Name: lymphocyte isolation from human skin for phenotypic analysis and ex vivo cell culture
Uploaded: 2016-04-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture at JoVE.com

Sedef hastalarının deri biyopsileri nazik Dr. Andreas Koerber bilimsel kullanım için yazılı veya sözlü aydınlatılmış onam sonra (Essen, Almanya Üniversitesi Dermatoloji bölümü) tarafından verilmiştir. XH da NSFC 61263039 ve NSFC 11101321 tarafından desteklenmektedir.

NOT: sağlıklı bireylerden deri biyopsileri, bilimsel kullanım için yazılı veya sözlü aydınlatılmış onam sonra elektif plastik cerrahisi geçiren bireylerin karın cilt leftover elde edilmiştir. insan derisinin kullanımı onaylanmış ve oldu Radboud üniversite tıp merkezi, Nijmegen, Hollanda ve Almanya&#39;nın Essen Üniversitesi insan araştırma Tıbbi Etik Komiteleri tarafından belirlenen yönetmeliklere uygun olarak. İnsan Cilt gelen Tek Hücre süspansiyonları 1. Hazırlık (a Flow-kabinede Çalışma Steril sonraki Hücre Kültürü ise Gerekli) <ol><li> Hücre kültürü ortamı hazırlayın: Resim serumu RPMI 1640 + Penisilin / streptomisin (ml nihai konsantrasyonları, 100 ünite / 100 ug / ml) ile + piruvat (0.02 mM) ve Glutamax (0.02 mM) ilave edildi. </li><li> Tüm kültür ortamı hazırlayın: kültür ortamı, adım 1.1 +% 10 insan toplanan serumdan (HPS) hazırlanmıştır; 4 ° C&#39;de saklayın. Bizden önce 20 ° C ± 2 orta getiring. </li><li> Bir 4mm yuvarlak biyopsi yumruk aleti kullanılarak deri biyopsisi elde edilir ve en fazla 4 saat veya 4 ° C AÇIK 20 ° C ± 2 de 1640 tam kültür ortamında saklayın. Laboratuvarda girişte en kısa sürede biyopsi işleyin. NOT: Derinin uzun depolama hücresi verim ve hücre canlılığı etkileyecektir. </li><li> mavi kapaklı ayrışma tüp Etiket ve etiketli tüpe 5 ml tam kültür ortamı ekleyin. </li><li> steril 6 oyuklu kültür plakasının (toplam 3 delikleri şeklinde), her oyuğa tam kültür ortamı içinde 2 ml ilave edilir. böylece üç durulama toplam elde, tek bir kuyunun içine biyopsi yerleştirmek durulayın, ikinci kuyunun onu taşımak ve bu adımı bir kez daha tekrar etmek steril araçlarını kullanın. </li><li> Steril Petri kabı iyi durulanmalıdır deri biyopsisi transfer biyopsi üstünde tam kültür ortamı 100 ul ekleyin ve dikkatlice bir paslanmaz çelik tek kullanımlık steril neşter kullanılarak deri altı yağ dokusu kazıyın. NOT: Tholan kritik bir adımdır. </li><li> Steril bir Petri kabı 4 küçük parçalar halinde her cilt biyopsisi kesin. Aktarım örnekleri (kadar tüp başına 4 mm biyopsi dört) tam kültür ortamı içinde 5 ml ihtiva eden hazırlanan ayrıştırma tüpüne. </li><li> Sıkıca kapaklı tüpler kapatın ve otomatik doku ayrıştırıcı kovanına ters takın. Tüm örnek malzeme rotor bölgede yer olduğundan emin olun. </li><li> &quot;Program m_spleen _01&quot; 56 sn için uygun döner hızında biyopsi ayırmak (birlikte bir program kartına cihazın dahili hafızasında veya tarafından sağlanan önceden tanımlanmış bir program) çalıştırarak ayrılma işlemini başlatın. </li><li> işlendikten sonra, dissociator gelen ayrılma tüpü ayırmak ve tüm ayrışmış madde tüpün dibinde toplanan olduğundan emin olun. </li><li> 37 ° C&#39;de çalkalanan bir su banyosu içerisinde ayrıştırma tüpüne kolajenaz IA (80 mg / ml) ul 150 ilave edin ve örnek inkübe60 dakika ° C. thedissociation tüpüne DNaz I, 100 ul (5 MU / ml) ekleyin, iyice karıştırın. Not: kolajenaz ya da hücre canlılığında değiştirecek uzun kuluçka süresi yüksek konsantrasyonlarda eklenmiştir. </li><li> Otomatik doku ayrıştırıcı kovana ayrışma tüp takın ve Biyopsiyi bir kez daha ayırmak &quot;programı m_ dalak _01&quot; çalıştırın. </li><li> bir 50 ml Falcon tüpü üzerine 70 um naylon hücre süzgecinden yerleştirin. hücre kümeleri / doku enkaz kaldırmak için bu hücre süzgeç ayrışmış örnek malzemeleri uygulamak. </li><li> Tüm kültür ortamı, 5 ml ile bir kez hücre süzgecinden yıkayın. 20 ° &#39;de santrifüje C ± 2, 10 dakika ve aspirat yüzer 450 x g. </li><li> Yıkama adımı bir kez daha tekrarlayın. tam kültür ortamı içinde 300 ul tekrar süspansiyon hücre peletleri. Tek hücre süspansiyonları daha fazla analiz için hazırdır; ex vivo hücre kültürü için protokollerle devam etme veya akış sitometri analizine. </li><li> Daha fazla i halindentracellular sitokin boyama, 37 ° C de 4 saat PMA (12.5 ng / ml), İyonomisin (500 ng / ml) ve Brefeldine A (5 ug / ml) ve hücreleri uyarır,% 5 CO2 kuluçka akış uygulamadan önce 4 saat sitometri analizi. </li></ol> Cilt Resident T hücrelerinin 2. Poliklonal Aktivasyon (Ex Vivo Hücre Kültürü) <ol><li> Yuvarlak dipli 96 gözlü plaka içine kısım 100 ul tek hücre süspansiyonları, (adım 1.15 hazırlandı). Not: 4 mm deri biyopsisi her biri için, elde edilen tek hücre süspansiyonları, 96 oyuklu bir plakanın en az iki kuyu ayrılabilir. </li><li> anti-CD3 / anti-CD28 mAb ile kaplanmış mikrotaneler (oyuk başına 25,000 boncuk), rekombinant insan sitokin rlL-2 (nihai konsantrasyon 25 U / ml) ve rlL-1β (nihai konsantrasyon 50 ng / ml) eklenir. </li><li> % 5 CO2,% 100 nem, 37 inkübe iyi olarak işaretlenmiş levha kapak kültürü plakası Kapak C inkübatör °. orta renk sarıya döndüğünde orta değiştirin. <br/&gt; Not: Açık bir hücre kolonisi hücre kültürünün 8 gün arasında gözlemlenebilir. </li></ol> 3. İlköğretim Sitometrisi Analizi / kültürlü Cilt Resident T hücrelerinin <ol><li> PBS +% 0.2 BSA: FACS tampon hazırlayın. </li><li> V-tabanlı 96 oyuklu bir plakaya ilgi hücreleri aktarın. 20 ° C ± 2, 2 dakika boyunca 450 x g&#39;de santrifüj ve aspire yüzer. </li><li> 100 ul PBS içinde pelletini. 20 ° C ± 2, 2 dakika boyunca 450 x g&#39;de santrifüj ve aspire yüzer. </li><li> (: PBS kullanarak 1000 sulandırma 1), 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca sabitlenebilir canlılığı boya konjüge hazırlanmış eFluorescence780 100 ul Leke hücreleri. 20 ° C ± 2, 450 2 dakika boyunca x g ve aspire yüzer FACS tamponu santrifüj 100 ul ekle. </li><li> , Gerekli hücre yüzey markörü mAb seçin örneğin: CD45-BV421 (HI30, 1:20), CD3-ECD (UCHT1, 1:50), CD4-PC5.5 (1388,2, 1: 200), CD8-APC-AlexFluo700 (B9.11, 1: 400), CD14-FITC (TUK4, 1:50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-119, 1:50), CD56-PE (MEM-188, 1:50), CD25-PeCy7 (BC96, 1:50), CD11c-PeCy7 (BU15, 1:10) ve CD1c-APC (AD5-8E7, 1:10), test edilen her mAb seyreltme faktörüne göre FACS tamponu kullanılarak mAb-karışım hazırlayın. olmayan leke numunesi ile birlikte antikor izotip kontrolü kullanarak kapı ayarlarını tanımlayın. </li><li> Her kuyuya hazırlanan mAb-karışımının 25 ul ekle. ışıktan korumak, 20 ° C ± 2 20 dakika kuluçkalayın. </li><li> 20 ° C ± 2, 450 2 dakika boyunca x g ve aspire yüzer FACS tamponu santrifüj 100 ul ekle. </li><li> Sadece hücre yüzey boyama gerektiren numuneler için, adım 3.16 ile devam edin. </li><li> hücre içi Foxp3 boyama durumunda: <ol><li> seyrelticiler 3 parça ile, konsantratın bir kısım karıştırılarak tespit ve permeabilizasyon tamponu hazırlayın. </li><li> 1x permeabilization tampon hazırlayın: sterilize H 2 O 1 kısım 10x permeabilization tamponu + 9 parça </li></ol></li><li> fiksasyon ve permeabili 100 ul pelet tekraryon tamponu, iyice karıştırın ve 4 ° C&#39;de inkübe 30 dakika ° C. </li><li> 450 2 dakika boyunca oda sıcaklığında xg, ve aspirat yüzer her şey, santrifüj 100 ul permeabilizasyon tamponu ekleyin. </li><li> permeabilizasyon tamponu bir kez daha hücreleri yıkayın. </li><li> Örnek için gerekli hücre içi mAb seçin, Foxp3-eFluo450 (PCH101, 1:50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1, 1:50) ve IFNy-PeCy7 (4S.B3, 1: 400). Test edilen her bir mAb seyreltme faktörüne göre% 2 normal sıçan serumu içeren permeabilizasyon tamponu kullanılarak mAb&#39;ler karışım hazırlayın. olmayan leke numunesi ile birlikte antikor izotip kontrolü kullanarak kapı ayarlarını tanımlayın. </li><li> Her kuyuya hazırlanan mAb karışımı 20 ul ekle. 4 inkübe ışıktan korumak, 30 dakika boyunca ° C. </li><li> 30 dakika inkübasyondan sonra, her kuyuya permeabilizasyon tampon 100 ul ilave edin. 20 ° C ± 2, 2 dakika boyunca 450 x g&#39;de santrifüj ve aspire yüzer. </li><li> Permeabilization Buffe hücreleri yıkayınr bir kez daha. microFACS tüpe 110 FACS tampon ul, ve transfer hücre süspansiyonları içinde süspanse pelet. NOT: Örnek 10 renkli akım sitometri kullanarak ölçüm için hazırdır. </li><li> Gerekli olan tam hücre sayısı halinde hemen akış sitometrisi kullanılarak ölçümler önce her numune içine florosferlerin iyi karıştırılmış düzgün süspansiyonu 10 ul ekle. </li></ol>

<ol>
	<li>Clark, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vast+majority+of+CLA++T+cells+are+resident+in+normal+skin.">The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin.</a> J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).</li><li>Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+human+dermis+contains+distinct+populations+of+CD11c+BDCA-1++dendritic+cells+and+CD163+FXIIIA++macrophages.">Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages.</a> J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).</li><li>Gebhardt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+T+cells+in+nonlymphoid+tissue+that+provide+enhanced+local+immunity+during+infection+with+herpes+simplex+virus.">Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus.</a> Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).</li><li>Boyman, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+development+of+psoriasis+in+a+new+animal+model+shows+an+essential+role+for+resident+T+cells+and+tumor+necrosis+factor-alpha.">Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha.</a> J Exp Med. 199, 731-736 (2004).</li><li>Christophers, E., Mrowietz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+infiltrate+in+psoriasis.">The inflammatory infiltrate in psoriasis.</a> Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+infection+generates+non-migratory+memory+CD8++T(RM)+cells+providing+global+skin+immunity.">Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity.</a> Nature. 483, 227-231 (2012).</li><li>Havran, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+diversity+of+T-cell+receptor+gamma-chain+expression+of+murine+Thy-1++dendritic+epidermal+cells+revealed+by+V+gamma+3-specific+monoclonal+antibody.">Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).</li><li>Campbell, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7+expression+and+memory+T+cell+diversity+in+humans.">CCR7 expression and memory T cell diversity in humans.</a> J Immunol. 166, 877-884 (2001).</li><li>He, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+PKC+in+human+T+cells+using+sotrastaurin+(AEB071)+preserves+regulatory+T+cells+and+prevents+IL-17+production.">Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production.</a> J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).</li><li>Clark, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+isolation+of+skin+resident+T+cells+from+normal+and+diseased+human+skin.">A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin.</a> J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).</li><li>Clark, R. A., Kupper, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-15+and+dermal+fibroblasts+induce+proliferation+of+natural+regulatory+T+cells+isolated+from+human+skin.">IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin.</a> Blood. 109, 194-202 (2007).</li><li>Keijsers, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+induction+of+cutaneous+inflammation+results+in+the+accumulation+of+extracellular+trap-forming+neutrophils+expressing+RORgammat+and+IL-17.">In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17.</a> J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).</li><li>Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+dissociation+of+keratinocytes+from+human+skin+biopsies+for+in+vitro+cell+propagation.">Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation.</a> Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).</li><li>Hennino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-infiltrating+CD8++T+cells+initiate+atopic+dermatitis+lesions.">Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions.</a> J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada, verimli insan derisi biyopsi cilt yerleşik T hücrelerini izole etmek için bir protokol mevcut. Bu protokolün avantajı canlı lenfositlerinin nispeten yüksek sayılar izolasyon ve ilgili yüzey belirteçlerinin ifade. Belirlenen hücre alt edildi: CD11c + DH&#39;ler, CD4 + ve CD8 + T hücreleri ve Foxp3 + CD25 + hücreleri. Önemli olarak, izole edilmiş bir cilt yerleşik T hücrelerinin ex vivo kültür çok iyi uygulanabilir ve daha sonra fonksiyonel analiz için bırakıldı. İnsan deri dokuları yapısal bütünlüğünü korumak için işlev dışı yapışma proteinlerine ait enzimatik bozulmaya mekanik ayrışmayı birleştirerek tek hücre süspansiyonları olarak ayrışmış edilebilir. epidermis ve dermis dispase bazlı tabaka ayrışması bu söz konusu cilt katmanlarında hücre infiltrasyonu belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir yöntem olmasına rağmen, biz dispase tedavi t led farked CD25 ve CD27 hücre yüzey ifadesi büyük bir azalma (gösterilmemiştir). Bu belirteçler lenfosit alt kümelerini karakterize etmek için önemli olduğu gibi, biz dispase tedavi etkiler sonraki immünofenotıpleme inanıyoruz. Dakikada, T hücresi sayıları epidermis 10 içinde mevcut ise dermiş uzaklaştırılması T hücrelerinin büyük bir çoğunluğu dermis lokalize sağlıklı bireylerin deride, çünkü CD25 veya CD27 ifade eden hücrelerde gözlendi azaltılması için sorumlu olduğu olası değildir -12. İzole keratinositlerin çoğalması kapasitesine dispase zararlı etkisi daha önce 13 bildirilmiştir. hücre fonksiyonu çalışmanın amacı ise, bu nedenle, dispase ihtiyatlı kullanılması garanti edilir. Bizim protokolde biz deri biyopsisi tek hücre süspansiyonu elde etmek kollajenaz türünü kullanarak edilmiştir. Kollajenaz I kollajenaz IV ile karşılaştırıldığında yüksek triptik aktiviteye sahiptir ve dolayısıyla daha sert olmasına rağmen te olmuştur, çünkü biz bu özel kollajenaz seçmişHücre kültürü için uygunluğu açısından sted. Hücre kültürü için uygun olan bir kollajenaz IV kullanımı ayrıca mevcut protokol optimize etmek için sonraki bir adımda olabilir. Niteliği gereği, cilt germe kuvvetleri ve mekanik ayrıştırma karşı oldukça dirençlidir. Şimdiye kadar, insan derisinde bağışıklık hücrelerinin kapsamlı bir analiz nispeten sert sindirim protokolleri kullanırken yeterli hücre sayıları elde teknik zorlukları engel olmuştur. Sonuç olarak, bugüne kadar yayınlanmış çalışmaların çoğu immünohistokimyasal analizler güveniyor. Deri biyopsilerinin CD4 + T hücrelerinin doğrudan izolasyonu için hantal olarak kabul edilir. Alternatif cilt eksplant kullanımı kültürleri 10 üzerinden tarama olacaktır. Bununla birlikte, bu kültür 2-3 hafta alır ve cilt eksplant kültür ortamı spesifik T hücre alt takım tercih edilen tarama yol açabilecek sitokinler ve kemokinlerin seçilen bir dizi ihtiva etmektedir. Buna ek olarak, kültür süresi affec olabilirHücrelerin fenotip t. Geçerli protokol fenotipik ve doğrudan izolasyon sonra T hücre popülasyonlarının fonksiyonel çalışma hem etkinleştirme eklenen sitokinler ya da kemokinler ve CD4 (ve aynı zamanda diğer hücre belirteçleri) ifadesi de izolasyon sonra korunmuş kullanılmasını yapmaz. Bir ticari olarak temin edilebilen otomatik bir doku ayıracı bozulması hücre dışı matris için gerekli kolajenaz ile kuluçkada bekletildi, deri parçalarının ayrılması için kullanılmıştır. ekstrasellüler matriksin hücreleri sonraki serbest bırakılması için, otomatik ayıracı yeniden kullanılır. Cildin geniş manuel kesme (veriler gösterilmemiştir) benzer hücre sayıları elde rağmen, sonuçlar daha az tutarlı ve sanatçının deneyimi daha bağımlıdır. cihaz tarafından sunulan önceden belirlenmiş bir prosedür kullanılarak derinin ayrışma daha tekrarlanabilir sonuçlar verecek. Bu cilt gösteren çalışmalar ile uyumlu çeşitli l içeriyoreukocytes 2,14, CD11c + DH&#39;ler, CD8 + ve CD4 + T hücreleri alt takımlarının ve Foxp3 + hücreleri Burada sunulan protokol ile hazırlanan tek hücre popülasyonlarında gözlenmiştir. Önemli olarak, protokol uygulanabilir lenfositlerin nispeten yüksek bir verim elde edilir. Nedeniyle protokolün verimliliği, sadece tek bir 4 mm deri biyopsisi elde edilebilir sık ​​sık hasta malzeme, özellikle yararlıdır okuyan zaman. Yöntemi kullanarak, biz sedef hastalarının lezyonlu derisinden izole edilen T hücrelerinin sağlıklı bir cilt 9 ile karşılaştırıldığında, IL-17A ve IFNy üretmek için yüksek kapasite gösterdi göstermek başardık. Araştırma, söz bağlı olarak, bundan başka, tek hücre süspansiyonlarının hazırlanması sonra belirli hücre alt saflaştırmak için gerekli olabilir. Bu durumda, deri daha büyük parçaları alt analiz için yeterli hücrelerin verimini sağlamak için kullanılabilir. Bunu yaparken cildin daha küçük pi oyulmuş gerektiğini, emin olunizolasyon protokolü başlamadan önce x 2 mm yaklaşık 2 mm eces. Sonuç olarak, bu protokol, böylece deri immün yanıtlarda eden bilgi iyileştirilmesi, tek hücre düzeyinde anlamlı fenotipik ve fonksiyonel olarak çözümlenmesini kolaylaştıran, deri yerleşik hücreleri izole etmek için geliştirilmiş bir yol sunar. bir ayrıştırma tüpüne birden fazla biyopsi işleme, özellikle mevcut protokol kritik adım deri altı yağ dokusu doğru kaldırılması ve küçük parçalar halinde deri kesimi vardır. Yağ dokusu ve / veya büyük doku parçaları ayıracı yeniden çalışır soran düzgün çalışmamasına neden olur. Bu ciddi bir hücre canlılığı zarar verecektir. tekniğin sınırlama tek 4 mm deri biyopsisinden türetilmiş hücre sayısı hücrelerin alt kümelerinin daha sonra izolasyonu için yeterli olmasıdır.

cilt, vücut ve çevre arasındaki temel arayüz olarak, dış fiziksel, kimyasal ve yaralama, ultraviyole radyasyon ve mikro-organizmalar gibi biyolojik hakaretlerle karşı ilk savunma hattını sağlar. Cilt iki bölme, epidermis ve dermiş içerir ve Langerhans hücreleri, makrofajlar, dendritik hücreler (DC) ve yaklaşık 20 milyar bellek T hücreleri dahil olmak üzere bağışıklık hücreleri, çeşitli tüm kan hacmi 1 &#39;de yaklaşık iki katı sayıda mevcut içerir 2. Verilerin artan vücut deri doku homeostazında sırasında ve çeşitli patolojik durumlarda, hem temel immünolojik fonksiyonu vardır görüşünü desteklemektedir. Normal deride yerleşik bağışıklık hücreleri immüno 3 yapmak için düşünülen ve sedef 4 gibi iltihaplı bozuklukların gelişiminde bir rol oynadığı gösterilmiştir. Psöriatik lezyonlu deride, CD4 + ve CD8 + T hücrelerinin hem obs vardı sızmışerved ve CD4 ve CD8 oranı hastalığın durumu 5 bağlı olarak değişir gösterilmiştir. Bununla birlikte, hücrelerin bu popülasyonlar, mevcut tekniklerin sadece birkaç hücre yalıtılmasını için çalışma zordur. İnsan derisinden T hücre izolasyonu için şu anda yaygın olarak kullanılan teknikler enzimatik tedavi ile mekanik cilt ayrışmasını birleştirir. İnsan deri biyopsileri yoğun Tripsin, kolajenaz ve / veya EDTA 6-8 gibi enzimler ile inkübe edilir. Cilt germe kuvvetleri ve mekanik ayrıştırma yüksek dirençli bir bariyer doku olduğu göz önüne alındığında, T hücre izolasyon kurulan yöntemleri bu hücre popülasyonlarının zor ve ex vivo hücre kültürü yapar çok az hücre ve canlı hücrelerin daha düşük sayıda üretilen meydan okuma. Burada, mechan birleştirerek sağlıklı ve ilgili her iki psoriatik insan cildi lenfositlerin izole edilmesi için bir tadil edilmiş yöntem raporenzimatik sindirim kolajenaz ile birlikte otomatik bir doku Dissociator yerine yoğun kıyma kurulan yöntemi kullanarak deri iCal&#39;ın ayrışma. DH&#39;ler ve T hücrelerini içeren çeşitli canlı immün hücre alt tek bir hücre süspansiyonunun hazırlanması sonra görülmüştür. Önemli yüzey markörlerinin CD3, CD4 ve CD8 salgılanma iyi korunmuştur. Bu şekilde hazırlanan hücreler, ex vivo hücre kültürleri veya akış sitometrik analizinde kullanım için hazırdır. Bu protokol başarıyla sedef hastalarının lezyonlu deride türetilmiş tek cilt biyopsisi (4 mm) analizi için istihdam edilmiştir. Sonuçlar cilt ikamet hasta T hücreleri sağlıklı gönüllülere 9 karşılaştırıldığında IL-17 ve IFNy gibi daha inflamatuar sitokinler üretilen gösterdi.

<table><tbody><tr><td>Disposable Biopsy Punch</td><td>Kai Europe</td><td>BP-40F</td><td>4 mm</td></tr><tr><td>Disposable sterile scalpels</td><td>Dalhausen</td><td>1100000510</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C tube</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-237</td><td>Blue-capped, used as the dissociation tube.</td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-235</td><td>Automated tissue dissociator. Using the &quot;program spleen_01&quot; for dissociation of the skin biopsy.</td></tr><tr><td>Cell strainer&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>352350</td><td>70 &amp;micro;m nylon</td></tr><tr><td>96-well U-bottom plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650180</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>22409-015</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Human Pooled Serum (HPS)</td><td>in house prepared</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2674</td><td>Type 1-A, suitable for cell culture</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>B Braun</td><td>3623140</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-18</td><td>Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1,000</td></tr><tr><td>Fixation/Permeabilization Concentrate</td><td>eBioscience</td><td>00-5123-43</td><td></td></tr><tr><td>Fixation/Permeabilization Diluent</td><td>eBioscience</td><td>00-5223-56</td><td></td></tr><tr><td>Permeabilization Buffer (10x)</td><td>eBioscience</td><td>00-8333-56</td><td></td></tr><tr><td>BV421 Mouse anti-human CD45</td><td>BD</td><td>563879</td><td>Clone: HI30; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>FITC Mouse anti-human CD14</td><td>Dako</td><td>T0844</td><td>Clone: TUK4; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>PE Mouse anti-human CD56</td><td>Dako</td><td>R7127</td><td>Clone: MOC-1; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>ECD Mouse anti-human CD3</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A07748</td><td>Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining.</td></tr><tr><td>PC5.5 Mouse anti-human CD4</td><td>Beckman - Coulter</td><td>B16491</td><td>Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200</td></tr><tr><td>PeCy7 Mouse anti-human CD11c</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A80249</td><td>Clone: BU15; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>APC Mouse anti-human CD1c</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-903</td><td>Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10</td></tr><tr><td>APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A66332</td><td>Clone: B9.11; dilution factor 1:400</td></tr><tr><td>APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A94681</td><td>Clone: J3-119; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>PeCy7 Mouse anti-human CD25</td><td>eBioscience</td><td>AD5-8E7</td><td>Clone: BC96; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;PE Rat anti-human CLA</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-635</td><td>clone: HECA-452; dilution factor 1:</td></tr><tr><td>eFluo450 Rat anti-human Foxp3</td><td>eBIoscience</td><td>48-4776-42</td><td>Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A</td><td>eBioscience</td><td>53-7179-42</td><td>Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>PeCy7 Mouse anti-human IFNg</td><td>eBioscience</td><td>25-7319-41</td><td>Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400</td></tr><tr><td>Flow-Count Fluorospheres</td><td>Beckman - Coulter</td><td>7547053</td><td>Counting beads, for flow cytometry</td></tr></tbody></table>

lymphocyte isolation from human skin for phenotypic analysis and ex vivo cell culture

İnsan derisi önemli bir bariyer işlevi vardır ve patojenlerin doku homeostazında ve korunmasına katkıda çeşitli bağışıklık hücrelerini içerir. Cilt erişimi nispeten kolay olduğundan, periferik immün düzenleyici mekanizmaları incelemek için ideal bir platform sağlar. aynı zamanda bağışıklık yerleşik sağlıklı deri Davranış immüno hücrelerin ancak, sedef hastalığı gibi iltihaplı deri hastalıklarının gelişiminde önemli bir rol oynar. Gelişmekte olan anlayışlar rağmen, çeşitli iltihaplı cilt hastalıkları altında yatan biyolojinin anlayışımız hala sınırlıdır. biyopsi yapılan deri numunelerinden izole kaliteli (tek) hücre popülasyonları için bir ihtiyaç vardır. Şimdiye kadar, izolasyon prosedürleri ciddi canlı hücre yeterli sayıda elde eksikliği ile engellenmiştir edilmiştir. İzolasyon ve sonraki analizler nedeniyle de elde etmek için geçerli ayrılma işlemleri nedeniyle mekanik ve kimyasal strese, immün hücre soyu belirteçleri kaybı etkilenmişTek hücre süspansiyonu. Burada, otomatik bir doku aynştıncı ve kollajenaz muamelesi ile mekanik deri ayrışmasını birleştirerek sağlıklı ve ilgili her iki psoriatik insan deri T hücrelerinin izole edilmesi için bir tadil edilmiş yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, tek hücre süspansiyonlarının hazırlanması üzerine, CD4, CD8, Foxp3 ve CD11c gibi en bağışıklık soy işaretlerinin ifadesi korur. Başarılı CD4 + T hücre izolasyonu ve sonraki fenotipik ve fonksiyonel analiz örnekleri gösterilmiştir.

Burada sunulan protokol, tek bir 4 mm deri biyopsisi kullanırken 760 ± 178.000 kadar 615 (± SEM, sağlıklı gönüllülerin cilt demek) ± 2.200 arasında insan derisinden canlı lenfositler (± SEM, sedef hastalarının lezyonlu deriye ortalama) verecektir. CD45 + hücrelerinin farklı CD4 + T hücreleri (~% 45), CD8 + T hücreleri (% 30) da dahil olmak üzere, sağlıklı bireylerin derisinden türetilen tek hücre süspansiyonları olarak tanımlanır ve CD11c + DH&#39;ler (yaklaşık% 5 bulundu ), birkaç B hücreleri (CD19 +), NK hücreleri (CD56 +, CD3 ise -) veya monosit / makrofajlar (CD14 + veya CD1c +) gözlendi (Şekil 1A). Yöntem, insan deri biyopsilerinde CD4 + CD25 + Foxp3 + hücrelerinin analizi sağlar. sabitlemek ve geçirgenliği sonrası hücre içi boyama kullanılarak, transkripsiyon FAC ekspresyonunu göstermek mümkündürCD25 + T hücrelerinin tor Foxp3 (Şekil 1A). insan derisi biyopsilerin türetilen tek hücre süspansiyonları, (veriler gösterilmemiştir) FL1 (FITC), FL2 (PE), FL3 (ECD) FL9 (Pasifik mavi) ve FL10 (krom portakal), bir Sitometreyi kullanarak kanal yüksek bir otofloresan arka planı oldukça gösterdiğinden . Lenfosit popülasyonunun doğru analizi için, biz bu nedenle lenfosit nüfus ve autofluorescent hücre popülasyonu (Şekil 1B) dışlanması yolluk için Parlak Violet 421 florokromla konjuge anti-insan CD45 mAb kullanılmasını öneriyoruz. Insan derisi yerleşik hücrelerin çoğunluğu CD3 + T hücreleri (Şekil 1 C) idi. Hücre canlılığı, analiz için ölü / ölmekte olan hücre (Şekil 1C) arasında uygulanabilir ayırt etmek için bir tamir edilebilir canlılığı boya kullanılması tavsiye edilir. 7.7 (Ortalama ± SD) canlı hücreler ± 65.3% olarak genellikle bu protokol sonuçları. veri akış sitometre daha fazla analiz için, ADVIS olduğuölü ya da ölmekte olan hücrelerin beri canlı hücre nüfus kapı, ed kendi hücre membran bütünlüğünü kaybeder ve non-spesifik böylece arka plan boyama artan konjuge antikor bağlayabilirsiniz. Bu protokol ile izole edilmiş T hücreleri, fonksiyonel analiz için son derece uygundur. Sedef hastalarının lezyonlardan tek 4 mm biyopsi kullanılarak, biyopsisi alınan T-hücreleri, brefeldin A varlığında, PMA / ionomisin ile uyarma 4 saat (Şekil 2), aşağıdaki, IL-17A ve IFNy ürettiği gösterilmiştir. Dahil Psoryatik deri lezyonları taze hazırlanmış tek hücreli cilt süspansiyonlar ayrıca ex vivo hücre kültüründe ve daha sonra fonksiyonel analiz için de kullanılabilir. Pro-inflamatuar sitokinler, IL-1β veya IL-23 8 gün mevcudiyetinde, anti-CD3 / anti-CD28 mAb ile kaplanmış mikro-poliklonal stimülasyon sonrasında Genişletmenin ardından, hücreler örneğin, kendi cytok için analiz edilebilirine kapasitesi (Şekil 3) üretir. Bu şekilde, sağlıklı ve Psoriasis derisinden türetilen hücrelerin sitokin üretimi potansiyeli arasında açık bir fark gözlenmiştir. psoriatik bulunan bireylerden alınan T hücrelerinin sedef ilişkili sitokinler IL17A ve IFNy üretimi için çok daha yüksek bir kapasite göstermiştir. Bu durum, ex vivo kültür sonra prototipik sedef sitokin fenotipi yoktur sağlıklı kontrol durumunda muhafaza edilmesi anlamına gelir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52564/52564fig1.jpg" /> Şekil 1:. Lökositlerin farklı tipleri metinde tarif edilen protokol kullanılarak izole sağlıklı bireylerin Cilt yerleşik lenfositlerin derisinden türetilen tek hücre süspansiyonları olarak tanımlanır ilgi artı tamir edilebilir canlılığı, boyanın florokrom-konjuge mAb&#39;ler ile boyanmış ve hemen analiz edildi akım sitometri. (A) Akış cyCD4 +, CD8 + ve CD25 + Foxp3 Cilt yerleşik lenfositler içinde + alt - monositler (CD14), DCler (CD11c), B hücreleri (CD19), NK hücreleri (CD56 +, CD3) arasında tometric tespiti. Anti-insan CD45 / BV421 mAb otofloresan hücrelerinden lenfositleri ayırır. CD45 + hücreleri için kullanılan yolluk stratejileri (B) &#39;de gösterilmektedir. Izole edildikten sonra uygun bir CD45 +, CD3 + T hücreleri (C) yüzdesi. Sayı pozitif hücrelerin yüzdesini gösterir. Üç farklı deneyler / donör dışında bir temsilci deney gösterilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52564/52564fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/52564/52564fig2.jpg" /> Şekil 2: sedef hastalarının lezyonlu deride türetilen T hücreleri süredence, IL-17A ve IFNy. Tek bir 4 mm deri biyopsisi ağızdan üzerine sedef hastanın lezyonlu deride alınan veya bilimsel kullanım için bilgilendirilmiş onam yazılmıştır. Cilt yerleşik T hücreleri metinde tarif edilen protokol kullanılarak izole edilmiştir. Cilt ikamet T hücreleri tarafından IL-17A ve IFNy üretimi. Brefeldin A varlığında, PMA / ionomisin ile 4 saat uyarılmasına tepki olarak sitokinlerin hücre içinde birikmesine akış sitometresi ile ölçüldü. sitokin-pozitif hücrelerin yüzdesi gösterilmektedir. Üç farklı hastanın verileri gösterilmektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52564/52564fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52564/52564fig3.jpg" /> Şekil 3: Cilt yerleşik T hücreleri, IL-17A ve IFNy aşağıdaki ex vivo üretme yeteneğine sahiptir <stSağlıklı veya sedef hastanın 4 mm deri biyopsisinden türetilmiş Rong&gt; poliklonal uyarım. Cilt yerleşik hücreler, metinde tanımlanan protokol kullanılarak hazırlanmıştır. Daha sonra, hücreler, İL-1 P, ya mevcudiyetinde, anti-CD3 / anti-CD28 mAb ile kaplanmış mikro-(50 ng / ml, A) ya da IL-23 (50 ng / ml, B) 8 gün ile uyarıldı. Daha sonra, hücreler Brefeldin A varlığında, PMA / ionomisin ile 4 saat uyarıldı ve daha sonra akış sitometrisi ile, hücre içi sitokin üretimi için analiz edilmiştir. Üç bağımsız deney / donör dışında temsili bir örneği gösterilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52564/52564fig3highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture at JoVE.com

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Fenotipik Analizi ve İnsan Cilt lenfosit izolasyonu<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Hücre Kültürü

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

lymphocyte-isolation-from-human-skin-for-phenotypic-analysis-ex-vivo

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

14.5K Görüntüleme.  Radboud University Medical Centre. We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Video: Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

Göç İnsan T Lenfosit İzolasyon, Kültür ve Analiz In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation of Papillary and Reticular Fibroblasts from Human Skin by Fluorescence-activated Cell Sorting

Fibroblasts are a highly heterogeneous cell population implicated in the pathogenesis of many human diseases. In human skin dermis, fibroblasts have traditionally been attributed to the superficial papillary or lower reticular dermis according to their histological localization. In mouse dermis, papillary and reticular fibroblasts originate from two different lineages with diverging functions regarding physiological and pathological processes and a distinct cell surface marker expression profile by which they can be distinguished.
Importantly, evidence from explant cultures from superficial and lower dermal layers suggest that at least two functionally distinct dermal fibroblasts lineages exist in human skin dermis as well. However, unlike for mouse skin, cell surface markers enabling the discrimination of different fibroblast subsets have not yet been established for human skin. We developed a novel protocol for the isolation of human papillary and reticular fibroblast populations via fluorescence-activated cell sorting (FACS) using the two cell surface markers Fibroblast Activation Protein (FAP) and Thymocyte antigen 1 (Thy1)/CD90. This method enables the isolation of pure fibroblast subsets without in vitro manipulation, which was shown to affect gene expression, thus permitting accurate functional analysis of human dermal fibroblast subsets in regard to tissue homeostasis or disease pathology.

This manuscript describes a FACS-based protocol for isolation of papillary and reticular fibroblasts from human skin. It circumvents in vitro culture which was inevitable with the commonly used isolation protocol via explant cultures. The emanating fibroblast subsets are functionally distinct and display differential gene expression and localization within the dermis.

Floresan-aktif hücre sıralama ile ınsan derisinden papiller ve Reiküler fibroblastların izolasyonu

Fibroblasts are a highly heterogeneous cell population implicated in the pathogenesis of many human diseases. In human skin dermis, fibroblasts have ...

Genetik

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

Fare Genital Sistemlerinin Mukozanin gelen Lenfosit İzolasyonu

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Enzimatik Digest ve Gradient Ayırma kullanma Fare Skin gelen sızan lökositlerin İzolasyonu

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

İzolasyon ve murin lenfositlerin aktivasyonu

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

Çoklu-parametre floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma İnsan lenfatik endotel hücreleri İzolasyonu

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Tıp

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

İnsan Cilt Yetişkin Epitel Kök Hücre İzolasyonu ve Kültür

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Biyoloji

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid enzymatic dissociation of skin. Primary keratinocytes, fibroblasts, and Schwann cells are all harvested from the human newborn foreskin, which is available following standard of care procedures. The removed skin is disinfected, and the subcutaneous fat and muscle are removed using a scalpel. The method consists of enzymatic and mechanical separation of epidermal and dermal layers, followed by additional enzymatic digestion to obtain single-cell suspensions from each of these skin layers. Finally, single cells are grown in appropriate cell culture media following standard cell culture protocols to maintain growth and viability over weeks. Together, this simple protocol allows isolation, culturing, and characterization of all three cell types from a single piece of skin for in vitro evaluation of skin-nerve models. Additionally, these cells can be used together in co-cultures to gauge their effects on each other and their responses to in vitro trauma in the form of scratches performed robotically in the culture associated with wound healing.

The study of wound healing associated with musculoskeletal injury often requires the assessment of in vitro interactions between Schwann cells (SCs), keratinocytes, and fibroblasts. This protocol describes the isolation, culturing, and characterization of these primary cells from the human foreskin.

İnsan Sünnet Derisinden Primer Schwann Hücrelerinin, Keratinositlerin ve Fibroblastların İzolasyonu, Kültürü ve Karakterizasyonu

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

Nörobilim

Human Skin Keratinocyte Isolation: A Method to Culture Primary Keratinocytes from Skin Samples

Johansen, C. et al. <a href="https://www.jove.com/v/56863"> Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin</a>. J. Vis. Exp. (2017)
This video describes the isolation of keratinocytes&#8212;the most prominent cells of human skin&#39;s epidermal layer, by employing a combination of enzymatic digestion and mechanical disruption methods. This method helps in the preferential growth of keratinocytes over other skin cell types using a selective growth medium.

İnsan Derisi Keratinosit İzolasyonu: Deri Örneklerinden Primer Keratinositlerin Kültürlenmesinde Bir Yöntem

Johansen, C. et al.  Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin. J. Vis. Exp. (2017)
This video describes the isolation of ...

Fenotipik Analizi ve İnsan Cilt lenfosit izolasyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Göç İnsan T Lenfosit İzolasyon, Kültür ve Analiz In Vitro