Name: assessment of the synaptic interface of primary human t cells from peripheral blood and lymphoid tissue
Uploaded: 2018-07-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue at JoVE.com

Bu eser desteklenmiştir Michael R. Betts için R01AI118694 NIH grant tarafından alt Ödülü 566950 Yuri Sykulev içerir. Sidney Kimmel Kanser Merkezi Bioimaging paylaşılan kaynak mükemmel desteklerinden dolayı teşekkür ediyoruz.

Bu çalışma Helsinki Bildirgesi uygun olarak yapılmıştır. Tüm katılımcılar Yazılı onam alındı ve kan ve lenf nodu (IRB #809316, IRB # 815056) Pennsylvania Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulunun onayı ile satın alınan. Tüm insan denekler yetişkindi. Kordon kan örnekleri nazikçe işçi ve kadın Doğum bölümü & Thomas Jefferson Üniversitesi'nde kadın hastalıkları teslim tarafından temin edilmiştir. Tüm örneklerini de-tespit edildi.
1. yalıtım CD4+ T hücreleri bir görüntü analizi için
<ol><li>
107 dondurulmuş periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) veya lenf nodu mononükleer hücreler (LNMCs) toplanan örnekleri içeren 1 mL aliquot çözülme. Steril bir başlık, penisilin/streptomisin ve glutamin ile RPMI 9 mL çözdürülen hücreleri ekleyin.
	<ol>
<li>Centrifugate 300 x g 4 ° C'de 10 dakika için hücreleri süpernatant Aspire edin ve 5 mL ilave RPMI % 10 içeren hücrelerde resuspend FBS (tam orta). CO2 kuluçka 37 ° C'de gecede hücrelerde kuluçkaya</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ertesi gün, CD4 arındırmak+ T hücreleri tarafından olumsuz immunomagnetic üreticinin yönerge göre piyasada bulunan bir seti kullanarak sıralama.</li>
	<li>Taze arıtılmış CD4 sayısı ölçmek için+ T hücreleri, hücre süspansiyon 5 µL bir trypan mavi çözüm eşit bir hacmi ile karıştırın. Bir hemasitometre hücre trypan ile yük mavi karışımı ve hemasitometre 5 bölümlerini içinde canlı hücreleri saymak.</li>
	<li>Hücre sayı ortalamasını almak ve özgün hücre süspansiyon hücre sayısı belirlemek: hücreler/1 mL sayısı = x 2 x 104ortalama sayısı. İzole hücre toplam sayısı çok küçük ise, hücre sayım olmadan olduğu gibi kullanın.</li>
	<li>Hücreleri vasıl 300 x g 10 dk santrifüj kapasitesi ve onları arabellekte bir tahlil (20 mM HEPES, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2 mM Na2HPO4, 5 mM D-glikoz, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2ve % 1 insan serum albümin) 105 resuspend < /C13 > hücreler/50 µL veya daha az ve hücreleri (için 1-2 h) 4 ° C'de deneylerde kullanıma hazır kadar tutun.</li>
	<li>Tüm biyolojik atık ilgili kurumsal yönergelere uygun bir biçimde atın.</li>
	<li>Denetimi hücre nüfus isterseniz, kordon kanı PBMC aktif CD8 T hücrelerden hazırlamak, 5 mL anti-CD3 ve anti-CD28 antikorları 10 µg/mL ve 1 µg/mL karışımı ile kaplı bir T25 kültür şişesi tam orta de 107 hücreleri yer , sırasıyla.</li>
	<li>Ertesi gün, aktif kordon kanı hücreleri balonun kaldırmak için onları yıkamak ile taze 1 x tamamlamak orta ve rekombinant IL-2 huzurunda hücreleri genişletin (100 U/mL) 2 hafta boyunca.</li>
	<li>Kordon kanı CD8 arındırmak+ T hücreleri üreticinin yönerge göre piyasada bulunan kit kullanarak negatif immunomagnetic sıralayarak. Hücreleri saymak ve tahlil arabellek medyaya LN ve PB CD8 için 1.3-1.6 adımlarda açıklandığı gibi döviz+ T hücreleri.</li>
</ol>2. düzlemsel Lipid Bilayers hazırlanması için bileşenler
<ol><li>Başka bir yerde5açıklandığı gibi lipozomlar 3 tür hazırlamak: (a) 0.4 mM DOPC (1,2-dioleoyl -sn- glycero-3-phosphocholine) lipozomlar, (b) 0.4 mM DOPC lipozomlar 33 mol % köpekler-NTA içeren (1,2-dioleoyl -sn- glycero - 3-[(N-(5- amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic asit) succinyl] (amonyum tuz)) lipidler, 4 mol % Biotinyl-Cap-PE içeren (c) 0.4 mM DOPC lipozomlar (1,2-dioleoyl -sn- glycero-3-phosphoethanolamine - N-(kap biotinyl) (sodyum tuzu)).</li>
	<li>
%5 kazein çözüm yukarıda açıklanan5olarak hazırlayın.
	<ol>
<li>5 g kazein tozu Ultrasaf Su 100 ml dağıtılması ve 10 M sodyum hidroksit 350 µL ekleyin. Her şey üzerinde düzenli bir manyetik karıştırıcı, oda sıcaklığında 2 h için kullanılabilir ölçeğine göre yavaş hızda karıştırın ve sonra 4 ° C'de gece 7.3 ve ultracentrifuge 100.000 x g 4 ° C'de 2 h için çözüm pH ayarlama Süpernatant 0,22 µm steril filtre ile filtre ve çözüm aliquots-80 ° C'de depolayın Dikkat: Sodyum hidroksit çözüm kimyasal yanıklara neden ve gözlerle temas üzerine kalıcı körlüğe neden olabilir. Lastik eldiven, Emanet giyim ve göz koruması bu kimyasal ya da çözümleri işlerken kullanır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Etiket anti-CD3 antikor ile mono-bionylated antikor molekülleri ile yukarıda açıklanan yaklaşım8üretmek için biotin.
	<ol>
<li>Dimetil sülfoksit (DMSO) 0.1 mg/mL, Biotin-PEO4-NHS çözeltilerine hazırlayın. Antikor fosfat tamponlu tuz (PBS) 100 mM sodyum bikarbonat içeren 0.5 ml 1 mg Biotin-PEO4-NHS çözüm 3.7 µL ekleyin.</li>
		<li>Karışımı oda sıcaklığında 2 h için kuluçkaya. Alexa Fluor 488 NHS ester adlı 10 mg/mL DMSO çözeltisi hazırlamak. Alexa Fluor 488 NHS ester çözüm Biotin-PEO4-NHS tarafından 10 kat molar aşırı etiketli antikor ekleyin.</li>
		<li>Karışımı yavaş karıştırma üzerinde düzenli bir manyetik karıştırıcı ile Oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya. İlişkisiz boya boyutu-dışlama Kromatografi kullanarak ayırın.</li>
		<li>280, antikor çözümün optik yoğunluk ölçerek antikor konsantrasyonu belirlemek nm (bir280). 577, etiketli antikorlar optik yoğunluğunu ölçmek nm (bir577).</li>
		<li>Boya antikor oranı aşağıdaki denklemi kullanarak belirleyin: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58143/58143eq1.jpg"> Not: ek ayrıntılar üreticinin iletişim kuralı'nda bulabilirsiniz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rekombinant çözünür ICAM-1 protein3,4,9,10daha önce açıklandığı gibi bir Drosophila ifade sisteminde hızlı.
	<ol>
<li>Klon cDNA kodlama ile ICAM-1 ectodomain içine Drosophila ifade vektör DEVRESEL_ÖDEME/V5-O'nun bir His ile eklenmiş bir Rekombinant protein üretmek için bir indüklenebilir metallothionein organizatörü ile6 etiketi C-terminal ucunda.</li>
		<li>S2 hücreleri elde edilen ICAM-1 içeren plazmid ve G418 ifade vektör Co transfect. Kararlı transfectants % 10 fetal buzağı serum (FCS) ve 0,5 mg/mL G418 ile 3 hafta boyunca takıma Schneider'ın Drosophila medya kullanarak seçin. Serum içermeyen böcek orta hücrelerde genişletin ve bir protein ifade ile 0,5 mM CuSO4 3 d için teşvik.</li>
		<li>Kültür süpernatant 10 x konsantre ve PBS üzerinden karşı teğet akışı yoğunlaştırıcı yukarıda açıklanan11olarak diyaliz.</li>
		<li>Süpernatant konsantre kültür Sepharose ile kovalent immobilize bir anti-ICAM-1 monoklonal antikor içeren bir sütun için geçerli ve ilişkili ICAM-1 50 mM glisin arabelleği, pH 3.0 ile elute. Hemen eluted ICAM-1 protein 2 M Tris arabelleği, pH 8.0 ile etkisiz hale getirin.</li>
		<li>PBS, pH 8.0 karşı eluted malzeme diyaliz ve bir sütun içeren Ni-NTA özel diyaliz malzeme ekleyin. Çözünür ICAM-1 200 mM imidazole, pH 8.0 ile elute. PBS arabellek, pH 8.0 karşı eluted malzeme diyaliz.</li>
		<li>Arıtılmış ICAM-1 Cy5 NHS ester göre üreticinin yönerge ile etiketleyin. Not: En iyi son boya protein oranı 1: 1'dir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fab üretmek papain sindirim tarafından bir anti-CD107a antikor parçaları ve Fab arındırmak parçaları3daha önce açıklandığı gibi İyon Kromatografi tarafından. Etiket Alexa Fluor 568 NHS ester göre üreticinin yönerge ile Fab parçaları.</li>
</ol>3. düzlemsel Lipid Cam destekli Bilayers oluşumu
<ol><li>Bir taze asidik piranha çözüm 140 mL konsantre sülfürik asit ve % 30 hidrojen peroksit 60 mL karıştırarak hazırlayın. Cam coverslips akışı slaytlar için onları 30 dk. tutun asit piranha çözümde cam coverslip Polipropilen makas tipi forseps ile ıslatarak yıkayın. Dikkat: Son derece güçlü bir oksitleyici Piranha çözümdür. Aşınma koruyucu gözlük ya da gözlük ya da kalın lastik eldiven ile birlikte tam yüz bir kalkan çözüm işleme sırasında her zaman unutmayın. Piranha çözüm bir duman başlık altında sadece çalışmak. Patlayabilir o olabilir gibi Isıtma, taşıma veya herhangi bir anında kullanım, sallıyorum kaçının. Piranha atık kurşun içeren çukur bir cam şişe içine toplamak. Kurumsal Güvenlik Komitesi uygun atık kullanımı hakkında başvurun.</li>
	<li>
Yıkanmış coverslips 7 durulama taze su içeren şişeler sırayla aktarmadan tarafından Ultrasaf Su ile x. Su kalan izin vermek bir yana coverslips ıslak kuru cam geride bırakarak temiz cam kapalı rulo seti.
	<ol>
<li>Alternatif olarak, bir vakum pompa bağlı bir pipet ucu dikkatle kalan su damlacıkları coverslips kaldırmak için kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Steril başlık, lipozom mix bilayers yapmak için üretmek için çeşitli lipitler dilutions gerçekleştirin. İlk olarak, DOPC lipozomlar 37 µL ve Biotinyl-Cap-PE lipozomlar 3 µL birleştirir. İkinci olarak, DOPC lipozomlar 14 µL ve köpekler-NTA lipozomlar 15 µL karıştırın. Üçüncü olarak, ilk Mix 1 µL son lipozom karışımı imal etmek ikinci mix 29 µL için ekleyin.</li>
	<li>
Steril başlık, bir çalışma alanı tarafından kuru coverslips yakın ile ayarlayın. Aliquot 2 µL son lipozom karışımı (bkz. Adım 3.3) tam olarak kendinden yapışkanlı slayt kanal merkezinde. Hemen ve çok hassas bir temiz ve kuru coverslip slayt ile hizalayın ve slayt yapışkan tarafındaki coverslip yavaşça indirin.
	<ol>
<li>Birden fazla slayt hazırlama, iş bir slayt üzerinde teker teker beri lipozom karışımı hızla buharlaşır. Slayt çevirin ve polipropilen makas tipi forseps dış halkasındaki kaydıraklı, slip kaçağı önlemek için slayda sıkıca bağlı olduğundan emin yapma coverslip periferik kişiye hafif bir basınç uygulamak için kullanın. Not: kırılma veya coverslip çatlama önlemek için slayt kanalları karşı basın değil.</li>
		<li>Slayt üzerinde yeniden açın ve derleme dış slayt tarafındaki bilayer çevresinde kalıcı bir kalem ile çizim 4 nokta tarafından bir damla coverslip ve kanal slayt arasında gibi görünüyor kurulan bilayer konumunu işaretleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kanal içine ilk enjeksiyon bir sıvı önce kanalın bir bağlantı noktası giriş bağlantı noktası diğer çıkış bağlantı noktası olarak atayın ve bu atama deneme boyunca korumak.</li>
	<li>Kabarcıklar oluşturan önlemek için doğrudan kanal giriş liman damlalıklı ucu ucunu bağlayın. Yavaş yavaş slayt kanalları sıcak 50 µL ile doldurun (en azından oda sıcaklığı) tahlil arabellek (bkz. Adım 1.5 arabellek oluşturma için).</li>
	<li>0, 5 M nickel(II) klorür çözüm hazırlamak. 2 mL aliquot su banyosu için 30 dk 37 ° C'de çözümde kazein, çözülme ve bir nikel klorür çözüme 200 µM son bir konsantrasyon ile ek.</li>
	<li>Bilayers ilk kanal giriş limanında kazein çözeltinin 100 µL enjekte ve sonra hemen dışarı slayt çıkış noktasındaki 100 µL pipetting tarafından kaldırarak yıkayın. Aynı çözüm ile bilayers 100 µL kazein çözümün her kanal giriş portuna enjekte ve slayt için 45 dakika oda sıcaklığında kuluçka engelleyin.</li>
	<li>Aliquots Cy5-ICAM-1-O'nun6 ve streptavidin proteinlerin çözülme. 2 µg/mL her son konsantrasyonu, tahlil arabellekte proteinleri birleştirir. Belgili tanımlık eriyik için 20.000 x g ve herhangi bir toplamları kaldırmak için 4 ° C'de 30 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Engelleme çözüm geri kalanı pipetting tarafından slayt kanal çıkış bağlantı noktasından çıkarın. 100 µL ICAM-1 ve streptavidin giriş portuna içeren çözüm enjekte.</li>
	<li>Slayt 45 dakika oda sıcaklığında için kuluçkaya. Herhangi bir aşırı protein çözüm çıkış bağlantı noktasından çıkarın. Bilayer 2 yıkama x ilk kanal giriş limanında tahlil tamponunun 100 µL enjekte ve sonra hemen çıkış bağlantı noktası dışında 100 µL kaldırarak.</li>
	<li>Alexa-Fluor-488-etiketli bir anti-CD3 antikor tahlil arabelleği için 2 µg/mL nihai bir konsantrasyon ile sulandırmak. Antikor çözeltinin 100 µL slayt giriş portuna enjekte ve oda sıcaklığında 45 dk için kuluçkaya. Herhangi bir aşırı protein çözüm çıkış bağlantı noktasından çıkarın. Bilayer 2 yıkama x 100 µL olduğu gibi adım 3.11 tahlil arabelleği ile.</li>
</ol>4. düzlemsel Bilayer ile T hücreleri etkileşim görüntüleme
<ol><li>
Sahne ve confocal veya toplam iç yansıma (TIRF) Floresan mikroskop amacı sıcaklığı 37 ° C'de equilibrated kadar onceden Bilayer(s) slaytla ısıtmalı sahnede ayarlayın. Sahne mürekkep işaretleri göre uygun bir konuma taşımak ve floresan Cy etiketli ICAM-1 moleküllerin istihdam bilayer odaklan.
	<ol>
<li>61 X amaç confocal mikroskop için veya 100 X amaç TIRF mikroskopla uygun filtre ayarlarını kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Granül için görüntüleme TIRF mikroskobu tarafından serbest, Alexa-Fluor-568-etiketli anti-CD107a eklemek için 4 µg/mL giriş noktalarına hücreleri enjekte önce son bir konsantrasyon, hücre süspansiyon parçaları antikor Fab.
	<ol>
<li>Hazırlanan CD4 resuspend+ T hücreleri izole LN veya PB veya kordon kan ve hücre süspansiyon 50 µL bilayer içeren slayt kanalı giriş bağlantı noktası enjekte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alanları istediğiniz sayıda ve kayıt görüntüleri her alanının 1 x 30 dk için her 2 dk sonra enjeksiyon seçin.</li>
	<li>Alan parlak, yansıyan ışık ve floresan kanal (Alexa 488 ve Cy5) görüntüleri elde etmek için confocal mikroskop yararlanmak. Alexa-Fluor-488 ve Alexa-Fluor-568 floresans ve widefield Cy5 floresan, hem de TIRF mikroskop üzerinde parlak alan görüntüleme için TIRF modunu kullanın.</li>
</ol>5. görüntü analizi
<ol><li>Uygun yazılımı kullanarak alınan görüntüleri analiz. Hücre morfolojisi iletilen ışık görüntü, kümelenmiş ve gözle görülür hasar dışlama veya analiz apoptotik hücreler içinde gözlemlemek. Analizde sadece üretken bilayer yüzey (Örneğin, Alexa-Fluor-488 Floresan (anti-CD3 antikor) arayüz biriken hücreler) ile etkileşim hücreler içerir.</li>
	<li>20 dk hücre adezyon alanının boyutu hücre bilayer etkileşim başlandıktan sonra belirleyin. Not: Parazit yansıması mikroskobu (IRM) resim hücre bilayer arabirimde geliştirilen karanlık alan yapışma alandır.</li>
	<li>Cy5-ICAM-1 floresans herhangi bir birikimi ve yüzük kavşak bir oluşum tarafından ayrılmış Cy-ICAM-1 moleküller hücre bilayer arayüz gözlemlemek. Birikmiş ICAM-1 molekülleri bir yapışma halkası kavşak en az iki ardışık görüntülerde oluşan isterseniz bu tür hücrelerin periferik supramolecular aktive küme (pSMAC)12gelişmekte olan hücreler olarak belirleyin.</li>
	<li>Granül sürümü hücre yakın temas bölgesinin dışında arka plan floresans üzerinde T hücre bilayer arabirimi Alexa-Fluor-568 floresans yoğunlukta ölçerek değerlendirin. Alexa-Fluor-568 sinyal-için-arka plan en az 1,3 oranında hücreleri degranulating hücreler olarak belirleyin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285, 221-227 (1999).</li><li>Somersalo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T+lymphocytes+form+an+antigen-independent+ring+junction.">Cytotoxic T lymphocytes form an antigen-independent ring junction.</a> Journal of Clinical Investigation. 113, 49-57 (2004).</li><li>Beal, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+theta+regulates+stability+of+the+peripheral+adhesion+ring+junction+and+contributes+to+the+sensitivity+of+target+cell+lysis+by+CTL.">Protein kinase C theta regulates stability of the peripheral adhesion ring junction and contributes to the sensitivity of target cell lysis by CTL.</a> The Journal of Immunology. 181, 4815-4824 (2008).</li><li>Beal, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+early+T+cell+receptor+signaling+regulate+the+pathway+of+lytic+granule+delivery+to+the+secretory+domain.">Kinetics of early T cell receptor signaling regulate the pathway of lytic granule delivery to the secretory domain.</a> Immunity. 31, 632-642 (2009).</li><li>Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+planar+bilayers+for+study+of+the+immunological+synapse.">Supported planar bilayers for study of the immunological synapse.</a> Current Protocols in Immunology. , (2007).</li><li>Reuter, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-Specific+CD8(+)+T+Cells+Exhibit+Reduced+and+Differentially+Regulated+Cytolytic+Activity+in+Lymphoid+Tissue.">HIV-Specific CD8(+) T Cells Exhibit Reduced and Differentially Regulated Cytolytic Activity in Lymphoid Tissue.</a> Cell Reports. 21, 3458-3470 (2017).</li><li>Buggert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+immune+surveillance+in+lymphoid+tissue+by+cytolytic+CD4++T+cells+during+health+and+HIV+disease.">Limited immune surveillance in lymphoid tissue by cytolytic CD4+ T cells during health and HIV disease.</a> PLoS Pathogens. 14, e1006973 (2018).</li><li>Carrasco, Y. R., Fleire, S. J., Cameron, T., Dustin, M. L., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LFA-1/ICAM-1+interaction+lowers+the+threshold+of+B+cell+activation+by+facilitating+B+cell+adhesion+and+synapse+formation.">LFA-1/ICAM-1 interaction lowers the threshold of B cell activation by facilitating B cell adhesion and synapse formation.</a> Immunity. 20, 589-599 (2004).</li><li>Anikeeva, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+role+of+lymphocyte+function-associated+antigen-1+in+mediating+effective+cytolytic+activity+by+cytotoxic+T+lymphocytes.">Distinct role of lymphocyte function-associated antigen-1 in mediating effective cytolytic activity by cytotoxic T lymphocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 6437-6442 (2005).</li><li>Steblyanko, M., Anikeeva, N., Campbell, K. S., Keen, J. H., Sykulev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+Influence+the+Size+and+Dynamics+of+Signaling+Microclusters+in+a+Pyk2-dependent+Manner.">Integrins Influence the Size and Dynamics of Signaling Microclusters in a Pyk2-dependent Manner.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290, 11833-11842 (2015).</li><li>Anikeeva, N., Lebedeva, T., Sumaroka, M., Kalams, S. A., Sykulev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+HIV-specific+T-cell+receptor:+expression,+purification+and+analysis+of+the+specificity.">Soluble HIV-specific T-cell receptor: expression, purification and analysis of the specificity.</a> Journal of Immunological Methods. 277, 75-86 (2003).</li><li>Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells.">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395, 82-86 (1998).</li><li>Riddell, S. R., Greenberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+anti-CD3+and+anti-CD28+monoclonal+antibodies+to+clone+and+expand+human+antigen-specific+T+cells.">The use of anti-CD3 and anti-CD28 monoclonal antibodies to clone and expand human antigen-specific T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 128, 189-201 (1990).</li><li>Lin, S. J., Yu, J. C., Cheng, P. J., Hsiao, S. S., Kuo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+interleukin-15+on+anti-CD3/anti-CD28+induced+apoptosis+of+umbilical+cord+blood+CD4++T+cells.">Effect of interleukin-15 on anti-CD3/anti-CD28 induced apoptosis of umbilical cord blood CD4+ T cells.</a> European Journal of Haematology. 71, 425-432 (2003).</li><li>Anikeeva, N., Sykulev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+controlling+granule-mediated+cytolytic+activity+of+cytotoxic+T+lymphocytes.">Mechanisms controlling granule-mediated cytolytic activity of cytotoxic T lymphocytes.</a> Immunologic Research. 51, 183-194 (2011).</li><li>Huppa, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity.">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature. 463, 963-967 (2010).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada açıklanan roman tekniği konvansiyonel akışı hücre5 düzlemsel bilayers oluşturmak için gerekli benzer reaktifler kullanır ve başarıyla birincil insan T hücre – bilayer arabirimleri3,4 görüntüleme gerçekleştirmek için uygulanabilir ,15. Teknik floresan molekülleri kullanımı önemli bir azalma sunmaktadır ve 10-20 daha az T hücreleri ile karşılaştırıldığında birinci...

T-hücre bağışıklık sinapslarda ve T hücrelerinin fonksiyonel etkinlik onların bağlantı yapısal özelliklerinden bilimsel bilgi öncelikle hücre hatları kursundan üretti ve PB türetilmiş klonlar. Bu bulgular için birincil T hücreleri arasında bir ilişki ne derece elde kan veya insan lenfoid doku kalır belirsiz, lenfoid ve diğer dokularda bulunan T hücre sinaptik arabirimleri şu ana kadar analiz değil gibi. Önemlisi, gelişmekte olan verileri doku yerleşik ve lenfoid organ elde T hücreleri fenotip ve fonksiyonel etkinlik bu PB6,7göre önemli farklılıklar olabileceğini göstermektedir. Bu daha fazla daha iyi birincil insan T hücreleri T-hücre sinaptik arabiriminde özelliklerini anlamak gerek katılaşmış.
Bu amaçla, biz bize insan PB ve LN. izole az 105 birincil T hücreleri ile T-hücre/bilayer arayüzleri görüntüleme gerçekleştirmesini sağlayan çok kanallı akışı slaytlar içine yerleştirilmiş lipid bilayers istismar bir roman mini ölçek yaklaşım geliştirdik Bu roman tekniği daha iyi model ve in vivo hücre-hücre etkileşimleri anlamak için birincil insan T-hücre sinaptik arabirimleri biyofiziksel özelliklerini sağlar.

<table><tbody><tr><td>CD4 T cell isolation kit, human</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-096-533</td><td></td></tr><tr><td>CD8 T cells Isolation Kit, human</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-096-495</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>DOGS NTA</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790528C</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyl Cap PE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870273C</td><td></td></tr><tr><td>Human Serum Albumin</td><td>Octapharma USA</td><td>NDC 68982-643-01</td><td></td></tr><tr><td>sticky-Slide VI 0.4</td><td>ibidi</td><td>80608</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips for sticky-Slides</td><td>ibidi</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Bioptech FCS2 Chamber</td><td>Bioptech</td><td>060319-2-03</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD3 antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16-0037-81</td><td>OKT3 clone, hybridoma cells are available from ATCC</td></tr><tr><td>anti- CD28 antibody</td><td>Genetex</td><td>GTX14664</td><td>9.3 clone</td></tr><tr><td>Casein</td><td>Sigma</td><td>C5890</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEO4-NHS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21329</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650-5</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 protein labeling kit with column for labeled protein purification</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10235</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 protein labeling kit with column for labeled protein purification</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10238</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Cy5 NHS Ester</td><td>GE Life Science</td><td>PA15101</td><td></td></tr><tr><td>pMT/V5-His A, B, C Drosophila Expression Vectors</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>V412020</td><td></td></tr><tr><td>pcopneo, G418 Drosophila expression vector for positive selection</td><td>ATCC</td><td>37409</td><td></td></tr><tr><td>Serum free Drosophial media Insect-XPRESS</td><td>Lonza</td><td>12-730Q</td><td></td></tr><tr><td>Hybridoma YN1/1.7.4</td><td>ATCC</td><td>CRL1878</td><td>The hybridoma secrets antibody against ICAM-1.</td></tr><tr><td>Cyanogen bromide-activated-Sepharose 4B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9142</td><td>Utilized for preparation of Sepharose with covelently bound anti-ICAM antibody.</td></tr><tr><td>MasterFlex tangential flow concentrator</td><td>Cole-Parmer</td><td>77601-60 7592-40</td><td>Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant</td></tr><tr><td>Centramate Lab Tangential Flow Systems</td><td>Pall Laboratory</td><td>FS002K10 OS010T12 FS005K10</td><td>Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant</td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>QIAGEN</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis tubing</td><td>Spectra/Por</td><td>131384</td><td></td></tr><tr><td>Papain from papaya latex</td><td>Sigma</td><td>P3125</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti-human antibody against CD107a</td><td>BD Bioscences</td><td>555798</td><td>Clone H4A3</td></tr><tr><td>Ansell Natural Blue Gloves</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-014-539</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Polypropylene Scissor-Type Forceps</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>6320-0010</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>ProZyme</td><td>SA10</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon TiE inverted microscope equipped with PFS for long-term image stability control, 60X oil objectives, 4 lasers with excitation lines at 405, 458, 488, 514, 561, and 640 nm, 2 GaAsP detectors and 2 high sensitivity PMTs, DIC transmitted light, Programmable X,Y,Z stage for multiple positions and stitching of large areas, time lapse functions, Tokai-Hit temperature and CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-controlled chamber for live imaging, and anti-vibration isolation table</td></tr><tr><td>TIRF microscope</td><td>Andor</td><td></td><td>Andor Revolution XD system equipped with Nikon TIRF-E illuminator, Lasers with 405,488,561 and 640 lines, DIC transmitted light, Yokogawa CSU-X1 spinning disk head for confocal imaging, 100/1.49 NA objective, Andor iXon X3 EM-CCD camera, objective heater, and a piezoelectric motorized stage with Perfect Focus System (PFS)</td></tr><tr><td>MetaMorph Premier Image Analysis Software</td><td>Molecular devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of the synaptic interface of primary human t cells from peripheral blood and lymphoid tissue

Dynamics mevcut anlayış ve yapısal özellikleri T-hücre sinaptik arayüzlerin düzlemsel bilayers Cam destekli ve vitrokullanımı ile büyük ölçüde kararlı olmuştur-türetilmiş T-Hücre klonlar ya da hatları1,2 ,3,4. Bu bulgular birincil insan T hücrelerine kan gelen izole veya lenfoid uygulamak nasıl dokular bilinmemektedir, hücre Analizi5için yeterli sayıda almak üzere kısmen önemli zorluklar nedeniyle. Burada bu bir teknik etkinleştirme ve adezyon molekülleri içeren düzlemsel lipid bilayers oluşturmak için çok kanallı akışı slaytlar istismar geliştirilmesi yoluyla ele. Akış slaytlar düşük yüksekliği hızlı hücre sedimantasyon hücre: bilayer eki, böylece araştırmacılar sinaptik arabirimi oluşumu dinamik ve granül yayın kinetik çalışmaya izin eşitlemek için teşvik etmektedir. Biz az 10 olarak sinaptik arabiriminin analiz etmek için bu yaklaşım uygulamak4 ' e 105 birincil cryopreserved T hücreler lenf düğümleri (içinde) ve periferik kan (PB) izole. Sonuçları ortaya çıkarmak roman düzlemsel lipid bilayer tekniği birincil insan T hücreleri kan ve doku bağlamında sağlık ve hastalık, türetilmiş biyofiziksel özelliklerini sağlar.

İlk olarak, biz aktif kordon kanı türevi CD8 tarafından kurulan sinaptik arabirimi yapısını göre+ T hücre lipid bilayers maruz inşa ikisinden biri içinde geleneksel büyük ölçekli akışı (bkz: ayrıntılı bilgi için Malzemeler tablo ) hücre sistemleri1 ,2,3,4 veya çok kanallı akışı slaytlar. Bilayers floresan ...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue at JoVE.com

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

Periferik kan ve lenf dokusu birincil insan T hücre sinaptik arabirimi değerlendirilmesi

Protokol düzlemsel lipid bilayers kullanarak sinaptik arabirimleri oluşturmak için birincil poliklonal insan T hücreleri yeteneklerini çalışmaya bir teknik anlatılmaktadır. İnsan birincil T hücreler lenf düğümleri ve periferik kan elde fark synapse oluşumu yeteneğini göstermek için bu tekniği kullanın.

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

assessment-synaptic-interface-primary-human-t-cells-from-peripheral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.4K Görüntüleme.  Thomas Jefferson University. Protokol düzlemsel lipid bilayers kullanarak sinaptik arabirimleri oluşturmak için birincil poliklonal insan T hücreleri yeteneklerini çalışmaya bir teknik anlatılmaktadır. İnsan birincil T hücreler lenf düğümleri ve periferik kan elde fark synapse oluşumu yeteneğini göstermek için bu tekniği kullanın.

Video: Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions of chromatin. These regions represent regulatory DNA elements (e.g., promoters, enhancers, locus control regions, insulators) to which transcription factors bind. Mapping the accessible chromatin landscape is a powerful approach for uncovering active regulatory elements across the genome. This information serves as an unbiased approach for discovering the network of relevant transcription factors and mechanisms of chromatin structure that govern gene expression programs. ATAC-seq is a robust and sensitive alternative to DNase I hypersensitivity analysis coupled with next-generation sequencing (DNase-seq) and formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE-seq) for genome-wide analysis of chromatin accessibility and to the sequencing of micrococcal nuclease-sensitive sites (MNase-seq) to determine nucleosome positioning. We present a detailed ATAC-seq protocol optimized for human primary immune cells i.e. CD4+ lymphocytes (T helper 1 (Th1) and Th2 cells). This comprehensive protocol begins with cell harvest, then describes the molecular procedure of chromatin tagmentation, sample preparation for next-generation sequencing, and also includes methods and considerations for the computational analyses used to interpret the results. Moreover, to save time and money, we introduced quality control measures to assess the ATAC-seq library prior to sequencing. Importantly, the principles presented in this protocol allow its adaptation to other human immune and non-immune primary cells and cell lines. These guidelines will also be useful for laboratories which are not proficient with next-generation sequencing methods.

Assay for Transposase-Accessible Chromatin coupled with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a genome-wide method to uncover accessible chromatin. This is a step-by-step ATAC-seq protocol, from molecular to the final computational analysis, optimized for human lymphocytes (Th1/Th2). This protocol can be adopted by researchers without prior experience in next-generation sequencing methods.

Birincil insan T lenfositler tarafından ataç-Seq genom genelinde erişilebilir Kromatin eşleme

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Genetik

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

İlköğretim İnsan naif ve Bellek T Hücreleri gelen İsteyerek Düzenleyici T Hücreleri Üretimi

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

A basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an ability to identify T cells based on their T cell antigen receptor (TCR) specificity. Many indirect methods are available in which a bulk population of T cells is stimulated in vitro with a specific antigen and epitope-specific T cells are identified through the measurement of a functional response such as proliferation, cytokine production, or expression of activation markers1. However, these methods only identify epitope-specific T cells exhibiting one of many possible functions, and they are not sensitive enough to detect epitope-specific T cells at naive precursor frequencies. A popular alternative is the TCR transgenic adoptive transfer model, in which monoclonal T cells from a TCR transgenic mouse are seeded into histocompatible hosts to create a large precursor population of epitope-specific T cells that can be easily tracked with the use of a congenic marker antibody2,3. While powerful, this method suffers from experimental artifacts associated with the unphysiological frequency of T cells with specificity for a single epitope4,5. Moreover, this system cannot be used to investigate the functional heterogeneity of epitope-specific T cell clones within a polyclonal population.
	The ideal way to study adaptive immunity should involve the direct detection of epitope-specific T cells from the endogenous T cell repertoire using a method that distinguishes TCR specificity solely by its binding to cognate peptide:MHC (pMHC) complexes. The use of pMHC tetramers and flow cytometry accomplishes this6, but is limited to the detection of high frequency populations of epitope-specific T cells only found following antigen-induced clonal expansion. In this protocol, we describe a method that coordinates the use of pMHC tetramers and magnetic cell enrichment technology to enable detection of extremely low frequency epitope-specific T cells from mouse lymphoid tissues3,7. With this technique, one can comprehensively track entire epitope-specific populations of endogenous T cells in mice at all stages of the immune response.

This protocol describes the use of peptide:MHC tetramers and magnetic microbeads to isolate low frequency populations of epitope-specific T cells and analyze them by flow cytometry. This method enables the direct study of endogenous T cell populations of interest from in vivo experimental systems.

Peptid: Epitop-spesifik T-hücrelerinin MHC tetramer bazlı Zenginleştirme

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

TCR-pMHC Bağlama Ölçüm<em&gt; In Situ</em&gt; Bir FRET tabanlı Mikroskopi Assay kullanılarak

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

Biyomühendislik

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Periferik Kan İnsan alloantijen-özgü T hücrelerinin üretilmesi

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Fenotipik Analizi ve İnsan Cilt lenfosit izolasyonu<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Hücre Kültürü

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

Görüntüleme İmmünoloji Synapse Dynamics için bir Endotel Hücre Modeli Düzlemsel

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

Akış Sitometresi Imaging kullanılarak insan sisteminde bağışıklık Synapse nitel ve nicel analiz

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Imaging the Human Immunological Synapse

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) and an effector helper T lymphocyte (Th) cell, and to record the images corresponding to the first stages of the IS formation and the subsequent trafficking events (occurring both in the APC and in the Th cell). These events will eventually lead to polarized secretion at the IS. In this protocol, Jurkat cells challenged with Staphylococcus enterotoxin E (SEE)-pulsed Raji cells as a cell synapse model was used, because of the closeness of this experimental system to the biological reality (Th cell-APC synaptic conjugates). The approach presented here involves cell-to-cell conjugation, time-lapse acquisition, wide-field fluorescence microscopy (WFFM) followed by image processing (post-acquisition deconvolution). This improves the signal-to-noise ratio (SNR) of the images, enhances the temporal resolution, allows the synchronized acquisition of several fluorochromes in emerging synaptic conjugates and decreases fluorescence bleaching. In addition, the protocol is well matched with the end point cell fixation protocols (paraformaldehyde, acetone or methanol), which would allow further immunofluorescence staining and analyses. This protocol is also compatible with laser scanning confocal microscopy (LSCM) and other state-of-the-art microscopy techniques. As a main caveat, only those T cell-APC boundaries (called IS interfaces) that were at the right 90&#176; angle to the focus plane along the Z-axis could be properly imaged and analyzed. Other experimental models exist that simplify imaging in the Z dimension and the following image analyses, but these approaches do not emulate the complex, irregular surface of an APC, and may promote non-physiological interactions in the IS. Thus, the experimental approach used here is suitable to reproduce and to confront some biological complexities occurring at the IS.

This protocol images both the immunological synapse formation and the subsequent polarized secretory traffic towards the immunological synapse. Cellular conjugates were formed between a superantigen-pulsed Raji cell (acting as an antigen-presenting cell) and a Jurkat clone (acting as an effector helper T lymphocyte).

İnsan İmmünolojik Sinaps Görüntüleme

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) ...

Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) soluble cytokines. T cells release two kinds of effector particles in response to activation: trans-synaptic vesicles (tSVs) and supramolecular attack particles, which transfer intercellular messengers and mediate cytotoxicity, respectively. These entities are quickly internalized by APCs engaged in physical contact with T cells, making their characterization daunting. This paper presents the protocol to fabricate and use Bead-Supported Lipid Bilayers (BSLBs) as antigen-presenting cell (APC) mimetics to capture and analyze these trans-synaptic particles. Also described are the protocols for the absolute measurements of protein densities on cell surfaces, the reconstitution of BSLBs with such physiological levels, and the flow cytometry procedure for tracking synaptic particle release by T cells. This protocol can be adapted to study the effects of individual proteins, complex ligand mixtures, pathogen virulence determinants, and drugs on the effector output of T cells, including helper T cells, cytotoxic T lymphocytes, regulatory T cells, and chimeric antigen receptor-expressing T cells (CART).

Here we present the protocol for the stepwise reconstitution of synthetic antigen-presenting cells using Bead-Supported Lipid Bilayers and their use to interrogate the synaptic output from activated T cells.

T Hücreli İmmün Sinapsların Partikül Çıkışını İncelemek için Boncuk Destekli Lipid Bilayerlerin Hazırlanması

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) ...

Periferik kan ve lenf dokusu birincil insan T hücre sinaptik arabirimi değerlendirilmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler