Yazarlar Dr Schütze sunulan Yöntem kurma onun yardım için teşekkür ederiz ve Dr Zoller değerli giriş için uygun kalibrasyon aralığı ile ilgili. Yazarlar da kütle spektrometresi tesisinin teknik personel kabul.

Not: Bu bir duman mahallede metanol gibi organik çözücü işlerken çalışmak için tavsiye edilir. Tüm arabellekleri ve mobil aşamaları hacimsel şişeler içinde hazır olun. Başka şekilde belirtildiği takdirde çözümleri oda sıcaklığında 1 ay sonra hazırlık için saklanır.
1. hazırlanması Kalibratörler ve kalite kontrol örnekleri
Not: Stok ve spike çözümleri hazırlanması için karşılık gelen bir veri analizi sayfasında Ek dosyaverilir. İzlenebilirlik nedenlerden dolayı üretici, katalog numarası ve bir lot numarası her antibiyotik karşılık gelen sütunları ekleyin. 4 ° C soğuk depoda tüm antibiyotiklere dağıtılması ve çalışma zamanı olabildiğince kısa tutmak.
<ol><li>100 mL % 25 metanol su hazırlamak: mutlak metanol ile 25 mL 100 mL volumetric flask prefill ve ilâ 100 mL distile su ile doldurun.</li>
	<li>10 mL suda 200 mM asetik asitin hazırlamak: 10 mL volumetric flask HPLC sınıf su ile 9 mL prefill, buzul asetik asit (% 99.5 saflıkta, 17.4 M) 115 µL eklemek ve distile su ilave 10 mL.</li>
	<li>25 mL suda ıslatın ve 20 mM asetik asit % 25 metanol hazırlamak: 2.5 mL sulu 200 mM asetik asit çözeltisi ile 25 mL volumetric flask prefill, mutlak metanol 6.25 mL ekleyin ve şişeye 25 ml distile su ile doldurunuz.</li>
	<li>15 mL konik tüpler antibiyotik uygun miktarda Ek dosya Başlangıç Ağırlıksütun içinde açıklandığı gibi tartmak için bir hassas ölçek kullanın.</li>
	<li>Fluorkinonlar, Siprofloksasin ve 20 mM asetik asit de dahil olmak üzere % 25 metanol-su moxifloxacin hisse senedi çözümleri hazırlayın. Bunu yapmak için ilgili birimin ağırlıklı miktarları "son hacim" sütununa Ek dosya açıklandığı gibi ekleyin. Hızla bir ultrason banyo 2 min için ve yoğun vortexing tarafından florokinolon antibiyotik geçiyoruz.</li>
	<li>Cefepime, meropenem, linezolid ve piperacillin % 25 metanol suda hisse senedi çözümleri hazırlayın. Bunu yapmak için ilgili birimin ağırlıklı miktarları Ek dosya sütun son hacim içinde açıklandığı gibi ekleyin ve hızla antibiyotikler tarafından yoğun vortexing geçiyoruz. Meropenem son madde olarak geçiyoruz.</li>
	<li>Tüm antibiyotiklere hisse senedi çözümleri on kat konsantre spike-çözümler vermeye Ek dosya karşılık gelen hisse senedi çözüm hacmi grafikte açıklandığı gibi birleştirin.</li>
	<li>Uyuşturucu ücretsiz serum dokuz birimleri ile serum Kalibratörler 0-7 elde etmek için on kat konsantre spike çözümleri bir güç spike ve kalite kontrol (QC) A – ö. Örneğin, 10 mL polipropilen tüp içinde serum 4.5 mL 0.5 mL spike çözeltisi ekleyin ve 15 dakika 50 rpm bir silindir karıştırıcı 4 ° C soğuk depoda kuluçkaya.</li>
	<li>Tekrarlayan bir pipet Kalibratörler ve QCs 100 µL aliquots 1,5 mL polipropilen tüplerde oluşturmak için kullanın.</li>
	<li>Kalibratörler, kalite kontrol ve-80 ° C'de antibiyotik hisse senedi çözümler altı aya kadar depolar.</li>
	<li>Her antibiyotik için Ayrıca 1000 mg/L tek bir antibiyotik içeren bir temiz çözüm hazırlayın. (Örneğin, Siprofloksasin, % 25 metanol-su kullanımı da dahil olmak üzere 20 mM asetik asit için) uygun bir eritici karşılık gelen hisse senedi çözümle sulandırmak. Not: Düzgün antibiyotik çözümleri araç ayarlamak için gerekli olan sadece.</li>
</ol>2. kendi standartlarına karışımı hazırlanması
Not: Kendi standartlarına izotop etiketli karşıtları, bir örnek için örnek temizleme sırasında eklenen analitler ilgi vardır. Kendi standartlarına etiketlenmemiş karşılıkları için hemen hemen aynı genel olarak Fizikokimyasal özellikleri gibi belirli bir örnek matris etkileri için telafi etmek.
<ol><li>Bir 10 mL sallamak şişesi 5 mL mutlak metanol de ekleyerek 10 mL % 50 metanol su hazırlamak ve ilâ 10 mL distile su ile doldurun.</li>
	<li>10 mL % 50 metanol 20 mM asetik asit de dahil olmak üzere su hazırlamak. Bunu yapmak için bir 10 mL şişesi 200 mM asetik asit 1 mL ekleyin, mutlak metanol 5 mL ekleyin ve ilâ 10 mL distile su ile doldurun.</li>
	<li>1000 mg/L doğrudan üretici tarafından sağlanan şişeleri ile kendi standartlarına (IS) hisse senedi çözümler üretmek. Cefepime -13C12D3 sülfat distile su, meropenem-D6, linezolid-D3ve piperacillin-D%5 50 metanol-su çözümünde geçiyoruz. 20 mM asetat ve moxifloxacin hidroklorid -13C1D3 ' te 20 mM asetat ile distile su ile Siprofloksasin-D%8 50 metanol-suda çözülür.</li>
	<li>Beş kat yoğun iç standart karışımı vermeye 1,5 mL polipropilen boru IS hisse senedi çözümlerinde birleştirin. Cefepime -13C12D3, meropenem-D6, Siprofloksasin-D8, moxifloxacin hidroklorid -13C1D3, 2 µL linezolid-d 2 µL 1 µL 10 µL 10 µL Ekle 3ve piperacillin-D5 965 µL % 25 metanol-su için 10 µL.</li>
	<li>İç standart stok çözümleri ve beş kat konsantre IS karışımı-80 ° C'de depolayın</li>
</ol>3. hasta örnek depolama
Not: serum kısa sürede elde edilir ve donmuş numuneler soğuk zincir korunur sağlamak.
<ol><li>Tam kan serumu koleksiyonu tüpler toplamak.</li>
	<li>Kan pıhtısı 20-30 dakika oda sıcaklığında izin.</li>
	<li>Serum Santrifüjü 2.000 x g 10 dk de tarafından kandan ayırın.</li>
	<li>Süpernatant temiz polipropilen boru için transfer.</li>
	<li>Bu denetlesinler kadar serum-80 ° C'de altı ay depolama yapar. Alternatif olarak, örnekleri-20 ° C'de 3 gün depolama yapar</li>
</ol>4. kromatografi için arabellek hazırlık
<ol><li>1 M amonyum Formiat su hazırlamak için 100 mL 100 mL sallamak şişesi kullanarak HPLC sınıf su amonyum Format 6.306 g geçiyoruz. 4 ° C'de 1 ay çözüm depolama yapar</li>
	<li>Belgili tanımlık hareket eden hazırlamak [10 mM amonyum Format] su formik asit (99.9:0.1 v/v) aşama. 1000 mL volumetric flask yaklaşık 500 mL HPLC sınıf su prefill, formik asitin 1 mL ve 10 mL 1 M amonyum Formiat çözeltisi ekleyin ve 1000 mL HPLC sınıf su ile doldurun. Mobil faz A temiz cam şişe aktarmak ve HPLC sisteme bağlayın. Mağaza oda sıcaklığında 2 hafta kadar bir mobil faz.</li>
	<li>Mobil faz B. Transfer HPLC Sınıf mutlak metanol temiz cam şişe içine hazırlamak ve HPLC sisteme bağlayın.</li>
	<li>İğne solvent yıkama ve karşılık gelen tüp mobil faz B. içeren cam şişe bağlanmak gibi mutlak metanol kullanın</li>
	<li>Mühür ve tasfiye çözücü metanol-su-formik asitin esterleri (7:92.9:0.1, v/v/v) oluşturur. 1000 mL volumetric flask yaklaşık 500 mL distile su prefill, mutlak metanol, formik asit, 1 mL 70 mL ekleyin ve 1000 mL distile su ekleyin. Çözücü bir temiz cam şişe aktarmak ve HPLC sistemi ile bağlayın. Not: Çeşitli Otomatik Örnekleyici Sistemleri hem güçlü ve zayıf iğne yıkama çözücü kullanın. Böyle bir durumda yıkama çözümler üreticinin önerilerini göre hazırlayın. Örneğin, metanol-su-isopropylic alkol (70:20:10, v/v/v) ile güçlü yıkama ve su-metanol (95:5, v/v) ile zayıf yıkama yapın.</li>
</ol>5. araç ayarlama
Not: Belirli bir kütle spektrometre yöntemi up için bu adım gerçekleştirilir.
<ol><li>Temiz 1000 mg/L analit ve iç standart çözümler 1:10 veya 1: 100 Dedektör sinyal şiddetlerde bağlı olarak mobil faz A ve B (50: 50, v/v), bir karışımı oranında seyreltin. Autotune fonksiyonu ile kütle spektrometre ayar ya da aşağıdaki ana-kız iyonları geçişler14için elle ayarlama yapmak: cefepime (481.0 > 167.0/395.7), cefepime -13C12D3 (485.1 > 167.1 / 400,0), meropenem (384.1 > 114.0/141.0), meropenem-D6 (390.1 > 114.0/147.2), Siprofloksasin (332.0 > 231.0/245.0), Siprofloksasin-D8 (340.1 > 235.1/249.3), moxifloxacin (402.0 > 261.0/383.9), moxifloxacin-13 C1D3 (406.1 > 265.1/388.0), linezolid (338.0 > 235.0/296.0), linezolid-D3 (341.1 > 235.1/297.1), piperacillin (518.0 > 143.0/358.9) ve piperacillin-D5 (523.1 > 142.8/364.1).</li>
	<li>Autotuning ile aletleri için autotune fonksiyonu dedektörleri ile gerilim ve MS giriş ayarlarını otomatik olarak ayarlamak için kullanın.</li>
	<li>Optimum (genellikle maksimum) kadar (Örneğin, çarpışma gerilim ve çarpışma enerji) ayarları elle ayarlama ile aletleri ayarlamak için sinyal yoğunluğu için her üst ve kızı iyon detektörü, elde edilir. Örneğin, bir karıştırma tee takın, mobil faz A ve B (50: 50, v/v) 0.5 mL/dk teslim ve sürekli olarak temiz antibiyotik veya iç standart 0.1 mL/dk debi ile demlemek.</li>
</ol>6. HPLC-MS/MS Set-up
Not: Özellikleri kütle spektrometre, HPLC sistemi (Otomatik Örnekleyici dahil olmak üzere) ve karşılık gelen yazılım üreticisine bağlıdır. Kütle Spektrometre parametreleri ve yıkama yordamı üreticinin önerilerini göre adapte.
<ol><li>Kütle Spektrometre parametreleri karşılık gelen içinde saklamak 'MS ayar dosyası '. Electrospray iyonlaşma olumlu modunda (ESI +) bütün analitler için kullanın. İyon kaynağı ayarları için kullanılan araç uyum (Örneğin, 1.5 kılcal bir gerilim kV, kaynak sıcaklığı 120 ° c, 400 ° C desolvation sıcaklığını, 600 L/h bir desolvation gaz debisi, bir RF objektif voltaj 0.1 V ve 80 MS Işınma Zamanı).</li>
	<li>Analit ve kendi standartlarına ayar parametreleri (Örneğin, kapiller gerilim, çarpışma enerji) belirtin bir 'MS dosya '.</li>
	<li>Otomatik Örnekleyici koşulları aşağıdaki gibi olarak ayarla 'giriş dosyası ': numune sıcaklığı 10 ° c ile bir limit ± 5 ° C; 1 x tasfiye-yıkama-tasfiye ile 600 µL, yıkama sırası birim yedek temizle.</li>
	<li>Yukarıda bahsedilen içinde 'giriş dosyası ', set akış oranı 0,4 veya 0.5 mL/dak, çalışma süresi 4 dk, 345 bar basınç yüksek limit ve sütun sıcaklığı 30 ° c ± sınırı ile 5 ° C. Mobil Aşama A ve B solvent adını ekleyin ve bunları sırasıyla % 7 B/93% A, ayarlayın.</li>
	<li>Kromatografik degradede programı 'giriş dosyası ' aşağıdaki gibi: 0.00-0,10 min % 7 mobil faz B/93% A, 0.11-0,60 ile min ile % 65 mobil faz B/35% A, 0.61-2,10 min % 95 mobil faz B/5% A, 2.11-4,00 min % 7 mobil faz B/93% A. ile Not: Ekstra-sütun hacim, soygun birimi enstrümantal platform ve USP < 621 > Kromatografi kılavuz16açıklandığı gibi analit saklama faktörler için hesaplayın.</li>
</ol>7. örnek ölçüm ana dosyası
Not: İle 'örnek ölçüm ana dosya ', hasta numuneleri belirtilir, HPLC-MS/MS Analizi başlatılır ve veri değerlendirme gerçekleştirilir. Düşük ve yüksek kalite kontrol çift de dahil olmak üzere iki ayrı şablon dosyaları oluşturulur; bir şablon QC çift A ve C, diğer bir QC çift B ve d içerir
<ol><li>Yeni bir 'örnek ölçüm ana dosya '. Yukarıda bahsedilen seçin 'MS ayar dosyası ', 'MS dosya 've bunları her örnek satırı ekleyin ve enjeksiyon birimi ile 15 µL belirtilecek 'giriş dosyası' (Bölüm 6).</li>
	<li>Artan sırada, "örnek metni" Kalibratörler 0-7 ve kalite kontrol (QC) çift a/c veya QC çifti B/D için ekleyin.</li>
	<li>Örnek türü belirtin. Örnek türü "standart" Kalibratörler ve "QC" kalite kontrol çiftleri için seçin.</li>
	<li>Her antibiyotik madde konsantrasyonu karşılık gelen Kalibratörler ve kalite kontrol (elektronik tablo, konsantrasyon [µg/mL] Cal 7-Cal 0, QC/c veya B/D, bakın) belirtin.</li>
	<li>Program 'veri değerlendirme yöntemi '. (Bölüm 5) ayarlama aracı sırasında optimize geçişleri kullanın. Her antibiyotik karşılık gelen izotop etiketli standart (Örneğin, meropenem - meropenem-D6) ile aynı.</li>
</ol>8. örnek temizleme ve HPLC-MS/MS Analizi
Not: her örnek toplu işlem için bir düşük ve yüksek antibiyotik konsantrasyon ile (QC A/C veya QC B/D) ayarla eşleştirilmiş bir kalite kontrol işlenen analiz ve. Farklı parçalar arasında alternatif bir sýrada eşleştirilmiş QC örnekleri kullanılır (seçin,Örneğin, 1, gün 'örnek ölçüm ana dosya ' QC dahil a/c çifti; 2 günde bir de dahil olmak üzere QC çift B/D seçin. Serum numuneleri işlenmesi Şekil 1' de gösterilmiştir.
<ol><li>Yağış Ajan % 10 metil -terthazırlamak-bütil eter metanol (10:90, v/v) içinde (Örneğin, prefill 25 mL hacimsel şişesi ile 2.5 mL metil -tert-butil eter ve mutlak metanol ile 25 mL doldurun).</li>
	<li>C8 ters faz sütun odasına koyun. HPLC ve akış yönünde kütle spektrometre bağlayın.</li>
	<li>Örnek liste oluşturmak. Buna karşılık gelen açın 'örnek ölçüm ana dosya ' şablon ve listeye işlenmesi gereken hasta numuneleri ekleyin. 20 hasta numuneleri grupları oluşturmak ve onlara karşılık gelen kalite kontrol çift kanat.</li>
	<li>Islak-Başbakan HPCL sistemini kullanarak 'giriş dosyası ' kontrol yazılımı: "ıslak Başbakan" işlevi % 50 mobil faz A/50% B ayarla ve ıslak-Başbakan bir akış hızı 1 mL/dk ile 2 dk için.</li>
	<li>Şırınga yenileyin. Bunu yapmak için kontrol yazılımı 600 µL 6 darbeleri yürütmek.</li>
	<li>C8 ters faz sütun equilibrate. Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı kullanarak akış içinde açmak 'giriş dosyası ' ve üstüne sifonu %7 ile mobil faz B/93% A en az 5 dk, bir akış hızı 0.5 mL/dak doğrulama kullanarak sütun sıcaklığı 30 ° c</li>
	<li>Hasta numuneleri, kalibratörler 0-7, bir aliquot ve bir kalite kontrol çift çözülme (ya A / B veya C/D).</li>
	<li>Tekrarlayan bir pipet ile bir kaç saniyeliğine 100 µL Kalibratör, QC örnek veya bir 1,5 mL polipropilen boru ve girdap tüp hastanın serum 25 µL iç standart karışımı ekleyin.</li>
	<li>Karışımı bir benchtop shaker (Örneğin, 1200 rpm) üzerinde oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Tekrarlayan bir pipet ile yağış reaktif 150 µL örnek iç standart karışıma ekleyin.</li>
	<li>Yine, girdap tüp birkaç saniye ve bir benchtop shaker (Örneğin, 1200 rpm) üzerinde oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Süspansiyon 20.000 x g masa üstü bir santrifüj 4 ° C'de 10 dakika içinde de santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Bir cam şişe bir mikro-INSERT ile kullanma HPLC sınıf su ile süpernatant 1:3 oranında seyreltin ve Otomatik Örnekleyici olarak işlenmiş örnekleri yükleyin.</li>
	<li>HPLC-MS/MS Analizi el ile başlatma yeri 'örnek ölçüm denetim dosyası '. Not: uzun süreli depolama için analitik sütun üreticinin tavsiye [Örneğin, 0,5 mL/dk metanol-su (50: 50, v/v)] faz çöküşü önlemek için göre kanül.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58148/58148fig1.jpg"> Şekil 1: örnek temizleme şematik Gösterim. Protein yağış yüksek merkezkaç kuvveti, yoğun bir Pelet verir ve net süpernatant, gösteren bu protein yağış tamamlanmıştı. Tüm işlem zamanı örnek Temizleme, kromatografik ayırma ve MS/MS analizi de dahil olmak üzere yaklaşık 30 dakika var. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58148/58148fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
9. kalite değerlendirme ve miktar
<ol><li>Buna karşılık gelen örnekleri işlemek için açmanız 'örnek ölçüm denetim dosyası ', Kalibratörler, kalite kontrol ve hasta numuneleri seçin ve onlarla birlikte değerlendirmek 'antibiyotik miktar yöntemi '.
</li>
	<li>Belirli bir analit için zirveleri düzgün entegre olup olmadığını kontrol edin. Tepeleri her Kalibratör, QC ve hasta örnek için kontrol edin ve el ile onları reintegrate temel gerekirse.</li>
	<li>Kalibrasyon eğrisi çalışma ve aşağıdaki kalite kriterleri karşılayan olup olmadığını inceleyin: a) doğrusallık tüm kalibrasyon aralığı, b) bir kalibrasyon katsayısı r2 > 0.995, c) her kalibrasyon ± % 15 içinde standart sapma nominal değer, ± % 20 gerekli olduğu miktar (LLOQ), alt sınırı dışında.</li>
	<li>Yukarıda belirtilen kriterleri ile uyumlu olmayan bir kalibrasyon standart reddetmek ve regresyon çözümlemesi dahil olmak üzere kalibrasyon eğrisi yeniden değerlendirmek.</li>
	<li>Kalite denetimleri çalışma ve sapmalar ± % 15 içinde nominal değerli olup olmadığını inceleyin.</li>
	<li>Hasta bir örnek konsantrasyonu yüksek Kalibratör konsantrasyonu aşarsa, distile su ile örnek kadar 1:5 (Örneğin, 100 µL serum artı 400 µL distile su) örnek temizleme önce oranında seyreltin. Adımları 8,8-8.14 belirli bu örnek için reperform ve bu reprocess.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fleischmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Global+Incidence+and+Mortality+of+Hospital-treated+Sepsis.+Current+Estimates+and+Limitations.">Assessment of Global Incidence and Mortality of Hospital-treated Sepsis. Current Estimates and Limitations.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 259-272 (2016).</li><li>Dellinger, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+Sepsis+Campaign:+international+guidelines+for+management+of+severe+sepsis+and+septic+shock,+2012.">Surviving Sepsis Campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock, 2012.</a> Intensive Care Medicine. 39 (2), 165-228 (2013).</li><li>Lodise, T. P., Drusano, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+and+pharmacodynamics:+optimal+antimicrobial+therapy+in+the+intensive+care+unit.">Pharmacokinetics and pharmacodynamics: optimal antimicrobial therapy in the intensive care unit.</a> Critical Care Clinics. 27 (1), 1-18 (2011).</li><li>Macedo, R. S., Onita, J. H., Wille, M. P., Furtado, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+and+pharmacodynamics+of+antimicrobial+drugs+in+intensive+care+unit+patients.">Pharmacokinetics and pharmacodynamics of antimicrobial drugs in intensive care unit patients.</a> Shock. 39, 24-28 (2013).</li><li>Petersson, J., Giske, C. G., Eliasson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+dosing+of+piperacillin+and+meropenem+fail+to+achieve+adequate+plasma+concentrations+in+ICU+patients.">Standard dosing of piperacillin and meropenem fail to achieve adequate plasma concentrations in ICU patients.</a> Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 60 (10), 1425-1436 (2016).</li><li>Abdul-Aziz, M. H., Lipman, J., Mouton, J. W., Hope, W. W., Roberts, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+pharmacokinetic/pharmacodynamic+principles+in+critically+ill+patients:+optimizing+efficacy+and+reducing+resistance+development.">Applying pharmacokinetic/pharmacodynamic principles in critically ill patients: optimizing efficacy and reducing resistance development.</a> Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 36 (1), 136-153 (2015).</li><li>Imani, S., Buscher, H., Marriott, D., Gentili, S., Sandaradura, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Too+much+of+a+good+thing:+a+retrospective+study+of+beta-lactam+concentration-toxicity+relationships.">Too much of a good thing: a retrospective study of beta-lactam concentration-toxicity relationships.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 72 (10), 2891-2897 (2017).</li><li>Ventola, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibiotic+resistance+crisis:+part+1:+causes+and+threats.">The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats.</a> Pharmacy &amp; Therapeutics. 40 (4), 277-283 (2015).</li><li>Pulcini, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+stewardship:+update+and+perspectives.">Antibiotic stewardship: update and perspectives.</a> Clinical Microbiology and Infection. 23 (11), 791-792 (2017).</li><li>Cairns, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+a+multidisciplinary+antimicrobial+stewardship+team+on+the+timeliness+of+antimicrobial+therapy+in+patients+with+positive+blood+cultures:+a+randomized+controlled+trial.">The impact of a multidisciplinary antimicrobial stewardship team on the timeliness of antimicrobial therapy in patients with positive blood cultures: a randomized controlled trial.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (11), 3276-3283 (2016).</li><li>Baur, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+antibiotic+stewardship+on+the+incidence+of+infection+and+colonisation+with+antibiotic-resistant+bacteria+and+Clostridium+difficile+infection:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Effect of antibiotic stewardship on the incidence of infection and colonisation with antibiotic-resistant bacteria and Clostridium difficile infection: a systematic review and meta-analysis.</a> Lancet Infectious Diseases. 17 (9), 990-1001 (2017).</li><li>Roberts, J. A., Norris, R., Paterson, D. L., Martin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+drug+monitoring+of+antimicrobials.">Therapeutic drug monitoring of antimicrobials.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 73 (1), 27-36 (2012).</li><li>Paal, M., Zoller, M., Schuster, C., Vogeser, M., Schutze, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+of+cefepime,+meropenem,+ciprofloxacin,+moxifloxacin,+linezolid+and+piperacillin+in+human+serum+using+an+isotope-dilution+HPLC-MS/MS+method.">Simultaneous quantification of cefepime, meropenem, ciprofloxacin, moxifloxacin, linezolid and piperacillin in human serum using an isotope-dilution HPLC-MS/MS method.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 152, 102-110 (2018).</li><li>Vogeser, M., Seger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pitfalls+associated+with+the+use+of+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+in+the+clinical+laboratory.">Pitfalls associated with the use of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in the clinical laboratory.</a> Clinical Chemistry. 56 (8), 1234-1244 (2010).</li><li>United States Pharmacopeia and National Formulary. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+&#60;621&#62;.">Chapter &#60;621&#62;.</a> CHROMATOGRAPHY (USP 37-NF 32 S1). , 6376-6385 (2014).</li><li>Wong, G., Sime, F. B., Lipman, J., Roberts, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+we+use+therapeutic+drug+monitoring+to+improve+outcomes+from+severe+infections+in+critically+ill+patients?.">How do we use therapeutic drug monitoring to improve outcomes from severe infections in critically ill patients?.</a> BMC Infectious Diseases. 14, 288 (2014).</li><li>. Cefepime hydrochloride: Highlights of prescribing information Available from: <a target="_blank" href="https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2016/050679s040lbl.pdf">https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2016/050679s040lbl.pdf</a> (2016)</li><li>. Meropenem: Highlights of prescribing information Available from: <a target="_blank" href="https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2008/050706s022lbl.pdf">https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2008/050706s022lbl.pdf</a> (2006)</li><li>. Ciprofloxacin hydrochloride: Highlights of prescribing information Available from: <a target="_blank" href="https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2016/019537s086lbl.pdf">https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2016/019537s086lbl.pdf</a> (2016)</li><li>. Moxifloxacin hydrochloride: Highlights of prescribing information Available from: <a target="_blank" href="https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2010/021277s038lbl.pdf">https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2010/021277s038lbl.pdf</a> (2010)</li><li>. Linezolid: Highlights of prescribing information Available from: <a target="_blank" href="https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2012/021130s028lbl.pdf">https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2012/021130s028lbl.pdf</a> (2011)</li><li>. Piperacillin and Tazobactam: Highlighs of prescribing information Available from: <a target="_blank" href="https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2017/050684s88s89s90_050750s37s38s39lbl.pdf">https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2017/050684s88s89s90_050750s37s38s39lbl.pdf</a> (2017)</li><li>Zander, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+biobanking+conditions+on+six+antibiotic+substances+in+human+serum+assessed+by+a+novel+evaluation+protocol.">Effects of biobanking conditions on six antibiotic substances in human serum assessed by a novel evaluation protocol.</a> Clinical Chemistry and Laboratory. 54 (2), 265-274 (2016).</li><li>Zander, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+piperacillin,+tazobactam,+cefepime,+meropenem,+ciprofloxacin+and+linezolid+in+serum+using+an+isotope+dilution+UHPLC-MS/MS+method+with+semi-automated+sample+preparation.">Quantification of piperacillin, tazobactam, cefepime, meropenem, ciprofloxacin and linezolid in serum using an isotope dilution UHPLC-MS/MS method with semi-automated sample preparation.</a> Clinical Chemistry and Laboratory. 53 (5), 781-791 (2015).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu makale, biz ICU19, cefepime, meropenem, Siprofloksasin, moxifloxacin, linezolid, sık kullanılan antibiyotikler miktar için basit ve sağlam tandem kütle spektrometresi tabanlı yöntemi için protokol raporu ve piperacillin14. Bir elektronik tablo el yazması antibiyotik hisse senedi çözümleri, kalibratörler ve kalite kontrol, antibiyotikler saflığı ve onların counterions molekül ağırlığı dikkate alarak hazırlanması için eşlik eder. Antibiyotiklerin...

Her ne kadar antibiyotik tıp pratiği devrim, şiddetli bakteriyel enfeksiyonlar önde gelen nedenidir morbidite ve mortalite kritik hastalıklar1kalır. Bu bağlamda, komut istemi bir uygun anti infective yeterli dozda en üstte yer alan önemli hastalık denetim2için bir ilçedir.
Kanıt büyüyen bir vücudun geniş spektrumlu antibiyotik ile ampirik tedavi hasta nüfus karmaşıklığı ile giderek daha sorunlu hale geliyor gösterir. Bu özellikle yoğun bakım üniteleri (ICU), nerede anahtar farmakokinetik (PK) parametreleri muazzam bir arası bireysel değişkenliği sık3,4görülmektedir doğrudur. Buna göre ICU hastaların yakın alt terapötik düzeylerinin yetersiz tedavi başarı5,6tehlikesi ile etkilenir. Sonra tekrar, hastalara gereksiz yere hiçbir klinik yarar7ile ciddi advers olaylar neden olabilir aşırı yüksek antibiyotik konsantrasyonları maruz kalır. Antibiyotik kötüye ve yetersiz dozaj halk sağlığı8için büyüyen bir tehdit haline geliyor antibiyotik direnci yayılması da yol açtı.
Mümkün olduğunca uzun süre antibiyotik kullanımı artırmak için ve kendi effectivenessas korumak için Dünya Sağlık Örgütü 20159antimikrobiyal direnç bir küresel eylem planı başlattı. Antibiyotik yönetim programları Ulusal Halk Sağlığı stratejileri10hasta bakımı11 ve aynı zamanda kalitesini önemli ölçüde artırmak için klinisyenler yardım, ihtiyatlı antibiyotik kullanımının temel bir temel taşı teşkil antibiyotik direnci12azaltılması. Antimikrobiyal tedavi edici ilaç uygulanması yoluyla bireysel hastalarda dozlama (TDM) izleme bir anahtar bu bağlam13' te aracıdır.
Bugüne kadar piyasada bulunan TDM deneyleri glycopeptide antibiyotik ve aminoglikozitler için kullanılabilirdir. Diğer sınıflardan maddelerin miktar yaygın bir in-house Yöntem geliştirme veya hantal olabilir doğrulama gerektirir. Biz, bu nedenle, kendi klinik ilgili toplama aralıkları14içinde yoğun bakımda antibiyotikler en uygun miktar için kullanılan güçlü bir kütle spektrometresi tabanlı tahlil için protokol ayrıntılı olarak mevcut. Yöntem kütle spektrometresi tesisimizde son zamanlarda kuruldu ve o zamandan beri rutin yoğun bakımda TDM için uygulanan. Yordamı kütle spektrometresi yetenekleri ile birçok tesislerinde antibiyotik TDM hızlı uygulama için izin veren bir üniforma örnek Temizleme ile kolay ve basittir analitik ayarını kullanır.
Burada açıklanan protokol cefepime, meropenem, Siprofloksasin, moxifloxacin, linezolid ve piperacillin bir tandem ile birlikte İzotop seyreltme sıvı kromatografi (LC) kullanarak insan serumda miktar için optimize edildi kitle spektrometresi (MS/MS). İzotop seyreltme için LC-MS/MS metodoloji kararlı izotop etiketli bileşikler (Örneğin, serum) belirli bir matris ile ilgi bir örnek eklenir. İzotop etiketli standartları yani analit doğal molekül ve bir üst iyon kızı iyon geçiş olarak adlandırdığı parçalanma ürünlerinin farklı molekül ağırlıkları nedeniyle ilgi onların etiketlenmemiş karşılığından ayrılır. İzotop etiketli bileşikler için etiketlenmemiş kendi meslektaşı karşılaştırıldığında hemen hemen aynı bir genel olarak fizikokimyasal davranış var onlar MS/MS, hemen hemen matris bağımsız analit miktar yüksek düzeyde izin için ideal kendi standartlarına şunlardır doğruluk15. Günümüzde, antimicrobials, TDM dahil olmak üzere küçük molekül miktar için kullanılabilecek pek çok kararlı izotop etiketli kendi standartlarına ticari olarak kullanılabilir.
Açıklanan protokolündeki antibiyotik analitler kromatografik ayırma bir analitik C8 alkil-zincir-uzunluk ters fazlı sütun (100 mm x 2.1 mm, 3 µm parçacık boyutu) gerçekleştirilir. Yöntem geliştirme sırasında bütün analitler için iç standart normalleştirilmiş matris etkenler %94.6 ve %105.4, ≤8.3%14varyasyon katsayısı ile arasında yapıldı.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>cefepime hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1097636</td>
			<td>USP Reference Standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meropenem trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0001252</td>
			<td>EP Reference Standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>moxifloxacin hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML1581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>linezolid</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>L466500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piperacillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cefepime-13C12D3 sulfate</td>
			<td>Alsachim</td>
			<td>C1297</td>
			<td>Isotope labelled internal standard for cefepime</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meropenem-D6</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>M225617</td>
			<td>Isotope labelled internal standard for meropenem</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ciprofloxacin-D8</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>C482501</td>
			<td>Isotope labelled internal standard for ciprofloxacin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>moxifloxacin-13C1D3 hydrochloride</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>M745003</td>
			<td>Isotope labelled internal standard for moxifloxacin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>linezolid-D3</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>L466502</td>
			<td>Isotope labelled internal standard for linezolid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piperacillin-D5</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>P479952</td>
			<td>Isotope labelled internal standard for piperacillin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>8402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade water</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formic acid</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>6914132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>1070501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70221-25G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyl methyl ether</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fortis 3 &#956;m C8 100 * 2.1 mm</td>
			<td>Fortis</td>
			<td>F08-020503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-PEEK-encased Prifilter (2 &#956;m)</td>
			<td>Chromsystems</td>
			<td>15011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2795 Alliance HPLC system</td>
			<td>Waters</td>
			<td>176000491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quattro micro API Tandem Quadrupole System</td>
			<td>Waters</td>
			<td>720000338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuanLynx 4.1 software</td>
			<td>Waters</td>
			<td>/</td>
			<td>Data evaluation software provided by the mass spectrometer manufacturer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplex therapeutic drug monitoring by isotope-dilution hplc-ms/ms of antibiotics in critical illnesses

Tedavi edici ilaç antibiyotik hastane antibiyotik yönetim programlarının uygulanması açısından özellikle birçok klinik tesislerinde izlemek için artan bir talep var.
Geçerli çalışma, biz cefepime, meropenem, Siprofloksasin, moxifloxacin, linezolid ve piperacillin, yaygın olarak kullanılan miktar için bir çok katmanlı yüksek performanslı sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometresi (HPCL-MS/MS) iletişim kuralı mevcut yoğun bakım ünitelerinde antibiyotik. Yöntemi daha önce kapsamlı bir şekilde Avrupa İlaç Ajansı kılavuz göre doğrulandı.
Hızlı örnek temizleme sonra analitler 4 dakika içinde bir C8 ters fazlı HPLC sütun ayrılmış ve karşılık gelen kararlı izotop etiketli iç standartları ile electrospray iyonlaşma (ESI +) kütle spektrometresi birden çok tepki sayılabilir (MRM) izlemeye zaman. Sunulan yöntemi ile Tekdüzen kromatografik koşulları ayarlama, günlük ve güçlü antibiyotik tedavi edici ilaç klinik laboratuarlarda izlemek için izin veren bir basit araçları kullanır. Kalibrasyon eğrisi böylece minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) yakın antibiyotik miktarda duyarlı bakteri ve bolus ile elde edilen en yüksek konsantrasyonları (Cmax) dahil olmak üzere farmakokinetik konsantrasyon aralığı aşıyor Yönetim rejimleri. Örnek temizleme önce serum seyreltme zorunluluk yönetilen bir antibiyotik için eğri altındaki alan birden fazla ölçümleri elde edilebilir.

Açıklanan iletişim kuralını kullanarak, tipik bir kromatografik Şekil 2' de tasvir edilir. Amerika Birleşik Devletleri Pharmacopeia (USP) Kromatografi yönergeleri16göre mevcut sistemde sütun ölü cilt ~0.22 mL ve (enjektör, boru ve bağlayıcıları içeren) ekstra sütunlu birimle ~0.08 mL, kararlıydı veren ~0.30 mL soygun hacmi. Bütün analitler için hesaplanan saklama faktörler (için cefepime) - 2,8 vardı 4.2 (iç...

Watch this Scientific Journal Video about Multiplex Therapeutic Drug Monitoring by Isotope-dilution HPLC-MS/MS of Antibiotics in Critical Illnesses at JoVE.com

Multiplex Therapeutic Drug Monitoring by Isotope-dilution HPLC-MS/MS of Antibiotics in Critical Illnesses

İzotop seyreltme HPLC-MS/MS kritik hastalıklar içinde antibiyotik ile tedavi edici ilaç izleme multiplex

Burada bir tandem kütle spektrometresi tabanlı protokol sık kullanılan antibiyotikler miktar yoğun bakım üniteleri, yani cefepime, meropenem, Siprofloksasin, moxifloxacin, linezolid ve piperacillin mevcut.

There is an ever-increasing demand for the therapeutic drug monitoring of antibiotics in many clinical facilities, particularly with regard to the ...

multiplex-therapeutic-drug-monitoring-isotope-dilution-hplc-msms

Research

JoVE Journal

Medicine

12.8K Görüntüleme.  LMU Munich. Burada bir tandem kütle spektrometresi tabanlı protokol sık kullanılan antibiyotikler miktar yoğun bakım üniteleri, yani cefepime, meropenem, Siprofloksasin, moxifloxacin, linezolid ve piperacillin mevcut.

Video: Multiplex Therapeutic Drug Monitoring by Isotope-dilution HPLC-MS/MS of Antibiotics in Critical Illnesses

Bronchial Thermoplasty:  A Novel Therapeutic Approach to Severe Asthma

Bronchial thermoplasty is a non-drug procedure for severe persistent asthma that delivers thermal energy to the airway wall in a precisely controlled manner to reduce excessive airway smooth muscle. Reducing airway smooth muscle decreases the ability of the airways to constrict, thereby reducing the frequency of asthma attacks. Bronchial thermoplasty is delivered by the Alair System and is performed in three outpatient procedure visits, each scheduled approximately three weeks apart. The first procedure treats the airways of the right lower lobe, the second treats the airways of the left lower lobe and the third and final procedure treats the airways in both upper lobes. After all three procedures are performed the bronchial thermoplasty treatment is complete.
Bronchial thermoplasty is performed during bronchoscopy with the patient under moderate sedation. All accessible airways distal to the mainstem bronchi between 3 and 10 mm in diameter, with the exception of the right middle lobe, are treated under bronchoscopic visualization. Contiguous and non-overlapping activations of the device are used, moving from distal to proximal along the length of the airway, and systematically from airway to airway as described previously. Although conceptually straightforward, the actual execution of bronchial thermoplasty is quite intricate and procedural duration for the treatment of a single lobe is often substantially longer than encountered during routine bronchoscopy. As such, bronchial thermoplasty should be considered a complex interventional bronchoscopy and is intended for the experienced bronchoscopist. Optimal patient management is critical in any such complex and longer duration bronchoscopic procedure. This article discusses the importance of careful patient selection, patient preparation, patient management, procedure duration, postoperative care and follow-up to ensure that bronchial thermoplasty is performed safely.
Bronchial thermoplasty is expected to complement asthma maintenance medications by providing long-lasting asthma control and improving asthma-related quality of life of patients with severe asthma. In addition, bronchial thermoplasty has been demonstrated to reduce severe exacerbations (asthma attacks) emergency rooms visits for respiratory symptoms, and time lost from work, school and other daily activities due to asthma.

Bronchial thermoplasty is a non-drug procedure for severe persistent asthma that delivers thermal energy to the airway wall in a precisely controlled manner to reduce excessive airway smooth muscle. Reducing airway smooth muscle decreases the ability of the airways to constrict, thereby reducing the frequency of asthma attacks.

Bronş Thermoplasty: Şiddetli Astım Yeni Bir Tedavi Yaklaşımı

Bronchial thermoplasty is a non-drug procedure for severe persistent asthma that delivers thermal energy to the airway wall in a precisely controlled ...

Tıp

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly hydrated, forming a substantial endothelial surface layer (ESL) that contributes to the maintenance of endothelial function. As the endothelial glycocalyx is often aberrant in vitro and is lost during standard tissue fixation techniques, study of the ESL requires use of intravital microscopy. To best approximate the complex physiology of the alveolar microvasculature, pulmonary intravital imaging is ideally performed on a freely-moving lung. These preparations, however, typically suffer from extensive motion artifact. We demonstrate how closed-chest intravital microscopy of a freely-moving mouse lung can be used to measure glycocalyx integrity via ESL exclusion of fluorescently-labeled high molecular weight dextrans from the endothelial surface. This non-recovery surgical technique, which requires simultaneous brightfield and fluorescent imaging of the mouse lung, allows for longitudinal observation of the subpleural microvasculature without evidence of inducing confounding lung injury.

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx/endothelial surface layer is ideally studied using intravital microscopy. Intravital microscopy is technically challenging in a moving organ such as the lung. We demonstrate how simultaneous brightfield and fluorescent microscopy may be used to estimate endothelial surface layer thickness in a freely-moving in vivo mouse lung.

Fare Pulmoner Endotelyal Yüzey Katman in vivo ölçümü olarak

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in sub-Saharan Africa continue to expand, individuals on ART should be closely monitored for the emergence of drug resistance. Surveillance of transmitted drug resistance to track transmission of viral strains already resistant to ART is also critical. Unfortunately, drug resistance testing is still not readily accessible in resource limited settings, because genotyping is expensive and requires sophisticated laboratory and data management infrastructure. An open access genotypic drug resistance monitoring method to manage individuals and assess transmitted drug resistance is described. The method uses free open source software for the interpretation of drug resistance patterns and the generation of individual patient reports. The genotyping protocol has an amplification rate of greater than 95% for plasma samples with a viral load &#62;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The sensitivity decreases significantly for viral loads &#60;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The method described here was validated against a method of HIV-1 drug resistance testing approved by the United States Food and Drug Administration (FDA), the Viroseq genotyping method. Limitations of the method described here include the fact that it is not automated and that it also failed to amplify the circulating recombinant form CRF02_AG from a validation panel of samples, although it amplified subtypes A and B from the same panel.

Drug resistance testing for HIV-1 infected individuals failing antiretroviral therapy (ART) can guide future therapies and improve treatment outcomes. Optimizing individual and population health outcomes in high HIV prevalence but resource-limited settings will ultimately require affordable and accessible drug resistance genotyping and interpretation methods.

Kaynak Sınırlı Ayarlar için uygun bir HIV-1 İlaç Direnci İzleme Yöntemi

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility. 
Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.
Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

Farelerde Basit Kritik ölçekli Femoral Hata Modeli

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular mechanisms responsible for the disease, and are very convenient for rapid drug screening and testing of promising therapies. A limiting factor in these studies is often the lack of efficient non-invasive methods for sequentially analyzing the anatomical and functional changes in the kidney. Magnetic resonance imaging (MRI) is the current gold standard imaging technique to follow autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) patients, providing excellent soft tissue contrast and anatomic detail and allowing Total Kidney Volume (TKV) measurements.A major advantage of MRI in rodent models of PKD is the possibility for in vivo imaging allowing for longitudinal studies that use the same animal and therefore reducing the total number of animals required. In this manuscript, we will focus on using Ultra-high field (UHF) MRI to non-invasively acquire in vivo images of rodent models for PKD. The main goal of this work is to introduce the use of MRI as a tool for in vivo phenotypical characterization and drug monitoring in rodent models for PKD.

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

The use of ultra-high field MRI as a non-invasive way to obtain phenotypic information of rodent models for polycystic kidney disease and to monitor interventions is described. Compared with the traditional histological approach, MRI images can be acquired in vivo, allowing for longitudinal follow-up.

Için Polikistik Böbrek Hastalığında Küçük Kemirgen modelleri Ultra yüksek Saha MRI Kullanımı<em&gt; In Vivo</em&gt; Fenotiplendirme ve İlaç İzleme

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...

Establishment of a Segmental Femoral Critical-size Defect Model in Mice Stabilized by Plate Osteosynthesis

The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a model organism, the mouse has already been widely used in bone-related research. Large diaphyseal bone defect models in mice, however, are sparse and often use bone fixation which fills the bone marrow cavity and does not provide optimal mechanical stability. The objectives of the current study were to develop a critical-size, segmental, femoral defect in nude mice. A 3.5-mm mid-diaphyseal femoral ostectomy (approximately 25% of the femur length) was performed using a dedicated jig, and was stabilized with an anterior located locking plate and 4 locking screws. The bone defect was subsequently either left empty or filled with a bone substitute (syngenic bone graft or coralline scaffold). Bone healing was monitored noninvasively using radiography and in vivo micro-computed-tomography and was subsequently assessed by ex vivo micro-computed-tomography and undecalcified histology after animal sacrifice, 10 weeks postoperatively. The recovery of all mice was excellent, a full-weight-bearing was observed within one day following the surgical procedure. Furthermore, stable bone fixation and consistent fixation of the implanted materials were achieved in all animals tested throughout the study. When the bone defects were left empty, non-union was consistently obtained. In contrast, when the bone defects were filled with syngenic bone grafts, bone union was always observed. When the bone defects were filled with coralline scaffolds, newly-formed bone was observed in the interface between bone resection edges and the scaffold, as well as within a short distance within the scaffold. 
The present model describes a reproducible critical-size femoral defect stabilized by plate osteosynthesis with low morbidity in mice. The new load-bearing segmental bone defect model could be useful for studying the underlying mechanisms in bone regeneration pertinent to orthopaedic applications.

Although mouse models are invaluable tools for bone tissue engineering, models of long bone defects are sparse. This need motivated development of the present protocol which uses a locking plate with four screws and a dedicated jig to perform and stabilize a reproducible, femoral, critical-size defect with low morbidity.

Farelerde bir Segmental Femoral Kritik boyutlu Defekt Modelinde kurulması Plaka Osteosentez tarafından Stabilize

The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a ...

Standardized Hemorrhagic Shock Induction Guided by Cerebral Oximetry and Extended Hemodynamic Monitoring in Pigs

Hemorrhagic shock ranks among the main reasons for severe injury-related death. The loss of circulatory volume and oxygen carriers can lead to an insufficient oxygen supply and irreversible organ failure. The brain exerts only limited compensation capacities and is particularly at high risk of severe hypoxic damage.This article demonstrates the reproducible induction of life-threatening hemorrhagic shock in a porcine model by means of calculated blood withdrawal. We titrate shock induction guided by near-infrared spectroscopy&#160;and extended hemodynamic monitoring to display systemic circulatory failure, as well as cerebral microcirculatory oxygen depletion. In comparison to similar models that primarily focus on predefined removal volumes for shock induction, this approach highlights a titration by means of the resulting failure of macro- and microcirculation.

Hemorrhagic shock is a severe complication in seriously injured patients, which leads to life-threatening oxygen undersupply. We present a standardized method to induce hemorrhagic shock via blood withdrawal in pigs that is guided by hemodynamics and microcirculatory cerebral oxygenation.

Domuzlarda serebral oksimetre ve genişletilmiş hemodinamik Izleme güdümlü standartlaştırılmış hemorajik şok Indüksiyon

Hemorrhagic shock ranks among the main reasons for severe injury-related death. The loss of circulatory volume and oxygen carriers can lead to an ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard therapy, a considerable number of CLI patients are not suited for either surgical or endovascular revascularization. Angiogenic therapies are emerging as an option for these patients but are currently still under investigation. Before application in humans, those therapies must be tested in animal models and its mechanisms must be clearly understood. An animal model of hindlimb ischemia (HLI) has been developed by the ligation and excision of the distal external iliac and femoral arteries and veins in mice. A comprehensive panel of tests was assembled to assess the effects of ischemia and putative angiogenic therapies at functional, histologic and molecular levels. Laser Doppler was used for the flow measurement and functional assessment of perfusion. Tissue response was evaluated by the analysis of capillary density after staining with the anti-CD31 antibody on histological sections of gastrocnemius muscle and by measurement of collateral vessel density after diaphonization. Expression of angiogenic genes was quantified by RT-PCR targeting selected angiogenic factors exclusively in endothelial cells (ECs) after laser capture microdissection from mice gastrocnemius muscles. These methods were sensitive in identifying differences between ischemic and non-ischemic limbs and between treated and non-treated limbs. This protocol provides a reproducible model of CLI and a framework for testing angiogenic therapies.

Here, a critical hindlimb ischemia experimental model is presented followed by a battery of functional, histologic and molecular tests&#160;to assess the effectiveness of angiogenic therapies.&#8203;

Hindekstremite Iskemi bir Murine modelinde terapötik anjiyogenezi değerlendirilmesi

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...

A Rat Carotid Artery Pressure-Controlled Segmental Balloon Injury with Periadventitial Therapeutic Application

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the luminal surface area in arteries thereby reducing adequate blood flow to organs and distal tissues. Clinically, revascularization procedures such as balloon angioplasty with or without stent placement aim to restore blood flow. Although these procedures reestablish blood flow by reducing plaque burden, they damage the vessel wall, which initiates the arterial healing response. The prolonged healing response causes arterial restenosis, or re-narrowing, ultimately limiting the long-term success of these revascularization procedures. Therefore, preclinical animal models are integral for analyzing the pathophysiological mechanisms driving restenosis, and provide the opportunity to test novel therapeutic strategies. Murine models are cheaper and easier to operate on than large animal models. Balloon or wire injury are the two commonly accepted injury modalities used in murine models. Balloon injury models in particular mimic the clinical angioplasty procedure and cause adequate damage to the artery for the development of restenosis. Herein we describe the surgical details for performing and histologically analyzing the modified, pressure-controlled rat carotid artery balloon injury model. Additionally, this protocol highlights how local periadventitial application of therapeutics can be used to inhibit neointimal hyperplasia. Lastly, we present light sheet fluorescence microscopy as a novel approach for imaging and visualizing the arterial injury in three-dimensions.

The rat carotid artery balloon injury mimics the clinical angioplasty procedure performed to restore blood flow in atherosclerotic vessels. This model induces the arterial injury response by distending the arterial wall, and denuding the intimal layer of endothelial cells, ultimately causing remodeling and an intimal hyperplastic response.

Periadventitial Terapötik Uygulama ile Sıçan Karotis Arter Basınç Kontrollü Segmental Balon Yaralanması

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the ...

Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. Plasma drug levels are the current gold standard assessment, but require phlebotomy and a cold chain, and capture only very recent adherence. Our method uses hair, a matrix that is easily collected and reflective of long-term adherence, to test for 11 anti-TB medications. Previous work by our group shows that antiretroviral drug levels in hair are associated with HIV outcomes. Our method for DR-TB drugs uses 2 mg of hair (3 cm proximal to the root), which is pulverized and extracted in methanol. Samples are analyzed with a single LC-MS/MS method, quantifying 11 drugs in a 16 min run. Lower limits of quantification (LLOQs) for the 11 drugs range from 0.01 ng/mg to 1 ng/mg. Drug presence is confirmed by comparing ratios of two mass spectrometry transitions. Samples are quantified using the area ratio of the drug to the deuterated, 15N-, or 13C-labeled drug isotopologue. We used a calibration curve ranging from 0.001-100 ng/mg. Application of the method to a convenience sample of hair samples collected from DR-TB patients on directly observed therapy (DOT) indicated drug levels in hair within the linear dynamic range of nine of the eleven drugs (isoniazid, pyrazinamide, ethambutol, linezolid, levofloxacin, moxifloxacin, clofazimine, bedaquiline, pretomanid). No patient was on prothionamide, and the measured levels for ethionamide were close to its LLOQ (with further work instead examining the suitability of ethionamide&#8217;s metabolite for monitoring exposure). In summary, we describe the development of a multi-analyte panel for DR-TB drugs in hair as a technique for therapeutic drug monitoring during drug-resistant TB treatment.

Current methods of analyzing patients&#8217; adherence to complex drug resistant-tuberculosis (DR-TB) regimens can be inaccurate and resource-intensive. Our method analyzes hair, an easily collected and stored matrix, for concentrations of 11 DR-TB medications. Using LC-MS/MS, we can determine sub-nanogram drug levels that can be utilized to better understand drug adherence.

Küçük Saç Örneklerinde 11 İlaca Dirençli TB İlaçların Ölçülmesi için Doğrulanmış LC-MS/MS Paneli

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. ...