözlemlemek. Analizde sadece üretken bilayer yüzey (Örneğin, Alexa-Fluor-488 Floresan (anti-CD3 antikor) arayüz biriken hücreler) ile etkileşim hücreler içerir.</li>
	<li>20 dk hücre adezyon alanının boyutu hücre bilayer etkileşim başlandıktan sonra belirleyin. Not: Parazit yansıması mikroskobu (IRM) resim hücre bilayer arabirimde geliştirilen karanlık alan yapışma alandır.</li>
	<li>Cy5-ICAM-1 floresans herhangi bir birikimi ve yüzük kavşak bir oluşum tarafından ayrılmış Cy-ICAM-1 moleküller hücre bilayer arayüz gözlemlemek. Birikmiş ICAM-1 molekülleri bir yapışma halkası kavşak en az iki ardışık görüntülerde oluşan isterseniz bu tür hücrelerin periferik supramolecular aktive küme (pSMAC)12gelişmekte olan hücreler olarak belirleyin.</li>
	<li>Granül sürümü hücre yakın temas bölgesinin dışında arka plan floresans üzerinde T hücre bilayer arabirimi Alexa-Fluor-568 floresans yoğunlukta ölçerek değerlendirin. Alexa-Fluor-568 sinyal-için-arka plan en az 1,3 oranında hücreleri degranulating hücreler olarak belirleyin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285, 221-227 (1999).</li><li>Somersalo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T+lymphocytes+form+an+antigen-independent+ring+junction.">Cytotoxic T lymphocytes form an antigen-independent ring junction.</a> Journal of Clinical Investigation. 113, 49-57 (2004).</li><li>Beal, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+theta+regulates+stability+of+the+peripheral+adhesion+ring+junction+and+contributes+to+the+sensitivity+of+target+cell+lysis+by+CTL.">Protein kinase C theta regulates stability of the peripheral adhesion ring junction and contributes to the sensitivity of target cell lysis by CTL.</a> The Journal of Immunology. 181, 4815-4824 (2008).</li><li>Beal, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+early+T+cell+receptor+signaling+regulate+the+pathway+of+lytic+granule+delivery+to+the+secretory+domain.">Kinetics of early T cell receptor signaling regulate the pathway of lytic granule delivery to the secretory domain.</a> Immunity. 31, 632-642 (2009).</li><li>Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+planar+bilayers+for+study+of+the+immunological+synapse.">Supported planar bilayers for study of the immunological synapse.</a> Current Protocols in Immunology. , (2007).</li><li>Reuter, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-Specific+CD8(+)+T+Cells+Exhibit+Reduced+and+Differentially+Regulated+Cytolytic+Activity+in+Lymphoid+Tissue.">HIV-Specific CD8(+) T Cells Exhibit Reduced and Differentially Regulated Cytolytic Activity in Lymphoid Tissue.</a> Cell Reports. 21, 3458-3470 (2017).</li><li>Buggert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+immune+surveillance+in+lymphoid+tissue+by+cytolytic+CD4++T+cells+during+health+and+HIV+disease.">Limited immune surveillance in lymphoid tissue by cytolytic CD4+ T cells during health and HIV disease.</a> PLoS Pathogens. 14, e1006973 (2018).</li><li>Carrasco, Y. R., Fleire, S. J., Cameron, T., Dustin, M. L., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LFA-1/ICAM-1+interaction+lowers+the+threshold+of+B+cell+activation+by+facilitating+B+cell+adhesion+and+synapse+formation.">LFA-1/ICAM-1 interaction lowers the threshold of B cell activation by facilitating B cell adhesion and synapse formation.</a> Immunity. 20, 589-599 (2004).</li><li>Anikeeva, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+role+of+lymphocyte+function-associated+antigen-1+in+mediating+effective+cytolytic+activity+by+cytotoxic+T+lymphocytes.">Distinct role of lymphocyte function-associated antigen-1 in mediating effective cytolytic activity by cytotoxic T lymphocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 6437-6442 (2005).</li><li>Steblyanko, M., Anikeeva, N., Campbell, K. S., Keen, J. H., Sykulev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+Influence+the+Size+and+Dynamics+of+Signaling+Microclusters+in+a+Pyk2-dependent+Manner.">Integrins Influence the Size and Dynamics of Signaling Microclusters in a Pyk2-dependent Manner.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290, 11833-11842 (2015).</li><li>Anikeeva, N., Lebedeva, T., Sumaroka, M., Kalams, S. A., Sykulev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+HIV-specific+T-cell+receptor:+expression,+purification+and+analysis+of+the+specificity.">Soluble HIV-specific T-cell receptor: expression, purification and analysis of the specificity.</a> Journal of Immunological Methods. 277, 75-86 (2003).</li><li>Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells.">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395, 82-86 (1998).</li><li>Riddell, S. R., Greenberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+anti-CD3+and+anti-CD28+monoclonal+antibodies+to+clone+and+expand+human+antigen-specific+T+cells.">The use of anti-CD3 and anti-CD28 monoclonal antibodies to clone and expand human antigen-specific T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 128, 189-201 (1990).</li><li>Lin, S. J., Yu, J. C., Cheng, P. J., Hsiao, S. S., Kuo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+interleukin-15+on+anti-CD3/anti-CD28+induced+apoptosis+of+umbilical+cord+blood+CD4++T+cells.">Effect of interleukin-15 on anti-CD3/anti-CD28 induced apoptosis of umbilical cord blood CD4+ T cells.</a> European Journal of Haematology. 71, 425-432 (2003).</li><li>Anikeeva, N., Sykulev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+controlling+granule-mediated+cytolytic+activity+of+cytotoxic+T+lymphocytes.">Mechanisms controlling granule-mediated cytolytic activity of cytotoxic T lymphocytes.</a> Immunologic Research. 51, 183-194 (2011).</li><li>Huppa, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity.">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature. 463, 963-967 (2010).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada açıklanan roman tekniği konvansiyonel akışı hücre5 düzlemsel bilayers oluşturmak için gerekli benzer reaktifler kullanır ve başarıyla birincil insan T hücre – bilayer arabirimleri3,4 görüntüleme gerçekleştirmek için uygulanabilir ,15. Teknik floresan molekülleri kullanımı önemli bir azalma sunmaktadır ve 10-20 daha az T hücreleri ile karşılaştırıldığında birincil insan T hücreleri kan ve diğer doku analiz etmek için fırsat oluşturma bir akış hücre sistemi5, x gerektirir.
Bu çalışmada kullanılan enjekte hücre sayısı 60 X amaç alanıyla Imaging başına yaklaşık 50 hücreleri görüntü izin verdi. Daha büyük bir konsantrasyon hücre toplama, analiz için uygun hücre sayısını azaltarak sonuçlandı. Daha fazla enjekte hücre sayısı 10-50 x azaltabilir, ancak hücre sayısı alt sınırı hücre heterojenite, görüntü alanlarının sayısı ve deneysel tasarım bağlıdır. Bazı araştırmacılar daha önce benzer bir hücre sayısı analiz16için gerekli bir cam alt ile bir açık odası inşa bilayers kullandık. Ancak, burada, 0.1 - 0.4 mm, kanal yüksekliği ile açıklanan kapalı sistem hücre eki ve analiz sıvı buharlaşma riski olmadan T hücreli yanıtının eşitlemek hızlı hücre sedimantasyon sağlar. Yapışkan slayt sistemi daha fazla kanal başına en fazla üç bilayers oluşumuna izin verir. Böylece, aynı hücre örnek farklı bilayers hücre davranış analizi ile uyarıcı bir farklı bileşimi, yapışma ve costimulatory moleküller için kullanılabilir.
Yapışkan slaytlar ve coverslips başarılı bilayer oluşumu için derleme sırasında bazı önlemler alınmalıdır. Özellikle, coverslips-meli var olmak tamamen kuru, üzerinde bile az miktarda sıvı sol olarak cam yüzey sızıntı yordamı yıkama bilayer sırasında neden olabilir. Önemlisi, Polipropilen makas tipi forseps (3.4.1 adımda anlatıldığı gibi) kaçağı önlemek için dış halkasındaki ile ilgili kişinin kenarlardaki ekli coverslip bile önemlidir. Herhangi bir kanal giriş bağlantı noktalarını köpüren önlemek önemlidir. Herhangi bir kabarcık bir kanal girerseniz, onlar kaldırmak ve bilayer kanal içinde berbat etmek imkansız. Benzer şekilde, türbülanslı akış sıvı kabarcıkları kanal tanıtmak ve bilayer zarar beri herhangi bir hızlı, pipetting önlemek önemlidir.
Cytolytic granül sürümü CD107a T hücre bilayer arayüzü görünümünü tarafından algılanır. Alexa-Fluor-568-etiketli anti-CD107a antikorların fab bölgeleri CD8 T hücreleri bilayers üzerinde yükleme önce eklenir. TIRF mikroskobu yararlanan alan yaklaşık 100 aydınlatmak için fani bir dalga nm görüntüleme dikey çözünürlüğünü artırmak için izin fani birim tanımlı birimindeki bilayer yukarıda. Çok hızlı bir şekilde 37 ° C'de fani birimi içindeki diffüz, antikor Fabs etiketli algılanabilir bir floresan sinyal üretemeyen. Litik moleküller hücre zarının CD107a membran protein üzerinde T görüntülenir içeren özel organellerin membran füzyonu sırasında farklı yerlerde yüzey hücreleri başvurun. Fabs CD107s protein o zaman bağlı. CD107a protein bağlı, floresan etiketli Fab(s) parlak floresans tespit TIRF mikroskobu, T hücre degranulation gösterge tarafından oluşturmak hareketsiz kümeleri oluşturur.

T-hücre bağışıklık sinapslarda ve T hücrelerinin fonksiyonel etkinlik onların bağlantı yapısal özelliklerinden bilimsel bilgi öncelikle hücre hatları kursundan üretti ve PB türetilmiş klonlar. Bu bulgular için birincil T hücreleri arasında bir ilişki ne derece elde kan veya insan lenfoid doku kalır belirsiz, lenfoid ve diğer dokularda bulunan T hücre sinaptik arabirimleri şu ana kadar analiz değil gibi. Önemlisi, gelişmekte olan verileri doku yerleşik ve lenfoid organ elde T hücreleri fenotip ve fonksiyonel etkinlik bu PB6,7göre önemli farklılıklar olabileceğini göstermektedir. Bu daha fazla daha iyi birincil insan T hücreleri T-hücre sinaptik arabiriminde özelliklerini anlamak gerek katılaşmış.
Bu amaçla, biz bize insan PB ve LN. izole az 105 birincil T hücreleri ile T-hücre/bilayer arayüzleri görüntüleme gerçekleştirmesini sağlayan çok kanallı akışı slaytlar içine yerleştirilmiş lipid bilayers istismar bir roman mini ölçek yaklaşım geliştirdik Bu roman tekniği daha iyi model ve in vivo hücre-hücre etkileşimleri anlamak için birincil insan T-hücre sinaptik arabirimleri biyofiziksel özelliklerini sağlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD4 T cell isolation kit, human</td>
			<td>Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-096-533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 T cells Isolation Kit, human</td>
			<td>Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-096-495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOGS NTA</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>790528C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinyl Cap PE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>870273C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin</td>
			<td>Octapharma USA</td>
			<td>NDC 68982-643-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sticky-Slide VI 0.4</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips for sticky-Slides</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioptech FCS2 Chamber</td>
			<td>Bioptech</td>
			<td>060319-2-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD3 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16-0037-81</td>
			<td>OKT3 clone, hybridoma cells are available from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- CD28 antibody</td>
			<td>Genetex</td>
			<td>GTX14664</td>
			<td>9.3 clone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEO4-NHS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 protein labeling kit with column for labeled protein purification</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 protein labeling kit with column for labeled protein purification</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Cy5 NHS Ester</td>
			<td>GE Life Science</td>
			<td>PA15101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMT/V5-His A, B, C Drosophila Expression Vectors</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>V412020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcopneo, G418 Drosophila expression vector for positive selection</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>37409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum free Drosophial media Insect-XPRESS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-730Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridoma YN1/1.7.4</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL1878</td>
			<td>The hybridoma secrets antibody against ICAM-1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanogen bromide-activated-Sepharose 4B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9142</td>
			<td>Utilized for preparation of Sepharose with covelently bound anti-ICAM antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterFlex tangential flow concentrator</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>77601-60 7592-40</td>
			<td>Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centramate Lab Tangential Flow Systems</td>
			<td>Pall Laboratory</td>
			<td>FS002K10 OS010T12 FS005K10</td>
			<td>Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Spectra/Por</td>
			<td>131384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain from papaya latex</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human antibody against CD107a</td>
			<td>BD Bioscences</td>
			<td>555798</td>
			<td>Clone H4A3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ansell Natural Blue Gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-014-539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Polypropylene Scissor-Type Forceps</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>6320-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>ProZyme</td>
			<td>SA10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Nikon TiE inverted microscope equipped with PFS for long-term image stability control, 60x oil objectives, 4 lasers with excitation lines at 405, 458, 488, 514, 561, and 640 nm, 2 GaAsP detectors and 2 high sensitivity PMTs, DIC transmitted light, Programmable X,Y,Z stage for multiple positions and stitching of large areas, time lapse functions, Tokai-Hit temperature and CO2-controlled chamber for live imaging, and anti-vibration isolation table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIRF microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>Andor Revolution XD system equipped with Nikon TIRF-E illuminator, Lasers with 405,488,561 and 640 lines, DIC transmitted light, Yokogawa CSU-X1 spinning disk head for confocal imaging, 100/1.49 NA objective, Andor iXon X3 EM-CCD camera, objective heater, and a piezoelectric motorized stage with Perfect Focus System (PFS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph Premier Image Analysis Software</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the synaptic interface of primary human t cells from peripheral blood and lymphoid tissue

Dynamics mevcut anlayış ve yapısal özellikleri T-hücre sinaptik arayüzlerin düzlemsel bilayers Cam destekli ve vitrokullanımı ile büyük ölçüde kararlı olmuştur-türetilmiş T-Hücre klonlar ya da hatları1,2 ,3,4. Bu bulgular birincil insan T hücrelerine kan gelen izole veya lenfoid uygulamak nasıl dokular bilinmemektedir, hücre Analizi5için yeterli sayıda almak üzere kısmen önemli zorluklar nedeniyle. Burada bu bir teknik etkinleştirme ve adezyon molekülleri içeren düzlemsel lipid bilayers oluşturmak için çok kanallı akışı slaytlar istismar geliştirilmesi yoluyla ele. Akış slaytlar düşük yüksekliği hızlı hücre sedimantasyon hücre: bilayer eki, böylece araştırmacılar sinaptik arabirimi oluşumu dinamik ve granül yayın kinetik çalışmaya izin eşitlemek için teşvik etmektedir. Biz az 10 olarak sinaptik arabiriminin analiz etmek için bu yaklaşım uygulamak4 ' e 105 birincil cryopreserved T hücreler lenf düğümleri (içinde) ve periferik kan (PB) izole. Sonuçları ortaya çıkarmak roman düzlemsel lipid bilayer tekniği birincil insan T hücreleri kan ve doku bağlamında sağlık ve hastalık, türetilmiş biyofiziksel özelliklerini sağlar.

İlk olarak, biz aktif kordon kanı türevi CD8 tarafından kurulan sinaptik arabirimi yapısını göre+ T hücre lipid bilayers maruz inşa ikisinden biri içinde geleneksel büyük ölçekli akışı (bkz: ayrıntılı bilgi için Malzemeler tablo ) hücre sistemleri1 ,2,3,4 veya çok kanallı akışı slaytlar. Bilayers floresan etiketli anti-CD3 ve ICAM-1 50 molekülleri/µm2 ve 300 molekülleri/µm2, sırasıyla içeriyordu. CD8+ T hücreleri insan kordon kanı türetilmiş bir stimülasyon ile plaka bağlı anti-CD3 ve anti-CD28 antikorlar13,14tarafından harekete geçirmek. CD8 arasında hiçbir fark+ T hücreleri kurulan bu klasik immünolojik sinapslarda üzerinde akış hücresini veya çok kanallı akışı slayt (Şekil 1) inşa lipid bilayers. Çok kanallı akışı slaytları yapılan lipid bilayers ile diğer deneyler yapıldı.
Sonra biz insan CD4 PB ve LN türetilmiş yeteneği muayene+ T hücreleri düzlemsel lipid bilayers ile sinaptik arabirimleri oluşturmak ve granül serbest bırakmak için. Biz TIRF mikroskobu görüntülenmeyecektir için hücreleri degranulating ve granül yayın kinetik değerlendirmek için T hücre bilayer arabirimi dikey çözünürlüğü en üst düzeye çıkarmak için kullandı. Biz her iki LN ve PBMC türetilen CD4 için 4 hücre grupları gözlenen+ T hücreleri: bazı T hücreler olgun bağışıklık sinapslarda kurulan ama mü ya da granül serbest değildi, granül olgun sinapslarda oluşumu olmadan diğer T hücreleri serbest ve hala diğer T hücreleri ne sinapslarda kurdu ne de tanecikler (Şekil 2)7serbest bırakmak. LN ve PBMC türetilen CD4 arasındaki fark+ T hücreleri granül yayın kinetik değerlendirildiğinde belirgin oldu. CD4 PBMC elde edilen+ T hücreleri granül neredeyse iki kat daha hızlı CD4 LN kaynaklı olarak serbest başlamak mümkün+ hücreleri (Şekil 3)7. Genel olarak, verileri CD4 LN ve PBMC türetilen bir heterojenite rağmen göstermek+ T hücreleri, yer alan İkincisi bir kısmını T hücreleri hızlı degranulation yeteneğine sahip.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58143/58143fig1.jpg"> Şekil 1: akış slayt sistemi ve geleneksel akışı odası karşılaştırılması. Çok kanallı akışı slayt 6 cam destekli düzlemsel lipid bilayers bir derleme izin (A) Bu panel gösterir. Her bilayer teslim ve çıkış bağlantı noktaları için bağlı. 1 x 10 daha az5 analiz için yeterli hücrelerdir. (B) Bu panel 1 düzlemsel lipid Cam destekli bilayer bir derleme izin geleneksel akış odası sistemi gösterir. 2 x 106 hücre analizi için gereklidir. Diğer paneller (C ve D) temsilcisi TIRF mikroskobu ve (E ve F) göstermek parazit yansıma mikroskobu ile confocal (IRM) tarafından geliştirilen arabirimi görüntülerini kordon kanı türevi CD8 T hücreleri harekete geçirmek. Hücreleri ICAM-1 (300 molekülleri/µm2) ve anti-CD3 antikor (50 molekülleri/µm2) satın içeren bir lipid bilayer (C ve E) akış slaytlar veya (D ve F) bir geleneksel sinin benzer koşullar altında akış sistemi. TIRF mikroskobu ve IRM ile confocal görüntüleri 100 X ve 60 X büyütme hedefleri, sırasıyla kullanarak alınır. Form olgun bilayers synapses T hücre yüzdesi ya akışı slayt inşa veya geleneksel akışı odası çok benzer ama % 90'dan % 75 deneyler arasında değişir. Tüm görüntüleri, Cy 5 etiketli ICAM-1 molekülleri mavi renkle gösterilir; Alexa-Fluor-488-etiketli anti-CD3 antikor yeşille gösterilir; Alexa-Fluor-568-etiketli anti-CD107a antikorlar CD107a için bağlı kırmızıyla gösterilir; IRM görüntüleri Camgöbeği içinde gösterilir; ve ölçek çubukları uzunluğu 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58143/58143fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58143/58143fig2.jpg"> Resim 2: Bir T hücre – bilayer arabirimin yapısı ve degranulation lenf nodu ve periferik desen kan mononükleer CD4+ T hücreleri. LNMC veya PBMC türetilen hücreler sıralı+ T bu hücreleri CD4 ayırmak için 50 molekülleri/µm2 anti-CD3 antikor ve 300 molekülleri/µm2 ICAM-1 protein içeren bilayers maruz kaldılar. Hücreleri ve bilayers arasında arayüz tarafından TIRF mikroskobu görüntüsü. Ölçek çubukları 5 µm.(a)olan bir T hücre - bilayer arabirim temsilcisi bu görüntülerin T hücre – bilayer arabirimleri ve degranulation desen yapısını göstermektedir. (B) aşağıdaki diyagramları gösterir LNMC ve PBMC türetilen CD4 gösterimi+ T hücre sinaptik Arayüzlerin farklı yapısı ve desen granül sürümü ile. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58143/58143fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58143/58143fig3.jpg"> Şekil 3: Mononükleer CD4 T hücre – bilayer arabirimi yapısını ve degranulation lenf nodu ve periferik kinetik dinamik değişiklikleri kan+ T hücreleri. (A) Bu panel gösterir saat-bağımlı değişiklikleri T hücre – bilayer arabirimi ve yayımlanan granül görünümünü. 5 µm. (B) Bu panel gösterir LN kaynaklı CD4 tarafından bir granül açıklaması kinetik Nefelometri ölçek çubukları vardır+ T hücreleri (kapalı daireler) ve PBMC elde edilen CD4+ T hücreleri (açık dairelerden). Her bireysel daire tek tek hücreler tarafından algılanabilir granül açıklaması ilk görünümünü zaman gösterir. Medyan ve IQR (interquartile Aralık) tüm scatter araziler için gösterilir. Mann-Whitney testleri T hücre belirtilen grupları arasındaki farkları karşılaştırmak için yapıldı. P < 0,05, ** P < 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58143/58143fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue at JoVE.com

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

Periferik kan ve lenf dokusu birincil insan T hücre sinaptik arabirimi değerlendirilmesi

Protokol düzlemsel lipid bilayers kullanarak sinaptik arabirimleri oluşturmak için birincil poliklonal insan T hücreleri yeteneklerini çalışmaya bir teknik anlatılmaktadır. İnsan birincil T hücreler lenf düğümleri ve periferik kan elde fark synapse oluşumu yeteneğini göstermek için bu tekniği kullanın.

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

assessment-synaptic-interface-primary-human-t-cells-from-peripheral

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.4K Görüntüleme.  Thomas Jefferson University. Protokol düzlemsel lipid bilayers kullanarak sinaptik arabirimleri oluşturmak için birincil poliklonal insan T hücreleri yeteneklerini çalışmaya bir teknik anlatılmaktadır. İnsan birincil T hücreler lenf düğümleri ve periferik kan elde fark synapse oluşumu yeteneğini göstermek için bu tekniği kullanın.

Video: Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of NK cells and ability to expand in vitro has restricted development of NK cell immunotherapy. Here we describe a method to efficiently expand vast quantities of functional NK cells ex vivo using K562 cells expressing membrane-bound IL21, as an artificial antigen-presenting cell (aAPC).
NK cell adoptive therapies to date have utilized a cell product obtained by steady-state leukapheresis of the donor followed by depletion of T cells or positive selection of NK cells. The product is usually activated in IL-2 overnight and then administered the following day 1. Because of the low frequency of NK cells in peripheral blood, relatively small numbers of NK cells have been delivered in clinical trials.
The inability to propagate NK cells in vitro has been the limiting factor for generating sufficient cell numbers for optimal clinical outcome. Some expansion of NK cells (5-10 fold over 1-2 weeks) has be achieved through high-dose IL-2 alone 2. Activation of autologous T cells can mediate NK cell expansion, presumably also through release of local cytokine 3. Support with mesenchymal stroma or artificial antigen presenting cells (aAPCs) can support the expansion of NK cells from both peripheral blood and cord blood 4. Combined NKp46 and CD2 activation by antibody-coated beads is currently marketed for NK cell expansion (Miltenyi Biotec, Auburn CA), resulting in approximately 100-fold expansion in 21 days.
Clinical trials using aAPC-expanded or -activated NK cells are underway, one using leukemic cell line CTV-1 to prime and activate NK cells5 without significant expansion. A second trial utilizes EBV-LCL for NK cell expansion, achieving a mean 490-fold expansion in 21 days6. The third utilizes a K562-based aAPC transduced with 4-1BBL (CD137L) and membrane-bound IL-15 (mIL-15)7, which achieved a mean NK expansion 277-fold in 21 days. Although, the NK cells expanded using K562-41BBL-mIL15 aAPC are highly cytotoxic in vitro and in vivo compared to unexpanded NK cells, and participate in ADCC, their proliferation is limited by senescence attributed to telomere shortening8. More recently a 350-fold expansion of NK cells was reported using K562 expressing MICA, 4-1BBL and IL159.
Our method of NK cell expansion described herein produces rapid proliferation of NK cells without senescence achieving a median 21,000-fold expansion in 21 days.

Here we describe a method to efficiently expand and purify large numbers of human NK cells and assess their function.

Genişleme, Saflaştırılması, ve İnsan Periferik Kan NK Hücrelerinin Fonksiyonel Değerlendirme

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and anti-infective activity.1 The majority of &gamma;&delta; T cells in peripheral blood have the V&gamma;9V&delta;2 T cell receptor. These cells recognize antigen in a major histocompatibility complex-independent manner and develop strong cytolytic and Th1-like effector functions.1Therefore, &gamma;&delta; T cells are attractive candidate effector cells for cancer immunotherapy. V&gamma;9V&#x03B4;2 T cells respond to phosphoantigens such as (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), which is synthesized in bacteria via isoprenoid biosynthesis;2 and isopentenyl pyrophosphate (IPP), which is produced in eukaryotic cells through the mevalonate pathway.3 In physiological condition, the generation of IPP in nontransformed cell is not sufficient for the activation of &gamma;&delta; T cells. Dysregulation of mevalonate pathway in tumor cells leads to accumulation of IPP and &gamma;&delta; T cells activation.3 Because aminobisphosphonates (such as pamidronate or zoledronate) inhibit farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS), the enzyme acting downstream of IPP in the mevalonate pathway, intracellular levels of IPP and sensitibity to &gamma;&delta; T cells recognition can be therapeutically increased by aminobisphosphonates. IPP accumulation is less efficient in nontransfomred cells than tumor cells with a pharmacologically relevant concentration of aminobisphosphonates, that allow us immunotherapy for cancer by activating &gamma;&delta; T cells with aminobisphosphonates. 4 Interestingly, IPP accumulates in monocytes when PBMC are treated with aminobisphosphonates, because of efficient drug uptake by these cells. 5 Monocytes that accumulate IPP become antigen-presenting cells and stimulate V&gamma;9V&delta;2 T cells in the peripheral blood.6 Based on these mechanisms, we developed a technique for large-scale expansion of &gamma;&delta; T cell cultures using zoledronate and interleukin-2 (IL-2).7 Other methods for expansion of &gamma;&delta; T cells utilize the synthetic phosphoantigens bromohydrin pyrophosphate (BrHPP)8 or 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP).9 All of these methods allow ex vivo expansion, resulting in large numbers of &gamma;&delta; T cells for use in adoptive immunotherapy. However, only zoledronate is an FDA-approved commercially available reagent. Zoledronate-expanded &gamma;&delta; T cells display CD27-CD45RA- effector memory phenotype and thier function can be evaluated by IFN-&gamma; production assay. 7

Expansion of Human Peripheral Blood  &#947;&#948; T Cells using Zoledronate

A method to expand &gamma;&delta; T cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) is described. PBMC-derived &gamma;&delta; T cells are stimulated and expanded using zoledronate and interleukin-2 (IL-2). Large scale expansion of &gamma;&delta; T cells can be applied to autologous cellular immunotherapy of cancer.

Zoledronate İnsan Periferik Kan Genişleme γδ T Hücreler

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

İlköğretim İnsan naif ve Bellek T Hücreleri gelen İsteyerek Düzenleyici T Hücreleri Üretimi

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

Primer insan T hücrelerinin piggyBac Transposon Sistem Modifikasyon

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Klinik Uygulama<em&gt; Sleeping Beauty</emGenetiği Periferik ve Göbek Kordon Kanı alınan T hücreleri Değiştir Sunan Hücreler&gt; ve Yapay Antijen

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Periferik Kan İnsan alloantijen-özgü T hücrelerinin üretilmesi

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

İnsan Maternal-Fetal Arabirimi lökosit İzolasyonu

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Tüm kan İnsan monosit türevli dendritik hücrelerin oluşumu

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

Dextran fare ve insan birincil NK hücreleri Lentiviral iletim verimliliğini artırır

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to promote survival, cellular proliferation, production of cytokines such as interferon gamma (IFN&#947;) and/or cytotoxicity programs. NK cell activation by cytokine stimulation requires a substantial remodeling of metabolic pathways to support their bioenergetic and biosynthetic requirements. There is a large body of evidence that suggests that impaired NK cell metabolism is associated with a number of chronic diseases including obesity and cancer, which highlights the clinical importance of the availability of a method to determine NK cell metabolism. Here we describe the use of an extracellular flux analyzer, a platform that allows real-time measurements of glycolysis and mitochondrial oxygen consumption, as a tool to monitor changes in the energy metabolism of human NK cells. The method described here also allows for the monitoring of metabolic changes after stimulation of NK cells with cytokines such as IL-15, a system that is currently being investigated in a wide range of clinical trials.

In this paper, we describe a method to measure glycolysis and mitochondrial respiration in primary human Natural Killer (NK) cells isolated from peripheral blood, at rest or following IL15-induced activation. The protocol described could be easily extended to primary human NK cells activated by other cytokines or soluble stimuli.

İnsan Doğal Katil Hücre Metabolizmasının Analizi

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to ...